一、DNA-PK、c-myc、cyclinE在食管黏膜上皮增生、异型增生和鳞状细胞癌中的表达（论文文献综述）
张月林[1]（2021）在《基于Caspase3/Bcl-2/Bax通路探究加味旋覆代赭汤治疗食管癌前病变的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:1.探究袁红霞教授治疗食管癌前病变的主要证型及对应方药;2.基于上述研究结果探究加味旋覆代赭汤对食管癌前病变大鼠Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路的调控作用。方法:选择2012年10月至2020年10月袁红霞教授在天津中医药大学附属保康医院和天津市南开医院门诊诊治食管癌前病变的病例,根据纳排标准,最终纳入108个有效病例;采用双人双录的方法将收集的资料信息录入Excel表中,并进行规范化处理,审核准确后上传至古今医案云平台（V2.2.3）软件,利用数据挖掘分析模块,对处方各数据进行频次统计、中医疾病分析及复杂网络分析。将48只雄性SD大鼠随机分为4组,除空白组外采用复合造模法制作食管癌前病变大鼠模型,造模成功后,分别进行药物灌胃干预,空白组、模型组用生理盐水灌胃,中药组及西药组分别给予加味旋覆代赭汤、西药（雷贝拉唑+莫沙必利）灌胃,给药8周取材。利用肉眼及光学显微镜观察食管上皮组织的形态学变化;分别应用Western-blot法以及PCR法检测食管上皮组织Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达。结果:研究一:1.（1）108例食管癌前病变患者中,男性有72例,女性有36例,男女比例为2:1;在50-59、60-69岁两个年龄段分布较多;（2）108首处方中,中药使用频次≥30的药物,其核心组成分别有旋覆代赭汤、枳术汤、小柴胡汤三个经方;（3）中医证型统计结果显示,食管癌前病变的6个核心证型中,中虚气逆证为最多,占比45.87%,其次为肝胃郁热证,占比20.18%,胆热犯胃证位列第三,占比10.09%,气郁痰阻证和瘀血阻络证并列第四,占比9.17%,津亏热结证位列第五,占比4.59（总结为:中虚气逆证>肝胃郁热证>胆热犯胃证>气郁痰阻证=瘀血阻络证>津亏热结证）。联合“中药-证型”复杂网络分析,其中,排名第一位的证型和对应基础方为:中虚气逆证,由半夏、甘草、旋覆花、生姜、大枣、赭石、党参、茯苓、黄芩组成。研究二:2.（1）各组大鼠一般情况:空白组一般状况良好,体重逐渐递增,无其他异常;其余各组均出现不同程度的纳食减少、体重下降、喜静喜扎堆、颤抖、眼神呆滞迷离,皮毛耸立、脱落、泛黄无光泽,口周有黄色液体（反流）等现象,部分大鼠出现腹大现象;经过8周药物干预,中药组和西药组大鼠一般状况好转,体重逐渐上升,口周反流及腹大现象几无。（2）与空白组比较,模型组大鼠食管上皮肉眼及病理积分升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组大鼠食管上皮肉眼及病理积分均降低,差异有统计学意义（P<0.01）,与西药组对比,中药组食管上皮肉眼及病理积分无统计学意义（P>0.05）。（3）PCR及Western-blot法统计结果显示,与空白组比较,模型组大鼠Caspase-3m RNA、蛋白表达均降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药、西药组大鼠Caspase-3m RNA、蛋白表达均增高,差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较,中药组Caspase-3m RNA、蛋白表达稍高,但无统计学意义（P>0.05）。模型组大鼠食管组织中Bcl-2的含量较中药组和西药组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与空白组比较,模型组、中药组、西药组均不同程度升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与西药组相比,中药组略低,差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组相比,模型组大鼠Bax m RNA、蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组大鼠Bax m RNA、蛋白表达均增高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,西药组Bax蛋白表达增高,差异有统计学意义（P<0.05）;与西药组比较,中药组Bax m RNA、蛋白表达稍高,但无统计学意义（P>0.05）。两个层面均显示中药组和西药组较模型组Bcl-2/Bax比值下调,Caspase-3含量上调,差异有统计学意义（P<0.05）,中药组与西药组组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.食管癌前病变证型以中虚气逆证多见,对应基础方为旋覆代赭汤合枳术汤加减;2.加味旋覆代赭汤可以助气机升降恢复,下调Bcl-2/Bax比值,增加线粒体外膜通透性,释放凋亡因子,激活Caspase-3,使病变组织发生凋亡,扭转食管上皮异型增生,从而起到治疗食管癌前病变的作用。
徐瑞华[2]（2020）在《同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血全基因组外显子测序结果对比》文中指出1.研究背景和目的人类基因组外显子数据量仅占总量的1%（约30 Mb）,相比全基因组测序,全基因组外显子测序（WES）技术可以检测到更多的低频突变和罕见突变,同时可以大幅度降低测序成本,缩短实验周期。WES是发现、甄别和筛选肿瘤相关致病基因最有效的方法。通过该技术已经找到了很多人类疾病的致病基因和驱动基因,其中一部分已经用于临床的靶向治疗。目前,WES已经广泛用于肿瘤的研究,让我们对肿瘤发生的分子机制有了进一步了解,全基因组外显子测序通常选择外周血DNA或癌旁组织DNA中作为正常对照,但是经常会出现不完全一致的结果。所以肿瘤领域对于如何选择正常对照,历来存在争议。对消化道类空腔脏器的肿瘤来说,虽然癌旁组织形态学正常,但是我们实验室及其他研究已经发现形态正常的上皮组织其实已经发生分子改变。通过文献调研,我们发现针对同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血全基因组外显子测序结果对比的研究尚无报道。本论文是我们在做贲门腺癌全基因组测序的时增做的同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血三种样品的全基因组外显子测序结果对比研究,目的是为贲门腺癌等正常对照组的选择提供指导性意见。2.材料与方法2.1 样品的准备本研究获得了患者及家属的知情同意和相关机构的审查和批准。我们共收取10位贲门腺癌患者的癌组织、癌旁组织和外周血。将每位患者的癌和癌旁配对,癌和外周血配对,以及癌旁和外周血配对,为进行全基因组外显子测序做准备,所收取的样品在-80℃深低温冰箱存储备用。2.2全基因组外显子测序的实验流程DNA样品的检测和质控→用破碎仪使DNA断裂为小片段→在DNA末端进行修复、磷酸化和加A尾→连接接头→用探针杂交捕获外显子区域的序列→除去未结合的DNA片段→DNA文库质量检测→Hiseq PE150上机测序2.3 分析方法2.3.1 测序数据质量评估通过对原始测序数据的错误率、对比率和数据量进行统计评估,符合标准后方能进行后续的分析,否则需要重新建库和加测。2.3.2 变异信息的收集和分析将高质量的原始测序序列与人类的参考基因序列进行比对,过滤掉样本中的胚系突变,得到贲门腺癌成对样品中检测到的体细胞突变（Somatic Mutation）,并对其检测出的体细胞突变和高频突变基因进行分析。3.结果3.1 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血的体细胞突变数目贲门腺癌vs癌旁组织（TvsN）进行全基因组外显子测序,贲门腺癌组织中发现8525个SNV、131个InDel和1150个CNV;贲门腺癌vs外周血（TvsB）进行全基因组外显子测序,贲门腺癌组织中发现8674个SNV、134个InDel和625个CNV;癌旁组织vs外周血（NvsB）进行全基因组外显子测序,癌旁组织中发现4297个SNV、42个InDel和362个CNV。3.2 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血发生SNV的基因数目（突变频率VAF>0.05）贲门腺癌vs癌旁（TvsN）中,贲门腺癌组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为2390个;贲门腺癌vs外周血（TvsB）中,贲门腺癌组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为2433个;癌旁vs外周血（NvsB）中,癌旁组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为785个。3.3 贲门腺癌vs外周血与癌旁vs外周血中发生相同SNV的基因同一个体贲门腺癌vs外周血,癌旁vs外周血对比,G070、G072、G074和G075样本的T和N中发生相同SNV的基因,G070样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是SFN、ZNF746、TDG、TP53TG3D;G072样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是FAHD2B;G074样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是 SIMC1、FOXO3、SLC2A3、TDG、KRTAP3-3、CSTF1;G075样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是CSDE1、OR2T4、OR2T2、AMIGO3、HTR1B、PTEN、PRH2、C17orf97、ROCK1、TMC4、ZNF416、PABPC1。3.4 贲门腺癌vs外周血的高频突变基因TvsB中共找到19个高频突变基因:TP53（75%）、ZNF208（38%）CNTN6（38%）、RBM42（25%）、YBX3（25%）、UNC80（25%）TRIM64C（25%）、RELN（25%）、RBBP8NL（25%）、CYP8B1（25%）CAAP1（25%）、ANKRD30A（25%）、SPAG16（12%）、PANK2（12%）NAT6（12%）、NARFL（12%）、KIR3DL1（12%）、DMRTB1（12%）CFHR2（12%）。3.5 贲门腺癌vs癌旁的高频突变基因TvsN中共找到15个高频突变基因:TP53（62%）、ZNF208（38%）、CNTN6（38%）、YBX3（25%）、TRIM64C（25%）、RBBP8NL（25%）、CYP8B1（25%）、SPAG16（12%）、RBM42（12%）、PANK2（12%）、NAT6（12%）、NARFL（12%）、KIR3DL1（12%）、DMRTB1（12%）、CFHR2（12%）。3.6 癌旁vs外周血的高频突变基因NvsB中共找到1个高频突变基因:PANK2（12%）。4.结论贲门腺癌用外周血做正常对照比癌旁组织更合适。
骆诤[3]（2019）在《BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究》文中研究指明背景:肝癌,作为一种高发病率,高死亡率的消化系统肿瘤,严重影响了大多数患者的生活质量。随着新药的不断出现,肝癌的治疗虽然取得了长足的进展,但其预后仍较差,5年生存率仅约10%。肝癌难以通过早期检查发现,且患病早期病患多无明显症状,多数病人就诊时已属晚期,失去手术彻底根治机会。肝癌的复发转移率高是肝癌预后效果差的主要原因,肝癌转移是一个多因素的复杂过程,其过程最主要包含上皮细胞极性转变、肿瘤细胞间黏附变化,运动能力加强,穿透基底膜,血管生成等。已有研究证明多种粘附分子、基质金属蛋白酶、细胞因子及其所参与的信号转导、癌基因和抑癌基因的表达和调控的改变均涉及到肝癌转移的过程。上皮-间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下,具有极性的上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、在细胞基质中自由移动的间质细胞的过程。在肿瘤的发展中,上皮-间质转化令原本不具有迁徙及侵袭能力的细胞获得浸润能力,并最终转移到其他组织和器官,从而使肿瘤形成局部浸润和远端转移,并再次通过间质-上皮转化定植于转移灶。Wnt/β-catenin信号通路被证明多种关键的不可忽略的调节作用,尤其在骨骼发生、发育与再生的各个阶段,Wnt信号通路扮演着十分活跃的角色。有研究表明,上调的β-catenin将进人细胞核与TCF/LEF信号通路发生作用,激活下游众多的靶基因过度表达,与EMT的发生有直接关联。糖原合成酶激酶-3β是Wnt/β-catenin信号通路的组成因子之一。有研究表明,GSK-3β可通过降解β-catenin抑制肿瘤生长,并通过抑制Wnt通路调节肿瘤细胞死亡增殖和凋亡。而BIRC5被普遍认为是Wnt/β-catenin的靶基因之一。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白家族 IAPs（inhibitor of apoptosis proteins）中抗凋亡作用最强,但结构最简单的蛋白。其基因BIRC5位于17q25,长14.7 kb,具有3个内含子及4个外显子,含有一个杆状病毒IAPs的重复序列。BIRC5在胎儿组织和各种人类恶性肿瘤组织中大量表达,但在正常组织或分化良好的成人组织中无表达。既往研究发现,BIRC5基因在肝癌中高表达,并且和肝癌患者不良的预后相关。敲低BIRC5基因会抑制肿瘤细胞的增殖,促进凋亡。miR-218已证实是DNA损伤修复基因,是核苷酸切除修复（NER）途径的限速酶,NER是DNA修复通路之一。NER可以识别修复紫外线损伤的及化学药物损伤的DNA双链螺旋结构。NER通过解开受损部分DNA的双螺旋结构,切除受损部分,重新合成受损部分使其连接于未受损的DNA结构上。研究发现BIRC5基因的mRNA可编码由297个氨基酸组成的蛋白质,其具有核苷酸切除修复的作用。基因BIRC5的表达与DNA的修复酶缺乏基因形成紧密的异二聚体存在,在核苷酸切除修复途径中作为一个整体,具有切除DNA 5’端和识别损伤的双向作用,同时还具有5’-3’核苷酸内切酶活性,在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用,而核苷酸切除修复过程需要miR-218的参与。目的:本课题针对我国人群,采用病例对照研究方法,分析我国肝癌的发病相关危险因素,采用分子生物学和传统的流行病学方法相结合,研究BIRC5基因型在肝癌中的分布,并在分子水平上研究miR-218靶向BIRC5并调节GSK-3 β/β-catenin通路对肝癌细胞侵袭转移能力及其他恶性生物学特征的影响。方法:本研究选取2014年1月-2016年12月在山东省立医院住院的204例肝癌患者作为研究对象,年龄在37-78岁范围;所有参与者均获取知情同意并签字。通过MassARRAY技术检测BIRC5基因的SNP位点,并对miR-218靶向蛋白BIRC5与肝癌患病风险进行相关性分析。通过miR-218模拟物（mimic）和阻遏物（inhibitor）转染构建相关细胞系并通过qPCR检测miR-218的表达。经转染后,通过双荧光素酶报告实验证明了 BIRC5与miR-218之间的靶标关系,并通过Western Blot检测EMT相关标志物的蛋白水平。细胞克隆形成实验检测了miR-218是否影响HepG2细胞的克隆形成能力,Transwell小室实验检测了各转染组细胞的侵袭转移情况,CCK8检测miR-218是否影响HepG2细胞的增殖能力,流式凋亡检测方法及免疫荧光实验检测miR-218是否影响HepG2细胞的凋亡,并进一步通过Western blot研究了 miR-218对GSK-3β/β-catenin通路的调控作用。同时,通过裸鼠成瘤实验及HE染色验证了 miR-218对肝癌瘤体的抑制作用。结果:1.BIRC5 rs3212986rs2298881,rs1 1615 和 rs6498486 基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P>0.05）,其SNP中的MAF与NCBI中的dbSNP数据库中所描述的普通中国人特征类似,并且SNP的MAF均大于10%。而rs2276466不符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P=0.02）。2.分析发现BIRC5 rs3212986与GG基因型比较,TT基因型和T等位基因肝癌发病风险略微增高(95%CIs 为 1.93（0.96-3.94）与 1.49（0.95-2.13）,BIRC5 rs11615 TT和T等位基因肝癌发病风险增高(95%CIs为1.59（0.96-2.98）和1.42（0.97-2.26）。3.BIRC5的rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。4.提取志愿者的肝癌及癌旁组织,结果显示,癌旁组织中niR-218的表达明显较高,而BIRC5的表达较低。与癌旁组织相比,miR-218的表达在不同分期肝癌组织中均明显下降,而BIRC5的表达则均明显上升,且分期越晚,癌组织中的miR-218及BIRC5与癌旁组织的表达差异越大。5.双荧光素酶实验的结果显示,当HepG2细胞转染了克隆有BIRC5 3’-UTR载体质粒后,miR-218过表达组荧光素酶活性明显受到抑制,与对照组相比较差异明显。而转染克隆有BIRC5 3’-UTR突变型载体质粒后,miR-218组荧光素酶的活性值之间无明显差异。同时,BIRC5的蛋白表达水平也通过Western blot进行检测。结果显示,与空白对照组相比,BIRC5在miR-218过表达组的表达明显降低,在miR-218 inhibitor组的表达明显升高,而miR-218 overexpression NC及miR-218 interference NC之间的BIRC5含量差异无统计学意义,因此证明了BIRC5与miR-218之间的靶标关系。6.HepG2组中肉眼可见明显克隆集落,克隆形成率为59±5.568%。与对照组相比,miR-218过表达时克隆集落数量明显减少,克隆形成率为47.67±4.163%,而miR-218 inhibitor组中克隆集落明显增多,克隆形成率为76.67±4.726%。由此可知,靶向BIRC5的miR-218抑制了 HepG2细胞的克隆形成能力（p=0.0038）。7.Transwell小室实验中,对照组中可见一定数量的侵袭及转移细胞,与对照组相比,转染miR-218 mimic的细胞的侵袭及转移均受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0032）。8.转染 miR-218 mimic 后抑制细胞 EMT 的转化,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达下调,而E-cadherin的表达上调。与此同时miR-218 inhibitor组,由于干扰了 miR-218在细胞中的表达,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达上调,E-cadherin的表达上调。（p<0.05）9.采用CCK8实验检测各转染组细胞的增殖情况。与microRNA对照组相比,转染针对BIRC5的miR-218组的细胞的生长受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0002）。10.采用流式细胞仪验证HepG2细胞凋亡,以此探讨靶向BIRC5的miR-218是否可以诱导了 HepG2细胞的凋亡。对照组中HepG2细胞凋亡比率为9.64±0.59%,miR-218mimic组的细胞凋亡数明显增加,其比例达到20.52±0.58%。同时,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡减少至5.6±0.63%,相比对照组,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡明显减少。同时,通过免疫荧光染色检测了细胞凋亡相关因子caspase3及caspase6的表达,与对照相比,靶向BIRC5的miR-218 caspase-3及caspase6的表达明显上升。11.与HepG2组相比,miR-218过表达后G1期比例明显上升,S期细胞显着下降,而miR-218 inhibitor组中G1期比例明显下降,S期细胞也有上升的趋势。（p=0.0101）。而G2期的比例变化无统计学意义。12.通过Western blot检测Wnt/β-catenin通路中沿路分子的蛋白表达。经检测发现,当miR-218过表达时,BIRC5表达下降,同时GSK-3β的磷酸化表达下降,TCF7、LEF1及β-catenin的表达均有明显下降（p=0.0023）,而Wnt3a,Dvl,GSK-3β的表达变化无统计学意义。13.在BALB/c-nu小鼠皮下成瘤实验8周后,可明显发现实验组（注射miR-218 mimic质粒转染后的HepG 2细胞株）所生成瘤体长径、短径、重量、体积均明显小于对照组（注射HepG 2细胞株）所生成的瘤体。进一步通过HE染色观察可发现,对照组肿瘤组织体积较大,有小片坏死区域,肿瘤细胞生长旺盛,细胞核异型性明显,间质血管丰富,而实验组的肿瘤切片坏死区域明显增大,间质血管稀少,可见明显纤维化形成,肿瘤细胞生长受到明显抑制。BIRC5的免疫组化证明,BIRC5表达于HepG2细胞质内,对照组中BIRC5表达较高,而miR-218 mimic质粒的转染明显抑制了 BIRC5的表达。14.肝癌细胞系中的miR-218能靶向BIRC5,高表达的miR-218通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,抑制肝癌细胞株HepG2中EMT相关基因Vimentin、β-catenin及N-cadherin的表达并上调E-cadherin表达,抑制钙黏蛋白转换的过程,以此抑制了 EMT的发生。同时,高表达的miR-218通过下调BIRC5抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡。结论:在中国人群中BIRC5 rs3212986和rs11615基因多态性与肝癌发病风险有相关性。rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。miR-218可能通过抑制BIRC5基因转录活性,并通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,下调β-catenin表达,从而抑制HepG2细胞株的侵袭转移能力并抑制EMT的发生发展过程,抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡,以此抑制肝癌的发生和发展。
乔冠恩[4]（2019）在《miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究》文中指出目的:本实验主要研究食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程。通过Target Scan以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR检测miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）的增殖能力;4、将合成的miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors转染至ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中,RT-qPCR检测转染效率;MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株（ECA109）裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors后ZNRF3 m RNA和蛋白的表达;Target Scan预测miR-106b-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR和Western blot检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显着高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR结果显示miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）中的表达要显着高于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的增殖能力要显着高于人正常食管上皮细胞（HET-1A）;4、转染miR-106b-3p inhibitors后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）的增殖能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显着增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显着增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显着下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Cyclin D1蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显着增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的侵袭显着增强;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够抑制ESCC细胞株对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附,而miR-106b-3p mimics能够增强对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显着抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显着促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的表达要显着低于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着降低,转染miR-106b-3p inhibitors后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着升高;Target Scan预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin m RNA的表达,促进GSK3βm RNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin m RNA的表达,降低GSK3βm RNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显着高表达;2、miR-106b-3p可以显着促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显着促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显着促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。
李明阳[5]（2019）在《RSK4在食管鳞状细胞癌转移、放疗抵抗及肿瘤干细胞特性中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发生率居各种恶性肿瘤第七位,死亡率居第六。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌最常见的组织学类型,全球超过一半的ESCC病例发生在中国。尽管临床上有针对ESCC的多种治疗方法,但晚期ESCC的5年总生存率仅为15%。放射治疗是ESCC一种重要的治疗方式,特别是对那些手术不可切除的晚期食管癌患者。遗憾的是,肿瘤细胞的放疗抵抗会导致ESCC的复发和治疗失败,大多数患者在病理缓解后仍有复发。肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是一种肿瘤细胞亚群,具有很高的致瘤潜能和对传统抗癌治疗的耐受性,是多种恶性肿瘤难以治愈的根源。越来越多的证据表明,CSC可以促进ESCC的放疗抵抗和远处转移,从而导致ESCC的放射治疗失败和复发。因此,阐明ESCC中CSC调控的分子机制,找到有效的分子治疗靶点,对改善ESCC患者的治疗和预后具有重要意义。RSK4是核糖体s6蛋白激酶（ribosomal s6 kinase,RSK）家族成员之一,与机体多种生理功能密切相关,包括调节基因转录、调控细胞周期、参与细胞增殖分化以及肿瘤的发生发展等。与其他RSK家族成员较明确的生物学功能不同,关于RSK4在恶性肿瘤的表达和功能的报道比较有限且相互矛盾,甚至有报道称RSK4可能在不同的癌症类型中发挥不同甚至相反的作用。我们前期通过免疫组织化学的方法在多种肿瘤的组织芯片中筛查发现RSK4在ESCC中的表达水平显着高于食管正常上皮组织,提示其可能在ESCC的恶性进展中发挥了一定作用。但到目前为止,RSK4在ESCC中发挥的具体作用及其分子机制还不十分清楚,这正是本研究想要解决的问题。本研究将围绕RSK4在ESCC中的病理生理作用及其上下游调控的分子机制进行深入探讨,阐明RSK4在ESCC转移、放疗抵抗以及CSC特性维持中的重要生物学意义,为ESCC的临床诊治提供新的有效分子靶点。目的1.明确RSK4在ESCC中的表达水平及其与肿瘤转移和预后的关系;2.明确RSK4与ESCC放疗抵抗以及CSC之间的关系;3.明确RSK4在ESCC转移、放疗抵抗和CSC特性维持中的作用;4.阐明ESCC中ΔNp63转录调控RSK4表达的分子机制;5.阐明RSK4磷酸化GSK-3β,激活Wnt/β-catenin信号通路,从而影响ESCC恶性进展的分子机制;6.明确RSK4小分子抑制剂对ESCC转移、放疗抵抗和CSC特性的抑制效果,探索RSK4能否作为ESCC的治疗靶标。方法1.利用实时定量PCR、Western blot以及免疫组化等技术检测ESCC和对应癌旁正常食管上皮的RSK4 mRNA、蛋白表达水平及其与CSC标志物的关系;2.收集手术切除ESCC病例信息,分析RSK4表达与患者临床病理指标以及生存预后的关系;3.收集放射治疗ESCC病例信息,分析RSK4表达与放疗抵抗的关系;4.建立RSK4过表达和敲低的稳定ESCC细胞系,利用Transwell侵袭迁移、三维培养侵袭、体内肺转移等实验技术检测RSK4对ESCC细胞转移能力的影响;5.利用流式细胞仪以及Western blot技术检测RSK4对ESCC细胞CSC标志物表达的影响,利用成球实验和极限稀释裸鼠成瘤实验检测RSK4对ESCC细胞CSC特性维持的影响;6.利用辐射克隆形成实验以及测定细胞内Caspase-3活性检测RSK4对ESCC细胞放疗抵抗的影响;7.ESCC临床标本中分析ΔNp63与RSK4蛋白表达的相关性,利用染色质免疫共沉淀以及荧光素酶报告基因活性分析检测ΔNp63α对RSK4的转录调控作用;8.利用体外激酶实验、体外GST pull-down以及免疫共沉淀等技术检测RSK4对GSK-3β的磷酸化作用以及二者的相互结合;9.利用蛋白稳定性及泛素化实验、免疫荧光和Western blot等技术检测RSK4对β-catenin蛋白稳定性的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用;10.利用RSK4小分子抑制剂BI-D1870检测其对ESCC细胞系、裸鼠移植瘤和病人来源异种移植瘤（patient-derived xenograft,PDX）模型的转移、放疗抵抗以及CSC特性的抑制效果。结果1.ESCC中RSK4的mRNA和蛋白水平较癌旁食管正常上皮升高,并且RSK4在ESCC CSC中可以富集,与CSC标志物ALDH1呈正相关关系;2.RSK4高表达与ESCC患者淋巴结转移、血管侵犯及较差的生存预后相关,多因素Cox回归分析发现RSK4是ESCC独立的预后影响因素;3.放射治疗可以诱导ESCC中RSK4的蛋白表达,高表达RSK4的ESCC患者与放射治疗抵抗有关,无病生存期较短;4.RSK4过表达能够促进ESCC细胞的侵袭迁移能力和体内肺转移潜能,敲低RSK4后ESCC细胞的转移能力降低;5.RSK4过表达能够提高ESCC细胞CSC标志物的表达水平,提高肿瘤成球能力和裸鼠体内成瘤能力,敲低RSK4后可以降低ESCC细胞的CSC特性;6.RSK4过表达能够促进ESCC细胞的放疗抵抗能力,降低辐射导致的细胞凋亡,敲低RSK4后可以提高ESCC细胞的放疗敏感性;7.ΔNp63和RSK4蛋白在ESCC中表达呈正相关关系,ΔNp63α能够结合到RSK4基因启动子的-644到-625区域,促进RSK4的转录激活;8.RSK4能够直接磷酸化GSK-3βSer9位点,并且GSK-3β能够与RSK4的N末端激酶活性区（N-terminal kinase domain,NTKD）结合;9.RSK4通过磷酸化GSK-3βSer9促进β-catenin蛋白的稳定性及核转位,进而激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达;10.RSK4的小分子抑制剂BI-D1870能够有效抑制ESCC细胞的转移能力和CSC特性,提高ESCC裸鼠移植瘤和PDX模型的放射治疗敏感性。结论1.RSK4在ESCC较正常食管上皮表达升高,且RSK4高表达与肿瘤的淋巴结转移和血管侵犯相关,并且是ESCC患者独立的预后因素;2.RSK4能够在ESCC CSC中富集,且与ESCC患者的放疗抵抗及CSC特性密切相关;3.RSK4能够促进ESCC细胞的转移潜能、放疗抵抗和CSC特性,为临床治疗ESCC提供了有效的分子靶点;4.RSK4是ΔNp63α的直接转录调控下游靶分子,ΔNp63α调控ESCC细胞的转移、放疗抵抗以及CSC特性需要依赖RSK4发挥作用;5.RSK4可以直接磷酸化GSK-3βSer9位点,激活Wnt/β-catenin信号通路,进而促进ESCC细胞的转移、放疗抵抗和CSC特性;6.RSK4的小分子抑制剂BI-D1870能够有效抑制ESCC细胞的转移能力和CSC特性,提高放射治疗敏感性,提示临床上BI-D1870联合放射治疗可以提高ESCC的肿瘤治疗效果。
张瑶[6]（2019）在《热敏灸“中脘”穴对慢性萎缩性胃炎模型大鼠Wnt2、β-catenin、MMP-7影响》文中研究表明目的:观察热敏灸“中脘”穴对慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）模型大鼠胃黏膜Wnt2、β-连环蛋白（β-catenin）和基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7,MMP-7）蛋白表达的影响,从而探讨热敏灸治疗CAG可能的作用机制,以期为热敏灸治疗CAG提供实验依据。方法:将66只雄性SD大鼠按随机数字表随机分为空白组、造模组。空白组正常饲养,造模组采用100ug/mL MNNG自由饮用、30%乙醇和2%水杨酸钠混合液灌胃并结合饥饱失常法建立CAG模型,共12W。造模结束后,造模组随机分为模型组、维酶素组、艾灸组,艾灸组灸“中脘”,1次/d,40min/次,每5min测大鼠尾温并记录,根据大鼠尾温变化分非热敏灸组和热敏灸组。维酶素组按2ml/kg/d灌胃维酶素,1次/d,共28d。观察各组大鼠一般状况、体质量、大便性状等变化;光镜下观察胃黏膜病理组织变化;运用Western Blot和免疫组化法检测Wnt2蛋白表达,免疫组化法检测β-catenin、MMP-7蛋白表达。结果:1.造模前,各组大鼠均精神良好,一般状况佳。造模后,空白组与造模前无明显变化。各造模组均出现精神萎靡,双目无神,形体消瘦,耳廓苍白,缺少血色。反应迟钝,大便稀溏或软等表现。造模前,各组大鼠在实验前体质量处于同一基线水平。造模后,空白组体质量正常增长,造模组大鼠体质量低于空白组（P<0.01）。造模结束后,空白组大鼠胃黏膜未见明显异常,造模组大鼠胃黏膜肉眼可见色暗红或灰白,黏膜层明显变薄,弹性减少,皱襞变平,粘液减少,走向紊乱,沟回变浅或消失,肌层变薄;光镜下可见胃黏膜层明显变薄,充血明显,腺体变小、萎缩甚至消失,排列紊乱,数量减少,并有囊性扩张,可见异型增生等。2.治疗28d后,各治疗组都出现不同程度的精神改善,其中以热敏灸组改善最为明显。各组大鼠治疗后与治疗前相比,体质量均明显增长（P<0.01）;治疗结束后,与空白组比较,模型组体质量增长缓慢（P<0.01）。与模型组相比,非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组体质量均有明显增长（均P<0.05）,但非热敏灸组、热敏灸组与维酶素组两两比较差异无统计学意义。光镜下观察可见空白组胃黏膜未有明显病变;模型组可见胃黏膜腺体大小不一,排列紊乱,腺体萎缩,黏膜上层偶可见肠化生。各治疗组胃黏膜表面均较模型组恢复,热敏灸组胃黏膜腺体排列规则,未见明显异常。3.与空白组相比,模型组、非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组Wnt2蛋白表达均上升（均P<0.01）;与模型组相比,非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组Wnt2蛋白表达均下降（P<0.01）;与非热敏灸组相比,热敏灸组及维酶素组Wnt2蛋白表达下降（均P<0.05）;热敏灸组与维酶素组之间二者无明显差异。与空白组相比,模型组、非热敏灸组Wnt2平均光密度均上升（P<0.01）,热敏灸组、维酶素组与空白组之间无明显差异;与模型组相比,热敏灸组、维酶素组Wnt2平均光密度均下降（均P<0.01）,非热敏灸组与模型组之间无明显差异;与非热敏灸组相比,热敏灸组、维酶素组Wnt2平均光密度均下降（P<0.05）;热敏灸组与维酶素组之间二者无明显差异。4.与空白组相比,模型组、非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组β-catenin平均光密度值均上升（P<0.01,P<0.05）;与模型组相比,非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组β-catenin平均光密度值均下降（均P<0.01）;与非热敏灸组相比,热敏灸组、维酶素组β-catenin平均光密度值均下降（P<0.05,P<0.01）;热敏灸组与维酶素组之间二者无明显差异。与空白组相比,模型组、非热敏灸组、热敏灸组、维酶素组MMP-7平均光密度均上升（均P<0.01）;与模型组相比,热敏灸组、维酶素组MMP-7平均光密度均下降（P<0.01）,非热敏灸组与模型组之间二者无明显差异;与非热敏灸组相比,热敏灸组、维酶素组MMP-7平均光密度值下降（P<0.05）;热敏灸组与维酶素组之间二者无明显差异。结论:（1）热敏灸能显着改善CAG大鼠的一般状态（如体质量、精神状态、大便性状）及胃黏膜病理组织学变化,通过形态学、病理学等变化,表明热敏灸治疗CAG的有效性。（2）热敏灸可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路,降低CAG大鼠胃黏膜Wnt2、β-catenin、MMP-7蛋白表达,调控胃黏膜细胞侵袭浸润甚至转移等而发挥效应从而达到治疗CAG的目的。
彭维[7]（2019）在《SOX2、VEGF-C在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义》文中指出目的:通过检测性别决定区Y框蛋白2（SRY related HMG box2,SOX2）和血管内皮生长因子-C（Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C）在上皮内瘤变、正常组织及食管鳞癌中的表达,探讨SOX2和VEGF-C两种蛋白在食管鳞癌发生发展的相关性,从而为食管癌的早期诊断和推测预后提供理论依据。方法:采用免疫组织化学染色技术检测食管正常黏膜组织、上皮内瘤变及食管鳞癌中SOX2、VEGF-C的表达情况。采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。结果:1.SOX2、VEGF-C在食管鳞癌、食管上皮内瘤变中的阳性表达率均高于正常食管组织,差异有统计学意义（P<0.05）。SOX2、VEGF-C在食管鳞癌中的阳性表达率均高于食管上皮内瘤变中的表达率,差异无统计学意义（P>0.05）。2.在食管鳞癌组中,SOX2的阳性表达率与TNM分期、有淋巴结转移、浸润深度呈正相关,分期越高、有淋巴结转移、浸润越深,SOX2的阳性表达率越高,差异有统计学意义（P<0.05）。VEGF-C的阳性表达率与有淋巴结转移、浸润深度呈正相关,有淋巴结转移、浸润越深,VEGF-C的阳性表达率越高,差异有统计学意义（P<0.05）。3.在食管鳞癌中SOX2与VEGF-C蛋白在食管鳞癌中的表达呈正相关（r=0.435,P<0.01）。结论:SOX2、VEGF-C高表达于食管鳞癌、食管上皮内瘤变组织中,可能是食管癌发生进展的重要分子之一;SOX2、VEGF-C在上皮内瘤变中的表达率高于食管正常黏膜,两者联合用于筛查食管黏膜癌前病变可能具有一定的应用价值;SOX2和VEGF-C的高表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移呈正相关,提示与肿瘤的浸润、转移有关,对判断食管鳞癌预后有潜在的临床价值;食管鳞癌组织中SOX2、VEGF-C的表达呈正相关关系。
牛锴[8]（2019）在《基于细胞信号通路对胃蛋白酶在下咽癌进展中的作用机制研究》文中研究说明咽喉反流（laryngopharyngeal reflux,LPR）其定义为胃内容物反流至上食管括约肌以上的咽喉部。病理性咽喉反流可表现为慢性咽喉炎、哮喘及不明原因的胸痛。下咽为食道上端的直接延续,对比食道,下咽黏膜缺乏有效的抗反流机制。下咽部恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的0.15%-0.24%,占头颈部恶性肿瘤的2%,95%为鳞状细胞癌。下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HPSCC）多发生于梨状窝区,下咽后壁区次之,环后区最少。HPSCC是否与咽喉返流相关是值得探讨的问题。研究目的:探讨引起咽喉返流的主要物质-胃蛋白酶与下咽鳞状细胞癌的发生和发展的相关性。材料和方法:（1）下咽癌和配对的癌旁组织免疫组化染色收集2013年8月至2016年8月吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科收治的70例HPSCC病理标本。肿瘤深部取新鲜癌组织。癌旁组织取材于距离肿瘤2cm外黏膜及黏膜下层,并由病理医生确认,标本取材后快速放入福尔马林固定,石蜡包埋。切片机连续切片厚度5μm。一抗采用胃蛋白酶多克隆抗体。二抗采用生物素化Ig G室温孵育20min,然后滴加辣根酶标记链霉卵白素室温孵育,DAB显色剂显色,显微镜下观察。收集患者信息,包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、TNM分期、肿瘤分化程度。统计学分析胃蛋白酶表达与患者一般临床及病理结果相关性。（2）Fadu细胞培养人下咽鳞状细胞癌Fadu细胞用含10%胎牛血清和l%青链霉素的EMEM在37℃、5%C02、饱和湿度的环境传代培养,细胞贴壁生长,对数生长期用于实验。（3）配制失活状态和灭活状态胃蛋白酶溶液为防止胃蛋白酶自消化,胃蛋白酶复合物贮存于4℃冰箱内。配置失活状态胃蛋白酶,将胃蛋白酶复合250mg溶入25ml高压灭菌双蒸水中,充分溶解后,用0.4um滤器过滤后4℃保存。配置灭活态胃蛋白酶,将胃蛋白酶复合250mg溶入25ml高压灭菌双蒸水中,充分溶解后,用0.4um滤器过滤后调节p H到8.0,37℃下静置15分钟使酶不可逆变性,而后调节p H到6.8-7.0,4℃保存。（4）细胞生物学实验CCK-8实验和细胞周期实验分别检测不同浓度下胃蛋白酶作用于Fadu细胞后细胞增殖和细胞周期变化。CCK-8实验检测灭活胃蛋白酶作用于Fadu细胞后细胞增殖。溶酶体共定位实验检测胃蛋白酶在Fadu细胞内定位。（5）基因芯片应用Human Signal Transduction Pathway Finder?RT2 Profiler?PCR Array检测胃蛋白酶作用于Fadu细胞后细胞信号传导通路基因差异性表达。应用免疫荧光实验、Western blot验证差异表达的信号通路。结果:（1）70例配对标本中,21例下咽癌组织和癌旁组织呈现胃蛋白酶阳性,18例患者下咽癌组织中胃蛋白酶阳性表达,而其在癌旁组织中阴性表达。其余31例患者表现为癌组织及癌旁组织胃蛋白酶均为阴性。胃蛋白酶在癌和癌旁组织中的检出差异具有统计学意义（P<0.01）。统计分析HPSCC癌组织中胃蛋白酶检出与患者临床病理因素的相关性。结果显示,在淋巴结转移组中64.0%胃蛋白酶阳性,明显高于无淋巴结转移组（35.0%）,两者差异具有统计学意义（P=0.027）。胃蛋白酶阳性与其他临床病理因素无明显相关性。（2）Fadu细胞系体外实验结果:1)0.2 mg/ml胃蛋白酶分别作用Fadu细胞0.5小时、1小时、2小时或4小时后,Fadu细胞较未加入胃蛋白酶刺激相比各时间点体外增殖能力均有显着差异（P<0.01）,但作用0.5小时、1小时、2小时和4小时之间细胞增殖无显着差异（P>0.05）。采用流式细胞仪检测胃蛋白酶作用0.5小时后Fadu细胞的G1期细胞比例明显低于对照组,S期细胞比例增高,与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。2)Fadu细胞与Cy3-胃蛋白酶共同孵育后24小时、36小时均可见红色荧光标记的溶酶体与胃蛋白酶携带的FITC荧光信号重叠。3)胃蛋白酶作用Fadu细胞导致6个细胞信号通路基因差异性表达,其中TNF-α和BCL2A1均较对照组上调>1.5倍,且有统计学意义（P<0.05）。TNFSF10（TRAIL）和HES5基因转录分别下调了1.93倍和2.83倍,差异有统计学意义（P<0.05）。而CCND2较对照组下调1.88倍,FABP1较对照组上调1.57倍,但两者均无统计学差异（P值分别为0.36,0.42）。3)免疫荧光实验验证胃蛋白酶作用于Fadu细胞后NF-κB p65、p21和C-myc表达增强。Western blot验证胃蛋白酶作用Fadu细胞后NF-κB p65、IκB磷酸化与对照组比较均显着增加。结论:（1）对比癌旁组织,胃蛋白酶在下咽癌组织呈高检出率,且与HPSCC淋巴结转移密切相关,与吸烟、饮酒以及肿瘤T分期、肿瘤分级无明显相关性。（2）细胞实验表明在中性环境中胃蛋白酶诱导下咽癌细胞更多的从G1期进入S期,细胞增殖。这一作用和胃蛋白酶浓度相关和胃蛋白酶作用时间无明显相关性。（3）胃蛋白酶被细胞内吞后富集于溶酶体内,而不可逆失活的胃蛋白酶不能诱导下咽癌细胞增殖,这提示胃蛋白酶可能在溶酶体的低p H环境下恢复活性。（4）胃蛋白酶诱导下咽癌细胞增殖和NF-κB、TRAIL信号通路相关;参与细胞增殖、分化调控的细胞因子,如TNF-α,在这一过程中也可能发挥作用。
曹明[9]（2019）在《食管鳞癌中Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40的表达及其与临床病理特征的关系》文中提出目的:探讨Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40在食管鳞癌组织中的表达和及其与临床病理特征的关系。方法:收集76例食管鳞状细胞癌患者临床资料和手术标本,采用实时定量PCR实验方法检测Mel-18和Bmi-1在食管鳞癌及癌旁组织中mRNA的表达,采用Western blotting实验方法对食管鳞癌及癌旁正常食管组织中Mel-18、Bmi-1的蛋白表达进行检测。免疫组织化学染色法检测Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40在76例食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达;并计数食管鳞癌组织CD34阳性的微血管密度（MVD）和D2-40阳性的微淋巴管密度（LVD）。分析e1-18、Bmi-1、CD34及D2-40在食管癌组织中的表达情况和相关性,分析其表达与临床病理因素的关系。结果.:实时定量PCR实验结果显示,用域值循环数根据食管鳞状细胞癌组织相对癌旁正常食管组织的基因表达倍数分析,在食管鳞癌组织中Mel-18 mRNA低表达53.94%（41/76）而Bmi-1mRNA高表达63.16%（48/76）。Western blotting实验结果显示Mel-18蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的相对表达量为0.683±0.125,在癌旁食管组织相对表达量为0.917±0.062,食管鳞癌组织中Mel-18蛋白的表达量显着低于癌旁正常组织,差异有统计学意义（t=14.620,P<0.001）;Bmi-1蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的相对表达量为0.985±0.104,在癌旁食管组织相对表达量为0.747±0.131,食管鳞癌组织中Bmi-1蛋白的表达量显着高于癌旁正常组织,差异有统计学意义（t=12.405,P<0.001）。免疫组化实验结果显示食管鳞癌组织中Mel-18阳性表达率为30.3%（23/76）,癌旁组织中Mel-18阳性表达率为67.1%（51/76）,有统计学意义（χ2=20.646,P<0.05）。Bmi-1在食管鳞癌组织中阳性表达率为77.6%（59/76）,Bmi-1在癌旁组织中阳性表达率为27.6%（21/76）,差异具有统计学意义（χ2=38.106,P<0.05）。食管鳞癌组织中CD34阳性表达率为88.2%（67/76）,癌旁组织中CD34阳性表达率为31.6%（24/76）,有统计学意义（χ2=50.630,P<0.05）。食管鳞癌组织中D2-40阳性表达率为80.3%（61/76）,癌旁组织中D2-40阳性表达率为23.7%（16/76）,差异具有统计学意义（χ2=48.734,P<0.05）。在食管鳞状细胞癌组织中Mel-18蛋白的表达阳性率与肿瘤的临床病理分期、浸润深度和淋巴结转移情况密切相关,与肿瘤的分化程度、性别和年龄无明显相关。Bmi-1蛋白在食管鳞癌组织中的表达阳性率与肿瘤的临床病理分期、分化程度和淋巴结转移情况密切相关,而与年龄、性别和肿瘤的浸润深度无明显相关。食管鳞癌组织中MVD计数为45.76±15.19,而癌旁组织为5.38±1.24,差异有统计学意义（P<0.05）。除年龄、性别外,食管鳞癌组织中MVD与肿瘤临床病理分期、浸润深度、淋巴结转移情况和分化程度有关。食管鳞癌组织中LVD计数为11.21±5.84,而在癌旁组织中为4.02±1.73,差异有统计学意义（P<0.05）。食管鳞癌组织中LVD与肿瘤临床病理、分化程度、浸润深度、和淋巴结转移情况有关,而于年龄、性别无关。Mel-18和Bmi-1在食管鳞癌中的表达情况呈负性相关（r=-0.261,p=0.007）。食管鳞癌组织中CD34和D2-40的表达MVD和LVD呈正相关性（r= 0.426,p=0.002）。结论:Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40与食管鳞癌的临床病理特征密切相关,可能有望成为食管鳞癌发展及预后的预测指标。
齐博[10]（2017）在《miR-30a-3p/5p表达失调促进食管鳞状细胞癌发生和发展的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:食管癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,其肿瘤相关死亡率位居所有肿瘤的第6位。食管癌的发生发展与人们的生活方式和饮食习惯密切相关,近年人们生活方式和饮食结构的转变在一定程度上增加了食管癌的发病率。食管鳞状细胞癌是食管癌最为常见的一种组织学分型,它在所有类型的食管癌中占绝大部分,且死亡率高。食管鳞状细胞癌在亚洲高发,在中国尤为高发。由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分食管鳞状细胞癌患者初次诊断即处于癌症晚期,患者出现癌灶转移和复发的风险居高不下,5年生存率不足20%。食管鳞状细胞癌严重影响患者的生活质量和身心健康,死亡率高,复发转移率高,生存时间较短,同时给家庭和社会带来沉重的负担。因此,急需深入研究食管鳞状细胞癌发生发展的机制,寻找具有临床价值的分子标志物,为食管鳞状细胞癌的早期诊断和预后判断乃至有效治疗提供理论基础。食管鳞状细胞癌的发生发展涉及多方面的因素,包括不良饮食习惯、长期化学和物理刺激、人乳头瘤病毒感染和基因易感性等。为了探究食管鳞状细胞癌的个性化治疗方案,目前许多研究聚焦食管鳞状细胞癌患者的基因易感性。通过高通量测序技术对食管鳞状细胞癌基因组和外显子组进行测序分析。研究者发现食管鳞状细胞癌中存在多种变异,比如单核苷酸变异和基因拷贝数变异。其中,变异的基因广泛参与多种肿瘤相关信号通路,包括细胞周期调控、DNA损伤修复、RTK-Ras-MAPK-PI3K-AKT信号通路、Notch通路和WNT通路。值得注意的是,最近的研究表明,经典WNT信号通路和非经典WNT信号通路在食管鳞状细胞癌的发生发展中均发挥重要作用,有望将WNT信号通路中的关键基因作为食管鳞状细胞癌的预后和治疗的靶点。然而,食管鳞状细胞癌中WNT信号通路异常的调控机制有待进一步研究。微小RNA（microRNA）是一类非编码单链小分子RNA,含有1822个核苷酸（nucleotide,nt）,广泛存在于真核生物细胞中。microRNA不编码蛋白质,而是通过与靶基因的3’-UTR互补结合使其降解或阻碍翻译,从而影响靶基因的表达。通过不同的靶点,引起不同的作用。大量研究表明,已经发现microRNA参与调控体内多种细胞的分化、生长、增殖、代谢和凋亡等过程,其表达失调会引起多种疾病,包括肿瘤的发生发展。microRNA-30（miR-30）家族在进化过程中中高度保守,提示其在生物过程中具有重要作用。miR-30家族包含5个成员,miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e。miR-30家族在不同肿瘤中扮演不同的角色,例如,miR-30抑制非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌等,但可以促进神经胶质瘤、胃癌和胰腺癌。miR-30家族广泛参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移,以及上皮间质转化。miR-30家族的多面性可能基于不同的肿瘤环境下靶向作用于不同的促癌基因和抑癌基因,其确切机制仍需深入研究。越来越多的研究表明,miR-30a-3p/5p在多种肿瘤中发挥重要的作用。最近的研究揭示miR-30a-3p/5p通过WNT信号通路参与乳腺癌、神经胶质瘤和多发性骨髓瘤。本课题组在前期研究中通过网路数据库的分析发现miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中表达下调,生物信息学的分析提示miR-30a-3p/5p与WNT信号通路密切相关。然而,miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的作用和调控机制尚未清楚。本课题拟通过实验进一步检测miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的表达情况,分析其表达与临床病理参数之间的关系,并探究miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用和相关的分子机制。方法:1.利用公共数据库GEO database中的食管鳞状细胞癌基因芯片数据,分析miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌组织及配对癌旁正常组织中的表达情况;2.利用荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,q RT-PCR）检测食管鳞状细胞癌组织和配对癌旁正常组织中miR-30a-3p/5p的表达情况,并分析miR-30a-3p/5p的表达水平与食管鳞状细胞癌分化程度、TNM分期、总生存率等临床病理参数以及预后之间的关系;3.应用q RT-PCR检测正常食管鳞状上皮细胞和食管鳞状细胞癌细胞中miR-30a-3p/5p的表达水平;通过慢病毒包装系统建立miR-30a-3p/5p稳定过表达的食管鳞状细胞癌细胞株;利用瞬时转染技术,通过miR-30a-3p/5p inhibitor实现对食管鳞状细胞癌细胞内源性miR-30a-3p/5p的干扰;4.通过MTT、平板克隆形成和软琼脂克隆形成实验探究miR-30a-3p/5p在体外对食管鳞状细胞癌细胞增殖能力的作用;通过裸鼠皮下成瘤实验进一步确认miR-30a-3p/5p在体内对食管鳞状细胞癌细胞增殖能力的作用;5.利用公共数据库和miRWalk2.0分别分析miR-30a-3p和miR-30a-5p的靶基因,通过公共数据库KEGG对靶基因进行通路富集分析;6.通过双荧光素酶报告基因实验、免疫印迹实验和q RT-PCR实验验证miR-30a-3p/5p对WNT信号通路的调控作用,并筛选和验证miR-30a-3p/5p的靶基因。结果:1 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌组织中的表达1.1公共数据库GEO database中miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的表达情况GEO database中的食管鳞状细胞癌芯片GSE43732检测了119对食管鳞状细胞癌及其配对癌旁正常组织,其中miR-30a-3p和miR-30a-5p在食管鳞状细胞癌组织中的表达水平均显着低于配对癌旁正常组织（P<0.05）。1.2食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p表达水平的检测使用qRT-PCR实验检测99对食管鳞状细胞癌组织（经术后病理证实）及其配对癌旁正常组织（经术后病理证实）中miR-30a-3p和miR-30a-5p的表达情况,结果显示81.82%（81/99）的食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p的表达水平显着低于配对癌旁正常组织（P<0.05）。1.3食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p的表达水平与临床病理参数和预后之间的关系食管鳞状细胞癌组织中,miR-30a-3p/5p的表达水平在不同年龄组、不同性别和癌组织不同分化程度之间无显着性差异（P>0.05）;miR-30a-3p/5p的表达水平在肿瘤浸润深度（T）和淋巴结转移（N）不同程度分组中具有显着性差异（P<0.05）,并且二者之间呈负相关关系。使用Kaplan-Meier进行生存分析,并使用Log-Rank法进行总体生存率差异分析,结果表明miR-30a-3p/5p低表达组的生存率显着低于miR-30a-3p/5p高表达组,其差异具有统计学意义（P<0.05）。2 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌发生发展过程中的作用2.1食管鳞状细胞癌细胞中miR-30a-3p/5p过表达和干扰的实现qRT-PCR实验结果显示,miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌细胞株KYSE30和KYSE150中的表达水平低于正常食管鳞状上皮细胞株Het-1A;miR-30a-3p/5p在KYSE30中的表达略高于KYSE150。使用分子克隆技术成功构建miR-30a-3p/5p过表达的慢病毒表达载体,经测序鉴定插入序列正确、无突变。使用慢病毒载体系统构建miR-30a-3p/5p稳定过表达的食管鳞状细胞癌细胞株KYSE30-miR-30a-3p/5p;使用瞬时转染技术,通过miR-30a-3p/5p inhibitor对食管鳞状细胞癌细胞株KYSE150中miR-30a-3p/5p的内源性表达实现干扰。过表达和干扰效果均通过q RT-PCR实验进行了验证。2.2过表达和干扰miR-30a-3p/5p在体外对食管鳞状细胞癌增殖能力的影响MTT实验结果表明,miR-30a-3p/5p过表达的KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞生长速度明显慢于对照组KYSE30-control细胞（P<0.05）;而与对照组KYSE150-contorl细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞生长速度显着加快（P<0.05）。软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验结果表明,miR-30a-3p/5p过表达的KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞形成克隆的数量明显少于对照组KYSE30-control细胞（P<0.05）;而与对照组KYSE150-control细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞形成克隆的数量显着增多（P<0.05）。2.3过表达和干扰miR-30a-3p/5p在体内对食管鳞状细胞癌增殖能力的影响裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组KYSE30-control相比,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p肿瘤生长速度较慢且肿瘤体积较小（P<0.05）;与对照组KYSE150-control相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p-inhibitor肿瘤生长速度较快且肿瘤体积较大（P<0.05）。3 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌进展过程中的作用机制3.1 miR-30a-3p/5p靶基因及其富集情况的分析使用网络数据库和算法miRWalk2.0分别预测miR-30a-3p和miR-30a-5p的靶基因,结果显示miR-30a-3p的靶基因有CCND2、PRKACB、MAPK10、WNT2、FZD10和DVL3,miR-30a-5p的靶基因有LRP6、FZD3、CSNK1A1、FZD2、MAP3K7和PRKCA。分别对两组靶基因进行KEGG通路富集分析,结果显示两组基因富集所在通路均有Pathways in cancer、Ras signaling pathway、MAPK signaling pathway和Wnt signaling pathway。3.2实验验证miR-30a-3p/5p对WNT信号通路的调控双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞中WNT信号通路活性显着低于对照组KYSE30-control细胞（P<0.05）,而miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞中WNT信号通路活性显着高于对照组KYSE150-control细胞（P<0.05）。q RT-PCR实验和免疫印迹实验表明,与对照组KYSE30-control细胞相比,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞中WNT信号通路下游关键分子Cyclin D1的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显着下调（P<0.05）,而p27和p21的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显着上升（P<0.05）;与此相反,与对照组KYSE150-control细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞中Cyclin D1的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显着上升（P<0.05）,而p27和p21的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显着下调（P<0.05）。3.3 miR-30a-3p和miR-30a-5p分别直接靶向WNT信号通路的成员WNT2和FZD2qRT-PCR结果显示,使用miR-30a-3p minics过表达miR-30a-3p后,KYSE30细胞中WNT2的m RNA表达量显着下降（P<0.05）,而CCND2、PRKACB、MAPK10、FZD10和DVL3的m RNA表达量不受影响;使用miR-30a-5p minics过表达miR-30a-5p后,KYSE30细胞中FZD2的m RNA表达量明显下降（p<0.05）,但LRP6、FZD3、CSNK1A1、MAP3K7和PRKCA的m RAN表达量无明显变化。进一步的q RT-PCR实验和免疫印迹实验结果表明,过表达miR-30a-3p可以显着抑制WNT2在m RNA水平和蛋白质水平的表达（P<0.05）,而干扰miR-30a-3p可以显着增加WNT2在m RNA水平和蛋白质水平的表达（P<0.05）;同样,过表达miR-30a-5p能够显着抑制FZD2在m RNA水平和蛋白质水平的表达（P<0.05）,而干扰miR-30a-5p能够显着增加FZD2在m RNA水平和蛋白质水平的表达（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果表明,共转染miR-30a-3p过表达质粒plvthm-miR-30a-3p和包含野生型miR-30a-3p靶向序列的psi-check-WNT2-3’-UTR-WT质粒后,KYSE30细胞中荧光素酶活性显着低于共转染空载体plvthm和psi-check的对照组KYSE30细胞（P<0.05）,而共转染plvthm-miR-30a-3p和包含突变型miR-30a-3p靶向序列的psi-check-WNT2-3’-UTR-MUT质粒后,KYSE30细胞中荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;同样,共转染plvthm-miR-30a-5p和psi-check-FZD2-3’-UTR-WT后,KYSE30细胞中荧光素酶活性显着低于对照组（P<0.05）,而共转染plvthm-miR-30a-5p和psi-check-FZD2-3’-UTR-MUT后,KYSE30细胞中荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.食管鳞状细胞癌中miR-30a-3p/5p的表达水平显着下调;miR-30a-3p/5p的表达水平与食管鳞状细胞癌的分化程度、T分期和N分期以及患者总体生存率之间均呈负相关关系。2.过表达miR-30a-3p/5p可以抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖能力,而干扰miR-30a-3p/5p能够增强食管鳞状细胞癌细胞增殖能力。3.miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中抑制WNT信号通路的活性,并且分别特异性地抑制WNT2和FZD2的表达。
二、DNA-PK、c-myc、cyclinE在食管黏膜上皮增生、异型增生和鳞状细胞癌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA-PK、c-myc、cyclinE在食管黏膜上皮增生、异型增生和鳞状细胞癌中的表达（论文提纲范文）
（1）基于Caspase3/Bcl-2/Bax通路探究加味旋覆代赭汤治疗食管癌前病变的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究一 基于数据挖掘探讨袁红霞教授治疗食管癌前病变的处方规律 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究二 基于Caspase3/Bcl-2/Bax途径探究加味旋覆代赭汤对食管癌前病变模型大鼠的作用机制研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验过程 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 中虚气逆是食管癌前病变的主要病机 |
| 2 加味旋覆代赭汤是治疗食管癌前病变的有效方剂 |
| 3 食管癌前病变的发病 |
| 4 实验结果分析 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 大鼠食管癌前病变模型制造过程 |
| 综述 中医药治疗食管癌及癌前病变研究进展 |
| 1 中医病因病机与治疗 |
| 2 药物机制及分子生物学研究 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血全基因组外显子测序结果对比（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 样品的准备 |
| 2.2 全基因组外显子测序的实验流程 |
| 2.2.1 测序所需仪器和试剂 |
| 2.2.2 DNA样品的提取和质量检测 |
| 2.2.3 样品的文库构建和质控 |
| 2.2.4 样品上机测序及质控 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 测序数据质量评估 |
| 2.3.2 测序深度与覆盖度分布 |
| 2.3.3 变异信息的挖掘与分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血的体细胞突变数目 |
| 0.05)'>3.2 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血发生SNV的基因数目(突变频率VAF>0.05) |
| 3.3 贲门腺癌vs外周血与癌旁vs外周血中发生相同SNV的基因 |
| 3.4 贲门腺癌vs外周血的高频突变基因 |
| 3.5 贲门腺癌vs癌旁的高频突变基因 |
| 3.6 癌旁vs外周血的高频突变基因 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 综述 贲门癌的临床病理特征和分子机制研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. 贲门的定义和贲门黏膜的研究 |
| 2.1 贲门的解剖学定义 |
| 2.2 贲门黏膜的研究 |
| 2.2.1 贲门的组织学特点 |
| 2.2.2 贲门黏膜的研究进展 |
| 3. 贲门癌的中西方差异 |
| 4. 贲门癌的临床病理特征 |
| 4.1 贲门癌的地域分布特征 |
| 4.2 贲门癌的性别和年龄特征 |
| 4.3 贲门癌的吸烟和饮酒特征 |
| 4.4 贲门癌与幽门螺杆菌 |
| 4.5 贲门癌与肥胖 |
| 4.6 贲门癌与胃远端肿瘤和食管腺癌 |
| 4.7 贲门癌与胃食管反流病 |
| 4.8 贲门癌与肠化生 |
| 4.9 贲门癌的肿瘤家族史特征 |
| 5. 贲门癌的组织病理学特征 |
| 6. 贲门癌变的分子机制研究进展 |
| 6.1 贲门癌与胃远端肿瘤和食管远端腺癌的分子差异 |
| 6.2 贲门癌的单核苷酸多态性特征 |
| 6.3 贲门癌的表观遗传特征 |
| 6.4 贲门癌的长非编码RNA和微小RNA特征 |
| 7. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文部分 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 BIRC5的基因型分布与肝癌发病率的相关性 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验方法 |
| 3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 |
| 4 统计学分析 |
| 第2章 实验结果 |
| 1 研究对象的基本特征 |
| 2 BIRC5各种SNP基因型特征 |
| 3 BIRC5各种SNP基因型与肝癌发病风险 |
| 第二部分 MIR-218在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 RT-PCR验证miR-218在不同肝癌细胞株中的表达 |
| 3 质粒转染 |
| 4 Western blot检测 |
| 5 CCK8实验检测细胞增殖水平 |
| 6 Transwell迁移实验 |
| 7 克隆形成实验 |
| 8 流式凋亡检测方法 |
| 9 免疫荧光 |
| 10 双荧光素酶实验 |
| 11 细胞周期检测 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 13 HE染色 |
| 14 免疫组化染色 |
| 15 统计学处理 |
| 第2章 结果 |
| 1 四株肝癌细胞株中miR-218基因的表达情况 |
| 2 不同分期肝癌组织中miR-218及BIRC5的表达 |
| 3 质粒转染后miR-218的表达 |
| 4 BIRC5是miR-218的靶基因 |
| 5 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞克隆能力的影响 |
| 6 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞侵袭转移能力的影响 |
| 7 EMT相关标志物的蛋白水平检测 |
| 8 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞增殖能力的影响 |
| 9 靶向BIRC5的miR-218的表达对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 10 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞周期的影响 |
| 11 miR-218通过下调BIRC5的表达调节GSK-3β/β-catenin通路 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 第三部分 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝癌相关基因突变与肝癌遗传易感性的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 学位论文及答辩辩情况表 |
| 附件 |
| 英文部分(大论文英文版) |
| Abstract |
| Chinese and English abbreviations table |
| Before the speech |
| The first part is the correlation between the genotype distribution of BIRC5 andthe incidence of liver cancer |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Research object |
| 2 experimental methods |
| 3 Hardy-Weinberg genetic balance test results |
| 4 statistical analysis |
| Chapter 2 The experimental results |
| 1 Basic characteristics of the research object |
| 2 Various SNP genotypes of BIRC5 |
| 3 Various SNP genotypes of BIRC5 and the risk of liver cancer |
| The two part expression of mir-218 in hepatocellular carcinoma cells and its effect on invasion ability of hepatocellular carcinoma cells |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Cell culture |
| 2 Rt-pcr confirmed the expression of mir-218 in different liver cancer cell lines |
| 3 Plasmid transfection |
| 4 Western blot test |
| 5 CCK8 assay was used to detect cell proliferation |
| 6 Transwell migration experiment |
| 7 Clone formation experiment |
| 8 Flow detection of apoptosis |
| 9 Immunofluorescence |
| 10 Double luciferase experiment |
| 11 Cell cycle detection |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| 13 HE dyed |
| 14 Statistical processing |
| Chapter 2 Bear fruit |
| 1 Expression of mir-218 gene in four hepatocellular carcinoma cell lines |
| 2 Expression of mir-218 and BIRC5 in liver cancer tissues of different stages |
| 3 Expression of mir-218 after transfection with plasmid |
| 4 BIRC5 is the target gene of mir-218 |
| 5 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on the cloning ability of HepG2 cells |
| 6 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on invasion and metastasis of HepG2 cells |
| 7 Detection of protein level of EMT related markers |
| 8 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on proliferation of HepG2 cells |
| 9 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on apoptosis of tumor cells |
| 10 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on HepG2 cell cycle |
| 11 Mir-218 regulates gsk-3 beta/beta-catenin pathway by down-regulating BIRC5expression |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| The three part Discussion |
| Conclusion |
| Reference |
| Literature Review Study on the genetic susceptibility of hepatocellular carcinoma to hepatocellular carcinoma |
| Reference |
（4）miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 食管鳞癌组织中microRNAs差异表达谱的筛选及研究 |
| 1.1 差异表达谱的筛选 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 结果 |
| 1.1.4 讨论 |
| 1.1.5 结论 |
| 1.2 食管鳞癌组织miR-106b-3p的研究 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.3 结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-106b-3p对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 2.1 对体外细胞生物学功能的影响 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 对裸鼠移植瘤的影响 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-106b-3p调控食管鳞癌分子机制研究 |
| 3.1 miR-106b-3p的靶基因验证及二者关系 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 结论 |
| 3.2 miR-106b-3p对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述:食管癌相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（5）RSK4在食管鳞状细胞癌转移、放疗抵抗及肿瘤干细胞特性中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 RSK4促进食管鳞癌转移、放疗抵抗与肿瘤干细胞特性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 RSK4是ΔNp63α的直接转录调控靶分子 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 RSK4通过磷酸化GSK-3β激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 阻断RSK4可抑制食管鳞癌转移能力和肿瘤干细胞特性,提高放疗敏感性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）热敏灸“中脘”穴对慢性萎缩性胃炎模型大鼠Wnt2、β-catenin、MMP-7影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文名词术语对照 |
| 前言 |
| 历史回顾 |
| 1 现代医学对CAG的认识 |
| 2 祖国医学对CAG的研究进展 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验器材及主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 CAG大鼠模型建立方法与模型评价 |
| 2.3 腧穴定位、施灸方法及腧穴敏化标准 |
| 2.4 实验操作方法 |
| 2.5 实验动物取材及标本制备 |
| 2.6 观察指标与检测方法 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 模型建立情况 |
| 3.2 各组大鼠一般状况观察 |
| 3.3 各组大鼠体质量变化 |
| 3.4 各组大鼠胃黏膜光镜下观察 |
| 3.5 胃黏膜Wnt2 蛋白表达测定结果 |
| 3.6 胃黏膜β-catenin免疫组化测定结果 |
| 3.7 胃黏膜MMP-7 免疫组化测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Wnt/β-catenin信号通路及关键因子与CAG及癌前病变密切相关 |
| 4.2 关于热敏灸 |
| 4.3 热敏灸治疗CAG等胃肠道疾病疗效佳 |
| 4.4 实验选穴依据 |
| 4.5 CAG热敏动物模型探讨 |
| 4.6 实验结果分析 |
| 4.7 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录:答辩委员会 |
| 作者简介 |
（7）SOX2、VEGF-C在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:SOX2 在消化道恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）基于细胞信号通路对胃蛋白酶在下咽癌进展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 咽喉返流症的研究进展 |
| 1.1.1 咽喉反流与胃食管反流的区别 |
| 1.1.2 胃蛋白酶（Pepsin）可能是导致LPRD主要物质 |
| 1.1.3 胃蛋白酶导致细胞损伤的可能机制 |
| 1.2 咽喉返流和咽喉部恶性肿瘤 |
| 1.2.1 咽喉返流是否是咽喉部恶性肿瘤的独立致癌因素存在争议 |
| 1.2.2 反流在食管腺癌发生发展中的作用机制得到阐释。 |
| 1.2.3 LPR与咽喉恶性肿瘤有因果关系的大规模流行病学证据目前不充足 |
| 1.2.4 咽喉返流物的致癌物尚难以确定 |
| 1.2.5 胃蛋白酶与咽喉癌发病的细胞生物学研究进展快速 |
| 1.2.6 LPRD与喉癌前病变 |
| 1.3 胃蛋白酶抑制剂可有效治疗LPRD |
| 第2章 胃蛋白酶蛋白在下咽癌及癌旁组织中的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象及标本收集 |
| 2.2.2 临床信息 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.2.4 IHC结果判读 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 IHC法检测胃蛋白酶在下咽癌和配对癌旁组织中的检出 |
| 2.3.2 胃蛋白酶在70 例下咽癌中检出和患者临床病理因素的相关性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 胃蛋白酶在下咽癌和癌旁组织中呈高检出率 |
| 2.4.2 胃蛋白酶检出与下咽癌淋巴结转移密切相关 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 中性环境下胃蛋白酶对下咽Fadu细胞的促增殖作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 配置失活状态和灭活状态胃蛋白酶溶液 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 CCK-8 细胞增殖实验 |
| 3.2.5 细胞周期检测 |
| 3.2.6 胃蛋白酶-溶酶体共聚焦定位实验 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 p H7.0 条件下不同浓度下胃蛋白酶对Fadu细胞体外增殖能力的影响 |
| 3.3.2 灭活胃蛋白酶不能导致Fadu细胞增殖 |
| 3.3.3 胃蛋白酶促进细胞从Gl期向S期分化 |
| 3.3.4 胃蛋白酶聚集于细胞溶酶体内。 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 在中性环境中胃蛋白酶诱导下咽癌细胞增殖呈现剂量依赖，与刺激时间无相关性。 |
| 3.4.2 灭活的胃蛋白酶不能导致诱导下咽癌细胞增殖。 |
| 3.4.3 胃蛋白酶被细胞内吞后聚集于溶酶体内。 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 胃蛋白酶诱导下咽癌细胞增殖的信号通路研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 细胞信号通路基因芯片 |
| 4.2.4 细胞免疫荧光实验 |
| 4.2.5 蛋白免疫印迹Western blot |
| 4.2.6 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 胃蛋白酶诱导下咽癌细胞的信号传导通路基因改变 |
| 4.3.2 荧光染色实验验证胃蛋白酶激活NF-k B信号通路 |
| 4.3.3 Western blot验证胃蛋白酶激活NF-κB信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 咽喉返流与咽喉部恶性肿瘤相关的流行病学依据 |
| 4.4.2 动物实验表明胃蛋白酶协同加剧二甲基苯蒽（DMBA）的致癌作用。 |
| 4.4.3 胃蛋白酶致癌作用的分子生物学机制研究 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 主要创新点与展望 |
| 6.1 本研究主要创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）食管鳞癌中Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40的表达及其与临床病理特征的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文 |
（10）miR-30a-3p/5p表达失调促进食管鳞状细胞癌发生和发展的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分：miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床病例参数的相关性分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分：miR-30a-3p/5p对食管鳞状细胞癌细胞增殖能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分：miR-30a-3p/5p调节食管鳞状细胞癌细胞增殖的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 食管鳞状细胞癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、DNA-PK、c-myc、cyclinE在食管黏膜上皮增生、异型增生和鳞状细胞癌中的表达（论文参考文献）
- [1]基于Caspase3/Bcl-2/Bax通路探究加味旋覆代赭汤治疗食管癌前病变的作用研究[D]. 张月林. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血全基因组外显子测序结果对比[D]. 徐瑞华. 郑州大学, 2020(02)
- [3]BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究[D]. 骆诤. 山东大学, 2019(03)
- [4]miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究[D]. 乔冠恩. 苏州大学, 2019(06)
- [5]RSK4在食管鳞状细胞癌转移、放疗抵抗及肿瘤干细胞特性中的作用及机制研究[D]. 李明阳. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [6]热敏灸“中脘”穴对慢性萎缩性胃炎模型大鼠Wnt2、β-catenin、MMP-7影响[D]. 张瑶. 江西中医药大学, 2019(02)
- [7]SOX2、VEGF-C在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[D]. 彭维. 川北医学院, 2019(03)
- [8]基于细胞信号通路对胃蛋白酶在下咽癌进展中的作用机制研究[D]. 牛锴. 吉林大学, 2019(12)
- [9]食管鳞癌中Mel-18、Bmi-1、CD34及D2-40的表达及其与临床病理特征的关系[D]. 曹明. 山东大学, 2019(09)
- [10]miR-30a-3p/5p表达失调促进食管鳞状细胞癌发生和发展的作用及分子机制研究[D]. 齐博. 郑州大学, 2017(05)