一、重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析（论文文献综述）
李兰洲[1]（2021）在《基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究》文中指出胸腺肽类药物在恶性肿瘤的临床治疗常作为免疫调节剂与化疗药物联合使用。临床数据显示,胸腺肽类药物的使用提升了恶性肿瘤患者存活率和生活质量。胸腺肽注射制剂在使用中容易引起严重的过敏等副作用,而胸腺肽肠溶片虽然安全性更高,但也存在药品标准简单,质量控制项少等问题,且其相关研究较少,临床定位模糊,作用机制不明确。本研究以胸腺肽肠溶片原料药小牛胸腺肽（CTP）作为研究对象,对其物质基础进行测定,并通过免疫低下小鼠模型,B6/JGpt-Apcem1Cin（Min C）/Gpt基因型（APC）原发性结直肠癌小鼠模型,造血体外细胞模型和造血功能障碍小鼠模型,对CTP的免疫调节活性,基于免疫调节活性的抗结直肠癌活性和促造血活性及其作用机制进行研究。首先测定了CTP的分子量及分子量范围,17种氨基酸及5种核苷酸含量。结果显示CTP中分子量在100-800道尔顿（Da）之间有69.15%的组分,CTP的数均分子量为222 Da,重均分子量为998 Da。同时发现CTP中既含有大量的必须氨基酸,如:60.24 g/kg的赖氨酸和49.46 g/kg的亮氨酸,又含有大量的非必需氨基酸,如:86.82 g/kg的谷氨酸和55.67 g/kg的天冬氨酸。5种核苷酸中CMP以49763.19 mg/kg的含量占据绝对优势地位。其次,通过75 mg/kg环磷酰胺（CTX）建立免疫低下小鼠模型,通过测定小鼠自然杀伤（NK）细胞杀伤活性,淋巴细胞转化活性,免疫球蛋白（Ig）及细胞因子含量,对CTP免疫调节活性进行研究。结果显示CTP有效地缓解了免疫低下小鼠体重的降低,提高了小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞转化活性,提高了Ig A,Ig G,Ig M,白细胞介素（IL）-2,IL-6,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,干扰素（IFN）-α和IFN-γ的含量,并降低了IL-10的含量。再次,在APC小鼠模型中,通过比较肿瘤形态变化及组织病理学,流式细胞术,肠道菌群测定,ELISA测定及western blot分析等技术,对CTP基于免疫调节的抗结直肠癌活性及作用机制进行研究。结果显示CTP作用有效地抑制了APC小鼠结直肠肿瘤的发展,限制了肿瘤组织中血管网络的建立,并有力地保持肠道细胞正常形态,说明在APC小鼠体内,CTP确实发挥了抑制结直肠癌的作用。CTP提高了APC小鼠外周血中NK细胞（CD3e-NK1.1+）和活化T淋巴细胞（CD3e+CD28+）的数量,提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞数量和辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2细胞比例。此外CTP作用显着提高了IL-2,IL-12,Toll样受体（TLR）4,TLR5含量,降低了IL-4,IL-10,转化生长因子β（TGF-β）含量,有效地提升了APC小鼠肠道菌群物种组成数量、种群丰度及均匀度,有效地降低了APC小鼠肿瘤及脾脏组织中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）,程序性细胞死亡蛋白1（PD1）和程序性细胞死亡蛋白配体（PD-L）1含量,升高了小鼠脾脏中IL-2含量及Calcineurin A/活化T细胞核因子1（NFAT1）通路蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB抑制剂激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）p65通路蛋白的活化水平。最后选用K562细胞和CHRF细胞作为体外模型,通过XTT测定,流式细胞术凋亡测定,联苯胺染色,western blot分析等,在体外模型中初步确定CTP促造血活性。并通过100 mg/kg CTX建立造血功能障碍小鼠模型,模拟化疗引起的骨髓损伤相关的造血功能障碍。通过外周血细胞分析,组织病理学分析,骨髓细胞流式细胞术分析,蛋白质组学联合ELISA测定技术对造血相关细胞因子进行分析,western blot分析等,在体内水平对CTP促造血活性及作用机制进行研究。体外细胞实验显示,CTP作用在增强K562细胞和CHRF细胞增殖活性的同时,也促进了细胞分化,增加了K562和CHRF细胞中磷酸化（P）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、P-核糖体蛋白S6激酶（RSK）1 p90、c-Myc和ETS转录因子ELK1（ELK1）等增殖分化相关蛋白的表达,证实CTP可通过调节增殖分化实现体外促造血作用。在造血功能障碍小鼠中,CTP促进了小鼠外周血中白细胞（WBC）,嗜酸性粒细胞（EO）,中性粒细胞（NE）等血细胞数量及血红蛋白含量的增多,并促进小鼠骨髓形态结构的重建及骨髓中B淋巴细胞,造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）的增多,同时增加了小鼠体内IL-2,IL-4,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等细胞因子水平,限制了IL-17,CCL1,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,TNF-α,IFN-γ等细胞因子的释放,显着升高了ERK1/2,PI3K,AKT和信号转导与转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平及G-CSF,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）,M-CSF,NFAT1和IL-2的蛋白水平。以上结果表明:（1）CTP作为小分子多肽类物质,可以提高免疫低下小鼠体内免疫相关细胞因子水平,并提高了小鼠杀伤性免疫细胞的活性;（2）CTP通过调节肠道菌群,调控IL-2相关通路蛋白活化,降低免疫检查点作用,增加T淋巴细胞和NK细胞介导的免疫杀伤反应实现抗结直肠癌活性。（3）CTP能够通过调节G-CSF、M-CSF和IL-2水平及其相关通路蛋白变化,促进骨髓完整性重建和造血功能细胞增多,从而发挥促造血作用。本文研究内容将为CTP药物质量标准提升提供科学数据支持,并有助于确定CTP药物作用机制,明确其临床适用症,为基于CTP开发抗肿瘤或促造血药物提供科学的数据支持。
刘茜婷[2]（2021）在《聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的药代动力学及安全性研究》文中认为研究背景中性粒细胞减少症是细胞毒性化疗药物和肿瘤靶向药物的主要剂量限制性毒性。发热性中性粒细胞减少症（Febrileneutropenia,FN）通常提示立即进行住院评估并需要接受广谱抗生素的经验性治疗。由于感染和脓毒症等并发症,与FN相关的死亡风险仍然相对较高。FN发生后的化疗药物剂量降低、化疗周期延迟或者取消,患者因无法接受足够剂量和疗程的化疗,其临床疗效受到影响,导致对治疗反应良好和潜在可治愈的恶性肿瘤控制不佳,威胁生命,甚至死亡。因此,为了确保患者的剂量密集化疗或者足剂量化疗计划顺利完成,其根本是积极预防或者治疗中性粒细胞减少症。重组人粒细胞刺激因子（Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF）和聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子（Pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,PEG-rhG-CSF）是在恶性肿瘤患者中对于预防或者治疗化疗诱导的中性粒细胞减少症起到积极作用的有效药物。PEG-rhG-CSF的半衰期长,单次皮下注射后,嗜中性粒细胞的绝对值会升高,其作用比传统的rhG-CSF更持久,具有更强的生物稳定性,从而缩短了化疗诱导的中性粒细胞减少症的持续时间。一个化疗治疗周期只要对患者进行一次剂量的给药,注射治疗次数大大减少,患者的依从性增加,并有效地保证了足剂量和足疗程化疗方案的实施。与每天皮下注射rhG-CSF在减少FN发生率和缩短严重中性粒细胞减少症的持续时间方面的治疗效果进行比较,单次皮下注射PEG-rhG-CSF产生的治疗效果与其具有可比性,并且具有良好的耐受性。在接受细胞毒化疗的实体瘤患儿中证实了 PEG-rhG-CSF的安全性和有效性。临床上,PEG-rhG-CSF已被用于支持小儿白血病患者骨髓抑制化疗后嗜中性粒细胞绝对值的恢复,但其疗效和安全性尚不清楚。仅有有限的研究评估了 PEG-rhG-CSF在小儿肉瘤患者中的药代动力学,目前尚无在小儿急性白血病患者中的药代动力学数据。研究目的本项研究者发起的开放式、前瞻性临床试验旨在初步评估PEG-rhG-CSF在急性白血病患儿中治疗化疗诱导的中性粒细胞减少症的药代动力学和安全性。研究方法患者在接受骨髓抑制性化疗结束后,发生了中性粒细胞减少症时,以单次皮下注射100 mcg/kg（最大剂量3 mg）PEG-rhG-CSF进行治疗。收集接受PEG-rhG-CSF治疗的急性白血病患儿的血液样本,测定其血药浓度的方法是酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA）。PEG-rhG-CSF 的群体药代动力学通过非线性混合效应模型（Nonlinear mixed-effect model,NONMEM）进行分析。通过收集不良事件评估PEG-rhG-CSF的短期安全性。本临床试验已在美国临床试验数据库（www.clinicaltrials.gov）进行了注册,注册号为NCT03844360。研究结果本研究共纳入16例急性白血病患儿（1.8～13.6岁）。在化疗结束后,有8例（50.0%）患者发生了严重中性粒细胞减少症,6例（37.5%）患者发生了 4级中性粒细胞减少症,2例（12.5%）患者发生了 3级中性粒细胞减少症。本研究共获得64个PEG-rhG-CSF血浆浓度用于群体药代动力学建模。采用一阶消除的一室模型描述群体药代动力学特征,体重是一个显着的协变量。CL和AUC的中位值（范围）分别是 5.65（1.49～14.45）mL/h/kg 和 16514.75（6632.45～54423.30）ng·h/mL。所有患儿均未观察到骨骼肌肉痛、发热、肾毒性和过敏反应。1例患儿在给药后第13天死亡,根据诺氏评估量表法客观评估和分析PEG-rhG-CSF引起肝毒性的因果关系和可能性大小,结果表明PEG-rhG-CSF与肝毒性的关联性是“可能有关”。研究结论本研究证实,PEG-rhG-CSF（100 mcg/kg,最大剂量3 mg）在急性白血病患儿中达到的AUC与PEG-rhG-CSF（100mcg/kg）在肉瘤患儿达到的AUC相似。PEG-rhG-CSF是安全的,并为治疗急性白血病患儿的化疗诱导的中性粒细胞减少症提供重要的选择,将在儿科药物开发计划的下一阶段中为PEG-rhG-CSF儿童临床试验的设计提供支持。
李登科[3]（2021）在《PEG-rhG-CSF与rhG-CSF对预防骨肉瘤患者化疗中性粒细胞减少的临床疗效研究》文中认为目的:比较聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子（PEG-rh G-CSF）和重组人粒细胞集落刺激因子（rh G-CSF）在骨肉瘤患者化疗后中性粒细胞减少症预防的临床疗效有无差别。方法:该研究为回顾性分析,选择2015年1月至2020年5月该院收治的90例初治骨肉瘤患者,均接受骨肉瘤新辅助化疗方案治疗,实验分三组,A组为rh G-CSF,5μg/kg,qd皮下注射;B组为rh G-CSF,5μg/kg,q12h皮下注射;C组为PEG-rh G-CSF,给药剂量为体重≥45 kg者每次6 mg,体重<45 kg者每次3 mg,皮下注射1次,（化疗疗程给药结束后48h皮下注射1次）。直至中性粒细胞绝对值（ANC）达低谷后连续2次检查≥5.0×109/L或1次检查ANC≥10.0×109/L时停药。对三组患者用药达标时间、Ⅲ度骨髓抑制发生率、Ⅳ度骨髓抑制发生率、Ⅳ度骨髓抑制持续时间、抗菌药物使用率、发热性中性粒细胞缺乏症发生率、三组患者用药所需费用进行统计学分析。结果:A、B、C三组用药达标天数:C组平均用药达标时间为（4.88±2.251）天,低于其他两组,具有统计学差异,P=0.000。三组在治疗费用上比较,B组平均费用为4562.07元,高于其他两组,具有统计学差异,P=0.000。下一周期化疗前测ANC值C组高于B组,具有统计学差异,P=0.005。三组FN发生率、抗生素使用率、Ⅲ度骨髓抑制发生率、Ⅳ度骨髓抑制发生率、Ⅳ度骨髓抑制持续时间,无统计学差异,P>0.05。结论:PEG-rh G-CSF在预防骨肉瘤患者化疗后发生骨髓抑制,使中性粒细胞恢复达标的时间比rh G-CSF用时短,所花费用较少。并且PEG-rh G-CSF仅需1次给药,更加方便,患者依从性好,值得临床推广。
葛韵[4]（2021）在《生白方防治结直肠癌化疗后白细胞减少症的临床观察》文中指出研究目的本课题旨在探讨以徐经世先生经验方——生白方防治结直肠癌化疗后白细胞减少症的临床观察。为临床治疗结直肠癌化疗后白细胞减少症给予新选择。研究方法本次研究选取安徽中医药大学第一附属医院肿瘤科的84例结直肠癌患者,按照随机的原则分对照组42例和治疗组42例。对照组观察期间每天口服地榆升白片0.2g tid,治疗组在对照组治疗基础上加服生白方,观察疗程为20天。若观察期间两组患者出现重度白细胞减少（白细胞计数<2.0×109/L,中性粒细胞计数<1.0×109/L）,立即予以rh G-CSF升白处理,其下一次的相关理化指标记录不纳入统计分析。分别于化疗前,化疗后第3、7、10、14、20天比较两组WBC、NE数值水平和升降趋势变化,同时比较两组白细胞减少分度情况（化疗后第7天和第10天）和升白疗效（自化疗后第10天至第20天）。兼顾观察比较两组相关营养指标数值（TP、Alb、PA、Hb）、中医证候积分和疗效及KPS评分情况。研究结果（1）主要指标:（1）两组初始WBC、NE数值无统计差异,具有临床可比性（P>0.05）;（2）化疗第4天两组WBC、NE数值水平均有所下降,统计学显示无差异（P>0.05）;（3）化疗第7天两组WBC、NE数值进一步跌落,治疗组WBC、NE计数高于对照组（P<0.05）,且其下降趋势较对照组更缓,但两组白细胞减少分布比较无统计学差异（P>0.05）,均集中于Ⅰ、Ⅱ度白细胞减少;（4）化疗第10天两组WBC、NE水平均跌至最低,治疗组WBC、NE数值高于对照组（P<0.05）;同时两组白细胞减少分布比较呈现明显差异（P>0.05）,治疗组白细胞减少集中于Ⅰ、Ⅱ度,优于对照组;（5）化疗第14、20天两组WBC、NE数值均较前恢复,治疗组上升趋势较对照组更明显,恢复数值也高于对照组（P<0.05）,治疗组升白有效率高于对照组（P<0.05）;（6）组内比较:化疗第20天治疗组可恢复至初始白细胞水平（P>0.05）,对照组则低于初始水平（P<0.05）。（2）治疗组治疗后的相关营养指标总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、前白蛋白（PA）均高于治疗前和同期对照组（P<0.05）。而血红蛋白Hb在组间和组内比较中,差异均无统计学意义（P>0.05）。（3）两组治疗前中医证候积分值具有临床可比性（P>0.05）,经治后生白方组中医证候积分明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。中医证候疗效对比,治疗组中医证候治疗有效率为71.4%优于对照组40.5%（P<0.05）。（4）两组治疗前KPS评分经统计学分析无差异（P>0.05）,经1疗程治疗后,治疗组KPS评分及疗效显着高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,治疗组KPS提高和稳定人数多于对照组。结论生白方联合地榆升白片组较单用地榆升白片组,能显着预防结直肠癌患者化疗后重度白细胞减少,加快白细胞恢复速度,还原初始水平,保证下一周期化疗;生白方能明显改善患者营养状况部分指标,提高化疗耐受性,进一步防治化疗后白细胞减少的发生;生白方能有效改善化疗后白细胞减少患者的中医证候和KPS评分,减轻不适证候,提高患者生活质量。
张开华[5]（2020）在《局部外用表皮生长因子促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究》文中认为第一部分表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究目的:探究表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床效果。方法:筛选2017-06至2020-06南昌大学第二附属医院收治的120例糖尿病足部溃疡患者,均自愿参与本实验并签署知情同意书。采用随机表法将120例患者随机分为4组:表皮生长因子组30例、纳米银敷料组30例、联合组30例、生理盐水对照组（生理盐水为常规治疗方式）30例。表皮生长因子组每次换药时使用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米;纳米银敷料组每次换药给予外用纳米银敷料,联合组使用表皮生长因子和纳米银敷料;其余治疗（生理盐水常规治疗方式）四组均相同。对照组仅用生理盐水进行常规治疗。各组都给予隔日换药一次,观察创面修复到各愈合阶段所需时间,愈合阶段分创面表皮愈合率及肉芽组织生长程度进行分级。治疗2周和4周后分别对创面渗出液进行细菌培养。结果:4组病例达到治疗有效阶段（1级）的时间无明显差异。与对照组相比,表皮生长因子组和联合组达到创面修复2、3级的时间更短,差异有显着性（P<0.05）;且联合组的创面修复时间比表皮生长因子组更短（P<0.05）。纳米银敷料组的创面修复时间比对照组短,但差异无显着性（P>0.05）。结论:在临床显效期内,四组的创面愈合效果无明显差异,在此期后使用表皮细胞生长因子能促进创面愈合,纳米银敷料对创面愈合有积极影响但效果不够明显;联合使用重组表皮生长因子和纳米银敷料则具有明显良好的促进创面愈合效果且能有效预防感染的发生。第二部分表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子治疗糖尿病足创面的临床研究目的:探究表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子对糖尿病足创面的愈合影响。方法:筛选2018-02至2020-02南昌大学第一附属医院烧伤科创面治疗中心及南昌大学附属九江医院普外科收治的80例糖尿病足部溃疡患者,均自愿参与本实验并签署知情同意书。采用随机表法将80例患者随机分为4组:重组人表皮生长因子组20例、酸性成纤维细胞生长因子组20例、生长因子联合组20例、桐叶烧伤油对照组（桐叶烧伤油为常规治疗方式）20例。各组患者在接受创面治疗期间,均将空腹血糖控制在11.1mmol/L以下,伴感染者使用相应抗生素治疗至感染完全控制,创面清创、清洗、去除病理性肉芽。联合用药组每次给予外用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米,外用酸性成纤维细胞生长因子100/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;重组人表皮生长因子组每次单纯给予外用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;酸性成纤维细胞生长因子组每次给予外用酸性成纤维细胞生长因子100U/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;桐叶烧伤油对照组仅用桐叶烧伤油进行常规治疗（以桐叶烧伤油浸泡纱布,将油纱敷于创面,主要为创面保湿及收敛创面作用,是临床上常规创面换药方式）。各组都给予每日换药一次,观察创面修复到各愈合阶段所需时间,愈合阶段分创面表皮愈合率及肉芽组织生长程度进行分级。结果:研究纳入糖尿病足患者80例,患者均进入结果分析。创面处理后各组创面愈合到各阶段的时间比较:4组在治疗开始后第3-4天（即临床显效期）,创面愈合情况相近（P>0.05）;而在此之后,联合用药组的愈合情况明显优于对照组（P<0.05）且表皮生长因子组的情况与联合组更为相近。4组病例在治疗开始后第3-4天（临床显效期）,肉芽组织生长情况相近（P>0.05）;在后期,联合用药组的愈合情况明显优于对照组（P<0.05）且表皮生长因子组的情况与联合组更为相近。结论:两种生长因子在临床显效期内对促进创面愈合的效果无明显差异,在此期后单独使用表皮细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子,对创面愈合有积极影响但效果不够明显,而联合使用重组表皮生长因子和酸性成纤维细胞生长因子则具有明显良好的促进创面愈合效果。第三部分表皮生长因子等多种生长因子在糖尿病足溃疡管理中的作用:临床试验的系统评价和荟萃分析目的:生长因子是糖尿病足溃疡的新兴疗法,尽管已有临床报道,但尚未有研究对生长因子在糖尿病足溃疡中的功效和安全性进行临床证据的全面、系统评估。我们通过对随机对照试验（RCT）进行系统综述来解决这一问题,并通过荟萃分析探究表皮生长因子对糖尿病足溃疡的治疗效果,为其临床使用提供循证医学证据。方法:搜索Pub Med,Cochrane库,Scopus,Embase和Google Scholar数据库,并选择有关生长因子治疗糖尿病患者溃疡创面的RCT研究文献。文献检索和评估由两名独立的审阅者进行。研究的方法学质量使用雅达量表进行评估。我们搜索数据库包括Pub Med,EMBASE,Cochrane图书馆,Web of Science,EBSCOhost,Science Direct和Scopus（截至2020年6月）,筛选表皮生长因子和安慰剂治疗糖尿病足溃疡创面的研究文章,并进行文献质量评估,从而纳入高质量文献。以糖尿病足治愈率为对比指标,根据给药途径的类型进行分层荟萃分析（局部注射和局部应用）,通过计算比值比（OR）和95%置信区间（95%CI）确定研究结论的准确性。结果:我们鉴定了涉及糖尿病的糖尿病患者的18项RCT,评估了血小板衍生生长因子,表皮生长因子,成纤维细胞生长因子,粒细胞集落刺激因子,血管内皮生长因子,促红细胞生成素,转化生长因子的有效性。主要的主要结局是完全愈合,尽管采用了不同的指标来定义这一点,例如伤口闭合,肉芽组织形成或完全再上皮化。很少有研究有随访期来报告任何复发和截肢率。由于干预,没有不良反应的报道。Meta分析共纳入六项研究,涉及530例患者符合分析条件。组合的OR（局部注射和局部适用）是4.005（95%CI:（2.248;7.135）,p<0.001）。病灶内注射和局部用药应用分别为3.599（95%CI:（1.213;10.677）,p=0.021）和4.176（95%CI:（2.112;8.256）,p<0.001）。统计异质性在整体治疗和两个子组（I2:24.56,p=0.25,I2:33.26,p=0.213）中并无明显意义（I2=15.17,p=0.317）。结论:总体而言,文献分析关于EGF增强糖尿病溃疡愈合效果的共识更大,meta分析结果也支持使用表皮生长因子对治疗糖尿病足创面溃疡有效。然而,由于大多数生长因子的试验很少,并且可用的研究方法也不相同,因此其他生长因子治疗糖尿病足创面的有效性缺乏明确循证医学证据。
雷欣华[6]（2020）在《重组灵芝免疫调节蛋白多周期治疗白细胞减少症的试验研究及其与造血干细胞结合受体的鉴定》文中研究指明目的:在先前的研究中,发现重组灵芝免疫调节蛋白（recombinant Ganoderma lucidum immunoregulatory protein,rLZ-8）可促进小鼠骨髓造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）的自我更新,并促进其向髓系祖细胞（Common myeloid progenitor cells,CMPs）及粒系-巨噬系祖细胞（Granulocyte and macrophage progenitor cells,GMPs）等粒细胞前体细胞分化。同时通过调节趋化因子受体4-趋化因子基质细胞衍生因子-1轴（CXC chemokine receptor type 4-Stromal cell derived factor-1,CXCR4-SDF1）促进成熟中性粒细胞从骨髓池释放至外周循环,进而实现小鼠模型中环磷酰胺引起的中性粒细胞减少症的治疗。为进一步完善rLZ-8在此病症中的治疗效果和作用机制,参考临床治疗中以粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）和聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子（Peg G-CSF）为主要药物的用药方案,需要对多治疗周期条件下rLZ-8治疗效果的持续性及稳定性进行评测;同时,作为已经被美国FDA批准进行I期临床试验的测试物,在非人类灵长类动物模型中评估此蛋白在白细胞减少症治疗中对外周循环血液环境的作用将极具指导意义。此外,在已经确定了小鼠骨髓来源造血干细胞是rLZ-8主要的作用细胞后,筛选出其在细胞表面的结合受体对于完善rLZ-8在环磷酰胺引起的白细胞减少症治疗中的作用机制至关重要。方法:首先,设计并构建高表达rLZ-8的毕赤酵母工程菌株,完善rLZ-8的发酵和纯化工艺以获得高纯度的活性蛋白用于下游实验;随后,建立稳定的小鼠及食蟹猴白细胞减少症模型,在小鼠模型中,以Peg G-CSF和G-CSF为对照药物,测试rLZ-8在多周期给药中治疗的有效性和稳定性,在食蟹猴模型中测试rLZ-8皮下和尾静脉两种给药方式对外周循环血细胞稳态的影响,评估rLZ-8在非人类灵长类动物模型中的生白作用;最后,基于TriCEPS活细胞表面受体识别鉴定技术,在鼠源造血干细胞表面筛选与rLZ-8结合的受体并进行验证,以完善rLZ-8在环磷酰胺引起的白细胞减少症治疗中的作用机制。结果:第一部分研究中,首先设计并构建了rLZ-8高表达菌株,随后在中试水平发酵培养了该工程毕赤酵母菌株,同时通过基于阳离子交换色谱和凝胶色谱的精细纯化技术,获得了高纯度的重组灵芝免疫调节蛋白,为下游实验提供了性状稳定的高质量重组蛋白样品。第二部分研究中,首先构建了稳定的小鼠白细胞减少症模型及食蟹猴白细胞减少症模型,在小鼠模型测试了多周期治疗中rLZ-8对外周循环血细胞的作用,确认了中性粒细胞是主要的效应细胞,同时相比Peg G-CSF、G-CSF治疗组,rLZ-8的促粒细胞数目增长效果稳定平缓,具有明显的剂量相关性,达到了持续维系外周循环处于稳态的作用。随后,在食蟹猴模型中,确认了在非人类灵长类动物白细胞减少症模型中,通过皮下注射rLZ-8同样具有升高外周循环中性粒细胞的作用。第三部分研究中,首先确认了rLZ-8可以与TriCEPS进行偶联,并优化了偶联的条件;随后,应用免疫磁柱分离出纯度较高的造血干细胞,使用偶联后的TriCEPS-rLZ-8去捕获及富集细胞表面潜在的可与rLZ-8结合的蛋白,并通过蛋白质组学进行鉴定及相对定量,与对照组进行比较,得到与rLZ-8在鼠源造血干细胞表面结合的候选物;最后基于免疫荧光技术进行验证,认为CSF1R是rLZ-8的受体之一。结论:研究证明CSF1R为rLZ-8在鼠源造血干细胞表面结合的受体,多治疗周期内,rLZ-8在小鼠白细胞减少症模型的治疗中具有良好的持续性及稳定性,中性粒细胞是主要的效应细胞,同时对外周循环血小板具有一定的恢复作用,再次证明rLZ-8相比G-CSF类细胞因子作用在更原始的细胞上,骨髓细胞储备种类更丰富,可以应对多次环磷酰胺给药造模引起的骨髓抑制,同时在食蟹猴白细胞减少症模型中皮下进行rLZ-8给药具有促中性粒细胞生成的作用。目前尚未有报道同时具有抗肿瘤作用及维系血细胞稳态作用的蛋白质,rLZ-8在化学疗法诱发的白细胞/中性粒细胞减少症的治疗中,具有可能成为治疗/预防肿瘤治疗过程中中性粒细胞减少的治疗药物或补充剂,以及干细胞体外动员及扩增的佐剂。
高晓娟[7]（2020）在《采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学》文中认为单克隆抗体因其对靶点的高度选择性正在成为治疗癌症和自身免疫等疾病的首选药物。但是,由于单抗复杂的多结构域特点和大分子属性,使得其在应用上受到了一定的限制。纳米抗体是源自骆驼重链可变区的单域抗体,也是目前已知分子量最小且具有完全抗原结合能力的抗体片段,可作为单抗的理想替代。然而,由于纳米抗体分子小和缺乏Fc结构,体内半衰期过短,不能获得有效的体内治疗效果。因此,需要发展延长纳米抗体半衰期的策略,以改善其体内代谢特性。当前主要采用聚乙二醇化、融合Fc片段、与白蛋白结合以及靶向FcRn等策略延长小分子药物的血浆半衰期。但哪种方法对于延长纳米抗体的半衰期更有效,目前未见相关报道。因此,在本研究中,我们选择白蛋白结合域（ABD）和新生Fc受体结合域(ZFcRn),将其与我们前期获得的一株CD47特异的纳米抗体3D3-2进行融合,并在小鼠体内评价和比较了两种融合策略对改善纳米抗体半衰期的效果。本研究主要包括以下两部分:1.融合ABD和ZFcRn的重组CD47纳米抗体的制备和鉴定采用DNA重组技术,将合成的ABD和ZFcRn的DNA序列与纳米抗体3D3-2在羧基端通过一段连接子（G4S）3进行融合,并连接到表达载体上,构建重组质粒p ET22b-3D3-2-ABD和p ET22b-3D3-2-ZFcRn,转化大肠杆菌BL21（DE3）并进行IPTG诱导表达。表达的融合蛋白采用Ni离子亲和色谱柱纯化。结果显示,转化重组质粒的表达菌经过IPTG诱导后,在SDS-PAGE胶上显示明显的重组ABD和ZFcRn融合蛋白的表达,分子量大小分别为27 k Da和28 k Da,与预期相符。表达的纳米抗体经过亲和纯化后获得了纯度90%以上的纯化抗体,得率分别为5.5 mg/L和6.5 mg/L。Western blot显示其能与特异抗体结合。2.重组纳米抗体3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn的抗原结合及体内半衰期分析为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2与CD47抗原和血清白蛋白（SA）结合的影响,采用间接ELISA检测了3D3-2、3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn重组纳米抗体与人CD47、人血清白蛋白（HSA）以及鼠血清白蛋白（MSA）的结合,结果显示,三种纳米抗体与CD47之间均具有较高的特异结合活性,并具有明显的浓度依赖性。与3D3-2相比,融合后的3D3-2-ABD与3D3-2-ZFcRn与CD47的结合能力有一定降低,但不显着（p>0.05）。融合ABD结构域的纳米抗体获得了较强的与HSA和MSA特异结合能力,并具有明显的浓度依赖性。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体没有显示出与重组蛋白FcRn的结合活性。为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2延长血浆半衰期的作用效果,我们将三种重组纳米抗体对ICR小鼠进行单次尾静脉注射,在注射后的不同时间点采集血清样本,采用双抗体夹心ELISA法测定各个时间点血清中纳米抗体的浓度,并使用数据处理软件Graphpad prism 5绘制药时曲线并计算终末半衰期。结果显示,融合了ABD结构域的纳米抗体3D3-2-ABD比未融合的纳米抗体3D3-2血浆半衰期延长了约14倍,融合前后血浆半衰期分别为35.82 min和501.52min。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体3D3-2-ZFcRn血浆半衰期为71.65 min,与未融合抗体相比,效果不明显。另外值得注意的是,三种纳米抗体在对小鼠注射后7天都检测到了鼠抗纳米抗体的抗体反应,表明都具有免疫原性。总结以上结果,本研究通过融合ABD和ZFcRn结构域获得了两种新的重组CD47纳米抗体,融合ABD和ZFcRn不影响纳米抗体与CD47抗原的结合,而融合ABD后CD47纳米抗体可以与HSA和MSA特异结合。小鼠体内代谢实验表明,纳米抗体与ABD融合后可以显着提高其血浆半衰期。本研究结果为延长纳米抗体体内代谢提供了一种可行的策略,对改善纳米抗体药物的体内药效具有一定参考价值。
许小宇[8]（2020）在《FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究》文中研究表明一、FUS-ERG融合基因阳性AML的临床特征目的:回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的7173例AML患者,根据细胞遗传学和融合基因检测的不同结果,分析不同融合基因阳性AML患者的临床特征、细胞遗传学特点以及生存预后的差别。方法:1.完善苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的AML患者基本信息的采集,系统性分析全部AML患者临床及细胞遗传学特征。2.根据融合基因和细胞遗传学的检测结果,比较不同融合基因亚型AML患者的临床特点及差异。3.详细分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的临床、实验室分子以及预后生存特点。结果:1.7173例AML患者的细胞遗传学特点:正常核型患者3025人,占42.1%;染色体核型未检测或者检测结果丢失的患者占6.5%（463/7173）;2.4%（172/7173）的患者染色体核型分析结果显示未见细胞分裂相;49%（3156/7173）的患者染色体核型存在异常,其中 t（15;17）,t（8;21）,inv（16）,t（9;22）分别占 12.3%（884）,11.2%（809）,1.8%（129）,1.4%（103）。2.从2006年起对初诊AML患者进行融合基因检测,共有3984例患者纳入本研究,结果提示融合基因阴性的患者2492例,占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排分别占 12.6%（500）,13.2%（527）,5.0%（198）,1.8%（71）,3.8%（152）。其他少见类型的融合基因有 DEK-NUP214（17）,FUS-ERG（10）,NPM-MLF1（3）和AML1-MTG16（2）。我们对不同融合基因阳性AML患者的临床特征进行分析,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄相对较小,中位发病年龄为24.5岁（8-52岁）,与其他融合基因组年龄的差异存在统计学意义（p<0.001）,但是检测到的FUS-ERG融合基因阳性的病例数仅为10人,样本数少统计结果可能存在偏差。3.搜集到FUS-ERG融合基因阳性的患者共38例,其中34例为AML患者,占全部AML患者的0.47%（34/7173）,3例为急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）以及 1 例急性混合细胞白血病（Mixed-Phenotype Acute Leukemia,MPAL）。对AML患者进行了随访调查,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的早期死亡（6月内死亡）患者达到17.6%（6/34）,一疗程诱导缓解率（complete response,CR）为64.7%（22/34）;AML患者中有17例患者进行了造血干细胞移植治疗,发现造血干细胞移植组患者与单纯化疗组患者的总生存率和无事件生存率的存在统计学差异（p=0.0075,p=0.021）,移植组患者的预后相对较好;但是移植患者移植后的复发率达到41.2%（7/17）,复发患者的治疗效果极差。结论:1.苏州大学附属第一医院血液科AML患者的临床特征和细胞遗传学特点与国际上的报道相类似,染色体核型正常的患者约占42.1%;49%的AML患者染色体核型存在异常,其中 t（8;21）,t（15;17）,inv（16）,t（9;22）分别占 11.2%,12.3%,1.8%,1.4%。2.进行融合基因检测的3984例AML患者,结果提示融合基因阴性的患者占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排阳性分别占12.6%,13.2%,5.0%,1.8%,3.8%;其他少见类型如FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄较小,中位发病年龄24.5岁（8-52岁）,与其他融合基因阳性AML患者中位年龄的差异存在统计学意义（p<0.001）。3.0.47%的AML患者可检测到FUS-ERG融合基因,但是FUS-ERG融合基因阳性的患者一共38例,其中34例AML,1例MPAL和3例ALL。在AML患者中,患者早期死亡患者达到17.6%;17患者进行造血干细胞移植治疗,移植患者的复发率达到41.2%（7/17）,此类患者的生存预后极差。二、FUS-ERG融合基因阳性患者的分子特征目的:通过全外显子测序技术（Whole exon sequencing technology,WES）,全转录组测序（Whole transcriptome sequencing technology,RNA-sequencing）及二代测序技术（next generation sequencing technology,NGS）揭示 FUS-ERG 融合基因阳性 AML 患者的分子生物学特征,并初步探讨其可能的致病机制。方法:1.回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断的AML患者的细胞遗传学和分子生物学数据,筛选FUS-ERG融合基因阳性AML患者为研究对象,搜集FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA或者RNA标本。2.通过WES对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,寻找共同伴随基因突变特征。3.通过RNA-sequencing对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的RNA标本进行基因表达和融合基因的检测,分析FUS基因和ERG基因断裂融合方式,以正常核型和其他类型AML患者作为对照,分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的基因表达特征及与其他类型AML患者的基因表达差异,寻找FUS-ERG融合基因可能的致病机制。4.采用包含51个血液肿瘤相关基因的靶向NGS,对13例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,进一步揭示其基因突变特征。结果:1.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行全外显子测序,分析测序结果显示:出现6次以上的重现性突变基因有RPL14、MUC4、LNP1、CAMKK2、FADS6、NBPF14,未检测到常见的 AML 基因突变。2.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞RNA标本进行RNA-sequencing检测,分析这组病人和正常核型急性髓系白血病患者基因表达差异,FUS-ERG融合基因阳性AML患者显着上调的通路有肿瘤信号转导通路、PI3K-Akt信号转导通路以及Rap1超RAS信号转导通路;通过和其他类型的AML患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异信号通路是主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。3.搜集到13例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行靶向NGS测序,一共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多,频率为30.8%（4/13）,其次是WT1突变,推测PTPN11突变可能对疾病的发生进展起到重要的作用。结论:通过和其他类型的急性髓系白血病患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异的通路主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。血液肿瘤相关基因的二代靶基因深度测序共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多（4/13）,推测PTPN11激活性突变可能对疾病的进展起重要作用。三、FUS-ERG融合基因的致白血病机制研究目的:应用体外和体内实验模型,阐述FUS-ERG融合基因的致白血病机制。方法:1.构建FUS-ERG融合基因过表达慢病毒质粒载体,三质粒系统包装慢病毒,分别在HL-60以及32D细胞株中稳定过表达,探究FUS-ERG融合基因在体外细胞株中对细胞增殖、凋亡以及分化的作用。2.构建逆转录病毒表达载体,转染人脐血CD34阳性的细胞,流式分选CD34+GFP+细胞,进行原代细胞克隆形成和液体培养髓系诱导分化实验,观察克隆数目和类别的差异,以及其对原代细胞分化能力的影响。3.构建慢病毒过表达载体,将PTPN11-WT、PTPN11-D61V、PTPN11-E76K突变体分别在32D-Venus与32D-FUS-ERG细胞中过表达,研究PTPN11-WT及突变体对细胞增殖和分化能力的作用。4.构建慢病毒过表达载体,转染Balb/c小鼠骨髓CD117阳性细胞,胫骨原位移植到同种Balb/c小鼠骨髓内,观察移植后小鼠的发病情况。5.构建Vav-1为启动子的FUS-ERG融合基因敲入小鼠模型,观察小鼠的发病情况。结果:1.成功构建FUS-ERG融合基因慢病毒表达载体,感染人白血病细胞株,研究结果显示FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖增多和凋亡减少,亦可以引起32D细胞分化阻滞。2.成功分选脐血中CD34阳性细胞,感染逆转录病毒,研究结果显示FUS-ERG融合基因可引起脐血细胞克隆形成能力增加,多潜能集落形成单位比例增加,髓系成熟分化阻滞,流式细胞学检测细胞阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.在体外,FUS-ERG融合基因可协同PTPN11激活性突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力显着增加以及髓系成熟分化阻滞,促使下游基因HIF-1a、IKKa、Casp9 基因的下调。4.在小鼠骨髓移植模型体内实验中,检测移植后小鼠的生存情况,结果显示FUS-ERG融合基因移植小鼠全部死亡,载体对照组小鼠仅死亡一只,两组小鼠总生存率存在显着的统计学差异（p=0.075）。小鼠进行流式细胞学以及病理切片HE染色观察,结果显示单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生骨髓原始细胞增多,同时表达CD3和/或ter1 19的阳性细胞,发病形式不统一,此和临床上FUS-ERG融合基因的疾病发生类型相似。结论:1.FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖能力增加,细胞凋亡减少;亦可以引起32D细胞髓系成熟分化阻滞。2.FUS-ERG融合基因引起脐血细胞克隆形成能力增加,髓系成熟分化阻滞,分化阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.FUS-ERG融合基因协同PTPN11突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力增加和髓系分化阻滞,下游HIF-1a、IKKa、Casp9基因下调。4.单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生类型多样,此结果和临床上FUS-ERG融合基因的发生白血病的类型相似。
夏文庆[9]（2020）在《骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究》文中指出研究背景近年来随着心血管病患病率的持续上升,冠心病、肺心病、心力衰竭等疾病对居民生活的影响不容小觑,心血管病相关的心肌纤维化、心室重塑等改变也越来越被临床研究所重视,且不仅在心脏疾病中,糖尿病人群也会出现血糖相关的心肌纤维化。心肌纤维化的病理生理改变是细胞外基质成分在心肌间质中过量沉积,导致心室壁弹性减弱,收缩及舒张功能受损,最终引起心力衰竭。细胞外基质沉积包括胶原增生、成纤维细胞大量增殖两方面,在心血管疾病的晚期,异常增生的胶原纤维相互交联,加重心肌纤维化。因此,预防心肌纤维化和减缓其进展,在慢性心脏疾病的治疗中具有重要的临床意义。心肌纤维化的机制错综复杂,相互影响,在对心肌纤维化信号通路的研究中发现,TGF-β是促纤维化过程中最重要的分子,被认为是心肌梗死后,组织由炎症反应向瘢痕组织转变的开关,其通过Smad蛋白依赖通路和非Smad蛋白依赖通路,刺激细胞因子和信号通路,进而影响胶原纤维等成分改变。TGF-β家族中,研究最多的是TGF-β。TGF-β是一个多效因子,其生理功能即使在同样的细胞里也有可能不同,甚至相反。目前发现哺乳动物中TGF-β有3种亚型,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,3种亚型在体内具有不同的功能。TGF-β和TGF-βR结合后,可激活下游的信号分子级联反应,参与分化、凋亡、炎症反应等过程。在TGF-β信号通路中,以Smad蛋白依赖的经典通路为主,活化的TGFβR与R-Smad蛋白结合,最终移位到细胞核内,调控靶向基因的转录过程。除此以外,不依赖Smad蛋白的信号通路在TGF-β反应中也有重要的作用,目前已发现的非经典信号通路有ERK-MAPK信号通路、TAK1介导的JNK/p38MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路等,这些信号通路通过与活化的TGF-β受体结合后级联调控,参与TGF-β介导的上皮间质转换、凋亡、纤维化等过程。除了介导信号通路,TGF-β还通过与其他的细胞因子互相作用,参与促纤维化的过程。因此,作为心肌纤维化中的主要因子,对抗TGF-β及其介导的信号通路无疑成为防范心肌纤维化进展的重要靶点。丝裂原活化蛋白激酶MAPK介导的p38MAPK信号通路在早期即发现有促进胶原纤维合成的作用,经典的MAPK是一个三级级联磷酸化过程,活化的TGF-βR激活TAK1,即MAP3K后,下游的MKKs、p38被依次磷酸化激活,调控Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。粒细胞集落刺激因子G-CSF是一种有效的干细胞动员剂,通过募集血液中的骨髓干细胞,并动员到心肌坏死部位后,分化为血管内皮细胞,促进血管再生,减少凋亡细胞表达,在急性心梗、心力衰竭方面发挥保护心脏的作用。G-CSF动员干细胞治疗心梗后心肌纤维化的机制目前主要集中于Smad依赖的信号通路,而对于非Smad依赖通路是否有调控作用目前尚不清楚。研究目的以Wistar大鼠为研究对象,异丙肾上腺素Iso构建心肌纤维化模型后,给予G-CSF皮下注射,观察动员治疗对大鼠心肌纤维化的影响。检测心肌组织中TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达情况,探讨G-CSF对抗心肌纤维化的可能机制,为干细胞动员在临床上的应用提供科学依据。研究方法1.22只Wistar大鼠标号,每日固定时间背部皮下注射Iso4mg/kg-1.d-1,连续10天,构建心肌纤维化模型;2.20只大鼠随机分为对照组（control group）和动员组（GT group）,G-CSF用生理盐水稀释后,动员组背部皮下注射G-CSF 50μg/kg-1.d-1,连续5天,对照组皮下注射生理盐水,末次给药结束后正常喂养4周;3.动员前及动员后第5天,尾静脉采血稀释后用血细胞计数仪检测外周血白细胞个数;4.动员第5天,大鼠尾静脉采血后,使用密度梯度离心法低温高速离心,吸取单个核细胞层后,用于细胞培养以及细胞的流式鉴定;5.大鼠取材前一天行心脏超声,了解心脏功能;6.所有大鼠麻醉后,腹主动脉采血后静置,高速离心后取上层血清分装,用于Elisa检测BNP含量;7.大鼠心脏在最大横径下方约2mm处横切,上半部分置于多聚甲醛中固定,下半部分剪去右心室及室间隔部分,置于冻存管内液氮冻存;8.心肌组织在固定24h后,用于HE染色、Masson染色以及免疫组织检测;9.Western Blot 检测心肌组织中 ColI、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达。实验结果1.Iso诱导大鼠心肌纤维化改变Iso连续皮下注射10天后,心肌组织HE染色显示,正常大鼠心肌结构整齐无异常胶原增生,注射Iso的大鼠心肌细胞结构错乱,间质胶原纤维大量增生,成纤维化改变。2.外周血粒细胞检测和鉴定G-CSF能动员骨髓中的造血干细胞和骨髓干细胞,因此可通过计数外周血白细胞WBC的数量,了解骨髓动员的情况。根据WBC计数结果,GT组在动员治疗前后,外周血粒细胞数量明显升高,组内比较有显着性差异（P<0.01）;动员第5天后,GT组的粒细胞计数较对照组相比也明显升高,组间有显着差异（P<0.01）;而对照组在动员前后,外周血粒细胞计数无明显变化。对动员第5天的外周血分离培养后,行流式细胞检测结果显示:外周血粒细胞表面标志CD29、CD90强阳性,CD45阴性,符合骨髓干细胞表面抗原表达的特点,由此证明粒细胞刺激因子动员后,外周血中的单个核细胞主要是骨髓干细胞。3.血清Elisa检测BNP含量动员治疗后,大鼠血清BNP的含量在GT组低于对照组,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。4.心肌病理学形态检测Masson染色显示与对照组相比,GT组心肌间质的胶原沉积程度显着减轻;使用Image-pro软件测量并计算胶原容积分数CVF值,GT组CVF值低于对照组,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。5.心肌III型胶原纤维表达情况心肌组织免疫组化结果显示:对照组心内膜下可见明显阳性表达,Ⅲ型胶原蛋白在间质内弥漫性增生;GT组阳性表达减少,胶原蛋白沉积减轻。6.Western Blot 检测心肌组织 Col I、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达与对照组相比,GT组的I型胶原蛋白表达减少,纤维化程度减轻;TGF-β、TAK1蛋白以及MKK3、p38MAPK蛋白表达下降,用Image-pro软件对两组蛋白条带进行测量后显示,两组间蛋白表达差异P<0.05,差异具有统计学意义。实验结论1.Wistar大鼠皮下注射Iso 4mg/kg-1.d-1,连续10天,大鼠心肌组织能观察到明显的纤维化改变,该建模方式稳定,且动物存活率高。2.心肌纤维化的大鼠在G-CSF动员治疗后,外周血的干细胞数量明显升高,并且升高的细胞以骨髓干细胞为主。3.G-CSF动员治疗可以改善心肌纤维化大鼠的心脏功能,并且减少间质的胶原纤维沉积,减轻心肌纤维化的程度。4.通过检测心肌组织的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达发现,GT组的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达减少,初步证实G-CSF动员干细胞对抗心肌纤维化的机制是通过抑制TGF-β介导的TAK1-MKK3-p38MAPK 通路实现的。
吕萃[10]（2020）在《多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究》文中指出从多能干细胞诱导分化出可移植、有功能的血液及免疫细胞一直是再生医学领域的研究热点和难点。本文第一部分证明小鼠胚胎干细胞分化来源、体内成熟的T细胞可以结合CAR-T技术改造实现体内清除肿瘤的目的,第二部分初步实现诱导小鼠胚胎干细胞获得可移植的髓系祖细胞种子,移植后可在体内短期再生髓系细胞（包括粒细胞、单核-巨噬细胞）。本研究为再生T细胞以及可移植髓系细胞的转化研究提供了技术借鉴。嵌合抗原受体 T 细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells,CAR-T）疗法已成为临床上治疗血液肿瘤的有效手段。通常CAR-T细胞是通过分离患者外周血来源的T细胞在体外进行基因编辑而制备,但是患者自身的T细胞数量有限且经常出现功能异常或耗竭,因此需要探索T细胞新的来源。本研究基于课题组已开发的定向诱导T细胞技术,利用Runx1-Hoxa9条件性表达的多能干细胞系诱导分化出可植入免疫缺陷鼠（B-NDG）的造血祖细胞（induced hematopoietic progenitorcells,iHPCs）,移植B-NDG小鼠5周后,从脾脏中分离出再生的T细胞（induced T cells,iT）,通过将iT细胞感染CD19-CAR逆转录病毒制备CD19-CAR iT细胞。为了验证CD19-CAR iT细胞在体内针对B淋巴瘤细胞的杀伤功能,本研究首先通过移植表达荧光素酶（luciferase）的B淋巴瘤细胞（Ka539-luciferase）构建了基于C57BL/6的肿瘤负荷鼠模型,随后分别将CD19-CAR iT细胞和Ctrl-CARiT细胞（阴性对照）过继移植到肿瘤模型中,流式检测发现CD19-CAR iT细胞可以持久抑制外周血中CD19+B细胞的产生,这表明了其具有针对特异抗原的直接杀伤能力。同时小鼠活体成像实验证实CD19-CAR iT细胞可以有效缓解肿瘤模型鼠的肿瘤负荷,并且相比于对照组,经过CD19-CAR iT细胞治疗的肿瘤鼠能够显着延长生存时间（>70天）。其次,CD19-CAR iT细胞在体内接受到CD19抗原刺激后能够快速增殖,并且可被大量激活（CD44+CD62L-）,从侧面印证了 CD19-CARiT细胞功能的有效性。以上结果说明CD19-CAR iT细胞可以有效清除B淋巴瘤细胞,也验证了由多能干细胞诱导再生的iT细胞可以用于制备CAR-T细胞,这为T细胞疗法的新细胞来源提供了技术参考。与此同时,髓系细胞,特别是粒细胞和单核-巨噬细胞,是天然免疫系统重要成员,在吞噬、杀菌和抗病原体感染中发挥关键作用。因此,再生有功能的髓系细胞对移植和化疗后的抗感染治疗具有重要的临床意义。本研究发现,Runx1-Hoxa10二因子条件性诱导表达的mES细胞系（iR10 mESCs细胞系）可诱导分化获得可移植的造血细胞种子,移植后体内再生出髓系细胞,包括粒细胞和单核-巨噬细胞。具体而言,首先通过形成拟胚体（Embryoid bodies,EBs）的方式模拟胚胎发育早期阶段,随后通过诱导Runx1和Hoxa10的表达和添加特定造血细胞因子进行培养获得诱导型生血内皮细胞（iHECs,CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi）。生成的iHECs再和OP9-DL1基质细胞共培养获得诱导型造血祖细胞（induced hematopoietic progenitor cells,iHPCs）,这些 iHPCs 植入半致死辐照后的Rag1-/-小鼠后成功再生髓系细胞（CD11b+）。PCR测序结果证明体内再生的髓系细胞确实插入了目的基因Runx1和Hoxa10。此外,在骨髓和脾脏组织中均检测到再生的髓系细胞,包括粒细胞（CD11b+Gr1+）、单核细胞（CD11b+Gr1-F4/80-）和巨噬细胞（CD11b+F4/80+）。最后,iHPCs在移植入半致死辐照后的野生型受体鼠后也成功再生髓系细胞。结合再生髓系细胞的功能实验结果,本研究将为再生人髓系细胞提供技术参考,也有望为临床上抗感染细胞疗法等提供新的细胞来源。
二、重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析（论文提纲范文）
（1）基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胸腺肽的研究进展 |
| 1.1.1 胸腺肽概述 |
| 1.1.2 胸腺肽作用研究 |
| 1.2 免疫系统的研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统的组成 |
| 1.2.2 免疫系统的功能 |
| 1.2.3 免疫系统影响因素 |
| 1.2.4 免疫系统与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2.5 造血与免疫系统 |
| 1.3 免疫治疗在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.3.2 免疫治疗在结直肠癌治疗中的应用 |
| 1.4 化疗引起的造血功能障碍研究进展 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 第2章 小牛胸腺肽成分分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CTP分子量测定 |
| 2.3.2 CTP中氨基酸含量的测定 |
| 2.3.3 CTP中核苷酸含量的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 分子量测定结果 |
| 2.4.2 氨基酸含量测定结果 |
| 2.4.3 核苷酸含量测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂盒和抗体信息 |
| 3.2.4 实验细胞及动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫低下小鼠模型的构建及分组给药 |
| 3.3.2 小鼠样品采集及脏器指数检测 |
| 3.3.3 NK细胞杀伤活性及淋巴细胞转化活性 |
| 3.3.4 小鼠肝脏、脾脏、肾脏病理学检测 |
| 3.3.5 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.6 APC小鼠分组给药 |
| 3.3.7 小鼠样品采集及脏器指数、肠道指数检测 |
| 3.3.8 小鼠外周血有核细胞制备、染色及流式测定 |
| 3.3.9 小鼠肠道菌群检测及分析 |
| 3.3.10 小鼠结直肠及脏器组织病理学检查 |
| 3.3.11 小鼠脾脏和肿瘤组织中相关蛋白免疫组化检测 |
| 3.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.13 Western blot分析 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CTP对免疫低下小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 CTP对免疫低下小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.4.3 CTP对免疫低下小鼠淋巴细胞转化活性的影响 |
| 3.4.4 CTP对免疫低下小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.5 CTP对免疫低下小鼠免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.6 CTP对 APC小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.7 CTP对 APC小鼠结直肠肿瘤和肠道指数的影响 |
| 3.4.8 CTP对 APC小鼠肿瘤组织病理学的影响 |
| 3.4.9 CTP对 APC小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.10 CTP对 APC小鼠外周血中免疫细胞的影响 |
| 3.4.11 CTP对 APC小鼠脾脏和结直肠肿瘤中免疫相关蛋白的影响 |
| 3.4.12 CTP对 APC小鼠血清和结肠中免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.13 CTP对 APC小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 3.4.14 小鼠肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 3.4.15 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 |
| 3.4.16 小鼠肠道菌群差异性分析 |
| 3.4.17 CTP对 APC小鼠肿瘤组织和脾脏中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小牛胸腺肽促造血功能活性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂盒及抗体信息 |
| 4.2.4 实验细胞及动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 K562 细胞和CHRF细胞的铺板及CTP给药 |
| 4.3.2 细胞活性检测 |
| 4.3.3 细胞凋亡检测 |
| 4.3.4 K562 细胞联苯胺染色 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 造血功能障碍小鼠模型的构建及CTP给药 |
| 4.3.7 样品采集及脏器指数检测 |
| 4.3.8 外周血细胞计数 |
| 4.3.9 小鼠骨髓有核细胞制备,染色及流式细胞术测定 |
| 4.3.10 小鼠骨髓及脏器组织病理学检测 |
| 4.3.11 蛋白质组学分析筛选细胞因子 |
| 4.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 4.3.13 Western blot分析 |
| 4.3.14 小鼠骨髓有核细胞制备及给药 |
| 4.3.15 Western blot分析 |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞活性的影响 |
| 4.4.2 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 CTP对K562 细胞分化能力的影响 |
| 4.4.4 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞增殖分化相关蛋白的影响 |
| 4.4.5 CTP对造血功能障碍小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.6 CTP对造血功能障碍小鼠外周血细胞的影响 |
| 4.4.7 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓细胞的影响 |
| 4.4.8 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓和脏器组织病理学的影响 |
| 4.4.9 CTP对造血功能障碍小鼠细胞因子的影响 |
| 4.4.10 CTP对造血功能障碍小鼠脾脏中相关通路蛋白的影响 |
| 4.4.11 CTP对小鼠原代骨髓细胞中相关通路蛋白的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的药代动力学及安全性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 急性白血病流行病学和治疗现状 |
| 1.1 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.2 急性髓细胞白血病 |
| 2 血液恶性肿瘤患者中性粒细胞减少症的管理 |
| 3 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的作用机制及优势 |
| 4 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子群体药代动力学和安全性研究的必要性 |
| 第二章 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的临床研究总体设计 |
| 1 研究设计 |
| 2 研究目的 |
| 2.1 主要研究目的 |
| 2.2 次要研究目的 |
| 3 纳入标准和排除标准 |
| 3.1 纳入标准 |
| 3.2 排除标准 |
| 4 给药方案 |
| 5 研究过程 |
| 5.1 基线期 |
| 5.2 用药期间访视 |
| 5.3 研究结束后随访 |
| 6 入组患者脱落 |
| 6.1 入组患者中止/退出研究 |
| 6.2 入组患者失访 |
| 6.3 对脱落的入组患者的处理 |
| 7 统计学方法 |
| 第三章 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的群体药代动力学研究 |
| 1 研究方法 |
| 1.1 样本采集 |
| 1.2 信息收集 |
| 1.3 终点指标 |
| 2 实验材料与仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 3 血药浓度的测定 |
| 3.1 试剂准备 |
| 3.2 测定过程 |
| 3.3 结果计算与分析 |
| 4 群体药代动力学模型的建立 |
| 4.1 数据前处理 |
| 4.2 群体药代动力学分析 |
| 第四章 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的安全性研究 |
| 1 不良事件 |
| 1.1 术语及定义 |
| 1.2 严重程度的判断标准 |
| 1.3 关联性评价 |
| 2 肾毒性和肝毒性的主动监测 |
| 2.1 肾毒性标准 |
| 2.2 肝毒性标准 |
| 3 安全性人群 |
| 4 不良事件的处理 |
| 4.1 不良事件的收集 |
| 4.2 不良事件的随访 |
| 4.3 不良事件的报告 |
| 第五章 结果与讨论 |
| 1 研究人群 |
| 2 血药浓度 |
| 2.1 标准曲线及定量范围 |
| 2.2 血浆中PEG-rhG-CSF浓度-时间曲线 |
| 3 群体药代动力学分析 |
| 3.1 房室模型的选择 |
| 3.2 模型变异性的描述 |
| 3.3 协变量分析 |
| 3.4 模型验证 |
| 4 安全性分析 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 全文结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）PEG-rhG-CSF与rhG-CSF对预防骨肉瘤患者化疗中性粒细胞减少的临床疗效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 资料和研究方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 材料及方法 |
| 3 观察指标 |
| 4 统计学方法 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 PEG-rhG-CSF 与 rhG-CSF 在骨肉瘤患者化疗后预防中性粒细胞减少的临床应用 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（4）生白方防治结直肠癌化疗后白细胞减少症的临床观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 Chinese and English abbreviations list |
| 前言 |
| 第一部分 临床研究 |
| 1 研究资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 观察指标 |
| 4 统计分析方法 |
| 第二部分 研究结果 |
| 1 基线资料比较 |
| 2 主要指标比较 |
| 3 次要指标比较 |
| 第三部分 研究讨论 |
| 1 化疗后白细胞减少症的现代医学研究 |
| 2 中医学对化疗后白细胞减少的病因病机认识 |
| 3 中医学对化疗后白细胞减少的治疗 |
| 4 生白方配伍特点、单味药药理研究及临床疗效分析 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 恶性肿瘤化疗后骨髓抑制中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）局部外用表皮生长因子促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 第一部分:表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 1.资料与方法 |
| 结果 |
| 2.1 参与者的基本信息和组间差异的比较 |
| 2.2 各组伤口愈合效果比较 |
| 2.3 各组新肉芽组织生长率比较 |
| 2.4 两组患者的细菌培养结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分:表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子治疗糖尿病足创面的临床研究 |
| 引言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验对象 |
| 1.3 治疗分组 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 描述性统计 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分:表皮生长因子等多种生长因子在糖尿病足溃疡管理中的作用:临床试验的系统评价和荟萃分析 |
| 1 引言 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 搜索策略 |
| 2.2 学习程序 |
| 2.3 数据综合与分析 |
| 2.4 偏见风险及出版偏差 |
| 2.5 敏感性分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 血小板源性生长因子 |
| 3.2 表皮生长因子 |
| 3.3 成纤维生长因子 |
| 3.4 其他生长因子 |
| 3.5 不良事件与质量评估 |
| 3.6 表皮生长因子meta分析的研究项目选择 |
| 3.7 meta分析纳入研究的特征 |
| 3.8 rhEGF与安慰剂的完全治愈率对比 |
| 3.9 证据质量与偏见风险评估 |
| 3.10 出版偏差与敏感性分析 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 关于生长因子及细胞因子在糖尿病足临床治疗应用的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）重组灵芝免疫调节蛋白多周期治疗白细胞减少症的试验研究及其与造血干细胞结合受体的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 重组灵芝免疫调节蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 灵芝免疫调节蛋白简介 |
| 1.1.2 重组灵芝免疫调节蛋白的免疫调节功能及作用机制 |
| 1.1.3 重组灵芝免疫调节蛋白的肿瘤杀伤功能及作用机制 |
| 1.1.3.1 重组灵芝免疫调节蛋白对肝细胞癌进展的影响 |
| 1.1.3.2 重组灵芝免疫调节蛋白对肺细胞癌进展的影响 |
| 1.2 化疗引起的白细胞减少症为代表的骨髓抑制的治疗 |
| 1.2.1 白细胞减少症简介 |
| 1.2.2 白细胞减少症的临床治疗 |
| 1.2.3 G-CSF和 GM-CSF与粒细胞增殖相关信号通路及作用机制 |
| 1.3 活细胞表面与蛋白相互作用受体的捕获与鉴定 |
| 1.3.1 配体-受体相互作用的鉴定具有特殊的生物学和药学重要性 |
| 1.3.2 Tri CEPS技术用于识别和鉴定活细胞/组织上与配体结合的受体 |
| 1.3.3 M-CSF与 M-CSFR的相互作用对骨髓造血功能的影响 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 重组灵芝免疫调节蛋白的表达和纯化 |
| 2.1 重组灵芝免疫调节蛋白毕赤酵母表达菌株构建 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 菌株和表达载体 |
| 2.1.1.2 实验试剂 |
| 2.1.1.3 实验仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 LZ-8密码子优化与基因合成 |
| 2.1.2.2 p GAPZαA-rLZ-8 表达载体构建 |
| 2.1.2.3 rLZ-8毕赤酵母表达菌株构建 |
| 2.1.2.4 重组毕赤酵母菌株鉴定 |
| 2.1.2.5 菌种保存与摇瓶小量表达 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.3.1 pGAPZαA-rLZ-8 表达载体构建 |
| 2.1.3.2 X-33毕赤酵母表达菌株构建 |
| 2.2 重组灵芝免疫调节蛋白的中试发酵及产物纯化 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 实验试剂 |
| 2.2.1.2 实验设备 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 rLZ-8酵母工程菌株中试水平的表达 |
| 2.2.2.2 rLZ-8蛋白的精细纯化 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.3.1 经中试发酵生产获得表达量较高的重组蛋白 |
| 2.2.3.2 经精细纯化获得纯度较高的重组蛋白 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 重组灵芝免疫调节蛋白表达系统的选择 |
| 2.3.2 重组灵芝免疫调节蛋白纯化策略 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 rLZ-8在白细胞减少症动物模型中的治疗作用 |
| 3.1 rLZ-8在小鼠模型中对白细胞减少症的治疗 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 实验动物 |
| 3.1.1.2 实验试剂 |
| 3.1.1.3 实验仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 小鼠白细胞减少症模型的建立 |
| 3.1.2.2 小鼠白细胞减少症的治疗方案 |
| 3.1.2.3 血液分析方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.3.1 单次腹腔注射高剂量环磷酰胺可以建立稳定的白细胞减少症小鼠模型 |
| 3.1.3.2 皮下进行rLZ-8给药在白细胞减少症小鼠模型中有升高外周血白细胞的作用 |
| 3.1.3.3 多治疗周期中rLZ-8可以稳定、持续的促进白细胞减少症小鼠外周血白细胞的恢复 |
| 3.1.3.4 中性粒细胞是rLZ-8作用下模型小鼠外周血主要响应群体 |
| 3.1.3.5 rLZ-8可以促进白细胞减少症小鼠骨髓中性粒细胞的恢复 |
| 3.1.3.6 rLZ-8可以促进白细胞减少症小鼠外周血血小板的恢复 |
| 3.1.3.7 多次造模治疗过程中rLZ-8治疗组小鼠死亡个体数目低 |
| 3.2 rLZ-8在食蟹猴体内对白细胞减少症的治疗 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 实验动物 |
| 3.2.1.2 实验试剂 |
| 3.2.1.3 实验仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 给药途径及给药剂量 |
| 3.2.2.2 观察时间及检测指标 |
| 3.3.2.3 临床检验 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.2.3.1 食蟹猴体重在实验过程中处于稳定状态 |
| 3.2.3.2 血细胞分析证明rLZ-8皮下给药会增加白细胞减少症食蟹猴模型动物外周血中性粒细胞和血小板的数目 |
| 3.2.3.3 细胞群占比分析证明中性粒细胞是rLZ-8作用下白细胞减少症食蟹猴模型动物的主要响应细胞,对淋巴细胞影响不显着 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 rLZ-8与鼠源造血干细胞表面受体的捕获与鉴定 |
| 4.1 小鼠骨髓造血干细胞提取及鉴定 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 实验试剂 |
| 4.1.1.2 实验仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 小鼠骨髓造血干细胞的提取 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.1.3.1 磁珠分选富集获得了高纯度的造血干细胞 |
| 4.2 造血干细胞活细胞表面与rLZ-8结合的受体捕获及验证 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 细胞 |
| 4.2.1.2 实验试剂 |
| 4.2.1.3 实验仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 活细胞表面受体捕获流程概述 |
| 4.2.2.2 rLZ-8与TriCEPS结合条件筛选方案 |
| 4.2.2.3 受体筛选策略 |
| 4.2.2.4 CSF1R为 rLZ-8 造血干细胞表面受体的验证 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.2.3.1 rLZ-8与TriCEPS可实现有效偶联 |
| 4.2.3.2 室温、20μg/mL rLZ-8_TriCEPS与造血干细胞孵育30 min可实现高效的受体捕获 |
| 4.2.3.3 应用TriCEPS技术在鼠源造血干细胞表面捕获的可与rLZ-8相互作用的蛋白候选物 |
| 4.2.3.4 OMX免疫荧光成像鉴定CSF1R为小鼠骨髓造血干细胞表面rLZ-8的结合受体之一 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 延长小分子蛋白药物体内代谢策略的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 影响小分子蛋白药物半衰期的因素 |
| 3 延长小分子蛋白药物半衰期的策略 |
| 3.1 增加蛋白质流体动力学半径 |
| 3.2 FcRn介导的再循环 |
| 4.本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 重组抗CD47纳米抗体的制备和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种及质粒 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.2 重组抗体的小量诱导表达及鉴定 |
| 2.3 重组抗体的纯化及鉴定(以 3D3-2-ABD 为例) |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体的构建 |
| 3.2 重组纳米抗体的表达及鉴定 |
| 3.3 重组纳米抗体的大量诱导表达及纯化和鉴定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组抗CD47纳米抗体的抗原结合活性检测及半衰期测定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组纳米抗体的体外活性检测 |
| 2.2 重组纳米抗体的体内血浆半衰期检测 |
| 2.3 重组纳米抗体的免疫原性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组纳米抗体体外活性检测 |
| 3.2 重组纳米抗体的体内血浆半衰期检测 |
| 3.3 重组纳米抗体的免疫原性检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FUS-ERG融合基因阳性AML的临床特征 |
| 引言 |
| 病例资料 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征 |
| 引言 |
| 病例资料 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 FUS-ERG融合基因的致白血病机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 FUS-ERG融合基因阳性的急性髓系白血病病例报告及文献复习 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（9）骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Iso诱导大鼠心肌纤维化改变 |
| 3.2 外周血粒细胞的检测和鉴定 |
| 3.3 G-CSF动员改善心肌纤维化大鼠的心功能 |
| 3.4 G-CSF动员后大鼠心肌病理形态分析 |
| 3.5 心肌免疫组化检测Ⅲ型胶原纤维 |
| 3.6 心肌Ⅰ型胶原纤维蛋白表达 |
| 3.7 G-CSF动员对TGF-β/TAK1/MKK3/p38MAPK通路蛋白的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 多能干细胞分化再生的T细胞体内抗肿瘤评估 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 癌症细胞免疫疗法概述 |
| 1.1.2 CAR-T细胞免疫疗法概述 |
| 1.1.3 再生T细胞的研究进展 |
| 1.2 实验材料和实验方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 实验试剂 |
| 1.2.3 实验器材 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 iR9 mESCs体外定向分化获得造血祖细胞iHPCs |
| 1.3.2 iR9 mESCs来源的iHPCs移植免疫缺陷鼠再生T淋巴细胞 |
| 1.3.3 CD19-CAR iT细胞体内肿瘤杀伤功能验证策略 |
| 1.3.4 CD19-CAR iT可有效清除肿瘤模型鼠外周血中的B淋巴细胞 |
| 1.3.5 CD19-CAR iT可有效消除肿瘤模型鼠的肿瘤负荷 |
| 1.3.6 CD19-CAR iT可有效延长肿瘤模型鼠的生存期 |
| 1.3.7 CD19-CAR iT细胞在小鼠体内显示出增殖和激活能力 |
| 1.4 总结和讨论 |
| 第2章 多能干细胞再生可移植髓系细胞研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 髓系细胞的发育和调控 |
| 2.1.2 再生髓系细胞的现状和进展 |
| 2.1.3 髓系细胞再生新思路 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验器材 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 iRunx1-P2A-Hoxa10-EGFP mES打靶细胞系(iR10 mESCs)构建成功 |
| 2.3.2 iR10 mESCs体外诱导分化生成造血祖细胞 |
| 2.3.3 基质细胞OP9-DL1较MS5-DL1更能促进造血祖细胞产生 |
| 2.3.4 iR10 mESCs来源iHPCs移植Rag1~(-/-)小鼠能够再生髓系细胞 |
| 2.3.5 受体鼠各组织中能检测到再生髓系细胞 |
| 2.3.6 受体鼠骨髓中检测到再生的髓系祖细胞 |
| 2.3.7 iR10 mESCs来源髓系细胞在体内短期存在 |
| 2.3.8 野生型受体鼠体内再生髓系细胞 |
| 2.4 总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析（论文参考文献）
- [1]基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究[D]. 李兰洲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子在急性白血病患儿中的药代动力学及安全性研究[D]. 刘茜婷. 山东大学, 2021(12)
- [3]PEG-rhG-CSF与rhG-CSF对预防骨肉瘤患者化疗中性粒细胞减少的临床疗效研究[D]. 李登科. 新疆医科大学, 2021(10)
- [4]生白方防治结直肠癌化疗后白细胞减少症的临床观察[D]. 葛韵. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [5]局部外用表皮生长因子促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究[D]. 张开华. 南昌大学, 2020(01)
- [6]重组灵芝免疫调节蛋白多周期治疗白细胞减少症的试验研究及其与造血干细胞结合受体的鉴定[D]. 雷欣华. 吉林大学, 2020(01)
- [7]采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学[D]. 高晓娟. 新疆大学, 2020(07)
- [8]FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究[D]. 许小宇. 苏州大学, 2020(06)
- [9]骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究[D]. 夏文庆. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究[D]. 吕萃. 中国科学技术大学, 2020(01)