一、Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo explants by Agrobacterium tumefaciens（论文文献综述）
刘炎,刘克俭,王江,王颖,张毓航伊,王昊,初艳,由香玲[1]（2021）在《农杆菌介导的针叶树种遗传转化研究进展》文中认为农杆菌介导法是目前遗传转化应用最广泛的技术手段之一。本文主要从农杆菌菌株、外植体类型、预培养时间、侵染过程、共培养条件以及抗性细胞的筛选等方面综述了影响针叶树转化效率的因素,为针叶树的遗传转化及遗传育种研究提供参考。
张素芳[2]（2020）在《杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究》文中研究表明落叶松是我国北方重要的用材、生态树种之一,利用选择育种、杂交育种等已获得一批生长材质优良的种质资源。由于极端气候条件频发,东北地区春季干旱严重,严重影响落叶松成活及生长,选育抗旱品种十分必要。常规育种改良周期较长,从分子方面开展遗传改良可缩短育种周期,但落叶松干旱响应等分子机理的研究远远落后于其他树种。miRNA是植物中参与转录后基因表达调控的一类非编码单链小RNA分子,主要通过降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译调控基因的表达,从而改变植株生长性状或抗逆性等。为定向改良落叶松的优良性状并大量快速繁殖优良种质资源,以杂种落叶松日3×兴9未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织,构建并优化落叶松胚性愈伤的遗传转化体系,同时对干旱胁迫条件下落叶松sRNA进行初步功能分析挖掘miRNA,获得Lol-miR11467并进行遗传转化,分析转基因细胞系在干旱、盐碱胁迫条件下的生理变化并筛选其调控的下游靶基因,主要研究结果如下:（1）杂种落叶松遗传转化体系的构建与优化。胚性愈伤组织的诱导率与球果采集时间有关,7月1日采集的材料诱导率最高,是未成熟合子胚的最佳采集时期。使用75%酒精消毒1 min后使用3%NaClO消毒10 min,接种在含有1.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM培养基中,胚性愈伤组织诱导率最大,为10.33%。在含有0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM增殖培养基上培养12 d时为最佳继代周期。预培养在含有10 g/L肌醇、60 g/L蔗糖的1/4 BM培养基上获的体胚发生数最多。45 mg/L的ABA和75 g/L的PEG4000共同作用能够促进体胚的发生数,体胚发生数量达到最大,为210个/g。采用农杆菌介导法对落叶松进行遗传转化时,发现使用OD600值为0.5的侵染液侵染20 min,共培养2 d,利用4 mg/L Hyg的筛选培养基进行抗性愈伤的筛选,pCAMBIA1301遗传转化效率最高,为45.56%。（2）干旱胁迫下落叶松小RNA挖掘。使用miRDeep2软件共预测到190个miRNAs,其靶基因总数为6284个,共4964个获得注释信息。获得差异表达的miRNAs共59个,约占所有预测的miRNAs（190个）的31.05%,其中有33个是上调表达,26个下调表达。对其差异表达miRNA的靶基因进行富集分析,发现富集较多的是代谢途径,显着富集的是代谢途径中的ABC转运、类胡萝卜素的生物合成、植物激素信号转导、N-聚糖生物合成等,表明miRNAs的调控由多种代谢途径共同参与,miRNAs可能在落叶松的生长发育、胁迫响应等不同生命过程中发挥着重要的作用。（3）落叶松miRNAs的表达分析。在不同的胁迫处理下,大多数miRNAs都能够响应干旱、盐碱胁迫。其中novelmiR63在PEG6000和NaCl胁迫时快速响应,利用不同激素处理后,发现novelmiR63（Lol-miR11467）均能够响应激素应答,novelmiR63与miRBase数据库比对发现,与云杉的miR11467相似度较高,其靶基因注释为生物保护性大分子蛋白之一的热激蛋白,在干旱胁迫中具有一定的调控作用。将其作为候选基因进行遗传转化,并命名为Lol-miR11467。（4）Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化。利用农杆菌介导法将Lol-miR11467转入杂种落叶松的胚性愈伤组织中,获得抗性愈伤细胞系27个。将转基因细胞系与野生型细胞系分别放于含有20%PEG6000、50 mM NaHCO3和250 mM NaCl的培养基中,在不同的胁迫处理下,转基因细胞系的POD活性均低于野生型,MDA含量均高于野生型,可溶性蛋白含量均低于野生型,推测Lol-miR11467在落叶松中具有一定的负调控干旱、盐碱胁迫的能力。（5）Lol-miR11467靶基因筛选。3个转基因细胞系的差异基因GO和KEGG富集分析表明,由Lol-miR11467转入后引起的差异基因显着富集在次生代谢的生物合成、激素响应、类黄酮生物合成以及苯丙烷生物合成,表明Lol-miR11467可能在落叶松中响应胁迫、激素等外界刺激以及次生代谢和苯丙烷生物合成的代谢途径中发挥着很重要的作用。对3个转基因细胞系共有的差异基因进行深入挖掘,发现MYB、bHLH、NAC、WRKY等转录因子类,LEA、热激蛋白等生物保护性大分子类以及糖基转移酶、半乳糖苷酶等糖代谢相关的酶类以及与miRNA自身相关的AGO蛋白等和抗旱相关基因的下调表达,推测过表达Lol-miR11467可以通过负调控这些基因的表达而使落叶松抵抗干旱胁迫的能力降低。以抗性愈伤组织转录组的差异基因序列作为参考序列,对Lol-miR11467进行靶基因预测,预测到4条与干旱胁迫相关且下调表达的靶基因。综上所述,本研究通过杂种落叶松遗传转化体系的构建及干旱胁迫下的差异miRNAs分析,获得转Lol-miR11467基因的抗性细胞系,其生理指标检测表明转基因细胞系的抗旱能力减弱,最终找到了可能与落叶松抗旱性减弱相关的4条Lol-miR11467的靶基因。本研究为落叶松或针叶树的遗传转化及miRNAs的分子机理研究奠定基础。
罗珍珍[3]（2020）在《农杆菌介导栓皮栎体胚遗传转化体系建立的研究》文中研究表明栓皮栎（Quercus variabilis Bl）是我国最主要的软木资源树种,具有重要的生态价值和经济价值。林木遗传改良是提高生产力和抗病虫害能力的重要途径,将植物基因工程和常规育种相结合,能够加快遗传改良的进程。其中,农杆菌介导的遗传转化是植物转基因强有力的生物技术工具。因此,开展栓皮栎遗传转化体系的研究,对该树种的遗传改良具有重要意义。本研究以栓皮栎未成熟合子胚为外植体诱导体胚发生,开展了细胞悬浮培养过程中不同因子对胚性组织增殖的影响,低温干燥处理对体胚萌发的影响,优化了体胚再生植株受体系统;在此基础上,研究了菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、预培养时间、侵染时间及共培养时间对遗传转化的影响,初步建立了栓皮栎体胚遗传转化体系。主要结果如下:1.栓皮栎通过次生体胚发生方式增殖,在瞬时浸入式培养中,每间隔48 h将胚性组织浸入液体培养基中1 min,获得了363.8%的增殖率。细胞悬浮培养过程中,每50 ml液体培养基接种0.1 g的初始培养物,在110 r·min-1转速中培养4周,获得了高达638.5%的增殖率。2.在萌发培养中,以MS为基本培养基,0.5 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的组合能促进体胚的萌发,得到40.0%萌发率。成熟培养后对体胚进行一定时间的冷藏或半干燥处理有利于体胚的萌发,其中2周的4℃冷藏萌发率达到了47.8%3.在抗生素敏感性试验中,头孢霉素浓度为300 mg·L-1时可以明显抑制胚性组织生长,潮霉素浓度为30 mg·L-1时胚性组织成活率仅为1.7%,因此在转化组织筛选培养阶段,头孢霉素和潮霉素的适宜浓度分别为300 mg·L-1和30 mg·L-1。4.通过农杆菌EHA105介导的遗传转化获得了转化GUS基因胚性组织:将胚性组织块预培养15天,用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染20 min,将侵染后的组织块在添加200μmol·L-1乙酰丁香酮的共培养基上共培养3天,GUS转化率可达100%。5.在经过GUS染色验证的转化组织中选取12块组织,提取DNA进行PCR检测,其中10块组织扩増出了目标条带,进一步证明GUS基因已转入栓皮栎中,另外2块组织未扩增出任何条带,是假阳性组织。
吴晓雪[4]（2020）在《日本落叶松体细胞胚发生及mtlD基因的遗传转化》文中提出为了得到环境适应性强的落叶松植株,本研究以日本落叶松胚性愈伤组织为材料,对落叶松体细胞胚发生的不同阶段、体细胞胚发育及mtl D基因的遗传转化进行研究。（1）采用正交设计确定日本落叶松体细胞胚诱导的ABA、PEG 4000、Ag NO3最佳浓度,并将体细胞胚接种至AC浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的萌发培养基,统计萌发数量。结果表明适合日本落叶松体细胞胚诱导的浓度是ABA 20 mg/L+PEG4000 120 g/L+Ag NO310 mg/L,AC 0.4～0.6 g/L有利于体细胞胚萌发。（2）采用正交设计研究胚性愈伤组织在2,4-D 0.15、0.3、0.5 mg/L、6-BA 0、0.15、0.3 mg/L和ABA0、0.5、1.0 mg/L的增殖情况,采用析因设计研究悬浮细胞在2,4-D0.15、0.3、0.5 mg/L和6-BA 0、0.15、0.3 mg/L的鲜重增长情况。然后,选择对数期的胚性愈伤组织和悬浮细胞分别验证其体胚发生能力,结合两结果确定两种培养方式的最佳激素浓度。最后,分别研究了GA3和IAA 0、10、20、30、40 mg/L对体细胞胚发生的影响。结果表明在增殖阶段,最佳的激素浓度是2,4-D 0.15 mg/L+ABA 0.5mg/L;在悬浮培养阶段,最佳激素浓度是2,4-D 0.15 mg/L+6-BA 0.15 mg/L;GA3、IAA 10～20 mg/L时成熟子叶胚数量显着升高。（3）通过测定悬浮细胞在6-BA 0、0.15、0.3、0.6 mg/L条件下的鲜重、活性、细胞形态、抗氧化指标及木质素含量,结果发现6-BA对落叶松悬浮细胞的鲜重、活性、细胞形态、抗氧化指标及木质素含量均有显着影响（P<0.05）。（4）通过对球形胚和子叶胚的蛋白组测序分析和GO功能注释,发现生物进程中参与氧化还原过程的差异蛋白最显着,其中6个属于硫氧化还原蛋白家族。（5）试验通过农杆菌法和基因枪法转化落叶松胚性愈伤组织,最终利用基因枪法成功获得了转mtl D基因的落叶松胚性愈伤组织。本研究成功得到了体胚苗,并筛选出适宜增殖阶段胚性愈伤组织培养的激素浓度为2,4-D 0.15 mg/L+ABA 0.5 mg/L,适宜悬浮细胞培养的激素浓度为2,4-D 0.15 mg/L+6-BA 0.15 mg/L,还发现添加GA3和IAA 10～20 mg/L可以显着提高成熟子叶胚数量;6-BA可以通过抗氧化作用调节落叶松悬浮细胞活性;硫氧化还原蛋白在球形胚向子叶胚的发育过程中发挥重要作用。基因枪法可以成功获得转mtl D基因的胚性愈伤组织。
张耀[5]（2020）在《农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化》文中研究表明落叶松是我国重要的针叶用材树种之一,利用分子育种手段对落叶松进行遗传改良,建立高效的人工林对落叶松产业的发展具有重要的意义。但目前落叶松的遗传转化技术仍然存在着不统一,稳定性差的问题,这主要是由落叶松易转化细胞系的缺乏,受体材料选择压使用不明确及转化条件没有标准化等因素造成。本研究以落叶松干细胞为材料,基于落叶松体细胞胚胎发生技术和农杆菌介导法,探究落叶松遗传转化过程中的影响因子,建立落叶松转基因标准化平台,提高落叶松遗传转化的效率和稳定性,并在此基础上筛选具有调控落叶松生长发育潜能的MADS-box基因,进行转化验证,为利用基因工程育种创制新种质对落叶松进行遗传改良提供良好的平台。主要研究结果如下:（1）利用不同浓度的Hyg（Hygromycin B）、Cef（Cefotaxime）对落叶松胚性细胞系进行抗生素选择压的筛选,结果显示:Hyg能显着抑制落叶松胚性细胞的生长,当Hyg浓度为3 mg/L时,细胞系X228已基本不再增殖;当Hyg浓度为5 mg/L时,细胞系X31和X268不能再进行增殖。最适合落叶松胚性细胞生长的Cef的浓度为300-500 mg/L,在此Cef浓度下,落叶松胚性细胞的增殖速率加快。（2）通过对9个不同基因型的落叶松胚性细胞系进行增殖能力、成熟体细胞胚诱导率、生根率及转化率的筛选,结果表明,细胞系X31、X228、X268具有较强的再生能力和较高的转化率,符合落叶松易转化细胞系的要求,适宜作为遗传转化的受体材料。（3）通过设置农杆菌浓度为OD600=0.1、0.3、0.5、0.7,侵染时间为10 min、20 min、30 min,共培养时间为1 d、2 d、3 d,和Cef的浓度为300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L,恢复培养的时间为5 d、7 d、9 d进行落叶松遗传转化条件的优化来探索遗传转化的标准条件,结果表明,当农杆菌的浓度为OD600=0.1,侵染时间为10 min,且共培养48 h时,具有最高的转化率;Cef的最适脱菌浓度为400 mg/L,恢复培养的最佳时间为7 d,基于此转化条件我们的转化率达到2.0个/g。（4）对实验室之前得到的27个转录本进行生物信息学分析和基因克隆,共得到20个转录因子,其中多数属于MADS-box家族。GO注释分析表明,它们大部分与植物的生殖发育相关,q RT-PCR的结果显示,LaAGL2-1、LaAGL2-2、LaAGL2-3、LaSOC1-1、LaAGL11、LaAP2-2的表达模式呈现出年龄依赖性,且在无性繁殖过程中表达模式发生了改变,在落叶松从幼年生长阶段向成年生殖生长阶段的转变中发挥着调控作用,具有促进落叶松速生的潜能。进一步利用本文建立的落叶松转基因标准化平台对这些基因进行遗传转化,成功获得了转基因阳性细胞系,证明了落叶松转基因标准化平台的稳定性。综上所述,我们建立了落叶松转基因标准化平台,提高了落叶松遗传转化的效率和稳定性,筛选出了具有速生潜力的目标基因,为利用遗传转化创制落叶松新种质提供了一个高效、稳定的体系。
李亦轩[6]（2019）在《油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究》文中提出油松（pinus tabulaeformis C.）具有耐瘠薄、抗风,适应恶劣环境能力强等特点,是华北,西北及东北地区主要的造林树种。油松虽然用途广泛,但是由于油松的繁殖效率低,生长周期长,且有性繁殖后代变异较大,所以有关该树种的快速繁殖技术仍停滞不前。而有关针叶树繁育技术的研究中,体细胞胚胎发生是大规模繁殖的有效方法之一,本研究以油松为试验材料,在前期建立的油松体胚发生体系基础上,在新细胞系筛选、胚性细胞增殖、体胚成熟等环节分析影响这些环节的各个因素,进一步提高效率,优化体胚体系;并基于体胚体系进行遗传转化的初步研究,以期为油松优良种质的大规模繁殖和重要基因的功能研究提供技术支撑。主要研究结果如下:（1）选用油松未成熟合子胚为外植体材料,诱导新的油松胚性细胞系,增多胚性细胞系的总量。共获得17个胚性细胞系,其中15c4b,16c4g,17c4c是3个有潜力进行大规模繁殖的细胞系。（2）基于气动生物反应器建立了油松胚性愈伤组织高效增殖体系。结果表明气动生物反应器中每100 mL液体培养基内接种胚性愈伤10g,2,4-D 0.2 mg·L-1保留20 mL的旧培养基时能使胚性愈伤增殖率达到最高,可达216.18%,比同期悬浮培养高3.15倍。（3）优化了油松体胚的成熟培养基。选用胚性较好的细胞系15c4b为材料,研究了 ABA浓度、PEG浓度、糖的种类和浓度、以及植物凝胶的浓度对胚性愈伤组织成熟的影响。最终结果显示:成熟培养基中ABA浓度16 mg·L-1、PEG浓度75 g·L-1、植物凝胶浓度5 g·L-1、麦芽糖和蔗糖浓度10+30 g·L-1时,油松体细胞胚的成熟效率提高了 0.8倍。（4）初步探索了油松的遗传转化。使用油松固体愈伤组织和液体悬浮组织进行遗传转化研究,研究结果显示Kan=50-75 mg·L-1对于转化是有利的,当OD值在0.4-0.6之间,侵染时间为5-15 min,共培养时间为48 h时,农杆菌与胚性愈伤组织状态良好,能够得到GUS染色为阳性的愈伤组织。
胡继文,郭文冰,邓乐平,钟岁英,王为民,赵奋成,黄婷,吴惠姗,李义良,廖仿炎[7]（2018）在《松树体细胞胚胎发生技术的发展与应用》文中研究指明植物体细胞胚胎（SE）发生作为上世纪中叶以来最强大的生物技术之一,相比其它无性繁殖方法,具有诸多优势。松树是世界上重要的商品林树种,松树SE研究是开展松树育种与繁育的热门领域。文章综述了松树SE的研究历程,对松属树种的SE发生情况进行了归纳;详细阐述了体胚发生技术在松树新品系选育（包括无性系林业及遗传改良）、苗木扩繁、遗传转化及杂种后代胚拯救方面的应用实例,以期为SE技术在松树上的利用提供参考。
殳晓强[8]（2017）在《马尾松组织培养与遗传转化的研究》文中指出本研究以广东信宜市林科所国家马尾松良种基地的混合家系成熟合子胚为外植体,对马尾松不定芽诱导、继代增殖、伸长和不定根诱导进行研究。并在此基础上,运用农杆菌介导马尾松RCA小同工型基因转化马尾松成熟合子胚进行遗传转化研究,以期提高马尾松光合生产力。主要研究结果如下:1.马尾松成熟种子的最佳灭菌方法为70%酒精消毒1min+0.1%升汞灭菌10min,成活率为90%。2.以马尾松成熟合子胚为外植体诱导不定芽的适宜培养基为DCR+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.7g/L琼脂,pH=5.8,诱导出的不定芽生长健壮、翠绿,最高诱导率为78.54%。同时在培养基中添加10mg/LVc能有效抑制外植体褐化。3.马尾松不定芽增殖的合适培养基为DCR+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+10mg/L Vc+30g/L蔗糖+6.7g/L琼脂,pH=5.8。增殖后的芽翠绿,生长健壮,增殖系数为12.74。4.马尾松不定芽伸长的适宜培养基为DCR+0.15mg/LIBA+30g/L蔗糖+10mg/LVc+6.7g/L琼脂,pH=5.8,最高不定芽高7.8cm,不定芽徒长,茎伸长方面显得不明显。5.马尾松诱导不定根的适宜培养基为1/2DCR+0.5mg/LIBA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+10mg/LVc+6.7g/L琼脂,pH=5.8,生根率为10.0%,生长良好,有利于移栽的成活。6.在遗传转化选择压和抑菌抗生素浓度的确定试验中,筛选标记基因为新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）,采用卡那霉素和头孢霉素作为筛选抗生素和抑菌抗生素。经过梯度对比试验,结果表明采用50mg/LKan、200mg/LCef作为筛选时的选择压和抑菌抗生素浓度。7.在马尾松成熟合子胚遗传转化体系研究中,分析了影响成熟合子胚转化率的几个因素（预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度）,结果显示预培养时间为3d,菌液浓度OD600=0.6,侵染时间20min,共培养时间为3d,AS浓度为100μM是获得抗性芽较好的转化条件。8.对未转基因的马尾松进行实时定量得知,RCA小同工型基因在嫩叶中表达最高,茎中次之,根中表达量最低。
宋跃[9]（2017）在《长白落叶松体细胞胚胎发生及遗传转化研究》文中研究说明长白落叶松具有抗逆性强及早期速生等优点,为北半球温带山区与寒带气候条件下重要的速生用材树种,具有很高的生态价值与经济价值。但长白落叶松杂合性高、有性生殖产生的子代变异较大,而扦插及不定芽再生途径等无性繁殖方式也存在生根率较低、成苗困难等问题,通过传统的育种方法无法满足快速遗传改良的需求。因此,本研究以长白落叶松未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织,建立并优化了体细胞胚胎发生体系、胚性愈伤组织的悬浮培养体系及农杆菌介导的遗传转化体系,并在此基础上,对处于不同发育阶段的体细胞胚的理化特性进行了初步研究。主要研究结果如下:（1）长白落叶松授粉70天后采集的合子胚适合诱导胚性愈伤组织,基本培养基为BM,添加2,4-D 1.5 mg·L-1、BA 0.5 mg·L-1及KT 0.5 mg·L-1,且不同无性系间的诱导率存在一定差异。（2）胚性愈伤组织在含2,4-D 0.3 mg·L-1、BA 0.1 mg·L-1及KT 0.1 mg·L-1的BM培养基中可迅速增殖并长期保持其胚性。经悬浮培养的胚性组织增殖较快,在震荡强度为120 r·min-1、初始接种量为4 g·L-1（即25 mL液体培养基接种0.1 g组织）的条件下,培养14天的增殖率约为1726.67±126.64%,约是相同条件下固体培养的8倍。（3）体胚成熟培养前,进行胚性愈伤组织的预培养对体细胞胚胎的成熟具有积极的促进作用。预培养培养基的肌醇浓度、离子总浓度及培养周期对胚性愈伤组织的体胚发生量均有极为显着的影响,而蔗糖、谷氨酰胺及水解酪蛋白的影响不显着。采用Box-Behnken Design设计响应面试验并建立数学模型,预测预培养最佳条件为离子浓度26.77%（BM）、肌醇浓度10.46 g·L-1、培养天数12.66 d,体细胞胚胎的发生量为337.04个·g-1。（4）体胚成熟阶段,体细胞胚胎的最终获得量受多种因素影响。其中,脱落酸、硝酸银、蔗糖、水解酪蛋白及过氧化氢浓度对体胚发生量的影响显着,而麦芽糖、肌醇及谷氨酰胺的影响则不显着。采用Box-Behnken Design设计试验建立响应面模型拟合长白落叶松体胚成熟的最适培养条件为:BM培养基添加ABA 18.28 mg·L-1、AgNO3 5.46 mg·L-1、蔗糖82.63 g·L-1,每克胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生量平均为203.72个。（5）长白落叶松的体胚发生过程伴随着细胞的分裂与分化、组织与器官的形态建成以及一系列的生理生化变化。根据胚性细胞及体细胞胚的形态认定:在组织增殖阶段,体胚处于原胚团时期;过渡培养14天,体胚已发育至前子叶胚初期;成熟培养7天,体胚的发育进入前子叶晚期;14天时,体胚发育至子叶胚初期,其形态接近成熟;28天时,体胚发育至子叶胚晚期阶段。在体胚成熟过程中,可溶性糖含量总体呈上升趋势,可溶性蛋白质含量及SOD活性呈“下降-上升-下降”的变化趋势,而POD活性则呈“波浪式”的下降。（6）Cef、Kan及Hyg三种抗生素对长白落叶松胚性愈伤组织均具有不同程度的毒性。添加100-400 mg·L-1的Cef可引起长白落叶松胚性愈伤组织的增殖速率降低,但不影响其胚性细胞及细胞团的形态结构。10 mg·L-1的Kan或2 mg·L-1的Hyg即能显着降低胚性愈伤组织的增殖率,并完全抑制体细胞胚的成熟;20mg·L-1的Kan或4 mg·L-1的Hyg能够抑制胚性组织的增殖。（7）在含有0.15 mg·L-1 2,4-D、0.05 mg·L-1 BA及KT的BM培养基上增殖的长白落叶松胚性愈伤组织经OD600≈0.6的菌悬液（菌株为GV3101）侵染20 min,随后共培养3天,菌悬液及共培养培养基中均添加100μM·L-1AS;使用200 mg·L-1的Cef漂洗组织10 min进行脱菌,恢复培养3-7天后,再将组织转接于含有4 mg·L-1 Hyg的培养基进行连续筛选,筛选时将组织的大小调整为1.4cm2,抗性组织平均可达0.56±0.04个·cm2。本研究共获得Hyg抗性细胞系74个;PCR检测阳性率达88.34%,组织化学检测初步证明外源GUS基因已整合到植物基因组中并进行了表达。抗性组织进行体细胞胚胎成熟获得GUS基因表达的成熟体胚,不同转化胚性系的体胚成熟频率略有不同,但相较于未经转化的对照组织无显着的差异。
孔宇飞[10]（2014）在《悬铃木开花相关基因遗传转化研究》文中研究指明悬铃木在我国种植范围广泛,已成为我国大中城市重要的行道树及园林绿化树种。在我国长江黄河流域,武汉、南京、上海等城市70%以上的行道树都为悬铃木。但是,悬铃木果实是由多数小坚果集合成球形的聚花果,小坚果基部围有长绒毛,每年4-6月老果脱落,大量的果毛飘散,而且在果毛飘散的同时,也会有大量的花粉随着当年新生雄花序开放而散落。这些问题不仅对环境造成了污染,而且还会引发一些呼吸系统疾病,对人们生活出行和身体健康产生影响,这使它的应用受到一些限制。利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导,将外源目的基因导入到受体中,培育新品种成为悬铃木缩短育种时间,定向育种的途径。本项研究是在本课题组在悬铃木无球果育种上的多年研究成果的基础上,利用GUS报告基因对影响以悬铃木合子胚为受体的农杆菌介导遗传转化条件进行探索。通过优化好的遗传转化体系,转化带有开花相关基因的目的载体,由PCR检测结果。主要研究结果如下：1.通过对悬铃木球果贮藏条件的初步探索,确定最适组合。通过合子胚成活率和成活后合子胚生长情况,选出处理条件为纸袋包装、放置72h、在-20℃下贮藏和乙烯袋包装、放置72h、在-20℃下贮藏,含水量约为6%,为最佳组合。2.通过对悬铃木合子胚再生体系的优化,结果表明用于侵染的合子胚幼苗,在分化培养基中Km浓度为100mg/L下,仍然是可以发生分化,只是分化数量减少,但是在其后的长时间Km筛选下在浓度为75mg/L是完全可以抑制住非转化苗的生长的；在生根实验中,在Km的生根压力为75mg/L下,即可完全抑制根生长；在Tm浓度对合子胚生长的研究中,确定Tm的浓度为300mg/L,最适合作为转化体系的抑菌浓度。3.在确定农杆菌介导的悬铃木合子胚遗传转化条件的实验中,通过对GUS瞬间表达率以及其他相关数据的分析,得出1h侵染时间、4h甘露醇处理、6-7d预培、3d100mg/1浓度的AS共培效果较好；通过对农杆菌菌液浓度和农杆菌类型分析,得出菌液浓度为OD值在0.6-0.8之间,农杆菌的侵染能力最强,适合侵染T-DNA的整合,农杆菌EHA105适合作为侵染细菌。4.五种目的基因经过长达半年多的筛选情况。LFY-FUli抗性植株得到2株为阳性；Ap3-Barnase抗性植株经PCR检测A-114、A-303、A-306为阳性植株；TFLi抗性植株经检测1株系为阳性植株；LFY没有得到阳性株；PI-Barnase抗性植株经检测有4株呈阳性。
二、Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo explants by Agrobacterium tumefaciens（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo explants by Agrobacterium tumefaciens（论文提纲范文）
（1）农杆菌介导的针叶树种遗传转化研究进展（论文提纲范文）
| 1 针叶树遗传转化农杆菌菌株的选择 |
| 2 针叶树遗传转化外植体的选择 |
| 3 农杆菌介导针叶树遗传转化的预培养时间 |
| 4 农杆菌介导针叶树遗传转化的侵染过程 |
| 4.1 菌液浓度和时间 |
| 4.2 添加剂 |
| 4.3 超声处理 |
| 5 农杆菌介导针叶遗传转化的共培养条件 |
| 6 农杆菌介导针叶树遗传转化的抗性细胞筛选培养 |
| 6.1 外植体脱菌 |
| 6.2 抗性细胞的筛选 |
| 6.2.1 延迟筛选 |
| 6.2.2筛选剂 |
| 6.2.3 浓度 |
| 6.2.4 筛选强度 |
| 7 结语 |
（2）杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 针叶树体胚发生研究进展 |
| 1.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
| 1.2.2 胚性愈伤组织的增殖及继代 |
| 1.2.3 体胚成熟 |
| 1.3 落叶松体胚发生研究进展 |
| 1.4 针叶树的遗传转化研究 |
| 1.4.1 针叶树的遗传转化 |
| 1.4.2 落叶松的遗传转化 |
| 1.5 miRNA的研究进展 |
| 1.5.1 miRNA的发现 |
| 1.5.2 miRNA的作用机理 |
| 1.5.3 植物miRNA的功能研究 |
| 1.5.4 miRNA在针叶树及落叶松中的研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 2 杂种落叶松遗传转化体系的建立与优化研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验菌株、药品与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 药品及培养基的制备 |
| 2.2.2 外植体的消毒及接种 |
| 2.2.3 胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.2.4 胚性愈伤组织的增殖及继代周期的确定 |
| 2.2.5 体细胞胚胎成熟及萌发 |
| 2.2.6 抗生素敏感性试验 |
| 2.2.7 胚性愈伤组织的遗传转化 |
| 2.2.8 统计及分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 再生体系的优化 |
| 2.3.2 遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.3.3 转pCAMBIA1301空载体株系的分子验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 外植体选择对诱导率的影响 |
| 2.4.2 植物生长调节剂对诱导的影响 |
| 2.4.3 胚性愈伤组织的增殖培养 |
| 2.4.4 农杆菌介导的遗传转化的影响因素 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 干旱胁迫下的落叶松小RNA挖掘与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小RNA文库的构建及质量控制 |
| 3.2.2 miRNA预测及鉴定分析 |
| 3.2.3 miRNA差异基因聚类及表达分析 |
| 3.2.4 miRNA靶基因预测及功能注释分析 |
| 3.2.5 sRNA测序数据的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小RNA文库的构建及质量分析 |
| 3.3.2 小RNA序列分析 |
| 3.3.3 miRNA预测及筛选 |
| 3.3.4 sRNA测序的数据验证 |
| 3.3.5 miRNA靶基因预测及其功能注释 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 miRNA响应不同处理的表达模式分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂及药品 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 miRNA提取及反转录 |
| 4.2.2 miRNA的qRT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 miRNA在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.3.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 miRNAs在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.4.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株、试剂及药品 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 pCAMBIA1301-Lol-miR11467的过表达载体构建 |
| 5.2.2 转pCAMBIA1301-Lol-miR11467基因株系的分子检测 |
| 5.2.3 不同胁迫处理的转基因愈伤组织的形态变化 |
| 5.2.4 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.0 转基因细胞系的检测 |
| 5.3.1 不同胁迫处理下转基因愈伤组织的变化 |
| 5.3.2 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 Lol-miR11467的靶基因筛选与分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 转录组测序及生物信息学分析 |
| 6.2.2 qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 测序数据质量评估及组装 |
| 6.3.2 差异表达基因筛选 |
| 6.3.3 转录组数据验证 |
| 6.3.4 Unigene功能注释 |
| 6.3.5 差异表达关键基因的挖掘及归纳 |
| 6.3.6 Lol-miR11467靶基因筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（3）农杆菌介导栓皮栎体胚遗传转化体系建立的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物体细胞胚胎发生 |
| 1.1.1 木本植物体胚发生研究进展 |
| 1.1.2 栎属植物体胚发生研究进展 |
| 1.2 木本植物遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 农杆菌介导木本植物遗传转化 |
| 1.2.2 影响农杆菌转化效率的因素 |
| 1.2.3 农杆菌介导栎属植物遗传转化 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 1.3.1 研究意义 |
| 1.3.2 研究目的 |
| 第二章 栓皮栎体胚再生植株受体系统的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 体胚的诱导 |
| 2.2.2 细胞悬浮培养 |
| 2.2.3 瞬时浸入式培养 |
| 2.2.4 体胚的成熟及萌发 |
| 2.3 数据统计 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 细胞悬浮培养初始接种量对培养物增殖的影响 |
| 2.4.2 转速对培养物增殖的影响 |
| 2.4.3 培养时间对培养物增殖的影响 |
| 2.4.4 瞬时浸入间隔时间对培养物增殖的影响 |
| 2.4.5 培养方式对增殖率的影响 |
| 2.4.6 植物生长调节剂浓度对体胚萌发的影响 |
| 2.4.7 成熟后处理对体胚萌发的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 外植体与胚性愈伤组织诱导 |
| 2.5.2 体胚增殖与培养方式 |
| 2.5.3 成熟后处理与萌发 |
| 第三章 农杆菌介导栓皮栎体胚的遗传转化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗生素敏感性试验 |
| 3.2.2 农杆菌的活化 |
| 3.2.3 转化试验 |
| 3.2.4 GUS组织化学染色 |
| 3.2.5 DNA的提取和GUS基因的PCR检测 |
| 3.2.6 统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 抗生素对胚性愈伤组织成活的影响 |
| 3.3.2 预培养时间对遗传转化率的影响 |
| 3.3.3 菌液浓度对遗传转化率的影响 |
| 3.3.4 侵染时间对遗传转化率的影响 |
| 3.3.5 共培养时间对遗传转化率的影响 |
| 3.3.6 乙酰丁香酮对遗传转化率的影响 |
| 3.3.7 抗性组织的PCR检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 转化受体的选择 |
| 3.4.2 抗生素的选择 |
| 3.4.3 预培养 |
| 3.4.4 农杆菌菌液浓度与侵染时间 |
| 3.4.5 共培养和乙酰丁香酮 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）日本落叶松体细胞胚发生及mtlD基因的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 1 引言 |
| 1.1 落叶松体细胞胚发生 |
| 1.1.1 落叶松胚性愈伤组织诱导与增殖 |
| 1.1.2 落叶松悬浮细胞培养 |
| 1.1.3 落叶松体细胞胚诱导与成熟 |
| 1.1.4 体细胞胚植株再生 |
| 1.2 落叶松遗传转化研究进展 |
| 1.3 mtlD基因研究进展 |
| 1.4 研究目标、研究内容及技术路线 |
| 1.4.1 研究目标 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 体细胞胚发生体系的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.2 体细胞胚发生体系的建立 |
| 2.2.1 胚性愈伤组织增殖 |
| 2.2.2 悬浮细胞培养 |
| 2.2.3 体细胞胚诱导与成熟 |
| 2.2.4 体细胞胚萌发 |
| 2.2.5 再生体胚苗的伸长与生根 |
| 2.2.6 数据统计 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 体细胞胚发生形态学观察 |
| 2.3.2 胚性愈伤组织增殖 |
| 2.3.3 悬浮细胞培养 |
| 2.3.4 体细胞胚诱导与成熟 |
| 2.3.5 体细胞胚萌发 |
| 2.3.6 体胚苗的伸长与生根 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 讨论 |
| 3 外源激素对体细胞胚发生的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 胚性愈伤组织增殖外源激素的选择 |
| 3.2.2 悬浮细胞培养外源激素的选择 |
| 3.2.3 体细胞胚诱导与成熟外源激素的选择 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 外源激素对胚性愈伤组织增殖的影响 |
| 3.3.2 外源激素对胚性愈伤组织体胚发生能力保持的影响 |
| 3.3.3 外源激素对悬浮细胞鲜重的影响 |
| 3.3.4 外源激素对悬浮细胞体胚发生能力的影响 |
| 3.3.5 外源激素对体细胞胚诱导与成熟的影响 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 4 6-BA对悬浮细胞活性的调控 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 悬浮细胞的培养条件 |
| 4.2.2 悬浮细胞形态学观察 |
| 4.2.3 悬浮细胞生长状态测定 |
| 4.2.4 细胞抗氧化能力分析 |
| 4.2.5 悬浮细胞木质素染色观察及含量分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 悬浮细胞形态学观察 |
| 4.3.2 不同浓度6-BA处理的落叶松悬浮细胞鲜重 |
| 4.3.3 6-BA对细胞SOD活性、H2O2和MDA含量的影响 |
| 4.3.4 木质素染色及测定分析 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 5 体细胞胚发育相关蛋白分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验试剂与仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 体细胞胚组织学观察 |
| 5.2.2 体细胞胚蛋白质组测序与分析 |
| 5.2.2.1 蛋白质的提取与定量 |
| 5.2.2.2 TMT标记与质谱分析 |
| 5.2.2.3 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 5.2.3 蛋白质聚类分析 |
| 5.2.4 差异表达蛋白质筛选 |
| 5.2.5 差异表达蛋白Gene Ontology功能注释 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 落叶松体细胞胚解剖学观察 |
| 5.3.2 蛋白质聚类结果分析 |
| 5.3.3 差异表达蛋白质 |
| 5.3.4 差异表达蛋白GO富集分析 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 讨论 |
| 6 mtlD基因的遗传转化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株与植物材料 |
| 6.1.2 试剂与仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 基因克隆 |
| 6.2.2 植物表达载体的构建 |
| 6.2.3 农杆菌侵染法转化落叶松胚性愈伤组织 |
| 6.2.4 基因枪法转化落叶松胚性愈伤组织 |
| 6.2.5 转基因愈伤组织的荧光观察 |
| 6.2.6 转基因愈伤组织PCR鉴定 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 目的基因的扩增 |
| 6.3.2 植物表达载体的构建与工程菌株的获得 |
| 6.3.3 转基因胚性愈伤组织瞬时表达荧光观察 |
| 6.3.4 基因枪转化愈伤组织PCR鉴定结果 |
| 6.4 小结 |
| 6.5 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（5）农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 国内外研究现状 |
| 1.3.1 落叶松遗传育种进展 |
| 1.3.2 裸子植物体细胞胚胎发生研究进展 |
| 1.3.3 落叶松体细胞胚发生研究进展 |
| 1.3.4 落叶松干细胞模型 |
| 1.3.5 针叶树遗传转化研究进展 |
| 1.3.6 影响农杆菌介导法转化效率的因素 |
| 1.3.7 针叶树的生长发育与相关基因的研究 |
| 1.4 研究的主要目标及内容 |
| 1.4.1 关键科学问题 |
| 1.4.2 研究目标及内容 |
| 1.5 研究技术路线 |
| 1.6 项目来源及经费支持 |
| 2 落叶松细胞系的抗生素敏感性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 抗生素与培养基 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 头孢霉素对落叶松细胞系生长的影响 |
| 2.2.2 潮霉素对落叶松细胞系生长的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 落叶松易转化细胞系的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验方法与设计 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 落叶松胚性细胞系的增殖 |
| 3.2.2 落叶松成熟体细胞胚的诱导和萌发 |
| 3.2.3 落叶松胚性细胞的转化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 落叶松转基因技术平台的标准化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 菌株与质粒 |
| 4.1.3 培养基与试剂 |
| 4.1.4 实验方法与设计 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 农杆菌浓度,侵染时间及共培养时间对遗传转化的影响 |
| 4.2.2 抑菌抗生素浓度和恢复培养时间的确定 |
| 4.2.3 抗性转化体的获得 |
| 4.2.4 抗性转化体的PCR检测 |
| 4.2.5 落叶松转基因技术的标准化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 受体材料对转化率的影响 |
| 4.3.2 农杆菌浓度,侵染时间和共培养时间与转化率 |
| 4.3.3 抑菌抗生素浓度及恢复培养时间与转化率 |
| 4.3.4 转化体的筛选方式与转化率 |
| 4.4 小结 |
| 5 落叶松 MADS-box家族 AGL2-2 的分离与转化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 落叶松不同年龄间差异表达基因的克隆与注释 |
| 5.2.2 落叶松不同年龄间差异表达基因的表达模式 |
| 5.2.3 年龄依赖性基因在修剪、扦插材料中的表达模式 |
| 5.2.4 年龄依赖性基因在嫁接材料中的表达模式 |
| 5.2.5 落叶松标准遗传转化技术的验证 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 落叶松的生长发育与年龄相关基因的关系 |
| 5.3.2 年龄依赖性基因与无性繁殖的年龄效应 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（6）油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 油松树属简介 |
| 1.1.1 生物学特性和形态特征 |
| 1.1.2 生态习性和分布 |
| 1.1.3 应用价值 |
| 1.2 针叶树繁殖研究进展 |
| 1.2.1 营养繁殖 |
| 1.2.2 组织培养技术 |
| 1.2.3 体细胞胚胎发生 |
| 1.2.4 针叶树体胚成熟的研究进展 |
| 1.2.5 基于气动生物反应器的针叶树愈伤组织增殖体系的研究 |
| 1.2.6 有关成熟培养中影响因素的研究 |
| 1.2.7 针叶树遗传转化研究 |
| 1.3 存在的问题 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 主要研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线图 |
| 2 油松胚性细胞系的诱导 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 2017年和2018年诱导情况 |
| 2.1.4 数据统计与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 2017年油松胚性细胞系诱导率 |
| 2.2.2 2018年油松胚性细胞系诱导率 |
| 2.2.3 现有胚性细胞系统计 |
| 2.3 小结 |
| 3. 基于气动生物反应器的油松胚性愈伤增殖体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 油松ALB增殖体系的建立 |
| 3.1.3 液体培养基 |
| 3.1.4 反应体系试验方法 |
| 3.1.5 ALB体系与锥形瓶悬浮培养的胚性愈伤生长量对比 |
| 3.1.6 ALB体系与锥形瓶悬浮培养胚性愈伤pH值的对比 |
| 3.1.7 不同继代周期的胚性愈伤与增值率的关系 |
| 3.2 油松愈伤组织胚性结构形态检验 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 正交试验结果 |
| 3.4.2 ALB体系与锥形瓶悬浮培养的愈伤生长量对比 |
| 3.4.3 ALB体系与锥形瓶悬浮培养胚性愈伤pH值的对比 |
| 3.4.4 不同继代周期的胚性愈伤与增值率的关系 |
| 3.5 油松愈伤组织胚性结构形态检验 |
| 3.6 小结 |
| 4 影响油松胚性愈伤组织形成成熟胚的因素 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 愈伤组织的悬浮前处理 |
| 4.1.3 单因素试验 |
| 4.1.3.1 基础固体成熟培养基 |
| 4.1.3.2 固体成熟培养基中四种影响因素水平的设置 |
| 4.1.4 正交设计与验证 |
| 4.2 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 油松愈伤组织悬浮前处理生长观察结果 |
| 4.3.2 成熟培养基中ABA浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.3 成熟培养基中PEG浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.4 成熟培养基中植物凝胶浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.5 成熟培养基中糖的种类和浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.6 四种影响因素正交设计 |
| 4.3.7 优化培养基验证 |
| 4.4 小结 |
| 5 油松遗传转化的初步探索 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 侵染材料 |
| 5.1.1.2 质粒和菌株 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 菌液划板 |
| 5.1.2.2 摇菌与菌液浓度设定 |
| 5.1.2.3 侵染与共培养 |
| 5.1.2.4 水洗材料与转入筛选培养基 |
| 5.1.2.5 筛选培养基中选择压的确定 |
| 5.1.2.6 油松愈伤组织遗传转化反应体系试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 筛选培养基中选择压结果的确定 |
| 5.2.2 愈伤组织遗传转化初步研究结果 |
| 5.3 小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 油松体细胞胚胎发生中油松胚性细胞系的补充 |
| 6.2 基于气动生物反应器的油松胚性愈伤增殖体系的建立 |
| 6.3 影响油松胚性愈伤组织形成成熟胚因素的研究 |
| 6.4 关于油松愈伤组织遗传转化的初步研究 |
| 7. 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（7）松树体细胞胚胎发生技术的发展与应用（论文提纲范文）
| 1 体细胞胚胎发生研究历程 |
| 1.1 植物体胚发生研究史上的里程碑 |
| 1.2 松树体胚发生研究历程 |
| 2 松树SE技术研究进展及现状 |
| 2.1 体胚发生技术在新品系选育上的应用 |
| 2.2 体胚发生介导的遗传转化 |
| 2.3 杂种后代的胚拯救 |
| 3 体胚发生技术的应用与前景 |
（8）马尾松组织培养与遗传转化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 马尾松概况 |
| 1.1.1 马尾松简介 |
| 1.1.2 马尾松的生态效益 |
| 1.1.3 马尾松的经济效益 |
| 1.2 针叶树种组织培养研究进展 |
| 1.2.1 针叶树组织培养方式 |
| 1.2.1.1 直接器官发生 |
| 1.2.1.2 间接器官发生 |
| 1.2.1.3 体胚发生与植株再生 |
| 1.2.2 针叶树种器官发生的影响因素 |
| 1.2.2.1 外植体 |
| 1.2.2.2 基本培养基类型 |
| 1.2.2.3 植物激素 |
| 1.2.2.4 其他原因 |
| 1.2.3 针叶树体胚发生的影响因素 |
| 1.3 针叶树种遗传转化研究进展 |
| 1.3.1 针叶树遗传转化方法 |
| 1.3.1.1 农杆菌介导的针叶树种转化法 |
| 1.3.1.2 基因枪法 |
| 1.3.1.3 电子法 |
| 1.3.1.4 PEG法 |
| 1.3.2 农杆菌介导的针叶树遗传转化的影响因素 |
| 1.3.2.1 外植体的选择 |
| 1.3.2.2 预培养时间 |
| 1.3.2.3 农杆菌菌液浓度对转化的影响 |
| 1.3.2.4 侵染时间对遗传转化的影响 |
| 1.3.2.5 共培养对转化的影响 |
| 1.3.2.6 AS对转化的影响 |
| 1.3.2.7 转化试验中Km的应用 |
| 1.3.2.8 Km添加的时间对产生抗性不定芽的影响 |
| 1.3.2.9 抑菌素的应用 |
| 1.4 RubisCO活化酶基因 |
| 1.5 RCA基因工程的研究现状 |
| 1.6 针叶树遗传转化存在的主要问题及其解决方法 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 马尾松成熟胚组织培养再生体系建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.2.1 外植体的预处理 |
| 2.1.2.2 成熟合子胚灭菌时间筛选 |
| 2.1.2.3 试验培养条件 |
| 2.1.2.4 基本培养基的筛选 |
| 2.1.2.5 6-BA与NAA组合对不定芽诱导的影响 |
| 2.1.2.6 Vc和柠檬酸对不定芽诱导中褐化的影响 |
| 2.1.2.7 6-BA与IBA组合对不定芽增殖的影响 |
| 2.1.2.8 NAA与IBA对不定芽伸长的影响 |
| 2.1.2.9 NAA与IBA组合对试管苗生根的影响 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同灭菌时间对外植体的影响 |
| 2.2.2 基本培养基对不定芽诱导的影响 |
| 2.2.3 6-BA与NAA组合对不定芽诱导的影响 |
| 2.2.4 褐变抑制剂对不定芽诱导中褐化的影响 |
| 2.2.5 6-BA与IBA组合对不定芽增殖的影响 |
| 2.2.6 生长素NAA与IBA对不定芽伸长的影响 |
| 2.2.7 NAA与IBA组合对试管苗生根的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马尾松成熟胚遗传转化研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 植物组织培养所用培养基 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 表达载体转化根癌农杆菌 |
| 3.2.2 阳性克隆的检测 |
| 3.2.3 卡那霉素本底浓度的确定 |
| 3.2.3.1 种胚分化的卡那霉素本底浓度的确定 |
| 3.2.4 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 3.2.5 根癌农杆菌Ti质粒介导转化马尾松种胚 |
| 3.2.5.1 外植体的制备 |
| 3.2.5.2 正负对照 |
| 3.2.5.3 外植体的侵染 |
| 3.2.5.3.1 菌液的制备 |
| 3.2.5.3.2 外植体的预培养 |
| 3.2.5.3.3 农杆菌侵染 |
| 3.2.5.3.4 共培养与恢复培养 |
| 3.2.5.3.5 抗性芽诱导培养 |
| 3.2.5.3.6 增殖分化培养 |
| 3.2.6 影响农杆菌转化的各个因素 |
| 3.2.6.1 预培养时间 |
| 3.2.6.2 菌液浓度 |
| 3.2.6.3 侵染时间 |
| 3.2.6.4 共培养时间 |
| 3.2.6.5 AS浓度 |
| 3.2.7 目的基因的转化效率 |
| 3.2.8 RCA小同工型基因在幼苗各个组织中实时定量检测 |
| 3.2.8.1 马尾松根茎叶总RNA提取 |
| 3.2.8.2 总RNA质量检测 |
| 3.2.8.3 反转录cDNA第一条链合成 |
| 3.2.8.4 内参引物特异性鉴定 |
| 3.2.8.5 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.2.8.6 目的片段半定量鉴定 |
| 3.2.8.7 引物扩增效率的验证 |
| 3.2.8.8 实时定量反应 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌液的目的片段的PCR检测 |
| 3.3.2 卡那霉素浓度的确定 |
| 3.3.2.1 种胚不定芽诱导分化的卡那霉素浓度的确定 |
| 3.3.3 抑菌性抗生素浓度的确定 |
| 3.3.4 正负对照 |
| 3.3.5 马尾松种胚遗传转化的条件 |
| 3.3.5.1 预培养 |
| 3.3.5.2 菌液浓度 |
| 3.3.5.3 侵染时间 |
| 3.3.5.4 共培养时间 |
| 3.3.5.5 AS浓度 |
| 3.3.6 转基因马尾松的获得 |
| 3.3.7 RCA小同工型基因在幼苗各个组织中实时定量检测 |
| 3.3.7.1 马尾松幼苗的RNA质量检测 |
| 3.3.7.2 内参引物特异性检测 |
| 3.3.7.3 内参基因引物扩增效率检测 |
| 3.3.7.4 半定量检测 |
| 3.3.7.5 相对定量图 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 4.2.1 直接器官发生的研究中 |
| 4.2.2 转化体系影响因素的研究 |
| 4.2.3 辅助其他处理及多种转化方法结合 |
| 参考文献 |
（9）长白落叶松体细胞胚胎发生及遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.2 植物组织培养 |
| 1.2.1 器官发生 |
| 1.2.2 体细胞胚胎发生 |
| 1.3 针叶树体胚发生研究进展 |
| 1.3.1 针叶树体胚发生的过程 |
| 1.3.2 针叶树体胚发生的理化基础 |
| 1.3.3 落叶松体胚发生的研究现状 |
| 1.4 针叶树遗传转化的研究进展 |
| 1.4.1 针叶树遗传转化的方法 |
| 1.4.2 农杆菌介导针叶树遗传转化 |
| 1.4.3 基因枪介导针叶树遗传转化 |
| 1.4.4 落叶松转基因研究的现状 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 项目来源及经费支持 |
| 2 胚性愈伤组织的诱导与增殖 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2 次氯酸钠的消毒效果 |
| 2.2.3 外植体采集时间对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.4 家系对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.5 2,4-D浓度对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.6 基本培养基对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.7 固体培养的最佳继代周期 |
| 2.2.8 生长调节剂对增殖的影响 |
| 2.2.9 悬浮培养体系的建立与优化 |
| 2.2.10 继代培养方式对增殖的影响 |
| 2.2.11 生长调节剂对体胚发生的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 体细胞胚成熟前的预培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 预培养周期对体胚发的影响 |
| 3.2.2 离子浓度对体胚发生的影响 |
| 3.2.3 蔗糖浓度对体胚发生的影响 |
| 3.2.4 肌醇浓度对体胚发生的影响 |
| 3.2.5 谷氨酰胺浓度对体胚发生的影响 |
| 3.2.6 水解酪蛋白浓度对体胚发生的影响 |
| 3.2.7 Gln与CH的互作效应对体胚发生的影响 |
| 3.2.8 生长调节物质对体胚发生的影响 |
| 3.2.9 预培养条件的响应面优化结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 体细胞胚的成熟及植株再生 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 糖类对体胚成熟的影响 |
| 4.2.2 有机物对体胚成熟的影响 |
| 4.2.3 ABA脱落酸对体胚成熟的影响 |
| 4.2.4 AgNO3硝酸银对体胚成熟的影响 |
| 4.2.5 过氧化氢对体胚成熟的影响 |
| 4.2.6 成熟培养条件的响应面优化结果 |
| 4.2.7 体细胞胚胎的萌发及植株再生 |
| 4.2.8 组织愈伤化的发生 |
| 4.2.9 次生体胚的发生 |
| 4.2.10 再生植株的移栽 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 体细胞胚胎发生的理化研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 生长调节剂对愈伤组织几种生化指标的影响 |
| 5.2.2 增殖方式对愈伤组织几种生化指标的影响 |
| 5.2.3 体胚发生过程中形态及几种生化指标的变化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 长白落叶松的遗传转化研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 胚性组织的抗生素敏感试验结果 |
| 6.2.2 侵染液浓度的影响 |
| 6.2.3 乙酰丁香酮添加方式的影响 |
| 6.2.4 共培养周期的影响 |
| 6.2.5 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 6.2.6 恢复培养周期的影响 |
| 6.2.7 植物材料对转化的影响 |
| 6.2.8 筛选抗生素种类的影响 |
| 6.2.9 基因枪介导遗传转化的结果 |
| 6.2.10 抗性组织的PCR检测结果 |
| 6.2.11 抗性组织的GUS染色结果 |
| 6.2.12 转化组织的体细胞胚胎成熟 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图版 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）悬铃木开花相关基因遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 问题由来 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 木本植物遗传转化研究进展 |
| 2.1.1 农杆菌介导的木本植物遗传转化研究进展 |
| 2.1.2 以种胚为受体的农杆菌介导研究进展 |
| 2.1.3 影响农杆菌介导转化的因素 |
| 2.1.4 悬铃木再生体系建立及遗传转化研究进展 |
| 2.2 开花相关基因介绍 |
| 2.2.1 植物TFL1基因 |
| 2.2.2 植物LFY基因 |
| 2.2.3 植物AP_3和PI基因 |
| 2.2.4 植物FUL基因 |
| 2.3 球果贮藏研究进展 |
| 2.3.1 种子含水量和环境温度 |
| 2.3.2 环境相对湿度 |
| 3 研究目的和意义 |
| 第二章 悬铃木球果贮藏条件初探 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 不同温度贮藏条件的确定 |
| 2.2 最适含水量的确定 |
| 2.3 不同气密度贮藏条件的确定 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 2.5 球果剥胚过程 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 含水量的计算 |
| 4.2 存在问题与下一步工作 |
| 第三章 种胚遗传转化体系优化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 培养条件与培养基 |
| 1.2.1 培养条件 |
| 1.2.2 培养基 |
| 1.3 转化载体材料与培养方法 |
| 1.3.1 转化载体材料 |
| 1.3.2 农杆菌培养方法 |
| 1.4 有关试剂与配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 悬铃木合子胚再生压力的确定 |
| 2.1.1 卡那霉素(Kan)有效选择压力 |
| 2.1.2 抑菌剂敏感性实验 |
| 2.2 农杆菌介导的悬铃木合子胚遗传转化条件探索 |
| 2.2.1 不同侵染时间对农杆菌侵染的影响 |
| 2.2.2 甘露醇渗透处理对转化效率的影响 |
| 2.2.3 不同种胚的生理状态 |
| 2.2.4 共培时间的确定 |
| 2.2.5 共培AS浓度的确定 |
| 2.2.6 不同农杆菌菌液浓度侵染实验 |
| 2.2.7 不同菌株对转化的影响 |
| 2.3 实验结果处理方法 |
| 2.3.1 GUS基因表达组织化学检测 |
| 2.3.2 数据统计与分析 |
| 2.4 农杆菌介导的不育基因转化方法 |
| 2.5 转基因植株的分子生物学检测 |
| 2.5.1 CTAB法提取植物基因组DNA |
| 2.5.2 PCR检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 悬铃木合子胚优化再生压力 |
| 3.1.1 悬铃木对卡那霉素的敏感性确定 |
| 3.1.2 抑菌剂对合子胚植株生长的影响确定 |
| 3.2 农杆菌介导的悬铃木合子胚遗传转化条件 |
| 3.2.1 不同侵染时间对农杆菌侵染的影响 |
| 3.2.2 甘露醇渗透处理对转化效率的影响 |
| 3.2.3 不同种胚的生理状态的确定 |
| 3.2.4 共培时间的确定 |
| 3.2.5 共培AS浓度的确定 |
| 3.2.6 不同农杆菌菌液浓度OD值确定 |
| 3.2.7 不同菌株对转化的影响 |
| 3.3 根癌农杆菌介导目的基因转化悬铃木 |
| 3.3.1 目的基因转化悬铃木合子胚 |
| 3.3.2 抗性植株分子检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Km筛选过程浓度与时间长短问题 |
| 4.2 假阳性与嵌合体 |
| 4.3 侵染与共培时间长短的问题 |
| 4.4 转化受体材料的特殊性 |
| 4.5 抗性植株的检测 |
| 4.6 农杆菌不同菌株侵染能力比较 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo explants by Agrobacterium tumefaciens（论文参考文献）
- [1]农杆菌介导的针叶树种遗传转化研究进展[J]. 刘炎,刘克俭,王江,王颖,张毓航伊,王昊,初艳,由香玲. 黑龙江农业科学, 2021(04)
- [2]杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究[D]. 张素芳. 东北林业大学, 2020
- [3]农杆菌介导栓皮栎体胚遗传转化体系建立的研究[D]. 罗珍珍. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [4]日本落叶松体细胞胚发生及mtlD基因的遗传转化[D]. 吴晓雪. 北京林业大学, 2020(02)
- [5]农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化[D]. 张耀. 中国林业科学研究院, 2020
- [6]油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究[D]. 李亦轩. 北京林业大学, 2019(01)
- [7]松树体细胞胚胎发生技术的发展与应用[J]. 胡继文,郭文冰,邓乐平,钟岁英,王为民,赵奋成,黄婷,吴惠姗,李义良,廖仿炎. 林业与环境科学, 2018(04)
- [8]马尾松组织培养与遗传转化的研究[D]. 殳晓强. 南京林业大学, 2017(04)
- [9]长白落叶松体细胞胚胎发生及遗传转化研究[D]. 宋跃. 东北林业大学, 2017(05)
- [10]悬铃木开花相关基因遗传转化研究[D]. 孔宇飞. 华中农业大学, 2014(09)