一、大肠杆菌中一种对NF-IL63′UTR专一的结合蛋白（论文文献综述）
莫双榕[1]（2021）在《番茄SlMPK2在高温胁迫过程中的作用机理研究》文中研究指明促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是细胞将胞外受到的各种环境刺激信号转换为细胞内各种生理生化反应的重要途径,它涉及植物响应各种环境胁迫的生理过程。MAPK级联系统是由MAP激酶激酶激酶（MAPKKK）、MAP激酶激酶（MAPKK）、MAP激酶（MAPK）构成的三级联模式（MAP3K-MAP2K-MAPK）。MAPK磷酸化后和其他信号激活特定下游靶标如转录因子、细胞骨架蛋白等,将级联信号进行传递。高温是影响番茄产量的主要环境因素之一,持续的高温环境通常会导致番茄异常生长。因此,研究番茄高温响应的分子机制和生理机制对于提高番茄的耐热性具有重要意义。我们已有的研究表明,番茄SlMPK1在调节高温胁迫下的耐热性方面起着负调控作用。同时,实验室发现了一个与SlMPK1基因高度同源的基因SlMPK2,但其作用机理不清楚。本研究中,首先利用基因重组技术,获得SlMPK2过表达和干扰转基因番茄植株,进一步在拟南芥中异源过表达SlMPK2,进而在高温下观察表型差异及相关生理变化,进行功能验证;其次,利用酵母双杂（Y2H）技术对热诱导的番茄cDNA文库进行筛选,获得与SlMPK2可能相互作用的蛋白,并且对部分蛋白进行Y2H点对点和BiFC技术验证;最后,对SlMPK2上游互作蛋白SlMKK9进行功能研究,进而探究SlMPK2在高温胁迫下的作用机制。本研究主要结果如下:1.SlMPK2在高温胁迫下负调控番茄的耐热性。克隆SlMPK2基因、构建该基因的过表达及干扰载体,通过农杆菌介导的番茄子叶遗传转化,获得SlMPK2过表达株系和干扰植株,并进行高温处理,观察生长表型及生理变化。在高温胁迫下,SlMPK2过表达植株的表型如生长状态、株高、鲜重、根长等明显弱于野生型;叶绿素含量降解较快;抗氧化防护酶如SOD、POD、APX、CAT和GR活性显着低于野生型;DAB和NBT染色结果进一步表明SlMPK2过表达植株积累过多的活性氧（ROS）,受到的氧化损伤较野生型更严重。相对应的,SlMPK2干扰植株的各方面表型、叶绿素含量、抗氧化酶活性及ROS水平都显示出SlMPK2干扰番茄植株耐热性强于野生型。2.SlMPK2在高温胁迫下负调控拟南芥的耐热性。通过农杆菌介导的拟南芥沾花法获得SlMPK2异源过表达拟南芥植株,并对SlMPK2过表达拟南芥进行高温处理。实验结果表明,高温处理后,SlMPK2过表达拟南芥种子萌发情况显着差于WT,SlMPK2过表达拟南芥植株生长状态也明显差于WT,且拟南芥的下胚轴长度也显着短于WT。以上实验结果进一步证明SlMPK2在植物响应高温胁迫的过程中起着负调控作用。3.成功进行酵母双杂交文库筛选。成功构建诱饵表达载体pGBKT7-SlMPK2,并对其进行自激活和毒力测试实验。结果显示,诱饵蛋白SlMPK2对酵母细胞无毒性,但是具有自激活活性。进一步筛选最适3-AT浓度抑制其自激活,发现20mM 3-AT在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+AbA+X-α-ga1培养基上能够有效抑制SlMPK2的自激活且不影响阳性对照酵母菌的互作,使用该浓度进行后续文库筛选。将番茄热诱导的专一 cDNA文库pGADT7质粒转入含有pGBKT7-SlMPK2质粒的酵母细胞中,经过2轮筛选获得301个阳性菌落,经PCR、测序、序列比对鉴定出129个蛋白。筛库结果中有一些蛋白反复出现,同时包含了一些已知与植物MAPK互作的蛋白,如SlMKK9（So1yc03g097920）,SlSPRH1（So1yc06g053700）等,这表明 Y2H 筛库结果可靠。4.Y2H及双分子荧光互补（BiFC）验证相互作用蛋白。将SlMKK9、8MFU与9DGC分别与荧光蛋白YFP的N端以进行融合,构建双分子荧光载体pSPYNE-8MFU、pSPYNE-SlMKK9和pSPYNE-9DGC。将它们分别与含有pSPYCE-SlMPK2的农杆菌共侵染烟草后利用激光共聚焦显微镜观察荧光,结果发现烟草叶片细胞中有荧光,证明SlMPK2 与 SlMKK9、8MFU、9DGC 蛋白存在互作。5.SlMKK9在高温胁迫下负调控番茄和拟南芥的耐热性。构建SlMKK9过表达与干扰载体,获得番茄遗传转化植株,进行耐高温观察表型及生理指标测定。高温处理下SlMKK9过表达植株的表型和生理指标的变化与SlMPK2过表达植株趋于一致,SlMKK9干扰植株的表型与SlMPK2干扰植株表型趋势一致,结果表明SlMKK9在高温胁迫下负调控番茄的耐热性;同时获得了 SlMKK9过表达拟南芥植株,以及以SlMKK9基因同源的拟南芥atmkk9突变体（AtMKK9-TDNA插入）为背景的过表达植株。高温处理后,SlMKK9过表达植株的种子萌发速度明显慢于野生型,萌发率也显着低于野生型。而且,atmkk9拟南芥种子在热处理后萌发率较野生型显着升高,而将SlMKK9进行回补后消除了这种差异。此外,高温处理后SlMKK9过表达拟南芥植株生长状态明显差于WT;拟南芥的下胚轴长度也显着短于WT。以上实验结果表明,SlMPK2参与了番茄对高温胁迫的响应,且存在负调控机制。SlMPK2介导的抗氧化酶活性变化、ROS代谢平衡及氧化胁迫是主要调控机制之一;同时,SlMKK9作为上游互作蛋白,可能以SlMKK9-SlMPK2级联参与SlMPK2介导的番茄高温胁迫响应。
蒋涛[2]（2020）在《RNA中m6A甲基化修饰与家蚕滞育的关联研究》文中研究指明RNA腺嘌呤第6位氮原子甲基化（m6A）是核酸表观遗传修饰研究的热点。RNA中发生m6A修饰后,可调节包括RNA剪接、核转运、RNA降解、翻译一系列下游事件,在生物体的生长、发育、疾病和应激反应等方面发挥了重要的作用。家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物,遗传背景清楚,是研究表观遗传学的良好素材。二化性家蚕子代滞育的发生与解除都受到外界信号的调控,极可能与表观遗传调控相关。本研究从RNA m6A表观遗传修饰角度出发,研究m6A表观修饰与家蚕滞育的关联。主要研究内容如下:在生物信息学分析家蚕m6A甲基化工具酶基因的相关信息的基础上,q PCR和Western blot技术分析了m6A甲基化工具酶在一化性、二化性、多化性家蚕中的转录特性和表达水平,检测了多化性不同滞育性家蚕品系相关组织中m6A丰度的变化,分析了外界因素与m6A甲基化修饰的关联,对二化性家蚕胚胎期不同处理组蛹期第3d卵巢进行表观转录组测序（Me RIP-seq）,分析了m6A修饰与家蚕滞育的关联。主要研究结果如下:1、家蚕中存在5种m6A甲基化工具酶同源基因从NCBI数据库查找了部分物种的m6A甲基化工具酶序列,采取同源比对的方式从家蚕基因组数据库中找到5个m6A甲基化工具酶同源基因,分别为METTL3、METTL14、Fl（2）d、YTHDC1、YTHDF3。系统发育学的分析结果表明,这5个基因在不同物种中具有较高保守性。2、不同滞育性家蚕中m6A甲基化工具酶的转录水平具有差异性采用q RT-PCR的方法分析了一化性品系安康4号（AK4）、二化性品系秋丰25℃明催青（QFHT）和17℃暗催青（QFLT）、多化性品系の海（NH）与Nistari 5个实验组家蚕从蛹期至蚕卵不同发育时期的卵巢、头部、蚕卵,m6A甲基化工具酶的转录特性。结果显示,不同滞育性家蚕中m6A甲基化工具酶基因的转录存在差异,特别是同一化性但滞育性不同的家蚕,基因转录的模式具有显着区别,提示家蚕的化性及滞育命运与m6A修饰存在关联。3、不同滞育性家蚕中甲基转移酶METTL3蛋白表达具有特异性采用western-blot的方法,分析了一化性、二化性、多化性等不同滞育性家蚕蛹期不同发育时期卵巢中METTL3的蛋白表达情况。实验结果进一步确认了家蚕中METTL3的存在,而且不同滞育性家蚕中METTL3的蛋白质表达具有差异性,这种蛋白水平的变化与转录特性分析的结果具有较高一致性。4、多化性滞育与非滞育性家蚕卵巢m6A丰度存在差异对多化性不同滞育性家蚕蛹期卵巢与蚕卵中m6A丰度的变化用荧光免疫的方法进行了检测。结果显示,多化性有滞育和多化性无滞育家蚕在蛹期与蚕卵的不同发育时期,m6A丰度有显着变化,多化性非滞育家蚕卵巢和蚕卵中m6A丰度普遍高于多化性滞育家蚕,这种丰度的变化与METTL3的表达变化具有较好的一致性。5、外界因素影响家蚕m6A修饰体系的变化采用常规即时浸酸方式处理产下后25℃18h的二化性家蚕蚕卵,使用不同浓度滞育激素处理家蚕Bm N细胞,分别从个体与细胞水平分析了家蚕滞育关联性环境因素对家蚕m6A修饰体系的影响。结果表明,环境因素显着改变了家蚕m6A甲基化工具酶的表达及m6A丰度。6、RNAi和Trim-Away可显着敲降METTL3分别使用RNAi与Trim-away的方法,结合显微注射技术,对蚕卵注射ds RNA,或注射外源抗体与泛素蛋白酶系统,靶向沉默METTL3的表达。结果表明,RNAi可在转录水平显着抑制METTL3的表达,Trim-away可在蛋白水平快速消减METTL3的存在。7、不同滞育性的二化性家蚕蛹期3天卵巢表观转录组存在显着差异对二化性QFHT组和QFLT组家蚕蛹期3d卵巢进行Me RIP-seq。结果表明,两组家蚕的表观转录组存在显着差异,相比QFLT,子代滞育命运的QFHT中发生了更多m6A事件,这种差异不仅体现在修饰基因的数量、种类与功能,而且体现在基因位点修饰频率上,进一步表明m6A修饰深度参与了家蚕滞育这一可塑性表型的塑造。上述结果证实,家蚕的滞育性与m6A表观修饰密切相关,环境因素的滞育信号可能通过对m6A修饰系统的作用进一步影响滞育关联基因的表达,引起家蚕滞育性的改变。研究结果为从m6A表观遗传层面进一步阐释家蚕滞育机制奠定了基础。
吴艳[3]（2019）在《大豆GmSPL3基因家族功能初探》文中认为大豆[Glycine max（L.）Merr.]是我国重要的粮食作物,其开花时间和株型是影响产量的重要因素。SPL3基因是SPL（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE,SPL）转录因子家族成员之一,模式植物拟南芥的研究发现microRNA156（miR156）能通过调控SPL基因的表达调控开花时间和株型,且AtSPL3/4/5促进开花。然而,在大豆中GmSPL3的功能尚属未知。因此,研究大豆GmSPL3基因的功能,有利于进一步了解大豆的株型和开花调控的分子机制,为大豆分子设计育种提供重要的基因资源。本研究以大豆为实验材料,通过生物信息学分析,预测GmSPL3在大豆中可能发挥的功能,进一步在大豆Williams82（W82）中,利用CRISPR/Cas9技术对GmSPL3进行基因编辑,获得GmSPL3突变体,进行表型观察与分析,从而研究GmSPL3在大豆开花和株型调控中的功能。研究得出以下主要结果:1.系统进化树和同源序列比对发现GmSPL3的四个拷贝GmSPL3（a,b,c,d）是拟南芥AtSPL3的同源基因,其氨基酸序列相似性达50%以上。对GmSPL3家族保守结构域SBP的位置分析发现均靠近N段,且含有2个锌指结构和一段核定位序列;2.大豆绥农14（SN14）中GmSPL3基因的组织特异性表达分析发现,GmSPL3a在花和茎尖的表达较高,GmSPL3（b,c）在叶中表达较高,GmSPL3d主要在三出复叶和茎尖表达;3.在GmSPL3基因敲除突变体中研究发现,长/短日照条件下,spl3abcd突变体株系的开花表型与野生型W82没有明显差异,而短日照条件下,spl3abcd突变体表现出叶片变小、节数减少、节间距缩短、株高降低的表型,表明GmSPL3在调控大豆植株形态方面发挥重要功能。以上结果表明:GmSPL3是AtSPL3的同源基因,但存在功能分化;在大豆中,GmSPL3不调控开花时间,但参与调控株型。
王义[4]（2019）在《橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究》文中研究指明橡胶树白粉病是橡胶树最具经济破坏性的病害之一,其病原物—橡胶树白粉菌Oidium heveae Steinm是专性寄生真菌,有性世代尚未被发现,特别是其无法离体培养,遗传转化体系未见报道。本研究通过研究橡胶树白粉菌的专性寄生特性及其生理生化特性,对转化介质、分生孢子悬浮液的配制方法、分生孢子的抗生素敏感性、转化子的筛选与观察方法、报告基因的选择及电击缓冲液等多方面进行了研究。利用电击转化法和农杆菌介导法（ATMT）成功构建了橡胶树白粉菌的遗传转化体系,并在橡胶树白粉菌基因组基础上,筛选和鉴定了来自橡胶树白粉菌的50个内源启动子,为进一步优化橡胶树白粉菌遗传转化体系、开展更深入的分子研究,以及探明白粉菌的致病分子机制和生物进化提供科学依据。具体研究结果如下:测试了8种常用抗生素对O.heveae分生孢子的敏感性。结果表明,潮霉素B、卡那霉素和链霉素浓度为100μg/m L,氯霉素浓度为510μg/m L和头孢霉素浓度为1000μg/m L时,可以有效地抑制O.heveae分生孢子的萌发。氨苄青霉素、利福平和四环素对橡胶树白粉菌分生孢子的萌发和生长没有明显的抑制作用,甚至部分还能促进分生孢子的萌发。8种抗生素中仅潮霉素B对橡胶树古铜期嫩叶具有明显的植物毒性。因此,确定卡那霉素、氯霉素、头孢菌素和链霉素抗性的基因适合于用作橡胶树白粉菌遗传转化的选择标记。测定葡萄糖、甘露醇、山梨醇、HEPES、PEG1000不同浓度的水溶液对橡胶树白粉菌分生孢子萌发的影响。结果表明,只有40 m M的HEPES对橡胶树白粉菌分生孢子的影响最小,与对照组水溶液非常接近。因此确定40 m M的HEPES作为橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液。选择卡那霉素抗性基因为筛选标记,引入红色荧光蛋白基因m Cherry为报告基因,成功构建表达载体p CAMBIA1302-m Cherry。在常规电击转化和ATMT法的基础上改进和创新,优化各类参数。转化后通过荧光显微镜观察到分生孢子、芽管、附着胞、初生菌丝、次生菌丝和分生孢子梗都具有红色荧光,而对照组野生型无荧光。转化后的橡胶树白粉菌T1到T10代都扩增到m Cherry基因,证明转化体非常稳定。PCR-Southern印迹杂交分析也证实靶基因整合进了橡胶树白粉菌的基因组中。电击转化体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;电击转化前混合物（载体DNA和O.heveae）的冰浴时间:1 min;电击转化的电压:2.5 kv;电脉冲,4.0 ms;电穿孔后的冰浴时间:5 min。ATMT体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;农杆菌复摇浓度:OD600=0.6～0.8;共培养时间:30 min。该电击转化和ATMT法转化体系的成功建立,对于研究外源基因的功能,相关效应蛋白的功能,橡胶树白粉菌的分子致病机制及其与宿主的互作都是非常有利的,更为其它专性寄生真菌的遗传转化提供了借鉴。以橡胶树白粉菌HO-73基因组数据为基础,利用生物信息学在线软件Promoter Scan进行启动子预测,得到疑似启动子135个。随后利用生物信息学在线预测软件Softberry进行二次筛选,得到50个疑似启动子序列。成功克隆获得50个内源疑似启动子序列并构建了其植物表达载体,利用烟草转基因技术进行瞬时表达验证其启动子功能,验证得到9个内源启动子。通过与阳性对照Ca MV 35S（35S）启动子的比较,初步判断其中4个（WY7、WY51、WY193和WY195）为强启动子,另5个（WY1、WY6、WY12、WY181和WY196）为弱启动子。通过q RT-PCR技术测定4个强启动子（WY7、WY51、WY193和WY195）调控GUS基因的表达量,均明显高于35S。其中WY195调控GUS基因的表达量最高,约为35S的17.54倍;WY7约为35S的11.72倍;WY51约为35S的8.38倍;WY193约为35S的8.34倍。利用橡胶树白粉菌内源强启动子WY7、WY51、WY193和WY195驱动GUS基因在双子叶植物烟草、橡胶和火龙果,以及单子叶植物水稻、玉米和大麦中进行瞬时表达,探索其调控转录范围。结果证明这4个强启动子既可以在单子叶植物中驱动外源基因高效表达,也可以在双子叶植物中驱动外源基因高效表达,具有极大的开发潜力。利用生物信息学在线软件Plant CARE对这4个强启动子的序列进行了顺式作用元件的预测和分析,根据顺式作用元件的类型和作用推测启动子的诱导类型,并通过对该4个启动子转基因烟草T1代实施相应诱导,初步确定了WY7为高温诱导启动子,WY51为低温诱导启动子,WY195是高温干旱盐诱导启动子。WY193的启动子诱导类型尚未确定。利用ATMT法获得了WY195-hpa Xm转基因烟草植株。接种TMV于T1代转基因植株,结果表明,与野生型三生烟和阳性对照35S-hpa Xm转基因烟草相比,WY195-hpa Xm转基因烟草植株的TMV抗性明显提高。WY195-hpa Xm转基因T1代植株与野生型烟草相比平均病斑数减少66.44%,与阳性对照相比平均病斑数减少52.48%。通过在线数据库PROMO和JASPAR数据库进行转录因子及其结合位点的预测和分析,以此为依据确定突变位点,利用渐变缺失突变对WY195的全长序列研究,瞬时表达量的测定结果初步鉴定了WY195的全长序列,这为后续工作中对启动子精确调控能力、进行有效改造及相关转录因子的研究奠定了基础。内源启动子的成功预测、筛选和鉴定,有利于理解橡胶树白粉菌的转录机制,也为构建其遗传转化体系提供了参考,更为植物转基因工程提供了新的工具和选择。
蔡文通[5]（2017）在《尿路致病性大肠杆菌中一个新的二元调控系统的鉴定及其调控机理和生物学功能的研究》文中进行了进一步梳理尿路感染是人类最常见的细菌感染之一。它的定义为:病原生物入侵尿路引起的尿路炎症反应。被感染的部位一般包括尿道、膀胱、输尿管、肾脏肾盂等。临床数据表明:高达90%的尿路感染是由尿路致病性大肠杆菌（UropathogenicEscherichia coli,UPEC）引起的。到目前,很多毒力因子被确定在UPEC感染的过程中起到不可或缺的作用。与肠道内共生的和致腹泻的大肠杆菌相比,尿路致病性大肠杆菌的生活环境非常特殊,如尿液对于UPEC来说是营养贫瘠、有胁迫的环境。UPEC如何感应特殊的宿主环境并启动适合的应对机制在当前仍然是一个不太清楚的问题。由于二元调控系统是细菌适应环境的重要机制,本文着重研究UPEC内的二元调控系统,具体内容分为以下三部分:1与尿路致病型相关的KguS/KguR的调控机理研究及其对UPEC致病性的影响二元调控系统（Two-component signaling systems,TCS）,又被称为双组份调控系统,是细菌适应环境的重要机制。因此,二元调控系统对于病原菌适应宿主环境应该起到至关重要的作用。于是,我们通过生物信息学的方法对UPEC的多个菌株的基因组进行分析,预测得到UPEC基因组内所有的TCS,以期待可以发现新的未研究过的TCS系统。结果显示:除了 30个大肠杆菌菌株共有的TCS外,还发现c3564/c3565、c4545/c4546和c5041/c5040为非致病性大肠杆菌菌株中很少存在的。最终,我们选择了c5041/c50 0进行下一步、深入的研究。通过对预测得到的C5041/C5040的三维结构和各结构域的分析,我们在肾盂肾炎分离株UPEC CFT073中鉴定了一个新的二元调控系统 C5041/C5040,并命名为 KguS/KguR（KguS:α-ketoglutarate utilization sensor;KguR:α-ketoglutarate utilization regulator）。通过双重PCR对多种致病型的大肠杆菌的菌种库进行检测发现:kguS/kguR与尿路致病性的大肠杆菌关联紧密,而在非致病性和肠道致病的大肠杆菌中却鲜有发现。利用小鼠尿路感染模型,体内竞争试验显示缺失kguS/kguR造成UPEC在小鼠膀胱和肾脏内定殖显着下降,暗示KguS/KguR具有增加UEPC在体内的适应力的能力。利用比较蛋白组学方法我们找到了 KguS/KguR的多个靶基因,如外膜蛋白（OmpA、OmpW、OmpF）、木糖异构酶XylA、铁结合蛋白SitA以及假定的α-酮戊二酸代谢酶C5035。我们进一步研究发现上调表达KguR可以激活c5035的表达。序列分析发现kguS/kguR和其靶基因c5032到c5039编码在一个基因岛上,而这个基因岛并不存在于肠道致病性大肠杆菌中,暗示这个基因簇很有可能是通过基因水平转移获得的,同时,再次说明其对UPEC的重要性。而且,缺失这个基因岛也会导致UPEC在体内竞争力的下降,说明KguSR影响UPEC的定殖很有可能是由c5032到c5039基因簇介导的。反转录-PCR结果显示上述提到的基因岛编码3个操纵元,分别为:c5032-c5037、c5038-c5039、c5040-c5041。靶基因的表达特异的被α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）所诱导。这些基因与α-KG作为唯一碳源的无氧利用有关。通过凝胶阻滞试验（EMSA）,我们发现KguS/KguR直接正调控c5032到c5039靶基因簇,并参与到α-KG的无氧利用中。最后,进化发育分析表明:kguS/kguR很有可能是通过基因水平转移的方式获得的,而且这个基因位点（loci）具有横向转移的潜力。α-KG是哺乳动物肾脏肾小管细胞中高度积累的物质,用于和有机阴离子进行跨膜交换,进而将它们以尿液的形式排出体外,是肾脏生理功能重要的一部分。所以,上述试验结果暗示了 α-KG的利用对UPEC的重要性,而这个能力促进了 UPEC在肾脏的定殖。综上所述,这一部分内容第一次描述了 一个与UPEC关联紧密的TCS;这个TCS与它的靶基因一起参与在无氧条件下对a-KG利用,进而增加UPEC在体内的适应能力。2 α-酮戊二酸转运蛋白C5038和KgtP在UPEC中的作用α-酮戊二酸广泛存在于宿主细胞,尤其是肾小管细胞中,并且很容易被UPEC利用。这一部分探究了两个转运蛋白C5038和KgtP在利用α-KG上起到的作用、它们的转录调控以及它们对UPEC体内适应性的影响。与UPEC密切相关的c5038很可能是通过基因水平转移获得的,C5038属于DASS（Divalent anion sodium symporter）家族。它与柠檬酸转运蛋白CitT具有49%的氨基酸序列相似性,TMHMM算法预测它含有13个跨膜区域。它含有的SAT序列很可能与α-KG的转运直接相关。kgtP则是相对保守的、广泛存在于致病性和非致病性大肠杆菌中的基因位点,KgtP蛋白属于MFS（Major facilitator superfamily）家族,具有12个跨膜区域。c5038的表达被低氧分压诱导,而kgtP的表达被低氧分压所抑制。无氧条件下,c5038被FNR和ArcA正调控,c5038在α-KG的无氧利用中担当重要角色;而KgtP对于α-KG的有氧利用是必需的,但是它的表达在无氧条件下被FNR和ArcA严重抑制。c5038通过二元调控系统KguSR直接或间接感应低氧分压:kguSR的表达在无氧条件下升高,而低氧分压对c5038的诱导需要kguSR的参与。c5038能被α-KG特异的诱导表达,而kgtP的表达对外界添加的KG没有反应。但是kgtP的表达在M9基本培养基中、以甘油为唯一碳源的时候最高,其次为葡萄糖,最低的是在LB中。与碳源利用有关的CRP蛋白正调控kgtP的表达。此外,我们发现c503和和kgtP的表达受不同的sigma因子控制:分别为σ54（RpoN）和a38（RpoS）。当被相同的组成型启动子驱动时,C5038在无氧环境中效率更高而KgtP在有氧条件时效率更高。在尿路感染的小鼠模型上,当共同感染野生型和c5038突变株或kgtP突变株时,结果显示c5038影响而kgtP并不影响UPEC在体内的适应能力;这种影响是可以被质粒上表达的c5038所恢复的。综上所述,转录水平调控的不同使得C5038和KgtP在KG的利用上发挥的作用不同,进而导致它们在体内的作用不同。所以,这一部分的研究加深了我们对尿路致病性大肠杆菌生理和毒力的理解。3 KguR调控的分子机理初探本部分试图找出KguR在转录水平直接调控的更多靶基因（由于KguR是转录调控因子）,从而对KguR的调控方式作更全面的了解。我们首先对c5038的启动子区域进行了分析,然后利用逐渐缩短启动子并测定启动子活性的方法找到了最短的有活性的启动子Pc5038F3R。接着,在Pc5038F3R区域我们找到了一个反向重复序列TGTGCG-N8-CGCACA。EMSA、启动子-报告基因融合和β-半乳糖苷酶活性测定试验 ·发现反向重复序列区域是被KguR直接结合的,并且极大的影响启动子的活性。但是,缺失反向重复序列区域并没有完全破坏KguR的诱导作用。此外,我们在c5032和kguS的启动子区域也发现了类似的序列,分别为TGTGTG-N13-CGCGCA和TGTGCG-N6-CACACA。缺失相应的区域都大幅的降低了 KguR对DNA探针的结合。KguR可以自调控kguSR操纵元,这种自调控很可能依赖于结合到上述的位点上。而且,这些结合位点在大肠杆菌中都非常保守。所以,我们利用这些序列生成了结合的通用序列,进一步利用生物信息学的方法,在CFT073的基因组内进行搜索、匹配。结果显示,有20个位点被筛选出来;有的在基因的编码区,有的在基因间区,即可能为启动子区。总之,本文系统性的阐述了二元调控系统KguSR的鉴定,通过揭示KguSR及其靶基因的功能,解释了这套系统增加UPEC体内适应性的机制。
黄得来[6]（2017）在《核仁蛋白Def与半胱氨酸蛋白酶CAPN3的互作研究及其在核仁中的靶蛋白鉴定》文中研究指明核仁不仅是核糖体合成与加工的场所,也与细胞周期调控、DNA损伤修复、压力信号应答等生化过程有关。核仁作为细胞核内致密的非膜细胞器,富集了超过4,500种不同蛋白质。然而,人们对于这些蛋白质在核仁中的功能以及这些蛋白在核仁中是如何被调控的所知甚少。本实验室之前的研究发现核仁蛋白Def（Digestive-organexpansion factor）能够介导半胱氨酸蛋白酶 CAPN3（Calpain3）降解p53。但是我们并不清楚Def如何帮助CAPN3降解p53,也不知Def-CAPN3在核仁内是否还存在其他靶蛋白。本研究首先发现人CAPN3能够降解p53A138V、p53M2371、p53R248W和p53R273P,而不能降解p53R175H。p53R175H作为癌症样品中出现频率最高的p53点突变,提示了 CAPN3在肿瘤形成中的意义。通过免疫共沉淀实验,我们证明Def与人CAPN3能够直接互作,并在核仁内形成蛋白复合体。我们发现这种互作在斑马鱼上也具有保守性,斑马鱼Def能够与Capn3b（人CAPN3在斑马鱼上的同源蛋白）在核仁内形成蛋白复合体。进一步的研究发现,Def能够通过磷酸化修饰调控其与CAPN3的结合能力,招募CAPN3进入核仁降解p53。此外,Def-CAPN3对细胞周期及斑马鱼器官发育的调控也是部分通过p53实现的。在两个不同的Caapn3b基因敲除品系斑马鱼的肝脏细胞中,p53都大量积累于核仁。虽然该斑马鱼纯合突变体可正常繁育,但是成年鱼表现出体长变短、躯体易侧弯的症状,与capn3基因突变引起的先天性肢带型肌肉营养不良（LGMD2A）症状类似。为了寻找Def-CAPN3在核仁内的其他靶蛋白,我们通过蛋白质组学技术分析了capn3b基因敲除斑马鱼与野生型斑马鱼肝脏细胞核仁中差异表达的蛋白,发现了 119个在capn3b突变鱼中上调（超过1.45倍）的核蛋白,其中核仁蛋白33个。对其中8个候选蛋白进行体内、体外的验证实验,证明其中7个（LmnA、Nkap、Ddx18、Cdk9、Hmgb1、Tra2a、Bbofl）蛋白能够被CAPN3降解,而且能够被Def诱导降解。此外,通过对蛋白质组学数据的深入分析,我们发现Capn3b还参与了免疫系统的调节,这解释了为何部分LGMD2A患者在发病早期出现炎症反应。综上所述,我们的研究首次阐明了 Def-CAPN3降解途径能够在核仁内通过对靶蛋白的降解,调控细胞周期进程及器官发育。作为首个斑马鱼核仁蛋白质组学研究,我们的工作不仅为斑马鱼核仁蛋白功能的研究提供了帮助,也通过这种方法鉴定出了 7个Def-CAPN3的新底物,为Def-CAPN3的功能研究提供了新的基础。此外,我们所构建的capn3b基因敲除斑马鱼能够作为LGMD2A疾病研究模型,将来可用于药物筛选。
张茂[7]（2017）在《miR-217负调控MTDH抑制肝癌细胞增殖和侵袭等作用机制的研究》文中进行了进一步梳理背景肝细胞癌（肝癌）在全球恶性肿瘤中发病率居第五位,死亡率居第三位。由于早期无特异表现、治疗后易复发,肝癌病人整体预后较差,是威胁人类健康的重大医疗问题。因此,寻找用于精准早期诊断的的生物标志物和有效的治疗靶点是肝癌研究的重点。近年来发现miR-217已被证实在胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤中异常表达,但是在肝癌中miR-217的作用机制仍不明确。异黏蛋白（MTDH）是一种含582个氨基酸的单跨膜蛋白,其在多种肿瘤中均有异常高表达,且其表达水平与肿瘤的进展正相关。MTDH基因的表达还与癌症进展的阶段、分期、以及预后相关。MTDH基因通过调控癌症过程中的多个信号通路参与癌症进程,因此MTDH是一个潜在的治疗靶点。目前对于MTDH在肝癌中的表达调控机制研究还比较少。miRNA能通过间接或者直接调控MTDH的的表达,在结直肠癌中是miRNA间接调控MTDH,在乳腺癌、人头颈部鳞状细胞癌中都是miRNA直接调控MTDH的实例,然而对于miR-217与MTDH的关系尚不明确。我们通过对患者肝癌组织和HepG2细胞的研究,探索miRNA-217介导MTDH在肝癌发生发展中的相关研究及作用机制。目的1.检测miR-217和MTDH在肝癌和癌旁组织中的差异性表达,探讨其相关性;2.验证miR-217与MTDH基因的靶向作用关系;3.检测miR-217对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法1.自南方医科大学南方医院病理科收集20例肝癌和癌旁组织,分别采用实时荧光定量PCR及Western Blot检测其中miR-217、MTDH mRNA和蛋白水平的表达;2.通过TargetScan预测miR-217与MTDH的结合位点,分别构建MTDH基因3’-UTR区的野生型和突变型荧光素酶报告质粒,与miR-217 mimics共转染HepG2细胞,检测其荧光表达变化。在HepG2细胞中过表达miR-217,通过实时荧光定量PCR、Western Blot及免疫荧光分别检测细胞中MTDH的mRNA和蛋白的表达变化,验证miR-217对MTDH的靶向作用;3.在HepG2细胞中过表达miR-217,通过MTT、流式细胞术、Transwell实验检测miR-217对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学特性的影响。结果1.在20例肝癌和癌旁组织中,miR-217在肝癌中的表达量较癌旁组织明显降低（40%）,而MTDH mRNA在肝癌中较癌旁组织表达高近一倍,MTDH蛋白水平的表达mRNA水平一致。2.通过转染miR-217 mimics,成功在HepG2细胞中过表达miR-217,miR-217显着抑制野生型MTDH 3’-UTR载体的荧光强度,对突变型MTDH 3’-UTR载体无明显作用。过表达miR-217明显抑制HepG2细胞中MTDH mRNA和蛋白的表达,证明了 miR-217直接靶向于MTDH基因的3’-UTR区,从而抑制MTDH基因的表达。3.在HepG2细胞中过表达miR-217,通过CCK-8实验和流式细胞周期检测发现:较之空白及阴性对照组,过表达miR-217能显着抑制HepG2细胞的增殖,并增加处于G1期、减少S期的HepG2细胞;同时,过表达miR-217,促进HepG2细胞的凋亡;Transwell实验结果表明,过表达miR-217后,转移到下室中的细胞明显减少,证明miR-217显着抑制HepG2细胞的迁移和侵袭。结论1.在肝癌组织中miR-217表达下调,MTDH表达上调。2.miR-217靶向作用于MTDH,抑制其表达。3.miR-217能够显着抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移并促进HepG2细胞的凋亡。
左东云[8]（2016）在《脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素诱导的小麦基因克隆及功能鉴定》文中研究说明脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）属于单端孢霉烯族毒素,是一类主要由小麦赤霉病优势菌禾谷镰刀菌产生的真菌毒素。DON是目前世界粮食和饲料产品中污染最为广泛的真菌毒素之一,严重威胁人、畜健康。DON能够通过与真核生物核糖体60S亚基结合,抑制真核细胞蛋白质合成,引起人和其它动物呕吐、免疫失调和腹泻等不良反应;DON也是赤霉菌的致病因子之一,可促进该菌在小麦体内的扩展。因此,筛选抗DON毒素及其产毒菌的基因,研究DON与小麦之间的分子互作机制,对于揭示赤霉菌致病机理,培育抗赤霉病小麦新品种具有重要理论意义。本研究主要包括两部分内容:①从小麦悬浮细胞抑制差减杂交文库中筛选经DON诱导的基因,以cDNA快速末端扩增方法（Rapid Aplification of cDNA ends,RACE）克隆基因全长序列,分析它们的表达模式,鉴定其生物学功能;②通过高通量RNA-seq测序,从转录水平研究DON与小麦细胞的互作,分析小麦应答DON毒素的基因网络和信号传导。主要结果如下:1)小麦TaAn基因的克隆和鉴定。受DON诱导的TaAn基因全长523 bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为222 bp,编码73个氨基酸,没有内含子;TaAn-GFP细胞定位分析表明,TaAn编码的蛋白质主要定位在细胞膜上,同时在细胞核中也有少量分布;DON处理小麦12 h后,TaAn基因的表达量提高了 17040 倍;利用热不对称交错 PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR）克隆了该基因的启动子,序列分析发现其含有多种应答胁迫环境的顺式作用元件;在拟南芥中表达TaAn基因,能显着提高转基因植株对DON和赤霉菌的抗性。2)小麦TaUn基因的克隆和鉴定。TaUn基因全长563bp,其ORF为168bp,编码55个氨基酸,没有内含子;TaUn-GFP细胞定位分析表明,该基因编码的蛋白质主要定位在细胞膜上,少量分布在细胞核膜中;DON处理小麦24 h后,TaUn基因的表达量提高了 28033倍;TAIL-PCR克隆该基因的启动子,序列分析发现其含有多种应答病原菌侵染和胁迫环境的顺式作用元件;将TaUn基因转化到拟南芥植株中后,能显着提高转基因植株对DON和赤霉菌的抗性。3)小麦甲硫氨酰tRNA合成酶（Methionyl-tRNAsynthetase,TaMetRS）基因的克隆和鉴定。TaMetRS基因全长3905 bp,含有7个内含子,其ORF为1791 bp,编码596个氨基酸,含有典型的甲硫氨酰tRNA合成酶保守序列及核定位信号;TaMetRS-GFP细胞定位分析表明,TaMetRS基因编码的蛋白质定位在细胞核中;这个基因只受DON毒素和产DON赤霉菌菌株的诱导,而丧失产毒能力的突变菌株Tri5-不能诱导TaMetRS基因的表达;在拟南芥中表达TaMetRS基因,能显着提高转基因植株对DON和赤霉菌的抗性。4)小麦多药输出泵蛋白（Multidrug and toxin compound extrusion,MATE）基因的克隆和鉴定。TaMATE基因全长2572 bp,含有7个内含子,其ORF为1449 bp,编码482个氨基酸,含有10个典型的跨膜结构,TaMATE-GFP细胞定位分析证实,该蛋白质定位在细胞膜上;这个基因的表达受到DON和产DON菌株的诱导,不产毒素的突变菌株Tri5-的诱导效率较低;将TaMATE基因转入拟南芥中,能显着提高转基因植株对DON和赤霉菌的抗性。5)DON与小麦细胞互作的转录组研究。高通量RNA-seq测序结果表明:①DON可对小麦细胞造成巨大的毒害作用,如激活28个逆转录转座子,诱发大量基因突变、干扰植物正常生长发育,诱导类穿孔毒素蛋白表达,破坏细胞膜的完整性,抑制真核生物蛋白质的生物合成,影响其正常的生理生化反应;②DON能够促进赤霉菌在小麦体内扩展的代谢途径,如激活腐胺生物合成途径,为禾谷镰刀菌的侵染提供营养,促进病菌在小麦上的生长繁殖;③DON能够诱导多种脱毒基因及修饰酶的表达,对DON进行脱毒;④DON能够激活小麦体内病原菌相关分子引发的免疫反应（PAMPs-triggered immunity,PTI）和效应蛋白诱导的免疫反应（Effector-triggered immunity,ETI）及一系列其它代谢途径,可以提高植物的防御反应和补救DON对小麦造成的伤害。在拟南芥中,DON毒素能够激活植物的PTI和ETI信号途径,这种激活作用与环氧结构密切相关。
应荣[9]（2014）在《茭白黑粉菌cAMP及MAPK途径关键基因的克隆及表达分析》文中指出茭白是我国第二大水生蔬菜，广泛栽培于长江流域及以南地区，具有重要的经济效益。茭白的孕茭与其内生真菌茭白黑粉菌的侵染互作关系密切，茭白黑粉菌的菌丝形态是决定茭白商品性和食用价值的关键因素。厚垣孢子充满茎部的灰茭严重影响茭白的经济价值。蛋白质组学和表达谱分析表明PKA和MAPK关键酶在酵母型和菌丝型茭白黑粉菌中差异表达PKA，它们积极参与了菌丝形成及玉米黑粉菌等真菌从酵母型向菌丝型转变的过程。本研究以分离自“龙茭2号”正常茭和灰茭的茭白黑粉菌为研究材料，利用分子生物学和生物信息学等研究了茭白黑粉菌cAMP途径关键基因（UePka）及MAPK途径关键基因（UeErk、UeMkk、UeSsk）的基因结构、不同碳源下的表达差异及基因之间的互作。结果如下：一、茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的克隆及序列分析根据转录组测序结果设计了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的引物，反转录PCR获得各基因的cDNA部分序列，RACE技术获得cDNA全长序列。序列同源性分析表明，UePka与玉米黑粉菌的同源性达到93.63%，UeErk与玉米丝黑穗病菌的同源性达到82.21%，UeMkk与大麦坚黑穗病菌的同源性达到83.53%，UeSsk与大麦坚黑穗病菌的同源性达到78.36%。UePka cDNA全长为1949bp，含有一个1230bp的开放阅读框，编码410个氨基酸，预测的分子量约为45.78kDa，理论等电点为8.29，包含555bp的5‘UTR和161bp的3‘UTR。UeErk cDNA全长为1828bp，含有一个1659bp的开放阅读框，编码553个氨基酸，预测的分子量约为62.05kDa，理论等电点为6.60，包含7bp的5‘UTR和10bp的3‘UTR。UeMkk cDNA全长为2204bp，含有一个2040bp的开放阅读框，编码680个氨基酸，预测的分子量约为72.68kDa，理论等电点为8.09，包含54bp的5‘UTR和107bp的3‘UTR。UeSsk cDNA全长为7625bp，含有一个5871bp的开放阅读框，编码1957个氨基酸，预测的分子量约为214.54kDa，理论等电点为5.19，包含1669bp的5‘非编码区（5‘UTR）和82bp的3‘UTR。各基因3‘UTR均有典型的poly（A）尾巴。各基因的开放阅读框都具有丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化域、蛋白激酶ATP结合位点、丝/苏氨酸蛋白激酶活化位点这三个特征序列。此外，UePka还具有AGC激酶C端特征序列，UeErk还具有MAPK保守位点特征序列。根据四个基因的cDNA全长序列，分别设计了引物进行茭白黑粉菌基因组序列扩增，获得了四个基因的基因组序列。通过与cDNA序列的比较发现，除UePka含有一个113bp的内含子外，UeErk、UeMkk和UeSsk都不具有内含子。二、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk不同碳源下的差异表达分析采用实时荧光定量PCR检测了四个基因在不同碳源下的差异表达。结果表明在相对于麦芽糖为唯一碳源的培养基中培养4天，在蔗糖为唯一碳源的培养基中培养第4天时，UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的表达量上调显着，分别为13.3、31.3、183.8、28.6倍；但随着培养时间的延长，四个基因在两种碳源培养基中的表达量间没有显着差异。显微观察表明，在以蔗糖为唯一碳源的培养基中培养第4天时，酵母型黑粉菌由原来的短杆菌开始出现分支并且菌体变长，逐渐转变为菌丝形态。说明不同碳源条件可以诱导茭白黑粉菌二型态转变，四种基因表达量都有明显上调表明四种基因在不同程度上都与茭白黑粉菌二型态的转变相关。三、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk原核表达分别构建了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的原核表达重组质粒pPorf-pET-28a、pEorf-pET-28a、pMorf-pET-28a和pSorf-pET-28a并实现了诱导表达。诱导表达条件为：37℃，180rpm摇床培养1.52h；OD600为0.40.6时加IPTG终浓度至0.2mM，继续培养57h。对原核表达产物进行了SDS-PAGE电泳分析，特异性条带与预测的大小相符。四、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的互作分析采用Ni-NTA亲和树脂来纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明，UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk都纯化得到了较为单一的条带。UePka蛋白与Ni-NTA具有高亲和性，纯化效果最理想。蛋白互作分析表明，UePka、UeErk与总蛋白存在互作，UeMkk和总蛋白不存在互作，UePka与UeMkk不存在互作。各蛋白之间的互作关系还需要进一步分析。
李微[10]（2014）在《中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析》文中研究说明病毒感染会激发宿主的免疫应答反应，宿主细胞内的一些因子在这一过程中起着重要的作用，其表达量通常会发生上调或下调的表达变化。白斑症病毒（WSSV）病是危害对虾养殖业健康发展的最重要疾病之一，中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）对其极其易感，为寻找在中国对虾应答WSSV感染反应中起关键作用的蛋白，本文利用蛋白质组学技术鉴定了中国对虾感染WSSV后血细胞中发生差异表达的蛋白质，并对其中的2种蛋白—小泛素相关修饰物（SUMO）和蛋白磷酸酶进行了深入分析，为揭示对虾抗WSSV反应的分子机制提供了重要数据，具体研究内容和结果如下：（1）中国对虾感染WSSV后血细胞差异表达蛋白质的鉴定。双向（2D）电泳分离感染组和对照组对虾血细胞样品，并用PDQuest软件分析2D凝胶。结果成功获得了中国对虾血细胞总蛋白2D图谱，每张凝胶上有约580个蛋白质点被检测出；WSSV感染24后，共有26个蛋白质点呈显着性上调表达（P﹤0.05），19个蛋白质点呈显着性下调表达。随后，对差异表达蛋白质进行质谱分析，共有33种蛋白质得到了成功的鉴定，包括SUMO1、细胞质MnSOD、微管蛋白α1链、微管-肌动蛋白交联因子1、磷酸丙糖异构酶、核受体E75蛋白、空泡ATP合酶亚基BL、肌醇1,4,5-三磷酸受体和精氨酸激酶等；利用生物信息学方法将鉴定的蛋白进行GO功能分类，结果将其分为9个类群，分别为：免疫相关蛋白、刺激应答蛋白、细胞骨架蛋白、DNA或蛋白质结合蛋白、葡萄糖代谢相关蛋白、甾类激素介导的信号转导蛋白、ATP合酶、跨膜转运蛋白和未分组蛋白。此外，利用实时荧光定量PCR检测WSSV感染后对虾血细胞中3种上调表达蛋白（细胞质MnSOD、热休克蛋白70和精氨酸激酶）和1种下调表达蛋白（酚氧化酶原）对应基因的表达变化情况，结果显示，这些因子在mRNA水平的变化与蛋白质组学结果较为一致。（2）中国对虾SUMO及其E2结合酶UBC9的基因克隆与表达分析。从鉴定出的差异表达蛋白质中选取SUMO进行深入分析，首先，采用RACE技术对中国对虾SUMO和UBC9进行基因克隆，结果显示，中国对虾SUMO cDNA全长1128bp，包含一个282bp的开放阅读框（ORF），编码93个氨基酸，其理论分子量为10.6kDa；UBC9cDNA全长1170bp，包含一个483bp的ORF，编码160个氨基酸，其理论分子量为18.4kDa;同源性比对发现，中国对虾的SUMO和UBC9均高度保守。随后，利用实时荧光定量PCR分别检测了SUMO和UBC9mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，SUMO和UBC9基因在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，二者均在血细胞和性腺中呈高丰度表达；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中这2种基因均呈显着性上调表达，且血细胞中的上调表达更为显着。（3）中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的原核表达及多克隆抗体制备及应用。利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的重组表达质粒，pET-28a-SUMO和pET-28a-UBC9，诱导表达后得到分子量分别为19.7kDa和25.6kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化；用纯化蛋白免疫小鼠，分别获得了抗SUMO和UBC9的多克隆抗体（PAb）。应用PAb分析中国对虾血细胞中SUMO和UBC9的特性，western blotting结果显示，SUMO的PAb可以特异性识别血细胞中13.5kDa的蛋白，而UBC9的Pab可以识别18.7kDa的蛋白；间接免疫荧光实验结果表明，SUMO分布于血细胞的细胞核和细胞质中，而UBC9主要分布于细胞核中。（4）RNA干扰实验分析SUMO和UBC9在病毒感染中的作用。利用体外转录法，分别合成了SUMO和UBC9的双链RNA（dsRNA），dsSUMO和dsUBC9。随后，将dsRNA注射到对虾体内以研究SUMO或UBC9基因沉默对WSSV感染的影响。结果显示，病毒感染后，RNA干扰组对虾血细胞中的WSSV拷贝数和病毒基因的表达量均较阳性对照组低；累计死亡率曲线显示，SUMO或UBC9的沉默均在一定程度上降低了WSSV感染引起的对虾的死亡。（5）中国对虾蛋白磷酸酶1催化亚基β（PP1β）的基因克隆及原核表达。首先，采用RACE技术对中国对虾PP1β进行基因克隆和生物信息学分析，结果显示，PP1β cDNA全长1214bp，包含一个987bp的ORF，编码328个氨基酸，其理论分子量为37.6kDa；同源性比对发现，中国对虾的PP1β氨基酸序列表现出高度保守性。随后，利用实时荧光定量PCR检测了PP1β mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，PP1β在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，其中在性腺中表达最高，血细胞次之；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中PP1β基因均呈上调表达，并在12h达到峰值，且血细胞中的上调表达更为显着。此外，利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾PP1β ORF的重组质粒pET-28a-PP1β，诱导表达后得到分子量为41kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化。
二、大肠杆菌中一种对NF-IL63′UTR专一的结合蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌中一种对NF-IL63′UTR专一的结合蛋白（论文提纲范文）
（1）番茄SlMPK2在高温胁迫过程中的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照词符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 植物MAPK级联 |
| 2. 植物MAPK分类 |
| 3. 植物MAPK功能 |
| 3.1 MAPK在生长发育过程中的功能 |
| 3.2 MAPK应答生物胁迫 |
| 3.3 MAPK应答非生物胁迫 |
| 4. 植物MAPK应答高温胁迫 |
| 4.1 钙(Ca~(2+))信号途径 |
| 4.2 活性氧(ROS)信号途径 |
| 4.3 热激转录因子(HSF)与热激蛋白(HSP〉 |
| 4.4 其他靶蛋白 |
| 5. 本研究的目的及意义 |
| 第二章 番茄SlMPK2在高温胁迫下的功能 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌种及质粒 |
| 2.3 相关试剂 |
| 2.4 相关溶液及培养基 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 亚细胞定位 |
| 3.3 番茄遗传转化 |
| 3.4 拟南芥遗传转化 |
| 3.5 番茄高温处理 |
| 3.6 拟南芥高温处理 |
| 3.7 生理指标测定 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 载体构建 |
| 4.2 SlMPK2蛋白的亚细胞定位 |
| 4.3 转基因材料获得 |
| 4.4 SlMPK2调节番茄对高温的耐受性 |
| 4.5 SlMPK2调节拟南芥对高温的的耐受性 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第三章 酵母双杂筛选与SlMPK2互作的蛋白 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 菌种及载体 |
| 2.2 溶液及培养基 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 pGBKT7-SlMPK2和pGADT7-EV共转化酵母菌株 |
| 3.3 SlMPK2自激活检测 |
| 3.4 3-AT浓度优化 |
| 3.5 酵母双杂文库筛选 |
| 3.6 pGADT7插入片段PCR扩增及测序 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 载体构建 |
| 4.2 诱饵蛋白自激活检验 |
| 4.3 3-AT浓度筛选 |
| 4.4 番茄cDNA文库筛选S1MPK2互作蛋白 |
| 4.5 测序结果及分析 |
| 4.6 Y2H验证与SlMPK2互作蛋白 |
| 4.7 BiFC验证与SlMPK2互作蛋白 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第四章 SlMPK2互作蛋白SlMKK9在高温胁迫下的功能 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 番茄遗传转化 |
| 3.3 拟南芥遗传转化 |
| 3.4 番茄高温处理 |
| 3.5 拟南芥高温处理 |
| 3.6 生理指标测定 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 SlMKK9与SlMPK2互作验证 |
| 4.2 载体构建 |
| 4.3 转基因材料获得 |
| 4.4 SlMKK9调节番茄对高温的耐受性 |
| 4.5 SlMKK9调节拟南芥对高温的耐受性 |
| 5. 小结与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 一、主要结果 |
| 二、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）RNA中m6A甲基化修饰与家蚕滞育的关联研究（论文提纲范文）
| 英文缩写说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 RNA修饰研究进展 |
| 1.1.1 RNA的表观修饰 |
| 1.1.2 m~6A修饰 |
| 1.1.3 m~6A修饰的识别与检测 |
| 1.1.4 m~6A修饰的编辑 |
| 1.1.5 m~6A修饰的生物学效应 |
| 1.2 昆虫及家蚕滞育研究进展 |
| 1.2.1 滞育的概念 |
| 1.2.2 滞育的生理 |
| 1.2.3 滞育与表观遗传 |
| 1.3 基因功能研究技术 |
| 1.3.1 RNAi |
| 1.3.2 CRISPR-Cas9 |
| 1.3.3 Trim-Away |
| 1.4 主要研究内容 |
| 1.4.1 问题的提出 |
| 1.4.2 研究内容与方法 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第2章 家蚕m~6A甲基化工具酶系统发生学与表达特性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 家蚕m~6A甲基化工具酶同源基因 |
| 2.3.2 家蚕m~6A甲基化工具酶基因系统发育分析 |
| 2.3.3 总RNA质量检验 |
| 2.3.4 q PCR与 RNAi引物 |
| 2.3.5 目的片段PCR的检测 |
| 2.3.6 质粒标准品鉴定结果 |
| 2.3.7 标准曲线的构建 |
| 2.3.8 m~6A甲基化工具酶转录特性分析 |
| 2.3.9 METTL3蛋白表达特性分析 |
| 2.3.10 RNAi结果检测 |
| 2.3.11 Trim-away结果检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 家蚕m~6A修饰丰度及外界因素影响效果分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 多化性家蚕蛹期卵巢m~6A丰度 |
| 3.3.2 多化性家蚕卵中m~6A丰度 |
| 3.3.3 浸酸处理对蚕卵中m~6A甲基化工具酶表达的影响 |
| 3.3.4 浸酸处理对蚕卵中m~6A丰度的影响 |
| 3.3.5 滞育激素处理对BmN细胞m~6A甲基化工具酶表达的影响 |
| 3.3.6 滞育激素处理对BmN细胞m~6A丰度的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 二化性家蚕蛹期3D卵巢Me RIP-seq分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 测序数据的分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 数据过滤与质量评估 |
| 4.3.2 序列比对分析 |
| 4.3.3 单样本peak分析 |
| 4.3.4 组内peak分析 |
| 4.3.5 motif分析 |
| 4.3.6 组间peak分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）大豆GmSPL3基因家族功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一节 引言 |
| 1.1 SPL转录因子研究进展 |
| 1.1.1 SPL转录因子的结构 |
| 1.1.2 SPL转录因子调控植物的生长发育 |
| 1.1.3 SPL转录因子调控植物开花 |
| 1.2 基因编辑技术的研究进展 |
| 1.2.1 ZFNs介导的基因定点修饰技术 |
| 1.2.2 TALE核酸酶介导的基因定点修饰技术 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.4 研究内容与技术路线 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和培养条件 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 GmSPL3基因的组织特异性表达分析 |
| 2.2.3 构建CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除载体 |
| 2.2.4 大豆遗传转化 |
| 2.2.5 DNA提取及浓度测定 |
| 2.2.6 CRISPR/Cas9载体骨架检测 |
| 2.2.7 spl3突变体基因型检测 |
| 2.2.9 GmSPL3基因敲除突变体种植 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 GmSPL3的聚类分析 |
| 3.2 GmSPL3蛋白保守结构域比对 |
| 3.3 GmSPL3基因的组织特异性表达模式分析 |
| 3.4 构建CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除载体 |
| 3.4.1 GmSPL3基因gRNA靶点设计 |
| 3.4.2 gRNAs表达盒扩增产物检测 |
| 3.4.3 阳性克隆筛选 |
| 3.4.4 AscI体外酶切验证 |
| 3.5 GmSPL3基因编辑株系的获得 |
| 3.5.1 农杆菌介导法进行大豆遗传转化 |
| 3.5.2 T0代植株PCR检测 |
| 3.5.3 T1代转基因植株检测 |
| 3.6 spl3abd突变体表型观察 |
| 3.7 转基因植株后代的基因型检测 |
| 3.8 T5代spl3abcd突变体的功能研究 |
| 第四节 讨论 |
| 4.1 CRISPR/ 技术 |
| 4.2 GmSPL3不调控大豆开花时间 |
| 4.3 GmSPL3调控大豆株型 |
| 4.4 GmSPL3调控大豆产量 |
| 第五节 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 GmSPL3是AtSPL3的同源基因 |
| 5.1.2 GmSPL3在大豆中不参与调控开花 |
| 5.1.3 GmSPL3调控大豆株型 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 橡胶树白粉菌 |
| 1.1.1 橡胶树及天然橡胶 |
| 1.1.2 橡胶树白粉病 |
| 1.1.3 橡胶树白粉菌(Oidium heveae Steinm) |
| 1.2 丝状真菌的遗传转化 |
| 1.2.1 基因工程的选择标记 |
| 1.2.2 丝状真菌的遗传转化方法 |
| 1.2.3 专性寄生真菌的遗传转化 |
| 1.2.4 橡胶树白粉菌的遗传转化 |
| 1.3 启动子 |
| 1.3.1 启动子的概念 |
| 1.3.2 真核生物的启动子 |
| 1.3.3 组成型启动子 |
| 1.3.4 诱导型启动子 |
| 1.3.5 丝状真菌的启动子 |
| 1.3.6 启动子的克隆方法 |
| 1.3.7 启动子的研究方法及策略 |
| 1.3.8 启动子研究中存在的问题和不足 |
| 1.4 hrp基因hpa Xm |
| 1.4.1 Harpin蛋白及hrp基因 |
| 1.4.2 hpa Xm基因及Hpa Xm蛋白 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 微生物材料 |
| 2.1.3 化学药品和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 1%琼脂糖平板上橡胶树白粉菌分生孢子萌发率的测定 |
| 2.2.2 抗生素的植物毒性(phytotoxicity)评估 |
| 2.2.3 确定合适的抗生素抗性基因用作筛选标记 |
| 2.2.4 重组载体的构建 |
| 2.2.5 适合橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液的确定 |
| 2.2.6 O.heveae的电击转化 |
| 2.2.7 O.heveae的 ATMT |
| 2.2.8 转化子的显微分析 |
| 2.2.9 转化子的分子分析 |
| 2.2.10 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 2.2.11 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 2.2.12 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因GUS瞬时表达量测定 |
| 2.2.13 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因表达范围的探索 |
| 2.2.14 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 2.2.15 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 2.2.16 橡胶树白粉菌内源强启动子序列全长分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 橡胶树白粉菌分生孢子萌发最佳测定时间的确定 |
| 3.2 橡胶树白粉菌分生孢子常用抗生素敏感性测定 |
| 3.3 抗生素的植物毒性评估 |
| 3.4 确定合适的筛选抗性基因 |
| 3.5 重组载体的构建 |
| 3.6 确定合适的电击缓冲液 |
| 3.7 橡胶树白粉菌电击转化 |
| 3.8 ATMT法转化橡胶树白粉菌 |
| 3.9 转化子的荧光观察 |
| 3.10 转化子的分子分析 |
| 3.10.1 T3代转化子的PCR验证 |
| 3.10.2 Southern blot analysis |
| 3.11 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 3.12 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 3.12.1 橡胶树白粉菌内源启动子克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.12.2 三亲杂交 |
| 3.12.3 橡胶树白粉菌内源疑似启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达 |
| 3.13 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因GUS瞬时表达效率测定 |
| 3.14 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的范围探索 |
| 3.14.1 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在双子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.14.2 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在单子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.15 橡胶树白粉菌内源强启动子的类型分析 |
| 3.15.1 转基因烟草的组培 |
| 3.15.2 T1代转基因烟草的分子检测 |
| 3.15.3 橡胶树白粉菌内源启动子的类型及序列分析 |
| 3.16 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 3.16.1 植物表达载体构建 |
| 3.16.2 WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的稳定表达 |
| 3.16.3 稳定表达及分子检测 |
| 3.16.4 WY195-hpa Xm转基因烟草T1 代的TMV检测 |
| 3.17 橡胶树白粉菌内源强启动子WY195序列全长分析 |
| 3.17.1 橡胶树白粉菌内源启动子WY195序列的生物信息学分析 |
| 3.17.2 渐变缺失分析WY195启动子的有效全长 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建 |
| 4.1.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系开发中的关键创新 |
| 4.1.2 其它技术限制 |
| 4.1.3 总结与展望 |
| 4.2 橡胶树白粉菌内源启动子的预测及功能鉴定 |
| 4.2.1 丝状真菌的内源启动子具有很大的开发潜力 |
| 4.2.2 橡胶树白粉菌内源强启动子具有很强的驱动外源基因表达能力 |
| 4.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子具有广泛的调控表达谱 |
| 4.2.4 后续工作及展望 |
| 5 结论 |
| 5.1 橡胶树白粉菌遗传转化的建立 |
| 5.1.1 橡胶树白粉菌抗生素敏感性评价 |
| 5.1.2 橡胶树白粉菌电击缓冲液的确定 |
| 5.1.3 橡胶树白粉菌的电击转化 |
| 5.1.4 橡胶树白粉菌的ATMT转化 |
| 5.2 橡胶树白粉菌内源启动子资源初探 |
| 5.2.1 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 5.2.2 橡胶树白粉菌内源疑似启动子的功能验证 |
| 5.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的能力测定 |
| 5.2.4 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因转录范围研究 |
| 5.2.5 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 5.2.6 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 调控外源基因hpa Xm在烟草中的表达 |
| 5.2.7 橡胶树白粉菌内源启动子WY195的全长分析 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）尿路致病性大肠杆菌中一个新的二元调控系统的鉴定及其调控机理和生物学功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 尿路致病性大肠杆菌及其致病机理 |
| 1 简述 |
| 2 尿路致病性大肠杆菌的致病过程及其毒力相关因子 |
| 2.1 尿路致病性大肠杆菌致病过程概述 |
| 2.2 粘附素 |
| 2.3 毒素蛋白 |
| 2.4 摄铁系统 |
| 2.5 宿主对尿路致病性大肠杆菌的反应 |
| 2.6 尿路感染的传播、治疗和防控 |
| 第二章 二元调控系统在病原菌中的作用 |
| 1 二元调控系统简述 |
| 2 二元调控系统影响病原菌的毒力相关因子 |
| 3 二元调控系统影响细菌的抗药性和生长增殖 |
| 4 波氏菌中非典型的二元调控系统对毒力的调控 |
| 5 二元调控系统作为靶标开发新的抗菌药物 |
| 第三章 细菌的MFS和DASS家族转运蛋白 |
| 1 MFS家族转运蛋白 |
| 1.1 结构特征 |
| 1.2 转运机制 |
| 2 DASS家族转运蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 新型二元调控系统KguSR调控尿路致病性大肠杆菌利用宿主体内代谢物的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 生物信息学预测二元调控系统 |
| 1.4 缺失突变株的构建 |
| 1.5 互补菌株的构建 |
| 1.6 生长曲线的测定 |
| 1.7 小鼠尿路感染模型 |
| 1.8 双重PCR鉴定基因型 |
| 1.9 缺失突变株生长特性的描述 |
| 1.10 差异二维蛋白电泳鉴定靶基因 |
| 1.11 实时荧光定量PCR检测基因转录水平 |
| 1.12 反转录-PCR检测操纵元的形成 |
| 1.13 双亲接合构建lacZ融合菌株 |
| 1.14 MBP-C5040-His_6融合蛋白的超量表达与纯化 |
| 1.15 凝胶阻滞实验(EMSA) |
| 2 结果 |
| 2.1 UPEC str. CFT073中二元调控系统的预测 |
| 2.2 C5041/C5040编码一个新的二元调控系统 |
| 2.3 在尿路感染的动物模型上,c5041和c5040显着提高CFT073在体内的适应性 |
| 2.4 利用差异蛋白组学(2D-DIGE)鉴定C5041/C5040的靶基因 |
| 2.5 C5041/C5040调控靶基因岛影响细菌在体内的适应性 |
| 2.6 基因岛基因c5032-5039参与无氧条件下α-KG的利用 |
| 2.7 无氧条件下C5040直接调控c5032-5039的表达并且参与α-KG的利用 |
| 2.8 无氧条件下C5041对c5032-5039表达的调控及对利用α-KG的影响 |
| 2.9 KguS(C5041)的遗传发育分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 尿路致病性大肠杆菌利用α-酮戊二酸的转运蛋白C5038和KgtP的转录调控的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 遗传发育树的构建 |
| 1.4 突变株、质粒载体和重组质粒的构建 |
| 1.5 β-半乳糖苷酶活性的测定 |
| 1.6 蛋白纯化和凝胶阻滞试验 |
| 1.7 生长参数的测定 |
| 1.8 小鼠尿路感染模型 |
| 1.9 实时荧光定量PCR检测基因转录水平 |
| 1.10 5'-RACE PCR方法鉴定转录起始位点 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 C5038和KgtP的序列及遗传发育分析 |
| 2.2 在不同的氧分压下,C5038和KgtP对KG的利用发挥的作用不同 |
| 2.3 低氧分压诱导c5038却抑制kgtP表达 |
| 2.4 FNR和ArcA诱导c5038但却抑制kgtP表达 |
| 2.5 c5038通过二元系统KguSR(C5041/C5040)感应低氧分压 |
| 2.6 c5038和kgtP在不同培养基和环境中的表达以及CRP的调控作用 |
| 2.7 c5038和kgtP受不同的Sigma因子控制 |
| 2.8 C5038无氧下工作效率更高而KgtP有氧下工作效率更高 |
| 2.9 c5038和kgtP对UPEC体内适应性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 二元调控系统响应蛋白KguR调控的分子机理初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 突变株、质粒载体和重组质粒的构建 |
| 1.4 β-半乳糖苷酶活性的测定 |
| 1.5 蛋白纯化和凝胶阻滞试验 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 KguR结合位点的鉴定 |
| 2.2 KguR对其它基因的调控 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）核仁蛋白Def与半胱氨酸蛋白酶CAPN3的互作研究及其在核仁中的靶蛋白鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 半胱氨酸蛋白酶家族及Calpain3(CAPN3) |
| 1.1.1 半胱氨酸蛋白酶家族Calpains |
| 1.1.2 CAPN3的发现 |
| 1.1.3 CAPN3蛋白的结构与功能 |
| 1.1.4 CAPN3与人类疾病LGMD2A |
| 1.2 抑癌因子p53 |
| 1.2.1 p53的发现 |
| 1.2.2 p53的功能及调控 |
| 1.2.3 p53的点突变与癌症 |
| 1.3 核仁的结构和功能 |
| 1.3.1 核仁的结构 |
| 1.3.2 核仁是核糖体合成、加工的场所 |
| 1.3.3 核仁的其他功能 |
| 1.4 核仁蛋白Def |
| 1.5 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.5.1 斑马鱼作为模式生物的历程 |
| 1.5.2 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.5.3 斑马鱼与免疫学研究 |
| 1.6 本研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 斑马鱼 |
| 2.1.1 斑马鱼伦理 |
| 2.1.2 斑马鱼饲养 |
| 2.1.3 斑马鱼的交配及受精卵的收集 |
| 2.1.4 斑马鱼品系 |
| 2.2 细胞系及细胞操作 |
| 2.2.1 本课题所用细胞系 |
| 2.2.2 细胞系培养和冻存 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.3 抗体 |
| 2.4 DNA相关操作方法 |
| 2.4.1 基因克隆 |
| 2.4.1.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.4.1.2 点突变或短片段删除 |
| 2.4.1.3 拼接PCR(适用于长片段删除) |
| 2.4.2 PCR及DNA酶切产物的纯化 |
| 2.4.3 酶切与连接 |
| 2.4.4 基因组DNA的抽提 |
| 2.5 大肠杆菌操作 |
| 2.5.1 菌株 |
| 2.5.2 热激法转化感受态细胞及大肠杆菌培养 |
| 2.5.3 菌液冻存 |
| 2.5.4 质粒抽提 |
| 2.5.5 菌落PCR |
| 2.6 蛋白质相关操作 |
| 2.6.1 蛋白样品的制备(SDS裂解法) |
| 2.6.1.1 斑马鱼胚胎蛋白样品的制备 |
| 2.6.1.2 斑马鱼肝脏、肌肉等组织蛋白样品的制备 |
| 2.6.1.3 细胞总蛋白样品的制备 |
| 2.6.2 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.6.2.1 SDS-PAGE蛋白胶的配制 |
| 2.6.2.2 凝胶电泳和转膜 |
| 2.6.2.3 目的蛋白信号检测 |
| 2.6.3 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.6.3.1 外源性免疫共沉淀 |
| 2.6.3.2 内源性免疫共沉淀 |
| 2.6.4 GST pull-down实验 |
| 2.6.4.1 蛋白的表达 |
| 2.6.4.2 His标签蛋白的纯化 |
| 2.6.4.3 GST标签蛋白的纯化 |
| 2.6.4.4 蛋白质体外结合与检测 |
| 2.6.5 抗体免疫荧光染色 |
| 2.6.5.1 人类细胞系免疫荧光染色 |
| 2.6.5.2 斑马鱼胚胎或组织的冷冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.7 体外酶活实验 |
| 2.8 真核表达系统表达蛋白及纯化 |
| 2.9 核仁分离 |
| 2.9.1 细胞系核仁分离 |
| 2.9.2 斑马鱼成鱼肝脏核仁分离 |
| 2.10 细胞流式计数分析 |
| 2.10.1 细胞系流式计数分析 |
| 2.10.2 斑马鱼胚胎肝脏细胞流式计数分析 |
| 2.11 mRNA的体外合成 |
| 2.12 斑马鱼显微注射 |
| 2.13 斑马鱼胚胎整胚原位杂交(WISH) |
| 2.14 蛋白质组学分析 |
| 2.15 TALENs技术构建基因敲除品系斑马鱼 |
| 2.16 生物信息学分析 |
| 2.17 本研究所用Morpholino、siRNA及引物序列 |
| 第三章 p53是CAPN3的底物 |
| 3.1 p53上有两个CAPN3的识别位点 |
| 3.2 野生型p53在体外能被CAPN3水解成小片段 |
| 3.3 p53~(R175H)对CAPN3不敏感 |
| 3.3.1 在体外酶活实验中,p53~(R175H)无法被CAPN3降解 |
| 3.3.2 His-CAPN3蛋白的表达 |
| 3.3.3 粗蛋白抽提液中His-CAPN3酶活性的检测 |
| 3.3.4 His-CAPN3蛋白的纯化 |
| 3.3.5 p53~(R175H)对纯化后的His-CAPN3不敏感 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Def-CAPN3在核仁中形成蛋白复合体 |
| 4.1 核仁分离技术的建立 |
| 4.1.1 HepG2细胞核仁分离 |
| 4.1.2 成年斑马鱼肝脏细胞核仁分离 |
| 4.2 Def与CAPN3形成蛋白复合体 |
| 4.2.1 人hu-Def能够与人CAPN3互作 |
| 4.2.2 斑马鱼Def能够与斑马鱼Capn3b互作 |
| 4.2.3 人类及斑马鱼Def-CAPN3结合位点的探索 |
| 4.2.4 Def-CAPN3还可能结合其他蛋白 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 Def通过磷酸化修饰招募CAPN3进入核仁 |
| 5.1 Def招募CAPN3进入细胞核仁 |
| 5.2 Def的N端磷酸化修饰影响了Def与CAPN3的结合 |
| 5.3 Def的N端磷酸化修饰影响了斑马鱼Capn3b进入核仁 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 Def-CAPN3-p53降解通路对细胞周期的影响 |
| 6.1 在细胞系中敲降hu-Def或CAPN3会引起p53依赖的细胞周期抑制 |
| 6.2 Def对肝脏发育的促进作用部分依赖于p53通路 |
| 6.3 Def的N端磷酸化能够调控斑马鱼肝脏细胞周期进程 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 通过核仁蛋白组学寻找Def-CAPN3的靶蛋白 |
| 7.1 capn3b基因敲除斑马鱼的表型研究 |
| 7.1.1 capn3b基因敲除斑马鱼的鉴定 |
| 7.1.2 capn3b基因敲除斑马鱼肝脏细胞核仁内p53增多 |
| 7.1.3 p53影响3b~(-/-)突变体幼鱼的存活率 |
| 7.2 斑马鱼肝脏核仁蛋白质质谱数据分析 |
| 7.2.1 质谱蛋白样品的准备 |
| 7.2.2 质谱数据分析 |
| 7.3 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定 |
| 7.4 小结与讨论 |
| 第八章 结论与讨论 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 讨论 |
| 8.2.1 CAPN3的核仁定位 |
| 8.2.2 Def-CAPN3对细胞周期的调控 |
| 8.2.3 Def-CAPN3与肿瘤 |
| 8.2.4 建立核仁分离技术的价值 |
| 8.2.5 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）miR-217负调控MTDH抑制肝癌细胞增殖和侵袭等作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.2 microRNA |
| 1.3 黏蛋白MTDH |
| 1.4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 miRNA-217和MTDH基因在肝癌组织中的表达检测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 miRNA-217对MTDH基因调控作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 miRNA-217对肝癌细胞功能影响研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及科研成果 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
（8）脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素诱导的小麦基因克隆及功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 赤霉菌毒素及其危害 |
| 1.2 植物抗赤霉病及赤霉菌毒素解毒相关基因研究进展 |
| 1.2.1 TRI101基因 |
| 1.2.2 UDP-糖基转移酶 |
| 1.2.3 核糖体L3蛋白 |
| 1.2.4 防御反应相关基因及其它基因的应用 |
| 1.3 甲硫氨酰-tRNA合成酶的功能及研究进展 |
| 1.4 多药输出蛋白的功能及研究进展 |
| 1.5 赤霉菌毒素及禾谷镰刀菌与小麦相互作用研究进展 |
| 1.6 植物与病原相互作用研究进展 |
| 1.6.1 植物与病原菌相互作用理论的发展 |
| 1.6.2 病原菌的PAMPs和植物的PRRs |
| 1.6.3 病原菌的效应蛋白和植物的R基因 |
| 1.6.4 病原菌与宿主植物的共进化 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和菌株 |
| 2.1.2 质粒载体 |
| 2.1.3 药品试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 培养基及试剂配方 |
| 2.1.6 PCR扩增引物列表 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因全长克隆及鉴定 |
| 2.2.2 Southern杂交 |
| 2.2.3 Nothern杂交 |
| 2.2.4 基因的启动子克隆 |
| 2.2.5 目的基因表达模式分析 |
| 2.2.6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 拟南芥遗传转化及功能鉴定 |
| 2.2.8 RNA-seq分析样品准备及分析流程 |
| 2.2.9 Epo蛋白的表达及降解DON条件摸索 |
| 2.2.10 拟南芥中胼胝质积累的观察 |
| 2.2.11 拟南芥中HR反应 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小麦TaAn基因的克隆与功能验证 |
| 3.1.1 小麦TaAn基因的cDNA及gDNA的全长克隆 |
| 3.1.2 小麦TaAn基因的Souhern和Northern分析 |
| 3.1.3 DON诱导不同小麦品种TaAn基因的表达分析 |
| 3.1.4 小麦TaAn基因启动子克隆及顺式作用元件分析 |
| 3.1.5 小麦TaAn蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.6 小麦TaAn基因在拟南芥中的表达及功能鉴定 |
| 3.2 小麦TaUn基因的克隆与功能验证 |
| 3.2.1 小麦TaUn基因的cDNA及gDNA的全长克隆 |
| 3.2.2 小麦TaUn基因的Southern和Northern分析 |
| 3.2.3 DON诱导不同小麦品种TaUn基因表达模式 |
| 3.2.4 小麦TaUn基因启动子克隆及顺式作用元件分析 |
| 3.2.5 小麦TaUn蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.6 小麦TaUn基因在拟南芥中的表达及功能鉴定 |
| 3.3 小麦TaMetRS基因的克隆与功能验证 |
| 3.3.1 小麦TaMetRS基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.3.2 DON诱导不同小麦品种TaMetRS基因表达模式 |
| 3.3.3 小麦TaMetRS蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.4 小麦TaMetRS基因在拟南芥中的表达及功能鉴定 |
| 3.4 小麦TaMATE基因的克隆与功能验证 |
| 3.4.1 小麦TaMATE基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.4.2 DON诱导不同小麦品种TaMATE基因表达模式 |
| 3.4.3 小麦TaMATE蛋白的亚细胞定位 |
| 3.4.4 小麦TaMATE基因在拟南芥中的表达及功能鉴定 |
| 3.5 RNA-seq分析DON与小麦的互作的基因网络 |
| 3.5.1 不同毒素处理小麦后的转录水平差异 |
| 3.5.2 DON处理小麦后差异基因的GO分析和KEGG分析 |
| 3.5.3 DON作为真菌毒素能够引起小麦的免疫反应 |
| 3.5.4 DON能够引起植物激素的信号传导路径的变化 |
| 3.5.5 DON能够诱导苯丙烷类的生物合成路径,加强木质素的生物合成 |
| 3.5.6 DON能够诱导腐胺途径从而促进禾谷镰刀菌在小麦上的扩展 |
| 3.5.7 DON作为真菌毒素对植物细胞造成损伤 |
| 3.5.8 植物细胞可以通过修饰蛋白及转运蛋白对DON进行脱毒 |
| 3.5.9 蛋白酶抑制剂 |
| 3.5.10 DON引起小麦转录因子的表达变化 |
| 3.5.11 q-PCR验证RNA-seq结果 |
| 3.5.12 DON引起拟南芥的PTI信号途径 |
| 3.5.13 DON引起拟南芥的ETI信号途径 |
| 3.5.14 DON的环氧结构在引发拟南芥的ETI和PTI信号通路中至关重要 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小麦TaAn基因的克隆与功能验证 |
| 4.2 小麦TaUn基因的克隆与功能验证 |
| 4.3 小麦TaMetRS基因的克隆与功能验证 |
| 4.4 小麦TaMATE基因的克隆与功能验证 |
| 4.5 DON与植物互作的基因网络分析 |
| 4.6 全文结论及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）茭白黑粉菌cAMP及MAPK途径关键基因的克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 茭白的研究概况 |
| 1.1.1 茭白简介 |
| 1.1.2 茭白的形态 |
| 1.2 茭白黑粉菌研究概况 |
| 1.2.1 黑粉菌目简介 |
| 1.2.2 茭白黑粉菌简介 |
| 1.2.3 菌丝的侵染与茭白茎的膨大 |
| 1.2.4 茭白黑粉菌离体培养条件研究 |
| 1.2.5 茭白黑粉菌的生活史 |
| 1.3 PKA 和 MAPK 研究概况 |
| 1.3.1 PKA 简介 |
| 1.3.2 MAPK 简介 |
| 1.3.3 cAMP/PKA 途径和 MAPK 途径之间的互作 |
| 1.3.4 cAMP/PKA 途径和 MAPK 途径对真菌二形态的影响 |
| 1.3.5 cAMP/PKA 途径和 MAPK 途径对玉米黑粉菌二形态和致病性的影响 |
| 1.4 研究内容及意义 |
| 2 UEPKA、UEERK、UEMKK 及 UESSK 基因的克隆及表达分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 UePka、UeErk、UeMkk 及 UeSsk cDNA 的克隆 |
| 2.1.3 茭白黑粉菌 UePka、UeErk、UeMkk 及 UeSsk 基因组序列的克隆 |
| 2.1.4 不同碳源下四个基因转录水平分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 茭白黑粉菌总 RNA 的提取 |
| 2.2.2 茭白黑粉菌 UePka 基因的克隆与分析 |
| 2.2.3 茭白黑粉菌 UeErk 基因的克隆与分析 |
| 2.2.4 茭白黑粉菌 UeMkk 基因的克隆与分析 |
| 2.2.5 茭白黑粉菌 UeSsk 基因的克隆与分析 |
| 2.2.6 不同碳源下四个基因表达量 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 茭白黑粉菌 UePka 基因的克隆 |
| 2.3.2 茭白黑粉菌 UeErk 基因的克隆 |
| 2.3.3 茭白黑粉菌 UeMkk 基因的克隆 |
| 2.3.4 茭白黑粉菌 UeSsk 基因的克隆 |
| 2.3.5 不同碳源下四个基因的差异表达分析 |
| 3 茭白黑粉菌 UEPKA、UEERK、UEMKK 及 UESSK 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 四个基因 ORF 的克隆 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 UePka 基因原核表达载体的构建及诱导 |
| 3.2.2 UeErk 基因原核表达载体的构建及诱导 |
| 3.2.3 UeMkk 基因原核表达载体的构建及诱导 |
| 3.2.4 UeSsk 基因原核表达载体的构建及诱导 |
| 3.3 讨论 |
| 4 UEPKA、UEERK、UEMKK 及 UESKK 蛋白的纯化及互作分析 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 蛋白纯化 |
| 4.1.3 蛋白互作分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 UePKA 蛋白的纯化 |
| 4.2.2 UeERK 蛋白的纯化 |
| 4.2.3 UeMKK 蛋白的纯化 |
| 4.2.4 UeSSK 蛋白的纯化 |
| 4.2.5 UePKA、UeMKK 与总蛋白互作分析 |
| 4.2.6 UeERK 与总蛋白互作分析 |
| 4.2.7 UePKA 与 UeMKK 互作分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 总结、创新与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.1.1 茭白黑粉菌 UePka、UeErk、UeMkk 和 UeSsk 基因的克隆及表达分析 |
| 5.1.2 茭白黑粉菌 UePka、UeErk、UeMkk 和 UeSsk 的互作分析 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（10）中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 0 前言 |
| 0.1 参与 WSSV 感染的对虾分子 |
| 0.1.1 对虾免疫相关分子 |
| 0.1.2 WSSV结合蛋白 |
| 0.1.3 其他参与WSSV感染的分子 |
| 0.2 蛋白质组学 |
| 0.2.1 蛋白质组学的概念及研究内容 |
| 0.2.2 蛋白质组学的研究技术 |
| 0.2.3 蛋白质组学技术在对虾病毒病中的应用 |
| 0.3 SUMO 化研究进展 |
| 0.3.1 SUMO化简介 |
| 0.3.2 SUMO化修饰在病毒感染中的作用 |
| 0.4 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶研究进展 |
| 0.4.1 蛋白磷酸酶1 |
| 0.4.2 蛋白磷酸酶2A |
| 1 中国对虾感染 WSSV 后血细胞差异表达蛋白质的鉴定 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 WSSV感染实验 |
| 1.1.3 血细胞总蛋白的制备 |
| 1.1.4 双向电泳 |
| 1.1.5 凝胶染色及图像扫描与分析 |
| 1.1.6 质谱分析与GO功能分类 |
| 1.1.7 RNA提取和cDNA第一链合成 |
| 1.1.8 实时荧光定量PCR实验 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 WSSV对中国对虾感染的巢式PCR检测 |
| 1.2.2 中国对虾血细胞差异表达蛋白质的双向电泳分析 |
| 1.2.3 差异表达蛋白质的质谱鉴定和功能分类 |
| 1.2.4 实时荧光定量PCR对蛋白组学结果的验证 |
| 1.3 讨论 |
| 小结 |
| 2 中国对虾 SUMO 和 SUMO E2 结合酶 UBC9 的基因克隆与表达分析 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 FcSUMO和FcUBC9核心片段的获得 |
| 2.1.3 3’RACE和5’RACE |
| 2.1.4 cDNA全长的获得及验证 |
| 2.1.5 FcSUMO和FcUBC9的生物信息学分析 |
| 2.1.6 FcSUMO和FcUBC9 mRNA的组织分布情况检测 |
| 2.1.7 WSSV感染后FcSUMO和FcUBC9的表达变化情况检测 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 FcSUMO和FcUBC9核心序列和两端序列的获得 |
| 2.2.2 FcSUMO和FcUBC9 cDNA全长序列分析 |
| 2.2.3 FcSUMO和FcUBC9 与其他物种的同源性分析 |
| 2.2.4 FcSUMO和FcUBC9 mRNA在各组织中的表达 |
| 2.2.5 WSSV感染后对虾血细胞和性腺中FcSUMO和FcUBC9的表达变 |
| 2.3 讨论 |
| 小结 |
| 3 中国对虾 SUMO ORF 和 UBC9 ORF 的原核表达及多克隆抗体制备及应用 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 FcSUMO ORF和FcUBC9 ORF的原核表达 |
| 3.1.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.4 多克隆抗体的制备与效价测定 |
| 3.1.5 免疫印迹法鉴定重组蛋白与多抗的结合 |
| 3.1.6 免疫印迹法鉴定中国对虾血细胞中的SUMO和UBC蛋白 |
| 3.1.7 间接免疫荧光实验 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 FcSUMO ORF和FcUBC9 ORF的原核表达与纯化 |
| 3.2.2 重组蛋白与多抗结合的免疫印迹法鉴定 |
| 3.2.3 中国对虾血细胞中SUMO和UBC蛋白的免疫印迹法鉴定 |
| 3.2.4 间接免疫荧光实验 |
| 3.3 讨论 |
| 小结 |
| 4 RNA 干扰实验分析 SUMO 和 UBC9 在病毒感染中的作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 SUMO和UBC9 RNA干扰用引物的设计 |
| 4.1.3 dsSUMO和dsUBC9的合成 |
| 4.1.4 dsSUMO和dsUBC9干扰效率的测定 |
| 4.1.5 注射dsSUMO或dsUBC9对WSSV感染的影响 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 SUMO和UBC9的干扰效率 |
| 4.2.2 注射dsRNA对对虾死亡率的影响 |
| 4.2.3 注射dsRNA对血细胞中病毒拷贝数和病毒基因表达量的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 小结 |
| 5 中国对虾蛋白磷酸酶 1 催化亚基β的基因克隆及原核表达 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 FcPP1β核心片段的获得 |
| 5.1.3 3’RACE和5’RACE |
| 5.1.4 cDNA全长的获得及验证 |
| 5.1.5 FcPP1β的生物信息学分析 |
| 5.1.6 FcPP1β mRNA的组织分布情况检测 |
| 5.1.7 WSSV感染后FcPP1β的表达变化情况检测 |
| 5.1.8 FcPP1β ORF的原核表达与重组蛋白纯化 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 FcPP1β核心序列和两端序列的获得 |
| 5.2.2 FcPP1β cDNA全长序列分析 |
| 5.2.3 FcPP1β与其他物种的同源性分析 |
| 5.2.4 FcPP1β mRNA在各组织中的表达 |
| 5.2.5 WSSV感染后中国对虾血细胞和性腺中FcPP1β的表达变化 |
| 5.2.6 FcPP1β ORF的原核表达与重组蛋白纯化 |
| 5.3 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在校期间发表的学术成果 |
四、大肠杆菌中一种对NF-IL63′UTR专一的结合蛋白（论文参考文献）
- [1]番茄SlMPK2在高温胁迫过程中的作用机理研究[D]. 莫双榕. 扬州大学, 2021(08)
- [2]RNA中m6A甲基化修饰与家蚕滞育的关联研究[D]. 蒋涛. 江苏科技大学, 2020
- [3]大豆GmSPL3基因家族功能初探[D]. 吴艳. 广州大学, 2019(01)
- [4]橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究[D]. 王义. 海南大学, 2019(06)
- [5]尿路致病性大肠杆菌中一个新的二元调控系统的鉴定及其调控机理和生物学功能的研究[D]. 蔡文通. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]核仁蛋白Def与半胱氨酸蛋白酶CAPN3的互作研究及其在核仁中的靶蛋白鉴定[D]. 黄得来. 浙江大学, 2017(12)
- [7]miR-217负调控MTDH抑制肝癌细胞增殖和侵袭等作用机制的研究[D]. 张茂. 南方医科大学, 2017(12)
- [8]脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素诱导的小麦基因克隆及功能鉴定[D]. 左东云. 华中农业大学, 2016(06)
- [9]茭白黑粉菌cAMP及MAPK途径关键基因的克隆及表达分析[D]. 应荣. 中国计量学院, 2014(01)
- [10]中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析[D]. 李微. 中国海洋大学, 2014(01)