一、MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究（论文文献综述）
肖艳宇[1]（2021）在《gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化》文中研究表明骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSC）,是一种常见的干细胞,可以定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等,在分化过程中细胞及外观特征发生变化,细胞标志物也会随之发生变化。Micro RNA是由一段核苷酸形成的微小RNA序列,其在细胞内利用调控靶基因来行使功能。Micro RNA在干细胞的增殖分化中发挥不容忽视的作用。本试验的目的是分离和培养具有多向分化潜能的鸡BMSCs,探究gga-let-7a-5p靶向GDF6对BMSCs多向分化的调控作用,为gga-let-7a-5p调控BMSCs在再生医学上的应用和疾病治疗提供实验基础与参考依据。1、鸡BMSCs分离培养及其多向分化潜能验证。利用全骨髓贴壁法从孵育16-18天鸡胚中获取BMSCs,经过多次更换培养液与控制消化时间的方法对BMSCs进行纯化。通过观察细胞外观特征、免疫荧光检测CD29、CD44以及波形蛋白的表达、集落形成能力试验,对本试验分离的BMSCs初步鉴定。为验证BMSCs的分化潜能,对BMSCs进行定向诱导为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞。通过q-PCR和免疫荧光检测这4种细胞各自标志基因表达水平,结合各自的特异性染色,证明BMSCs具有多向分化潜能。结果表明:（1）本试验获得的BMSCs呈纤维状、梭状,且经过多次传代,细胞形态保持不变;（2）免疫荧光检测表明BMSCs表达CD29、CD44以及波形蛋白;（3）BMSCs培养10天时均形成细胞数超过50的细胞集落,表明这些BMSCs具有良好增殖能力;（4）BMSCs向成骨细胞分化时,细胞表面被茜素红染成红色,并表达其标志基因RUNX2、COL1A1、BGLAP和BMP2;（5）BMSCs向脂肪细胞分化时,油红O染色呈阳性,并表达其标志基因PPARG、FABP4、CEBPA和CEBPB;（6）BMSCs向肌肉细胞分化时,表达其标志基因Myo D1、myf5、Myo G和Pax7;（7）BMSCs向神经细胞分化时,甲苯胺蓝染色呈阳性,并表达其标志基因NES、TUBB3、NGF和MAP2。2、gga-let-7a-5p差异表达对BMSCs定向分化能力的影响。首先用gga-let-7a-5p增强剂（mimics）或抑制剂（inhibitors）转染BMSCs进行差异化表达,然后再将这些BMSCs定向诱导分化为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,q-PCR检测相应的分化标志基因,并进行相应的特异性染色。结果表明:（1）gga-let-7a-5p过表达时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达上调,而脂肪细胞标志基因m RNA表达下调;（2）gga-let-7a-5p表达受抑制时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达下调,但脂肪细胞标志基因m RNA表达上调。3、GDF6过表达对BMSCs定向分化能力的影响。依据gga-let-7a-5p靶基因预测的结果,构建靶基因GDF6过表达质粒（pc DNA3.1-EGFP-GDF6）,并将其转染BMSCs,再将其分别诱导成成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,q-PCR检测相应的分化标志基因,并进行相应的特异性染色。结果表明,GDF6过表达时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达下调,而脂肪细胞标志基因m RNA表达上调。总而言之,本研究获得了具有良好增殖能力的BMSCs,表达干细胞标志基因CD29、CD44以及波形蛋白,而且能诱导分化为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,具有多系谱分化的能力;gga-let-7a-5p差异表达和GDF6过表达后BMSCs定向诱导分化试验证明,gga-let-7a-5p促进BMSCs向成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞分化,抑制BMSCs向脂肪细胞分化;而GDF6过表达则得到相反的结果,证明gga-let-7a-5p靶向作用于GDF6,促进BMSCs分化为成骨、肌肉、神经细胞,但脂肪细胞的分化受到了阻碍。
陈锦成[2]（2021）在《基于MAPK/ERK1/2/ETS1信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响》文中进行了进一步梳理目的明确龟鹿二仙胶含药血清对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性、成骨分化及MAPK/ERK1/2信号通路中关键蛋白与基因m RNA表达水平的影响;旨在从体外细胞水平与MAPK/ERK1/2信号通路角度揭示龟鹿二仙胶对骨髓间充质干细胞成骨分化的干预作用及其调控机制。方法1.龟鹿二仙胶含药血清的制备将SPF级8周龄的SD大鼠60只随机分为含药血清组和空白血清组各30只,含药血清组按3.15g/kg/d的龟鹿二仙胶药液进行灌胃,空白血清组采用等剂量蒸馏水灌胃。连续灌胃7d后进行腹主动脉采血制备含药血清。2.龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖活性最佳作用时间的筛选将F3代细胞分为5组,加入10%龟鹿二仙胶含药血清分别干预12h、24h、48h、72h、96h后,酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。根据CCK-8最高的吸光度值实验结果对应组别的干预时间点作为本实验最佳干预时间点。3.骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的干预与指标检测将F3代细胞分为胎牛血清组、空白血清组、龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组,采用各组条件培养基进行成骨诱导分化干预,干预7d后检测各组细胞培养液中ALP活性水平;干预14d后行茜素红染色检测和定量分析;干预14d后RT-q PCR法检测ALP、Runx2、ETS1、PPARγm RNA表达水平;干预14d后Western-Blot法分别检测胎牛血清组、空白血清组、龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组以及通路抑制剂干预后龟鹿二仙胶含药血清加MAPK抑制剂组、MAPK抑制剂组和龟鹿二仙胶含药血清组细胞中ALP、Runx2、ETS1、PPARγ、collagenⅠ、P-ERK1/2蛋白的表达水平。结果1.10%龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响根据CCK-8实验结果,以10%龟鹿二仙胶含药血清干预72h后对BMMSCs的促增殖活性作用显着（P<0.01）,后续干预实验均采用10%龟鹿二仙胶含药血清进行,干预细胞期间72h换液一次。2.龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞ALP活性的影响与胎牛血清组、空白血清组相比,龟鹿二仙胶组含药血清干预7d,可提高骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的活性（P<0.05）,但其提高骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的活性的能力较经典诱导组低（P<0.05）。3.龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化矿化结节形成的影响诱导14d后,与胎牛血清组和空白血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清干预骨髓间充质干细胞成骨矿化结节明显增多。茜素红染色矿化结节定量分析结果也显示龟鹿二仙胶含药血清组成骨分化能力强于胎牛血清组和空白血清组（P<0.05）。4.各组ALP、Runx2、ETS1和PPARγm RNA表达比较与胎牛血清组和空白血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组细胞中ALP、Runx2、ETS1 m RNA表达明显升高（P<0.05）;与空白血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组细胞中PPARγm RNA表达下调（P<0.05）。5.各组ALP、collagenⅠ、Runx2、ETS1、PPARγ和P-ERK1/2蛋白表达与空白血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组细胞中P-ERK1/2、ALP、collagenⅠ和Runx2蛋白表达水平均升高（P<0.05）;与空白血清组和胎牛血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清组细胞中ETS1蛋白表达水平升高（P<0.05）;与空白血清组和胎牛血清组比较,龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组细胞中PPARγ蛋白表达水平明显下调（P<0.05）。通路抑制剂干预后,与龟鹿二仙胶含药血清+MAPK通路抑制剂组和MAPK通路抑制剂组对比,龟鹿二仙胶含药血清组中P-ERK1/2、ALP、collagenⅠ、Runx2和ETS1蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;同时MAPK通路抑制剂组中PPARγ蛋白表达水平显着高于龟鹿二仙胶含药血清组（P<0.05）。结论龟鹿二仙胶含药血清通过上调MAPK/ERK1/2/ETS1信号通路相关因子ALP、Runx2、ETS1、collagenⅠ和P-ERK1/2的表达,下调PPARγ表达,激活了MAPK/ERK1/2/ETS1信号通路,促进BMMSCs向成骨细胞分化。
商国凯[3]（2021）在《骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究》文中研究表明研究背景肌少症是一类以进行性和广泛性骨骼肌肌力减弱和肌量减少为特征,以肌细胞的萎缩和减少、间质纤维和脂肪组织增多为主要病理表现的综合征。肌少症的发生与年龄增长息息相关,自35岁起人体肌肉组织含量逐渐减少,100%的老人患有肌少症。肌少症可以造成诸多不良事件,包括摔倒、功能减退、虚弱乃至死亡。在人口老龄化愈益明显的当代,肌少症作为一个在老年人群中普遍存在的现象,探寻其可能的发生机制及有效的干预靶点具有重要意义。骨骼肌细胞萎缩是肌少症的主要病理学改变之一。骨骼肌细胞包括慢肌细胞（Ⅰ型肌细胞）和快肌细胞（Ⅱ型肌细胞）。研究报道,在老年人群中,骨骼肌细胞大小及数量均发生衰减,而这种衰减以快肌细胞为着。运动训练虽然可以部分减轻快肌细胞的衰减,但是并不能完全阻止。快肌细胞的减少与老年人群快速运动能力下降密切相关,而慢肌细胞的保留与老年群体缓慢行走的特点相符合。因此,改善骨骼肌细胞萎缩,特别是快肌细胞的萎缩,对于改善老年人群运动功能十分重要。骨骼肌间质纤维组织增多是肌少症的另一主要组织病理学改变,是导致老年人群骨骼肌功能减退的重要原因。研究显示,老年小鼠骨骼肌间质存在纤维结缔组织的增多,增加了骨骼肌的僵硬程度,限制伸展和收缩,降低老年人的运动能力。此外,纤维组织沉积会干扰肌卫星细胞与周围细胞的相互作用,导致其成肌功能减退,从而影响肌组织再生。因此,改善间质纤维化有望改善衰老骨骼肌功能。骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化是肌少症的两大主要改变,是老年人群骨骼肌功能和整体运动能力减退的重要原因,如何减轻肌细胞萎缩、抑制间质纤维化,是改善老年人群肌少症的关键。TRB3可能是架起老年人骨骼肌细胞萎缩、间质纤维化和运动能力减退的桥梁。研究报道,TRB3基因的表达水平存在年龄相关性,并在细胞增殖、细胞分化和间质纤维化中起到重要作用。TRB3能够在食物剥夺的情况下通过负性调节蛋白转换导致骨骼肌细胞萎缩和骨骼肌功能抑制,能够抑制体外培养的C2C12细胞的成肌分化。TRB3与多种疾病的间质纤维化相关,例如糖尿病心肌病变、糖尿病肾病和系统性硬化等。因此,有理由推测,TRB3表达水平改变可能在衰老相关骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化中发挥作用。在本研究中,我们以野生型及TRB3基因敲除小鼠为研究对象,建立自然衰老小鼠动物模型,探讨小鼠骨骼肌中TRB3表达水平改变对骨骼肌细胞萎缩及间质纤维化程度的影响及其可能机制。研究目的1.研究TRB3基因是否参与老年肌少症的发生发展;2.研究TRB3基因干预改善老年肌少症的可能机制。研究方法1.实验动物分组4周龄雄性C57/BL6野生型（WT）小鼠和同品系TRB3基因敲除（TRB3-/-）小鼠随机分为年轻组和老年组:WT年轻组、WT老年组、TRB3-/-年轻组、TRB3-/-老年组。年轻组小鼠饲养至3月龄,老年组小鼠饲养18月龄。2.运动能力检测于实验末进行小鼠运动能力检测,包括:拉力测试:水平放置测力计,抓住鼠尾,通过训练使小鼠双前肢抓紧测力元件,水平向后拉动小鼠使其腾空,直至其松开测力元件,记录测力计数值,测量3次取平均值。笼线测试:将45 cm×45 cm铁丝网置于55 cm高的笼线架上方,下方铺5 cm厚的软垫,将小鼠放在笼线中间部位,经其头侧翻转,使之倒挂,记录力竭掉落的时间,间隔30min以上进行3次测量,取平均值。跑步力竭运动测试:将小鼠放在跑道上,初始速度13 m/min、坡度0°,每3 min速度和坡度分别增加2 m/min和2°,直至分别达到39 m/min和14°,当小鼠至少连续20 s不上跑道,并对外界刺激反应明显下降时,记录运动时间。3.骨骼肌功能检测麻醉小鼠,暴露趾长伸肌,远端肌腱处用外科缝线打结后离断,沿肌肉边界分离至近端附着处。将缝线另一端连接到力量传感器上,调节至较低的基础张力。采用铂丝将肌肉与脉冲刺激仪相连。以20 V/cm的电压,发放5 ms方波,同时逐渐增加基础张力,直至检测到最大力量。固定在该张力,以5 ms方波刺激肌肉收缩,记录最大等长抽搐力,间隔5 s测量3次取平均值;以5 ms 100 Hz方波连续刺激300 ms,记录最大等长强直力,间隔1 min测量3次取平均值。4.组织病理学检测将腓肠肌组织切片进行HE染色,观察形态学改变,计算平均肌细胞面积;进行slow MyHC和fast MyHC的免疫组织化学染色,计算快肌细胞和慢肌细胞的平均肌细胞面积和相对含量;进行Masson和天狼星红染色,计算胶原容积分数;进行胶原的免疫组织化学染色,计算Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量及比例。5.分子学检测采用western blotting技术检测腓肠肌衰老相关β-半乳糖苷酶（GLB1）、p16、p21、p53、TRB3、肌萎缩因子 atrogin 1 和 MuRF 1、Ⅰ 型和 Ⅲ 型胶原、p62、LC3、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38的相对含量。采用免疫共沉淀技术检测TRB3 与 p62、MEK1/MEK2、MEK3/MEK6、MEK4/MKK4 及 MKK7 能否相互作用。研究结果1.自然衰老小鼠动物模型的构建将野生型C57/BL6小鼠分别以普通饮食喂养至3月龄和18月龄,分别作为年轻组和老年组。与年轻组小鼠相比,老年组小鼠毛发稀疏、色泽暗淡、行动缓慢,体重呈上升趋势,腓肠肌GLB1、p53、p21、p16的相对含量明显升高,说明成功建立了自然衰老小鼠动物模型。2.衰老小鼠运动能力明显减低与年轻组相比,老年组小鼠前肢拉力、笼线悬挂时间及跑步力竭运动时间均显着缩短,说明衰老小鼠运动能力明显减低。3.衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩,且以Ⅱ型肌细胞为主与年轻组相比,老年组小鼠腓肠肌占体重的百分比、腓肠肌重量与胫骨长度的比值均显着降低。HE染色发现,与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌细胞大小不一、排列紊乱,平均肌细胞面积显着缩小。Fast MyHC和slow MyHC的免疫组织化学染色发现,与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌快肌细胞的平均肌细胞面积显着缩小,慢肌细胞的平均肌细胞面积显着增加,慢肌细胞数量与快肌细胞数量的比值显着增加。与年轻组相比,老年组小鼠肌萎缩因子atrogin 1和MuRF 1的蛋白水平显着增加。4.衰老小鼠骨骼肌存在明显的间质纤维化与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌胶原容积分数、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量均显着增加,Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量的比值亦显着增加。5.TRB3表达水平与衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩和纤维化相关与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平显着增加。小鼠骨骼肌平均肌细胞面积与TRB3蛋白水平呈负相关;小鼠骨骼肌胶原容积分数与TRB3蛋白水平呈正相关。6.TRB3基因敲除能够改善衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩与WT老年组小鼠相比,TRB3-/-老年组小鼠腓肠肌重量占体重的百分比和腓肠肌重量与胫骨长度的比值呈增加趋势,骨骼肌细胞排列相对整齐,平均肌细胞面积显着增加,平均快肌细胞面积显着增加,平均慢肌细胞面积无显着改变,慢肌细胞与快肌细胞数量的比值呈增加趋势,肌萎缩因子atrogin 1蛋白水平显着下降,MuRF 1蛋白水平呈下降趋势。7.TRB3基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌间质纤维化与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠骨骼肌间质纤维组织明显减少,胶原容积分数、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量以及Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量的比值亦显着降低。8.TRB3基因敲除能够改善衰老小鼠运动能力和肌肉功能与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠前肢拉力和笼线悬挂时间显着改善,跑步力竭运动时间呈改善趋势,趾长伸肌抽搐力呈增加趋势,强直力显着增加。9.TRB3基因敲除可能通过改善自噬水平减轻骨骼肌细胞萎缩与WT年轻组相比,WT老年组骨骼肌LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白水平显着增加;与WT老年组相比,TRB3-/-老年组骨骼肌LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白水平显着减少。免疫共沉淀检测发现,骨骼肌组织中的TRB3能够与p62结合。10.TRB3基因敲除可能通过影响MAPK信号通路减轻骨骼肌纤维化与WT年轻组相比,WT老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平、JNK磷酸化水平和ERK磷酸化水平显着增加,p38磷酸化水平呈下降趋势;与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平和JNK磷酸化水平显着降低,ERK磷酸化水平呈下降趋势,p38磷酸化水平显着升高。免疫共沉淀检测发现,骨骼肌组织中的TRB3能够与MEK1/MEK2、MEK3/MEK6以及MEK4/MKK4结合,但是不能与MKK7结合。研究结论1.衰老小鼠骨骼肌TRB3呈高表达状态;2.TRB3基因敲除减轻骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化,改善衰老小鼠运动能力;3.TRB3基因敲除通过改善衰老后受阻的自噬流、降低JNK磷酸化水平、增加p38磷酸化水平,实现对老年肌少症的保护作用。研究背景人口老龄化正在加速进展,带来一系列医养服务需求及经济负担,是全球面临的严峻挑战。肌少症作为一种老年人群中普遍存在并带来诸多不利影响的状态,已成为研究热点。肌少症是一类以进行性和广泛性骨骼肌肌力减弱和肌量减少为特征的综合征,与年龄相关,能够引起诸多不良事件,并导致多种疾病预后不良。但目前,关于肌少症的明确发病机制有待进一步研究。骨骼肌间质脂肪组织增多是肌少症的主要组织病理学改变。间质脂肪组织是一种特殊的异位脂肪组织,具有旁分泌、自分泌功能,可改变骨骼肌微环境,并与肌细胞相互作用,导致肌肉功能障碍,与机体运动耐力、紧张度、力量及机动功能的减低密切相关。研究报道,年龄是肌间脂肪组织增加的独立危险因素。肌间脂肪含量以每年9克至70克不等的速度增长,是导致衰老骨骼肌功能减退的重要原因。但是衰老后骨骼肌间质脂肪组织沉积的具体机制尚不清楚。骨骼肌间叶祖细胞成脂分化增多可能是衰老骨骼肌间质脂肪沉积的重要因素。多项体内和体外研究均证实,骨骼肌异位脂肪细胞来源于间叶祖细胞。间叶祖细胞是间充质起源的多能祖细胞,在病理条件下能够发生异常增殖和分化,导致肌间脂肪增加和成肌能力受损。骨骼肌间叶祖细胞与骨髓间充质干细胞具有同源性,后者衰老后成骨分化能力下降、成脂分化能力增强,是衰老机体骨质疏松和骨髓脂质沉积的重要原因,提示骨骼肌间叶祖细胞衰老后成脂分化能力增强可能是衰老骨骼肌肌间脂质沉积的重要因素。但是,目前尚无研究予以证实,且衰老骨骼肌间叶祖细胞向脂肪细胞分化增加的具体分子机制尚不清楚。Pim1可能是调节间叶祖细胞向脂肪细胞分化的关键分子。基因芯片检测显示Pim1在衰老骨骼肌高表达。Pim1蛋白具有丝/苏氨酸激酶活性,与细胞增殖、凋亡、分化、代谢等密切相关。Pim1与牛肌肉内脂肪含量相关。Pim1在良、恶性脂肪细胞肿瘤中均高表达,而在非脂肪细胞肿瘤中不表达或表达量很低。Pim1抑制剂SGI1776能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。因此,有理由推测Pim1可能是调控衰老骨骼肌间叶祖细胞成脂分化的关键靶点。在本研究中,我们通过构建野生型及Pim1基因敲除小鼠自然衰老模型以及骨骼肌间叶祖细胞复制衰老模型,研究Pim1对骨骼肌间质脂肪组织沉积的影响及其可能的机制。研究目的1.研究Pim1干预对老年肌少症是否具有改善作用;2.研究Pim1干预是否影响肌间脂肪含量;3.研究Pim1干预影响衰老小鼠肌间脂肪含量的机制;4.研究Pim1干预介导的肌间脂肪含量改变影响老年肌少症的机制。研究方法1.实验动物分组4周龄雄性野生型（WT）和同品系Pim1基因敲除（Piml-/-）小鼠分别随机分为年轻组和老年组。年轻组小鼠饲养至3月龄,老年组小鼠饲养至18月龄。2.双能X射线检测于实验末,测量体重,麻醉小鼠,固定在泡沫板上,采用双能X线检测小鼠脂肪和肌肉含量。3.运动能力检测于实验末进行小鼠运动能力检测,如下:拉力测试:训练小鼠双前肢抓紧水平放置的测力计,水平向后拉动使其腾空,缓慢加力直至其松开测力计,测量3次取平均值。笼线测试:将小鼠放于笼线中央,经头侧翻转使之倒挂,记录力竭掉落时间,间隔30 min以上测量3次取平均值,计算悬挂冲量。跑步力竭运动测试:将小鼠放在跑步机跑道上,初始速度和坡度分别为5 m/min和0°,每5 min分别增加5 m/min和5°,直至分别达到20 m/min和14°,记录力竭运动时间。4.骨骼肌功能检测于实验末,麻醉小鼠后暴露趾长伸肌,远端用缝线打结后离断肌腱,沿肌肉边缘分离至近端附着处。缝线远端固定于传感器上,调节为较低的基础张力,以铂丝连接肌肉与脉冲刺激仪。采用20 V/cm 5-ms方波刺激,同时逐渐增加基础张力,直至检测到最大力量,固定在该张力,以20 V/cm 5-ms方波刺激肌肉收缩,记录最大等长抽搐力,间隔5s测量3次取平均值;20 V/cm 5-ms 100 Hz方波刺激300ms,记录最大等长强直力,间隔1 min测量3次取平均值。分离趾长伸肌并横切,采集横切面图像,计算最大横截面积。5.组织处理于实验末,称量体重,麻醉小鼠,采血,灌注,分离双侧腓肠肌并称重。收集血清,-80℃冻存备用。一侧腓肠肌经液氮处理后存放于-80℃;一侧腓肠肌以4%多聚甲醛固定后横切,近段经梯度酒精脱水后石蜡包埋,制作5 μm石蜡切片,远段经梯度蔗糖溶液脱水后,制作10μm冰冻切片。6.血液生化指标测定采用血液化学分析仪检测血清游离脂肪酸、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯的含量。应用ELISA技术检测血清中的脂联素及瘦素的含量。7.骨骼肌病理学检测对于骨骼肌组织切片,采用HE染色检测形态学改变;采用免疫组织化学染色检测myosin、fast MyHC和slow MyHC,计算平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积、平均慢肌细胞面积以及快慢肌相对含量;采用免疫组织化学染色检测laminin,计算中心核细胞含量;采用油红O染色检测肌间脂肪含量;采用免疫组织化学染色技术检测骨骼肌中脂联素的含量;采用免疫组织化学染色法检测骨骼肌中TNF-α和IL-6的含量。8.骨骼肌分子学检测采用western blotting技术检测腓肠肌衰老相关β-半乳糖苷酶（GLB1）、p53、p16、Pim1、脂联素、肌萎缩相关因子atrogin 1和MuRF1、早期成肌分化标志物MyoD和Myf5、晚期成肌分化标志物MyoG、成脂相关转录因子PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ、FABP4的相对含量。9.骨骼肌PDGFRα+间叶祖细胞的分离和鉴定采用免疫磁珠分选的方法从1月龄小鼠下肢骨骼肌中分离PDGFRα+间叶祖细胞;采用免疫荧光染色鉴定其纯度。10.PDGFRα+间叶祖细胞复制衰老模型的构建PDGFRα+间叶祖细胞以生长培养基培养,每周换液2次,传代1次。以复制6代和22代的细胞分别作为年轻组和衰老组。采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色的方法染色衰老细胞,计算衰老细胞比例;采用western blotting技术检测衰老标志物的蛋白水平;采用实时定量PCR技术检测相对端粒长度,以评估细胞衰老。11.PDGFRα+间叶祖细胞的成脂诱导将年轻和衰老细胞以成脂诱导培养基诱导成脂,隔日换液,评估成脂情况,筛选最适成脂诱导时间。年轻和衰老细胞分别以含有不同浓度Pim1抑制剂SGI1776的成脂诱导培养基培养相同时间,评估成脂情况,以筛选抑制成脂的最适浓度。12.细胞成脂检测采用油红O染色观察细胞形态改变,以等量异丙醇萃取后,检测OD510,以评估成脂情况;采用western blotting技术检测脂肪细胞标志物脂联素的蛋白水平;通过ELISA技术测定细胞上清中脂联素的含量。13.Pim1调控细胞成脂分化的机制检测年轻和衰老细胞分别以普通成脂诱导培养基、含DMSO的成脂诱导培养基、含5 μM SGI1776的成脂诱导培养基培养,采用western blotting技术检测成脂相关转录因子PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ、FABP4的相对含量。14.Pim1抑制对PDGFRα+间叶祖细胞衰老的影响年轻和衰老细胞分别以普通生长培养基、含DMSO的生长培养基、含5 μM SGI1776的生长培养基培养,采用衰老相关β半乳糖苷酶染色技术染色衰老细胞,计算衰老细胞含量,采用western blotting技术检测细胞中衰老标志物的水平。15.Pim1介导的PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化对体外培养的肌细胞的影响将年轻和衰老PDGFRα+间叶祖细胞分别以含DMSO或SGI1776的成脂诱导培养基诱导成脂后以普通培养基培养24 h,取其上清作为条件培养基培养肌细胞,采用western blotting技术检测肌细胞中肌萎缩指标蛋白水平改变。研究结果:1.野生型和Pim1基因敲除小鼠自然衰老模型构建将WT和Piml-/-小鼠随机分为年轻组和老年组,分别喂养至3月龄和18月龄。与年轻组小鼠相比,老年组小鼠毛发稀疏、色泽暗淡、反应迟钝、行动迟缓,其腓肠肌高表达衰老标志物GLB1、p53和p16蛋白,表明成功构建自然衰老小鼠模型。与WT小鼠相比,Pim1-/-小鼠腓肠肌Pim1蛋白水平显着降低,表明成功构建Pim1基因敲除小鼠模型。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠骨骼肌Pim1蛋白水平显着增加。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠体重显着增加,血清学指标无显着改变;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠体重显着降低,血清瘦素和游离脂肪酸水平显着降低。2.Pim1基因敲除改善衰老小鼠肌少症与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠前肢拉力、倒置悬挂冲量、跑步力竭运动时间均显着降低;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠前肢拉力、倒置悬挂冲量、跑步力竭运动时间均显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠运动能力的衰退。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠趾长伸肌强直力显着降低;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠趾长伸肌强直力显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌功能的衰退。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠整体肌肉含量、腓肠肌占体重百分比显着降低;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠整体肌肉含量、腓肠肌占体重百分比显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌含量的衰退。上述结果表明,Pim1基因敲除能够改善衰老小鼠肌少症。3.Pim1基因敲除减少衰老小鼠肌间脂肪含量与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠整体脂肪含量、腓肠肌脂质含量、脂联素蛋白水平显着增加;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠整体脂肪含量、腓肠肌脂质含量、脂联素蛋白水平显着降低。表明Pim1基因敲除能够减少衰老小鼠骨骼肌肌间脂肪含量。4.Pim1正性调节PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化能力,促进肌间脂肪生成4.1 PDGFRα+间叶祖细胞的分离、鉴定和衰老模型构建采用磁珠分选的方法获取PDGFRα+间叶祖细胞,采用免疫荧光染色法证实其纯度,以复制6代和22代的细胞作为年轻组和衰老组。与年轻组相比,衰老组衰老相关β半乳糖苷酶染色阳性细胞含量、衰老标志物GLB1、p53、p16蛋白水平显着增加,相对端粒长度显着缩短,提示成功构建PDGFRα+间叶祖细胞衰老模型。与年轻组相比,衰老组细胞Pim1蛋白水平显着增加。4.2衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化能力增强在年轻组,随成脂诱导时间延长,细胞内脂滴逐渐增多、OD510递增、细胞内脂联素蛋白含量递增,呈时间依赖性,在第9天达峰值;在衰老组,随成脂诱导时间延长,细胞内脂滴增多、OD510增加、细胞内脂联素蛋白含量增加,呈时间依赖性,在第6天达峰值;在第3天和第6天,衰老组细胞内脂滴含量和OD510显着高于年轻组。表明衰老细胞对成脂刺激的反应更为灵敏,具有更强的成脂分化能力。进一步检测成脂分化过程中成脂相关转录因子蛋白水平改变,结果显示,随成脂诱导,年轻组细胞中PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ和FABP4蛋白水平呈时间依赖性增加,在第9天达峰值,衰老细胞中C/EBPβ、C/EBPδ和FABP4蛋白水平首先呈时间依赖性增加,在第6天达高峰,而后减少;在第6天,衰老细胞内C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着高于年轻细胞。综合上述结果,选择6天作为成脂诱导时间。4.3 PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化过程中出现Pim1表达上调在年轻组,随成脂诱导时间延长,Pim1蛋白水平呈增加趋势;在衰老组,随成脂诱导时间延长,Pim1蛋白水平呈先降低、后升高、再降低的趋势,可能与细胞增殖停滞、成脂分化开始、成脂分化结束有关;在成脂诱导第6天,衰老组细胞内Pim1蛋白水平显着高于年轻组。4.4抑制Pim1显着降低衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化在成脂诱导培养基中加入不同浓度的Pim1抑制剂SGI1776,结果显示,SGI1776以浓度依赖的方式抑制细胞内脂滴形成、降低OD510。与年轻溶剂组相比,5 μMSGI1776使年轻细胞的OD510呈下降趋势,显着降低年轻组细胞内和上清中的脂联素水平。与衰老溶剂组相比,5μM SGI1776能够显着降低衰老细胞的OD510,使衰老细胞内脂联素水平呈降低趋势,显着降低衰老细胞上清中的脂联素含量。结果说明,5μM Pim1抑制剂能够显着抑制衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化。5.Pim1通过激活C/EBPδ成脂通路促进衰老间叶祖细胞成脂分化与年轻溶剂组相比,年轻抑制剂组PPARγ、FABP4蛋白水平显着降低;与衰老溶剂组相比,衰老抑制剂组C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着降低;与年轻对照组相比,衰老对照组细胞内C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着增加,PPARγ、FABP4蛋白水平显着降低。与WT年轻组相比,WT老年组小鼠腓肠肌C/EBPδ蛋白水平显着增加;与WT老年组相比,Piml-/-老年组小鼠腓肠肌C/EBPδ、FABP4蛋白水平显着降低。综合上述结果,C/EBPδ可能是介导Pim1调控衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化的关键分子。此外,抑制Pim1能够显着降低PDGFRα+间叶祖细胞中衰老标志物的含量,提示Pim1抑制有可能通过年轻化PDGFRα+间叶祖细胞降低其成脂分化能力。6.Pim1基因敲除介导的肌间脂肪减少通过减轻衰老小鼠肌细胞萎缩改善肌少症与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠肌细胞明显变小,且大小不一、排列紊乱,间质成分增多,其平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积显着降低,慢肌细胞数量与快肌细胞数量的比值显着增加,肌萎缩因子MuRF 1和atrogin 1蛋白水平显着增加;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠肌细胞显着增大、排列规则,间质成分减少,其平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积显着增加,肌萎缩因子MuRF 1和atrogin 1蛋白水平显着降低。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩。进一步通过体外实验验证Pim1敲除对肌细胞萎缩的改善作用是否通过介导肌间脂肪减少而实现,发现来自衰老的成脂分化后的PDGFRα+间叶祖细胞的条件培养基能够增加体外培养的肌细胞中肌萎缩标志物的蛋白水平,而Pim1抑制能够显着改善衰老PDGFRα+间叶祖细胞条件培养基引起的肌细胞萎缩,提示Pim1基因敲除可能通过减少肌间脂肪生成,减轻肌细胞萎缩,发挥改善肌少症的作用。研究结论1.Pim1基因敲除对衰老小鼠肌少症具有改善作用;2.Pim1基因敲除能够减少衰老小鼠肌间脂肪含量;3.Pim1抑制能够降低衰老骨骼肌PDGFRα+间叶祖细胞增强的成脂分化能力,这可能是Pim1基因敲除减少衰老小鼠肌间脂肪含量的重要机制,Pim1的这一作用可能通过影响C/EBPδ成脂通路而实现;4.Pim1抑制或敲除介导的衰老间叶祖细胞成脂分化能力减低能够改善肌细胞萎缩,可能是其改善肌少症的重要机制,提示Pim1是架起衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化与肌萎缩、实现对肌少症调控的重要桥梁。
闫研[4]（2020）在《调控PPARγ对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响》文中认为近年来,随着人们的生活水平不断提高以及畜牧业的快速发展,在追求畜产品数量的同时,消费者对肉类产品质量的标准与以前相比也越来越高,肉质评定中最重要的指标为大理石花纹,即肌内脂肪（IMF）的沉积情况,IMF的含量与牛肉适口性高度相关,可以影响牛肉的多汁性,嫩度和风味。因此,必须提高我们对影响IMF沉积的分子机制的理解,以便基因组选择可用于生产质量稳定的高档牛肉。而肌内脂肪的形成一部分是由于脂肪细胞的分化,另一部分是由其他肌源性干细胞的转分化而形成。本试验以延边牛阉牛为动物模型,在细胞层面上利用化学诱导方法调控PPARγ表达,从而调控脂肪形成。主要分为以下三个试验:试验一:延边牛骨骼肌卫星细胞模型的建立为探究PPARγ基因对延边牛肌内脂肪沉积的影响,本研究以延边牛后臀部骨骼肌的半膜肌为试验材料,利用链霉蛋白酶消化分离法分离细胞,建立起延边牛原代骨骼肌卫星细胞体外培养模式;采用差速贴壁法纯化细胞;利用形态学上及免疫荧光法共同鉴定骨骼肌卫星细胞;利用MTS法检测并绘制生长曲线探究骨骼肌卫星细胞的增殖分化规律。研究结果如下:纯化后的细胞生长呈梭型,细胞与细胞间接触,发生细胞间彼此融合,从而形成多核肌管,并且在免疫荧光染色后,MyoD蛋白、Pax7蛋白和Desmin蛋白呈阳性,MTS法检测细胞增殖并绘制曲线为“S”型生长曲线。从而鉴定本试验提取细胞为骨骼肌卫星细胞;并成功建立可用于后续研究的延边牛骨骼肌卫星细胞模型。试验二:环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响本研究旨在探讨不同浓度环格列酮（CL:5 μM,CM:10 μM,CH:20μM）对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。结果表明,用环格列酮分化处理延边牛骨骼肌卫星细胞96 h以后,延边牛骨骼肌卫星细胞由原来的梭型形态转变为圆形,与对照组（CON）相比,环格列酮组（CL,CM,CH组）肌管减少甚至消失,并且有脂滴生成,且脂滴面积与环格列酮的不同浓度高度相关,并且伴有剂量依赖性关系（P<0.01）;与对照组（CON）相比,添加环格列酮后,各试验组（CL,CM,CH组）的甘油三酯合成显着增加（P<0.01）,并且伴有剂量依赖关系;实时荧光定量RT-PCR反应结果表明:与对照组（CON）相比,各试验组（CL,CM,CH组）的PPAR γ,C/EBPα,C/EBPβ,FABP4,FAS,ACC,SREBP1,LPL,GPR43,SCD,AMPKα,PLIN2,Pax3和Pax7基因表达显着上升（P<0.01）,并且显着降低了 CPT1,MyoD,MYOG,MYF5和MRF4的表达（P＜0.01）;蛋白免疫印迹反应结果显示:与对照组（CON）相比,各试验组（CL,CM,CH组）的成脂重要蛋白PPARγ,C/EBP α,SREBP1及脂滴形成重要蛋白PLIN2的表达明显增加,成肌重要蛋白MyoD和MYOG表达下降。与对照组（CON）相比,各试验组（CL,CM,CH组）的脂联素（ADP）分泌量显着上调（P<0.01）。这些结果表明,环格列酮可以促进延边牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。试验三:调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响本研究主要探究在延边牛骨骼肌卫星细胞中单独添加环格列酮（C:10 μM）,GW9662（G:10 μM）,及二者共同添加（CG:10μM 环格列酮+10μM GW9662）对骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。分化96h以后的结果表明,与对照组（CON）和单独添加GW9662组（G组）相比,单独添加环格列酮组（C组）和二者共同添加组（CG组）的肌管减少,细胞由梭型变为圆形,并且有脂滴生成;与对照组（CON）相比,单独添加环格列酮组（C组）的甘油三酯显着增加（P<0.01）,单独添加GW9662组（G组）的甘油三酯量显着下降（P<0.01）;实时荧光定量RT-PCR结果显示:与对照组相比,C 组和 CG 组的 PPAR γ、C/EBP α、C/EBP β、SREBP1、FAS、ACC、LPL、FABP4和GPAR43基因显着上调,且两组差异显着,G组除GPR43基因无显着差异,其他成脂基因显着下调（P<0.01）;与CON组相比,C组SCD基因显着上调（P<0.01）,其他两组无明显差异（P>0.05）,且与对照组相比,C组的Pax3基因显着上调（P<0.01）,Pax7基因的显着下调（P<0.01）;C组和CG组的MYOG、MyoD、MRF4、和MYF5基因表达量显着下调,G组显着上调MYF5的基因表达量（P<0.01）。蛋白免疫印迹反应结果显示:与对照组（CON）相比,C组和CG组的成脂相关蛋白PPAR γ、C/EBPα、PLIN2及SREBP1蛋白的表达量增加,G组蛋白下降趋势;各处理组成肌相关蛋白MYOG呈下降趋势,C组的MyoD蛋白表达量明显减少,G组的表达量明显增加;与对照组相比,试验组的Pax7蛋白表达量呈下降趋势。并且与对照组（CON）相比,C组和CG组的脂联素（ADP）分泌量显着上升,G组显着下降（P＜0.01）。这些结果表明,上调PPAR γ的表达可以促进延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化,下调PPAR γ表达抑制延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞分化。综上所示,本研究表明PPARγ激动剂环格列酮可以促进延边牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。
赵昱[5]（2019）在《有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究》文中认为肌肉干细胞（muscle stem cells,MuSCs）是肌肉组织中的成体干细胞,对修复肌纤维损伤,减缓骨骼肌衰老有着重要作用。积极的体育锻炼是维持骨骼肌功能的主要方式,这是否是因为运动维持了肌肉干细胞的正常状态,而肌肉干细胞的增加对骨骼肌的功能是否亦有帮助,这些问题目前仍不是十分清楚。随着当代人口寿命的延长,运动功能障碍已成为影响老年人群生活质量的重要原因,如何合理的利用运动锻炼长期维护骨骼肌健康直到老年,并掌握肌肉干细胞的增殖（细胞周期）特性来为其潜在的医疗应用价值提供依据,是本课题的研究初衷。目的:研究中等强度有氧运动对不同生命阶段小鼠肌肉干细胞数量和增殖能力的影响,分析肌肉干细胞数量、肌核数量与肌肉质量、肌力、肌纤维横截面积等表型指标之间的关系,探讨运动通过影响肌肉干细胞而减缓骨骼肌衰老的细胞周期调控机制,为深入研究运动抵抗机体运动功能衰老的作用提供新的思路。同时,建立单肌纤维培养、分析技术与小动物骨骼肌功能测试方法,为以应用动物模型的运动科学基础研究提供相应技术支持。方法:研究采用BALB/c品系雄性小鼠,分为5个组别系列,安静对照组（C组）、6-12周龄运动组（Q组）、20-26周龄运动组（M组）、50-56周龄运动组（L组）、6周龄起终生运动组（Z组）,按照相应的运动周期,采用中等强度跑台运动干预后,在各组别系列的6、12、26、56周龄四个不同生命阶段分别取样。小鼠的一侧腓肠肌用作分离及培养单根肌纤维,利用免疫荧光染色观察肌肉干细胞分子标志Pax7的定位,同时统计单根肌纤维上总细胞核数与肌肉干细胞数。另一侧腓肠肌石蜡包埋后横切,做HE染色,测量腓肠肌及肌纤维横截面积。大腿股四头肌用于细胞周期调控相关蛋白的免疫印迹（Western blotting）检测。在取样前,还需测试小鼠抓力峰值,抓力耐力、体重等表型指标。结果:1)小鼠腓肠肌中肌肉干细胞数量随周龄的增加逐渐减少,通过长期有氧运动干预可以减缓肌肉干细胞减少的趋势,而6周有氧运动干预可以逆转已经减少的肌肉干细胞数量。2)小鼠腓肠肌中肌纤维细胞核的数量虽然随周龄的增加而下降,但下降幅度较小,通过有氧运动干预可以增加肌核数量,但同样增加幅度也较小。3)在衰老之前,随着周龄增加,小鼠的体重、腓肠肌质量无论运动与否均呈增加趋势,进入老年后,对照组体重、腓肠肌质量均出现明显下降,而有过有氧运动干预的组别,体重、腓肠肌质量下降较少。但腓肠肌质量分数从12周龄之后,各组均呈现下降趋势。4)小鼠抓力的高峰出现在12周龄,随后逐渐下降,而在不同组别中有氧运动可以维持或小幅增加小鼠的抓力。5)在衰老之前,随周龄的增加,小鼠腓肠肌横截面积也增加,进入老年后腓肠肌横截面积下降较快,而肌纤维的横截面积在12周龄最大,随周龄的增加逐渐下降。年轻时,有氧运动对增加肌纤维的横截面积作用明显,而老年时这种作用减弱。6)肌肉干细胞数量与肌核数量呈现明显的正相关性。同时,肌核数量与肌纤维横截面积、肌力及腓肠肌质量分数也呈现正相关性,但与体重、肌肉质量没有明显相关性。7)长期有氧运动显着下调小鼠骨骼肌中Visfatin、Sirt1、CDK6、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D3、Cyclin E2、p16、p21的蛋白水平。结论:1)有氧运动可以增加成年小鼠肌肉干细胞的数量与肌核的数量。2)肌肉干细胞的数量与肌核的数量高度正相关,而肌核的增加有助于提高肌纤维的横截面积和骨骼肌的力量水平。3)有氧运动在任何生命阶段干预小鼠,都对其老年时的体重和肌肉质量维持有帮助,但对改变身体成分中骨骼肌比例下降的趋势作用较小。4)促进细胞周期上调并不是有氧运动维持肌肉干细胞在一定数量的主要调控通路,反而持续一段时间的有氧运动可以促进肌纤维的稳态,使肌肉干细胞维持静止状态,细胞周期蛋白表达下调。5)骨骼肌中p16基因的表达随衰老而增加,p16蛋白的积累与骨骼肌和肌肉干细胞的衰减有关,而有氧运动可以降低p16的表达,减缓骨骼肌的衰减。6)骨骼肌中Sirt1表达水平的下调有利于肌纤维的蛋白质合成,同时会抑制肌肉干细胞的增殖活动。
杜文敬[6]（2019）在《绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究》文中指出脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。UCMSCs具有来源丰富、不涉及伦理道德、低免疫原性、体外扩增能力强及能分化为多种体细胞等特征,因此,UCMSCs的相关研究备受关注。目前,已成功从人、大鼠、兔、猪等动物分离获得脐带间充质干细胞,但与其相比,关于绵羊脐带间充质干细胞（sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs）的分离、培养及定向分化等研究的相关报道甚少。绵羊是基础生物学及畜牧学等研究领域的重要大动物模型。据此,本研究在改良sUCMSCs分离及培养体系的基础上,探讨了诱导sUCMSCs为诱导多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的同时将sUCMSCs定向诱导分化为成肌细胞并初步探究其在体内修复损伤组织的作用机制。本研究主要研究结果如下:1.建立了组织块二次贴壁分离绵羊脐带间充质干细胞的方法,并用改良的无血清体系在体外扩增培养获得了绵羊脐带间充质干细胞,经鉴定,所获得的sUCMSCs的免疫表型在高表达CD90、CD105及CD44（表达量在95%以上）的同时,低表达CD45、CD34及CD14（表达量在2%以下）。此外,组织块二次贴壁法获得的sUCMSCs可在体外传至12代,并且能向成骨、成脂及成软骨细胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法诱导sUCMSCs为iPSCs,获得了类胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）的克隆样细胞,对其进行碱性磷酸酶染色鉴定,结果显示克隆呈棕红色的阳性结果;此外,对所获得的克隆进行多能性因子表达情况的检测,结果发现,克隆表达多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;为检测获得的sUCMSCs来源的克隆在体内分化能力,将克隆制备成单细胞悬液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蜡切片后进行HE染色,在倒置显微镜下可观察到肌肉、毛囊、腺体等三个胚层的组织。3.采用5-氮杂胞苷联合马血清法,诱导sUCMSCs分化为成肌细胞,检测分化不同时期成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD与标志分子Desmin、Myf5及MyoG的表达情况;此外,将sUCMSCs、分化第14天的成肌细胞及丝裂霉素C处理的sUCMSCs移植入肌肉损伤模型小鼠的胫骨前肌,在移植细胞后不同时间经石蜡切片并HE染色,检测小鼠损伤的肌肉的修复情况。结果显示:（1）在5-氮杂胞苷及马血清的联合作用下,sUCMSCs在诱导分化第3天Myf5基因开始表达;第7天个别细胞形态发生改变,呈杆状、多角状,细胞增殖减缓,且成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表达,有部分细胞发生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表达量升高,细胞增殖持续减缓,融合细胞增多,且融合后的细胞内细胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表达量骤升,且细胞代谢产物增多,出现肌管样结构;（2）在细胞移植后,sUCMSCs组小鼠损伤肌肉后第2天即进入修复期,在第10天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;成肌细胞组小鼠损伤肌肉第3天即进入修复期,在第14天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;丝裂霉素C组及对照组小鼠损伤肌肉在第2-3天进入修复期,且在第10天损伤肌肉未能完全修复,肌纤维之间仍存在明显的空隙,第14天肌肉也未能完全恢复正常。综上所述,采用二次贴壁法及无血清培养体系可获得形态及体外增殖能力正常、且表达间充质干细胞表面标志分子并具有多向分化潜能的sUCMSCs。所获得的sUCMSCs不仅能诱导为iPSCs,而且可分化为对小鼠损伤肌肉有修复功能的成肌细胞。本研究为建立完善的绵羊诱导多能干细胞技术及探明间充质干细胞的定向分化及修复机制提供科学依据。
马丽媛[7]（2015）在《利用MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究》文中进行了进一步梳理已有研究证实,绵羊脐带间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞和成肌细胞等分化的潜能。为了建立诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的方法,本研究在构建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表达载体的基础上,转染至绵羊脐带间充质干细胞进行诱导。对诱导细胞进行细胞形态学、蛋白表达以及基因表达等检测,以期最终获得绵羊成肌细胞。本研究中获得结果如下：1.小鼠MyoD基因的克隆参照GenBank中的小鼠MyoD基因序列（NM010866）,采用RT-PCR扩增技术,克隆小鼠Myo D基因,将其连接到pcDNA3.1 （+）载体,获得MyoD-pcDNA3.1真核表达载体：将获得的MyoD-pcDNA3.1转染到小鼠胎儿成纤维细胞中,采用Real-Time PCR、免疫荧光、流式细胞分析等进行活性检测。其结果,MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎儿成纤维细胞中具有表达活性；2.MyoD-pcDNA3.1转染绵羊脐带间充质干细胞将冷冻保存的绵羊脐带间充质干细胞复苏培养,当细胞达到约80%汇合时,分别进行下列处理：1)采用脂质体转染法将MyoD-pcDNA3.1无内毒素质粒转染细胞,并在培养基中添加DMSO作为诱导剂诱导培养（A组）；2)采用脂质体转染法,转染MyoD-pcDNA3.1无内毒素质粒（B组）；3)用添加有DMSO诱导剂的培养基进行培养（C组）。在经上述三种处理后,分别对诱导细胞进行如下检测：（1）细胞形态学检测经3种诱导处理后的第12d,在倒置荧光显微镜下观察,3组细胞均由长梭形转变成细长的成肌细胞状态,即细长管状,旋涡状逐渐消失。（2）免疫荧光检测在上述各组在开始处理后的第8d,利用MyoD 和 Desmin抗体进行检测,其结果,虽然3种处理组细胞的MyoD均呈现阳性表达,但与A和B组相比,C组的MyoD表达量较低；3种处理组的细胞均表达Desmin,且其表达量无明显差别；在第16d,利用MyoD、MyoG 和 Desmin抗体进行检测,在3种处理组的MyoD相对表达量与第8d检测时相比均有所下降,MyoG蛋白的表达量较弱,而Desmin的表达量与第8d检测时相比无明显差异。（3）流式细胞检测 采用流式细胞仪进行检测结果,上述3种处理组的细胞均表达成肌细胞特异因子MyoD、Desmin和MyoG,且3种蛋白的阳性细胞率均达到86.6%以上（A组分别为98.6%、99.0%和99.0%；B组分别为93.5%、99.5%和97.4%；C组分别为99.3%、99.5%和86.6%）。（4） Real-Time PCR采用Real-Time PC R方法,对上述3种处理组细胞的MyoD、 MyoG和Desmin的相对表达量进行检测,其结果,与转染前细胞（标准化为1）相比,上述3种处理组的MyoD、MyoG和Desmin勺相对表达量与均升高（A组分别为3.217+0.01倍、4.345+0.01倍和5.107+0.01倍；B组分别为2.046±0.01倍、2.389+0.01倍和5.489+0.01倍；C组分别为3.713+0.01倍、1.861土0.01倍和5.271士0.01倍）。上述结果表明,本研究利用小鼠MyoD基因构建的MyoD-PcDNA3.1真核表达载体可以诱导绵羊脐带间充质干细胞为成肌细胞,为进一步研究成肌细胞对肌损伤修复的作用奠定基础。
吴海浩[8]（2013）在《小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究》文中进行了进一步梳理本研究运用Ⅰ型胶原酶消化法分离4周龄雌性ICR小鼠脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）,进行体外分离培养,随后观察传代生长过程中的形态变化,绘制生长曲线,进行染色体分析,和细胞周期的测定。随后用RT-PCR法对ADSCs进行转录因子的检测,流式细胞仪检测细胞表面标志CD29,CD31,CD44,CD45。结果显示小鼠ADSCs体外培养时呈成纤维细胞样,增殖速度快,各代次细胞经历生长潜伏期、指数生长期和平台期,生长状态无异常,细胞表面标志CD29阳性率为95.51%,CD44为31.63%,CD31为20.22%,CD45表达量极少。RT-PCR检测ADSCs的转录因子结果表明,小鼠ADSCs少量表达Oct-4和C-kit,大量表达Sca-1。可经成脂诱导体系诱导成为脂肪细胞,经过苏丹黑染色显蓝色,并表达PPARy2这一脂肪细胞分化过程中重要的调节因子。可经成骨诱导体系诱导成为成骨细胞,经过茜素红染色呈红色,并表达钙骨素基因。用胶原酶和胰酶联合消化法消化分离小鼠原代肌肉卫星细胞,该方法比组织块等方法得到卫星细胞所用时间短。免疫荧光显示其表达FITC标记的Myod抗体和Cy3标记的Desmin抗体。RT-PCR结果显示,小鼠骨骼肌卫星细胞表达MyoD, Myogenin和Myf5等生肌决定因子,其中MyoD的表达量最高。不同代次之间不同生肌决定因子的表达量不同,新分离的骨骼肌卫星细胞和第二代细胞之间MyoD的表达量差异并不显着,而MyoG的表达量差异显着,而Myf5的表达量差异极其显着,说明骨骼肌卫星细胞在传代生长过程中,迅速地发生分化,逐渐变为生长成熟的成肌细胞,失去分化增殖能力。用不同浓度去甲基化试剂5-氮杂胞苷（5-Aza）处理间充质干细胞寻找最佳培养条件后进行成肌检测。免疫荧光结果表明其定向分化为肌肉细胞的能力强,添加10μmol-L-15-Aza与10%的马血清（Horse Serum,HS）的条件培养基可使诱导效果更好。诱导后部分相邻细胞开始融合,形成类似肌管样的细胞,成肌特异性抗体anti-MyoD和anti-Desmin阳性表达。5-Aza单独诱导组、5-Aza与马血清（HS）协同诱导组与阴性对照脂肪间充质干细胞（ADSCs）组和阳性对照第一代骨骼肌卫星细胞（SCs）组,RT-PCR结果表明各组之间生肌决定因子MyoD,Myogenin和Myf5的表达量有差异,说明其成肌分化的程度不同,并有改善空间。因此,本研究分离培养得到小鼠ADSCs,该细胞取材容易,带入杂质细胞很少,分离方法简便,体外生长增殖能力强,经多次传代后细胞仍生长稳定、增殖速度快、贴壁率高。并且在利用5-Aza以及优化的协同诱导体系可以在较短时间内使其诱导分化为成肌细胞样细胞,并具有表达生肌的标志性蛋白MyoD和肌肉骨架蛋白Desmin的能力,可以作为体外肌组织工程的种子细胞。
赵文勇[9]（2013）在《间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究》文中研究表明外周神经损伤后骨骼肌发生严重萎缩抑或损伤神经修复后肌肉功能难以恢复的患者在临床上较为常见,并且治疗相当困难。深入阐明失神经性骨骼肌萎缩的机理，有效地延缓或防治其萎缩，最大程度地维持骨骼肌原有功能，是近年来研究的重点和亟待解决的难题。显微外科技术的广泛应用尽管能提高外周神经损伤的修复水平，但术后骨骼肌功能恢复并不十分理想，其根源在于周围神经损伤后，运动神经再生非常缓慢，当受损神经通过再植或重新长入所支配的靶肌肉时，长时间失神经支配所致的肌肉不可逆变化（如肌肉萎缩、纤维化等）使骨骼肌无法恢复正常功能。为防治失神经性骨骼肌萎缩，国内外学者采取了许多方法，包括功能性电刺激、被动运动、药物疗法、神经元植入、生长因子治疗、基因治疗等，尽管实验研究均取得了一定成功，但临床应用的疗效却有限。干细胞（stem cell，SC）是一类具有自我增殖能力与多向分化潜能的细胞,既能产生基因型与自己完全相同的子代细胞,也能分化为祖细胞，具有再生为各种组织、器官的潜能,故医学界称其为“万用细胞”。研究表明，成体干细胞（adult stem cells，ASCs）在自然条件下通常倾向于分化为所属组织的各种细胞类型，主要用于替换衰老死亡的细胞和维持机体新陈代谢的相对稳定，但在特定的外界诱导条件下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”为其他组织的功能细胞，参与组织的损伤修复。此外，成体干细胞还可取自于患者的自身组织,通过定向诱导分化后重新植入患者体内避免了免疫排斥的问题。正是由于成体干细胞具有可塑性、旺盛的自我增殖能力及多向分化潜能，且疾病或损伤均能刺激成体干细胞的增殖和分化，因此一些学者认为成体干细胞对于各种神经系统损伤将是一种重要的治疗措施，并具有广阔的应用前景。近年来，一些学者将神经干细胞（neural stem cells，NSCs）及间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植于离断的外周神经或直接注入靶肌肉内并有效延缓了失神经性骨骼肌萎缩，动物实验确实获得了成功，但由于足量的神经干细胞获得途径相对有限且扩增困难，体外培养的小鼠间充质干细胞又极易遭受到造血干细胞的污染而使其增殖效果不理想，寻找新的移植细胞尤为迫切。新近研究发现，间充质祖细胞（mesenchymal progenitor cell,MPCs）可体外定向诱导分化为神经元样细胞，同时间充质祖细胞具有易获取、易生长、增殖能力强等特点，且来源于密质骨，体外培养时可避免造血干细胞的污染，故有望成为神经干细胞及间充质干细胞的替代种子细胞。因此，本课题拟培养GFP转基因C57小鼠密质骨碎片来源MPCS，体外定向诱导分化为神经元样细胞后进行神经断离处移植或直接注入靶肌肉内，初步探讨移植细胞体内原位定植存活情况以及延缓骨骼肌萎缩的作用与机制，为进一步探明其分子机制、后期临床应用提供理论指导和实验依据，同时也为法医物证学的个体识别方法、神经损伤后鉴定时限及其损伤程度的把握提供了新的思路。本研究内容主要包括两部分：第一部分：间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植后自身特性的维持。目的：体外培养绿色荧光蛋白转基因C57小鼠密质骨碎片来源的间充质祖细胞，通过体外定向诱导分化为神经元及神经胶质样细胞后移植于神经断离处及直接注入靶肌肉中，探讨肌内移植后能否定植存活并维持其移植前的特性。方法：取3周龄健康GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPCs培养，利用流式细胞术及成骨、成脂定向诱导分化检测其纯度及多向分化潜能。选取生长良好的第三代MPCs，神经元原代培养上清液进行神经元及神经胶质样细胞诱导分化后，采用免疫荧光染色检测神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况并收集细胞，用生理盐水调整细胞浓度至5×105/μl细胞悬液备用；选取12周龄健康C57小鼠24只，按随机数字表法分为神经断离处+MPC移植组、神经断离处+生理盐水组、肌肉+MPC移植组、肌肉+生理盐水组，其中上述各组小鼠右后肢作为实验侧，左后肢为假手术侧。参照文献操作方法，4组小鼠右后肢均切断坐骨神经建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型，左后肢仅分离坐骨神经但不做切断处理。神经断离处+MPC移植组和肌肉+MPC移植组：右侧坐骨神经切断处、右侧腓肠肌内及左侧对应部位分别注入5μl MPCs悬液；神经断离处+生理盐水组和肌肉+生理盐水组：右侧坐骨神经切断处、右侧腓肠肌内及左侧对应部位均注入5μl生理盐水。术后4周，荧光显微镜下观察肌内移植细胞存活情况，并采用免疫荧光染色检测移植细胞神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况。结果：1、通过小鼠密质骨培养获得的MPCs主要表达间质细胞免疫表型CD29、CD44、CD90、CD106，不表达造血干细胞免疫表型CD31和CD45，且在体外能够诱导分化为骨细胞及脂肪细胞，提示通过小鼠密质骨培养获得的MPCs是细胞同源性好、纯度高、排除了造血干细胞干扰且具有多向分化潜能的成体干细胞。2、MPCs经神经元原代培养上清液诱导24h后，大部分细胞阳性表达NSE、NeuN，少数细胞阳性表达GFAP，而对照组未见确切阳性表达细胞，提示MPCs经体外定向诱导分化后具备神经元或神经胶质的某些特性。3、术后4周，荧光显微镜下观察发现移植细胞均匀分布于肌细胞间隙；免疫荧光检测发现，神经断离处+MPC移植组和肌肉+MPC移植组右后肢注射部位周围肌肉组织中大部分移植细胞阳性表达NSE、NeuN，少量细胞阳性表达GFAP，而左侧对应部位肌肉组织以及另外两组均未见明显阳性细胞表达，提示MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及失神经支配靶肌中能够定植存活并很好地维持其移植前特性。结论：1、成功培养出生长良好、纯度高且具有多向分化潜能的MPCs细胞。2、MPCs体外可定向诱导分化为神经元及神经胶质样细胞。3、MPCs源性神经元样细胞肌内移植后能够在原位定植存活并很好地维持其移植前特性。第二部分：间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的研究目的：初步探讨间充质祖细胞源性神经元样细胞移植于神经断离处和靶肌肉中延缓失神经性骨骼肌萎缩作用及其机制。方法：取GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPCs培养及鉴定，选取生长良好的第三代MPCs，采用神经元原代培养上清液进行神经元及神经胶质样细胞诱导分化后收集细胞，生理盐水调整细胞浓度至5×105/μl细胞悬液备用。选取C57小鼠48只，随机分为对照组、神经断离组、神经断离处移植组、肌肉移植组，每组12只。参照文献操作方法，建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型，其中对照组不做任何处理。神经断离处移植组和肌肉移植组分别于坐骨神经断离处、腓肠肌内注入5μl MPCs悬液，神经断离组于腓肠肌内注入等量生理盐水，对照组不作任何处理。观察小鼠后肢活动能力，术后2和4周测量腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率及观察超微结构，用Western blot检测α-actin、MHC及RT-PCR检测Myogenin、MyoD的表达情况。结果：1、术后2和4周，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积维持率显着高于神经断离组，提示两种治疗方法均可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩，其中神经断离处移植组治疗效果更显着。2、术后4周，神经断离处移植组和肌肉移植组肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化程度明显低于神经断离组，且部分细胞表现出旺盛的增殖活性的特点（细胞核内移，核增大，核仁明显，异染色质发达、线粒体数量增多等），表明两种治疗方法均可有效抑制失神经性骨骼肌纤维化；3、术后4周，Western blot检测发现，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌内α-actin及MHC的表达程度均显着高于神经断离组和对照组，表明两种治疗方法既可有效抑制失神经性骨骼肌蛋白质的降解，又能够促进蛋白质的加快合成。4、术后4周，RT-PCR检测发现，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌内Myogenin及MyoD的基因表达丰度显着高于神经断离组和对照组，其中以MyoD的高表达更为显着。结论：1、MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内均可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩及肌肉纤维化的发生，其中以神经断离处细胞移植的疗效更为显着；2、MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内均可有效抑制失神经支配靶肌肉蛋白质的降解；3、初步得出MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内延缓失神经性骨骼肌萎缩的机制。
刘岱[10]（2009）在《人脐带血间充质干细胞向成肌细胞分化的体外研究》文中研究说明研究背景和目的人脐带血间充质干细胞（human umbilical cord bloodmesenchymal stem cells,hUCB-MSCs）具有其他组织来源的间充质干细胞的生物学特性。目前的研究表明hUCB-MSCs含量较少,培养体系众多,但培养效率较低。对UCB-MSCs体外向成肌细胞分化的研究不够深入。因此,我们选择hUCB-MSCs作为研究的种子细胞,优化体外培养条件,探讨其体外诱导成肌细胞的能力,为肌源性疾病的治疗提供理想的种子细胞。实验方法①hUCB-MNCs培养体系的建立:应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法和羟乙基淀粉+淋巴细胞分离液两步法三不同方法分别从脐带血中获得单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）,应用L-DMEM、DMEM/F12和MesencultTM不同培养基,在不同胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）浓度和细胞接种密度下,培养UCB-MNCs。比较所获得的MNCs数量、原代培养时间和不同培养条件下hUCB-MSCs的生长情况。流式细胞仪对P3细胞进行细胞表面标记鉴定,并诱导成骨,观察其生物学特征。②基于上一部分的UCB-MSCs培养体系,建立以5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-Aza）为诱导剂的诱导成肌分化体系:MTT法选择5-Aza适宜的诱导浓度,对P3 hUCB-MNCs进行体外向成肌细胞诱导分化,于诱导后第7d和第14d进行MyoD1、myogenin和myosin heavy chain免疫荧光染色和Real-time PCR检测。实验结果建立了hUCB-MSCs稳定有效的培养体系:应用羟乙基淀粉+淋巴细胞分离液两步法采集单个核细胞的数量较多（P＜0.01）;10%FBS DMEM/F12和MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时培养效率高于各对照组（P＜0.01）;贴壁细胞表达CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD90、CD133;经成骨诱导培养21d后,细胞Yon Kossa染色可见矿化结节。P3 UCB-MNCs经5μmmol/L5-Aza诱导7d后,免疫荧光检测仅表达MyoD1;当诱导后14d时,可见MyoD1和myogenin阳性表达。始终无myosin heavy chain的表达。Real-time PCR检测显示诱导后14d较7d,MyoD1和myogenin的相对浓度增高,而无myosin heavy chain的表达。另外,在未诱导条件下UCB-MNCs同样能表达MyoD1。实验结论脐带血中存在一定数量的间充质干细胞,通过改善hUCB-MSCs分离方法,优化培养条件,提高了培养效率。UCB-MSCs不表达造血干细胞和内皮细胞表面标记,表达与骨髓间充质干细胞表面标记,并能够诱导成骨,符合间充质干细胞的特点。在成肌细胞分化中,hUCB-MSCs经5μmmol/L5-Aza诱导后,表达成肌细胞分化过程中的调节因子,能够向成肌细胞分化,而且在未诱导条件下能够保持成肌细胞分化的潜能。
二、MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究（论文提纲范文）
（1）gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词中英文全称 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骨髓间充质干细胞 |
| 1.2 影响骨髓间充质干细胞分化的因素 |
| 1.2.1 细胞因子对BMSC的影响 |
| 1.2.2 其他诱导培养基添加物对BMSC的影响 |
| 1.2.3 骨髓间充质干细胞向不同系谱细胞分化的调节机制 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞的特性及应用 |
| 1.4 miRNA的相关研究 |
| 1.4.1 miRNA概述 |
| 1.4.2 miRNA生物发生途径 |
| 1.4.3 miRNA作用机理 |
| 1.4.4 miRNA靶基因预测 |
| 1.4.5 miRNA与干细胞 |
| 1.4.6 miRNA对干细胞分化的调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 鸡BMSC分离培养及其多能性鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1BMSCs的分离与培养 |
| 2.3.2 向成骨细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.3 向脂肪细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.4 向肌肉细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.5 向神经细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 BMSC分离与培养 |
| 2.4.2 向成骨细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.3 向脂肪细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.4 向肌肉细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.5 向神经细胞分化及其标志物检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 gga-let-7a-5p对BMSC多向分化能力的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 BMSCs不同系谱分化时gga-let-7a-5p表达量的变化 |
| 3.3.2 gga-let-7a-5p过表达或抑制后在BMSCs中gga-let-7a-5p的表达量的检测 |
| 3.3.3 gga-let-7a-5p靶基因GDF6预测及验证 |
| 3.3.4 gga-let-7a-5p对BMSCs增殖能力的影响 |
| 3.3.5 gga-let-7a-5p对BMSCs定向分化能力的影响 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 BMSCs不同系谱分化时gga-let-7a-5p表达量变化情况 |
| 3.4.2 gga-let-7a-5p过表达或抑制处理后在BMSC中gga-let-7a-5p的表达量 |
| 3.4.3 gga-let-7a-5p靶基因验证与选择 |
| 3.4.4 gga-let-7a-5p对BMSCs增殖能力的影响 |
| 3.4.5 gga-let-7a-5p对BMSCs成骨分化的影响 |
| 3.4.6 gga-let-7a-5p对BMSCs脂肪分化的影响 |
| 3.4.7 gga-let-7a-5p对BMSCs肌肉分化的影响 |
| 3.4.8 gga-let-7a-5p对BMSCs神经分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 GDF6对BMSCs多向分化能力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 获取GDF6过表达质粒 |
| 4.3.2 GDF6对BMSCs定向分化的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 GDF6对BMSCs向成骨细胞分化的影响 |
| 4.4.2 GDF6对BMSCs向脂肪细胞分化的影响 |
| 4.4.3 GDF6对BMSCs向肌肉细胞分化的影响 |
| 4.4.4 GDF6对BMSCs向神经细胞分化的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 本论文的主要创新点 |
| 5.3 本论文存在的不足 |
| 5.4 展望 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）基于MAPK/ERK1/2/ETS1信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 主要实验仪器和设备 |
| 1.3 实验药物 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验药物和主要试剂制备 |
| 2.2 SD大鼠骨髓间充质干细胞的干预 |
| 2.3 细胞样品收集与实验指标检测 |
| 2.4 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 10%龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响 |
| 3.2 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的影响 |
| 3.3 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化矿化结节形成的影响 |
| 3.4 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞ALP、Runx2、ETS1和PPARγm RNA表达水平的影响 |
| 3.5 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞中P-ERK1/2、collagenⅠ、ALP、Runx2、ETS1和PPARγ蛋白表达水平的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 龟鹿二仙胶促BMMSCs增殖和成骨分化作用与骨质疏松的相关性 |
| 4.2 MAPK信号通路的组成和作用机制 |
| 4.3 MAPK/ERK1/2 信号通路与骨质疏松的相关性 |
| 4.4 实验指标P-ERK1/2、ETS1、Runx2、ALP、collagenⅠ和PPARγ之间的相互关系 |
| 4.5 结合龟鹿二仙胶组分的药理研究分析龟鹿二仙胶含药血清对BMMSCs增殖活性与成骨分化的影响 |
| 4.6 龟鹿二仙胶含药血清对信号通路相关蛋白P-ERK1/2、ETS1、Runx2、ALP、collagenⅠ和PPARγ的影响 |
| 结论 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ERK1/2 信号通路在骨质疏松症成骨细胞增殖、分化和凋亡中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ TRB3调控骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化在肌少症中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ Pim1调控骨骼肌间质脂肪生成在肌少症中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（4）调控PPARγ对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 延边牛(Yanbian Cattle)概述 |
| 2 牛骨骼肌卫星细胞及成脂转分化的研究进展 |
| 2.1 牛骨骼肌卫星细胞(Bovine Satellite Cells, BSC)概述 |
| 2.2 骨骼肌成肌分化过程中相关的转录调控因子 |
| 3 PPAR γ及其激动剂的研究进展 |
| 3.1 PPARs家族的研究进展 |
| 3.2 PPAR γ激动剂的研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 试验一 骨骼肌卫星细胞模型的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 药品的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 延边牛骨骼肌卫星细胞的分离培养和传代培养 |
| 3.2 延边牛骨骼肌卫星细胞生长曲线的绘制 |
| 3.3 延边牛骨骼肌卫星细胞形态学及免疫荧光学鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 骨骼肌卫星细胞分离与提取 |
| 4.2 延边牛骨骼肌卫星细胞的纯化与培养 |
| 4.3 延边牛骨骼肌卫星细胞的鉴定 |
| 5 本章小结 |
| 试验二 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 药品的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞大小及活力的影响 |
| 3.2 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞脂滴形成的影响 |
| 3.3 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞甘油三酯形成的影响 |
| 3.4 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞脂联素分泌的影响 |
| 3.5 环格列酮添加后对延边牛骨骼肌卫星细胞中差异表达基因的分析 |
| 3.6 环格列酮添加后对延边牛骨骼肌卫星细胞中差异表达基因KEGG富集的分析 |
| 3.7 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞基因表达的影响 |
| 3.8 环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 试验三 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 药品的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞大小及活力的影响 |
| 3.2 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞脂滴形成的影响 |
| 3.3 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞甘油三酯形成的影响 |
| 3.4 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞脂联素分泌的影响 |
| 3.5 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞基因表达的影响 |
| 3.6 调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A |
（5）有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 有氧运动与衰老 |
| 1.2 肌肉干细胞研究进展 |
| 1.2.1 卫星细胞概述 |
| 1.2.2 卫星细胞即肌肉干细胞的验证过程 |
| 1.2.3 肌肉干细胞的异质性及不同分子标记 |
| 1.2.4 与肌肉干细胞数量相关细胞更新、增殖、分化调控的分子机制 |
| 1.2.5 微环境对肌肉干细胞数量相关细胞事件的调控作用 |
| 1.2.6 衰老、运动对肌肉干细胞数量与功能的改变 |
| 1.3 细胞周期调控与肌肉干细胞的增殖、分化、衰老 |
| 1.3.1 细胞周期调控概述 |
| 1.3.2 肌肉干细胞的细胞周期调控研究 |
| 1.3.3 p16INK4a与肌肉干细胞的衰老 |
| 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 小鼠抓力测试方法 |
| 2.3.2 小鼠腓肠肌单肌纤维分离培养方法 |
| 2.3.3 体外培养肌纤维的免疫荧光染色、成像及计数 |
| 2.3.4 组织石蜡包埋切片 |
| 2.3.5 石蜡组织切片的HE染色及成像 |
| 2.3.6 蛋白免疫印迹实验(Western blotting) |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 有氧运动对不同生命阶段小鼠腓肠肌中肌肉干细胞及总细胞核数量的影响 |
| 3.1.1 小鼠腓肠肌单根肌纤维分离技术的建立及体外培养肌纤维发育过程的形态学观察 |
| 3.1.2 有氧运动对各组小鼠肌肉干细胞及总细胞核的数量分析 |
| 3.2 有氧运动对不同生命阶段小鼠骨骼肌相关表型指标的影响研究 |
| 3.2.1 有氧运动对各组小鼠体重的影响 |
| 3.2.2 有氧运动对各组小鼠腓肠肌质量的影响 |
| 3.2.3 有氧运动对各组小鼠腓肠肌质量分数的影响 |
| 3.2.4 有氧运动对不同生命阶段小鼠肌力的影响 |
| 3.2.5 有氧运动对不同生命阶段小鼠腓肠肌及肌纤维横截面积的影响 |
| 3.2.6 小鼠肌纤维上肌肉干细胞与总细胞核数量和各表型数据的相关性分析 |
| 3.3 有氧运动对小鼠骨骼肌及肌肉干细胞的细胞周期调控信号影响 |
| 3.3.1 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌Sirt1与Visfatin蛋白表达的影响 |
| 3.3.2 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌CDK6 蛋白表达的影响 |
| 3.3.3 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌各Cyclins蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌各CKIs蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 运动适应后肌纤维上激活态的肌肉干细胞数量观察 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 年龄与运动对肌肉干细胞数量的影响 |
| 4.2 肌核与肌肉干细胞数量的关系 |
| 4.3 从衰老的角度看肌核与肌纤维体积之间的关系及“肌核域”假说 |
| 4.4 衰老对肌力的影响 |
| 4.5 肌肉干细胞与骨骼肌质量的关系 |
| 4.6 长期运动对骨骼肌细胞周期调控的影响 |
| 4.7 运动通过抑制p16INK4a表达以对抗肌肉的衰老 |
| 4.8 Sirt1 对肌纤维及肌肉干细胞的不同影响作用 |
| 第五章 研究总结 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 创新之处 |
| 5.3 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历及在学期间所取得的学术成果 |
| 后记 |
（6）绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 脐带间充质干细胞 |
| 1.1.1 脐带间充质干细胞的来源 |
| 1.1.2 脐带间充质干细胞的的分离培养 |
| 1.1.3 脐带间充质干细胞的形态特征和生长特性 |
| 1.1.4 脐带间充质干细胞的的鉴定标准 |
| 1.2 脐带间充质干细胞的主要生物学特性 |
| 1.2.1 脐带间充质干细胞的分化潜能 |
| 1.2.2 诱导多能干细胞系的建立与发展 |
| 1.2.3 脐带间充质干细胞的的免疫调节特性 |
| 1.3 脐带间充质干细胞的应用 |
| 1.3.1 脐带间充质干细胞的应用 |
| 1.3.2 脐带间充质干细胞的作用机制 |
| 1.3.3 脐带间充质干细胞应用的局限性 |
| 1.3.4 脐带间充质干细胞应用的展望 |
| 1.4 绵羊脐带间充质干细胞的研究进展 |
| 1.5 诱导多能性干细胞研究进展 |
| 1.5.1 制备诱导多能干细胞的方法 |
| 1.5.2 绵羊诱导多能性干细胞 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 绵羊脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊脐带间充质干细胞原代分离及培养 |
| 2.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的传代培养 |
| 2.2.3 绵羊脐带间充质干细胞实验分组 |
| 2.2.4 绵羊脐带间充质干细胞表面标志物的检测 |
| 2.2.5 绵羊脐带间充质干细胞增殖曲线的检测 |
| 2.2.6 绵羊脐带间充质干细胞体外分化的检测 |
| 2.2.7 数据统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊脐带间充质干细胞的的原代培养 |
| 2.3.2 绵羊脐带间充质干细胞的的传代培养 |
| 2.3.3 绵羊脐带间充质干细胞的增殖能力 |
| 2.3.4 绵羊脐带间充质干细胞的表面标志物 |
| 2.3.5 绵羊脐带间充质干细胞的分化能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊脐带间充质干细胞诱导多能性干细胞 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验质粒 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂及配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 多能性诱导因子无内毒素质粒的制备 |
| 3.2.2 实验细胞的准备及培养 |
| 3.2.3 逆转录病毒的制备 |
| 3.2.4 逆转录病毒的侵染 |
| 3.2.5 绵羊诱导多能干细胞的传代培养、冻存及复苏 |
| 3.2.6 绵羊诱导多能干细胞的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 逆转录病毒的包装和侵染 |
| 3.3.2 绵羊诱导多能干细胞过程中细胞形态变化 |
| 3.3.3 绵羊诱导多能干细胞克隆的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊脐带间充质干细胞的定向分化 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 丝裂霉素C处理绵羊脐带间充质干细胞 |
| 4.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的成骨分化 |
| 4.2.3 绵羊脐带间充质干细胞的成脂分化 |
| 4.2.4 绵羊脐带间充质干细胞的成软骨分化 |
| 4.2.5 慢病毒包装及侵染 |
| 4.2.6 绵羊脐带间充质干细胞诱导分化成肌细胞 |
| 4.2.7 免疫荧光检测成肌细胞标志物 |
| 4.2.8 提取细胞总RNA |
| 4.2.9 RNA反转录为cDNA |
| 4.2.10 实时定量PCR检测成肌细胞标志基因表达 |
| 4.2.11 制备胫骨前肌损伤小鼠模型 |
| 4.2.12 细胞移植肌肉损伤小鼠 |
| 4.2.13 石蜡切片—组织块包埋 |
| 4.2.14 石蜡切片—切片 |
| 4.2.15 石蜡切片—HE染色 |
| 4.2.16 Western Blot检测移植细胞来源 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 绵羊脐带间充质干细胞成肌细胞分化形态变化 |
| 4.3.2 成肌细胞的检测 |
| 4.3.3 小鼠肌肉损伤修复 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）利用MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 结论 |
| 1.1 间充质干细胞 |
| 1.1.1 骨髓间充质干细胞 |
| 1.1.2 脂肪充质干细胞 |
| 1.1.3 脐带间充质干细胞 |
| 1.2 脐带间充质干细胞的分化 |
| 1.2.1 脐带间充质干细胞的分化 |
| 1.2.2 脐带间充质干细胞的临床应用基础 |
| 1.2.3 脐带间充质干细胞在研究中遇到的问题 |
| 1.3 生肌调节因子概述 |
| 1.3.1 MyoD因子的结构特点 |
| 1.3.2 MyoD能使其他类型的细胞向成肌细胞转化 |
| 1.3.3 MyoD的表达与生物学功能 |
| 1.4 研究的目的意义 |
| 2 小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和细胞 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 主要试剂及药品 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.1.5 实验仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠MyoD真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 MyoD-pcDNA3.1载体的检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠MyoD基因的扩增及克隆载体的鉴定 |
| 2.3.2 小鼠MyoD基因真核表达载体的鉴定 |
| 2.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞培养及转染 |
| 2.3.4 MyoD的相对表达量检测 |
| 2.3.5 MyoD蛋白表达检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊脐带间充质干细胞诱导分化为成肌细胞 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂及药品 |
| 3.1.3 溶液的配制 |
| 3.1.4 实验仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绵羊脐带间充质干细胞的培养 |
| 3.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的转染及诱导分化 |
| 3.2.3 成肌细胞的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊脐带间充质干细胞的培养 |
| 3.3.2 绵羊脐带间充质干细胞的转染及诱导分化 |
| 3.3.3 成肌细胞的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究（论文提纲范文）
| 表格索引 |
| 图形索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1 干细胞与间充质干细胞 |
| 1.1 干细胞的定义与分类 |
| 1.2 间充质干细胞的多能分化特性 |
| 1.3 脂肪间充质干细胞的分离培养与性质 |
| 2 肌肉形成与成肌诱导 |
| 2.1 胚胎发育与细胞分化机理 |
| 2.2 骨骼肌细胞发育和成肌调节的关键因子 |
| 2.3 间充质干细胞的成肌诱导与机理 |
| 3 体外肌肉组织工程 |
| 3.1 种子细胞 |
| 3.2 支架技术研究概况 |
| 3.3 培养条件与生物反应器 |
| 3.4 国内外“试管肉”研究组织概况 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 小鼠ADSCs的分离、鉴定与生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞培养与形态 |
| 2.2 细胞不同代次的生长曲线 |
| 2.3 细胞周期 |
| 2.4 染色体分析 |
| 2.5 小鼠ADSCs的表面标志鉴定结果 |
| 2.6 鼠ADSCs的成脂染色结果 |
| 2.7 小鼠ADSCs的成骨染色结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离与鉴定研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 培养细胞生长特性 |
| 2.2 生长曲线 |
| 2.3 小鼠骨骼肌卫星细胞的核型分析 |
| 2.4 小鼠骨骼肌卫星细胞的免疫荧光鉴定 |
| 2.5 小鼠骨骼肌卫星细胞的RT-PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 小鼠脂肪间充质干细胞的成肌诱导分化与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 诱导剂5-Aza的浓度效应的测定结果 |
| 2.2 ADSCs在最佳诱导浓度中的凋亡检测 |
| 2.3 ADSCs经过不同诱导后细胞形态的变化 |
| 2.4 ADSCs诱导后免疫荧光检测 |
| 2.5 诱导后不同组生肌基因的RT-PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新说明 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（9）间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植后自身特性的维持 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新及意义 |
| 思考与展望 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表的论文 |
（10）人脐带血间充质干细胞向成肌细胞分化的体外研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 引言 |
| 第一部分:脐带血间充质干细胞培养体系的建立 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 1.4 主要试剂和溶液的配制 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 脐带血的采集与MNCs的分离 |
| 2.2 培养条件的比较 |
| 2.3 流式细胞仪测定UCB-MSCs表面标记 |
| 2.4 向成骨细胞的诱导 |
| 2.5 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 UCB-MNCs不同分离方法的比较 |
| 3.2 不同培养基的比较 |
| 3.3 不同FBS浓度的比较 |
| 3.4 不同种植密度的比较 |
| 3.5 UCB-MSCs表面标记的流式细胞仪测定 |
| 3.6 UCB-MSCs诱导成骨 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分:脐带血间充质干细胞向成肌细胞分化的研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 1.4 主要试剂和溶液的配制 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 UCB-MNCs的采集、分离与UCB-MSCs的培养 |
| 2.2 MTT法检测不同浓度5-Aza对UCB-MSCs增殖的影响 |
| 2.3 5-Aza诱导UCB-MSCs向成肌细胞分化 |
| 2.4 UCB-MSCs经5-Aza诱导后,MyoD1、myogenin和myosin heavy chain免疫荧光染色 |
| 2.5 UCB-MSCs经5-Aza诱导后,MyoD1、myogenin和myosin heavy chain的mRNA Real-time PCR检测 |
| 2.5.1 Trziol法提取总RNA的步骤 |
| 2.5.2 RNA逆转录cDNA |
| 2.5.3 PCR预实验 |
| 2.5.4 SYBR GREEN Realtime PCR |
| 2.5.5 数据处理 |
| 2.5.6 引物序列 |
| 2.6 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 UCB-MNCs的采集、分离与UCB-MSCs的培养 |
| 3.2 5-Aza对UCB-MSCs增殖的影响 |
| 3.3 5-Aza诱导UCB-MSCs向成肌细胞分化的形态学改变与MyoD1、myogenin和myosin heavy chain IF染色表达 |
| 3.4 Real-time PCR检测UCB-MSCs经5-Aza诱导后,成肌细胞分化相关调控基因mRNA水平的表达 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间撰写的论文与参加会议情况 |
| 致谢 |
四、MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究（论文参考文献）
- [1]gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化[D]. 肖艳宇. 广西大学, 2021(12)
- [2]基于MAPK/ERK1/2/ETS1信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[D]. 陈锦成. 福建中医药大学, 2021(09)
- [3]骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究[D]. 商国凯. 山东大学, 2021(11)
- [4]调控PPARγ对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响[D]. 闫研. 延边大学, 2020(05)
- [5]有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究[D]. 赵昱. 华东师范大学, 2019(08)
- [6]绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究[D]. 杜文敬. 东北林业大学, 2019(02)
- [7]利用MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究[D]. 马丽媛. 东北林业大学, 2015(01)
- [8]小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究[D]. 吴海浩. 南京农业大学, 2013(08)
- [9]间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究[D]. 赵文勇. 重庆医科大学, 2013(03)
- [10]人脐带血间充质干细胞向成肌细胞分化的体外研究[D]. 刘岱. 中国协和医科大学, 2009(07)