一、间凝和快速酶标联合检测血吸虫病的应用（论文文献综述）
刘飞[1]（2021）在《胞外ATP联合日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究》文中研究表明以前的血吸虫疫苗研究结果显示,辐照致弱的肺期童虫（LS）具有高度的免疫保护作用,这种免疫机制可能是LS差异性表达的抗原分子与先天性和获得性免疫细胞反应,致使宿主肺部产生了促炎性的Th1型免疫微环境。因此,筛选和鉴定这些抗原分子并阐明其免疫生物学功能,成为研制有效和安全的抗血吸虫疫苗的重要方向。本实验室前期研究发现,辐照尾蚴转化来的童虫细胞呈现免疫原性细胞死亡的表型特征,其释放的危险（应激）信号分子如HSP70、CRT、HMGB1以及ATP等,可能在诱导宿主产生高保护性免疫中起了重要作用。本文旨在研究胞外三磷酸腺苷（ATP）联合日本血吸虫膜外钙网质蛋白（Sj CRT）在先天性免疫反应和获得性免疫反应中功能,为进一步阐明辐照致弱童虫的高保护性机制提供基础。1、正常及辐照致弱日本血吸虫童虫胞外ATP释放图式和虫体细胞胞内ATP的表达测定。体外培养不同期别的正常日本血吸虫童虫和辐照致弱日本血吸虫童虫,分别收集虫体培养液和细胞,利用增强型ATP检测试剂盒检测童虫胞外和胞内ATP含量。实验结果显示,随着培养时间的推移,辐照组童虫胞外和胞外ATP含量逐渐降低,正常组童虫呈现先升高后降低的趋势。体外培养1 d和2 d时,辐照组童虫胞外ATP含量比正常组高,且差异极显着（P<0.01）,而培养到4 d和5 d时,正常组童虫胞外ATP含量比辐照组高,且差异极显着（P<0.01）。3 d、6 d和7 d时,辐照组童虫胞外ATP含量和正常组无明显差异。检测虫体胞内ATP含量,我们发现了,辐照组童虫细胞胞内ATP含量随着培养时间的增加,呈现逐渐降低的趋势,正常组童虫细胞胞内ATP含量先升高后降低再升高最后降低,总体表现为降低的趋势。体外培养1 d时,辐照组童虫细胞胞内ATP明显比正常组高,且差异极显着（P<0.01）,培养2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d时,正常组童虫细胞胞内ATP含量明显高于辐照组,差异极显着（P<0.01）,培养到8 d时,与正常组相比,辐照组童虫胞外ATP含量无明显差异。结果提示,辐照早期1 d时童虫胞内ATP和释放到胞外ATP含量高,随着培养时间的推移,胞内和胞外ATP含量均下降。2、胞外ATP联合Sj CRT活化小鼠DC的功能鉴定。流式细胞术250 n M或1 m M Bz ATP（P2X7R激动剂,一种ATP拟似物）或r Sj CRT刺激的骨髓源树突状细胞（BMDC）表面标志受体CD80、CD86和MHCII的表达情况;ELISA检测Bz ATP或r Sj CRT作用的BMDC培养上清中细胞因子的表达水平;CCK-8法检测刺激剂脉冲的DC作用的CD4+T细胞的增殖情况;流式细胞术检测CD4+T细胞的胞内细胞因子IFN-γ和IL-4的表达情况。流式实验结果显示,250 n M ATP和1 m M ATP都能显着的上调表达DC表面标志分子CD80、CD86和MHCII,但是,250 n M ATP和Sj CRT联合作用时,DC表面标志分子CD80、CD86和MHCII能极显着地升高;ELISA结果表明,250 n M ATP和1 m M ATP的刺激都能促进DC的TNF-α和IFN-γ显着地增加（P<0.05）,但250 n M ATP较PBS对照组显着地升高IL-4的分泌,1 m M ATP的刺激则是显着地（P<0.05）降低,两者的IL-10表达水平无显着性差异。250 n M ATP和1 m M ATP与Sj CRT联合刺激时,TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达趋势与单独刺激时相同。CCK-8实验结果显示,250 n M ATP、1 m M ATP、250 n M ATP+Sj CRT和1 m M ATP+Sj CRT都能刺激CD4+T细胞增殖,但是联合刺激组的促进CD4+T增殖的能力高于单独刺激组。流式检测结果显示250 n M ATP、1 m M ATP和250 n M ATP+Sj CRT能显着地（P<0.05）上调表达IFN-γ,1 m M ATP+Sj CRT的IFN-γ的表达与阴性对照组无显着差异。与阴性对照组相（control组）相比较,250 n M ATP+Sj CRT能显着地（P<0.05）降低IL-4的表达,250 n M ATP、1 m M ATP和1 m M ATP+Sj CRT无显着性差异。结果提示,250 n M ATP+Sj CRT能促进DC表型和功能成熟,成熟的DC诱导CD4+T增殖活化。3、胞外ATP联合Sj CRT诱导致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞免疫反应的特征研究。MTT法检测Bz ATP或r Sj CRT再刺激致敏小鼠的脾脏混合淋巴细胞的增殖;流式细胞术检测致敏小鼠的淋巴细胞亚群状况和致敏小鼠再刺激的脾脏混合淋巴细胞胞内细胞因子的表达;ELISA检测Bz ATP或r Sj CRT致敏小鼠再刺激的淋巴细胞胞外细胞因子表达情况。MTT检测结果显示250 n M ATP+Sj CRT促进脾脏混合淋巴细胞显着性地增殖（P<0.05）。淋巴亚群实验结果显示,250 n M ATP免疫组混合淋巴中CD4+/CD8+Tcell为2.12、1 m M ATP免疫组混合淋巴中CD4+/CD8+Tcell为1.47和250 n M ATP+Sj CRT免疫组混合淋巴中CD4+/CD8+Tcell为2.19和1 m M ATP+Sj CRT免疫组混合淋巴中CD4+/CD8+Tcell为2.93。CD4+T细胞胞内细胞因子检测结果为:与PBS阴性对照组相比,250 n M ATP+Sj CRT和1 m M ATP+Sj CRT能极显着地（P<0.01）促进脾脏混合淋巴细胞胞内细胞因子IFN-γ高表达,250 n M ATP和1 m M ATP能极显着地下调表达IL-4（P<0.01）。ELISA实验结果显示250 m M ATP、250 n M ATP+Sj CRT或1 m M ATP+Sj CRT的刺激使脾脏混合淋巴细胞胞外促炎细胞因子TNF-α和INF-γ显着的高表达（P<0.05）,1 m M ATP+Sj CRT的刺激组的IL-10的分泌,显着的高于阴性对照组（PBS组）（P<0.05）。各个实验组的胞外细胞因子IL-4表达含量与阴性对照组相比无显着性差异。结果提示,250 n M ATP+Sj CRT能够诱导小鼠产生CD4+Th1型免疫应答反应。综上所述,ATP在日本血吸虫童虫的辐照早期能够在胞内高度表达,并且大量地释放到胞外。胞外250 n M ATP联合Sj CRT可以促进骨髓源树突状细胞表型和功能发育成熟,并且能够活化CD4+T细胞并诱导其向致炎性Th1型细胞免疫应答分化。初步探索了ATP联合Sj CRT活化树突状细胞（DC）和诱导T细胞极化的机制,为进一步阐明辐照致弱疫苗模型中损伤相关分子模式（Sj CRT、Sj HMGB1、Sj HSP70和ATP）在诱导免疫原性死亡中发挥的作用和机制奠定了基础。
孙爱平[2]（2020）在《血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测血吸虫病的临床意义》文中研究表明目的研究血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测血吸虫病的临床意义。方法我院2018年1月—2019年3月诊治200例血吸虫病患者,分别采用血吸虫循环抗原检测、血吸虫虫卵抗体检测、血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测,比较三种检测方法检出率、误诊率。结果三种检测方法检出率在血吸虫病和慢性血吸虫病方面差异均有统计学意义,其中血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测检出率最高（P<0.05）;三种检测方法误诊率在血吸虫病、慢性血吸虫病和晚期血吸虫病方面差异均无统计学意义（P>0.05）;血吸虫虫卵抗体检测、血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测的检出率及误诊率在晚期血吸虫病方面差异无统计学意义（P>0.05）。结论采用血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测血吸虫病检出率显着高于单一方法检测,可减少误差,值得推广应用。
张建强[3]（2020）在《miR-181b-5p靶向Smad7促进血吸虫病肝纤维化作用及机制研究》文中提出血吸虫病是临床上常见的慢性寄生虫病,其危害程度仅次于疟疾。在全球范围内,有过2.3亿人感染血吸虫病,波及76个国家和地区,每年因血吸虫相关疾病死亡的患者至少有20万。血吸虫病的主要危害是虫卵肉芽肿的形成以及由虫卵诱导的一系列免疫反应引发的肝纤维化,主要特征为大量细胞外基质沉积于肝脏,严重影响肝功能,甚至导致肝衰竭,而肝星状细胞被认为是细胞外基质的主要来源细胞。目前,血吸虫病主要生物防治措施是进行吡喹酮治疗,但在临床上,吡喹酮对血吸虫感染所造成的肝肉芽肿及肝纤维化无明显改善作用,且吡喹酮的耐药性和化学毒性也限制了其应用。因此,寻找有效的防治肝纤维化策略对血吸虫病患者的生活质量以及疾病预后的改善有着十分重要的意义。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长度较短的非编码RNA分子,可与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合,从而抑制靶基因的翻译或促进靶基因mRNA的降解。在转录后水平负调控基因表达。研究表明,miRNA在肝脏疾病及肝纤维化中具有重要的调控作用,其有望成为未来抗肝纤维化治疗的药物靶点。MiR-181b-5p在小鼠感染血吸虫后表达明显升高,并且细胞实验也发现其对肝星状细胞的活化具有重要作用。因此,本研究拟以miR-181b-5p为研究对象,旨在通过对血吸虫病肝纤维化的发生、发展机制的深入研究,探索可能的抗肝纤维化治疗靶点,为临床血吸虫病的防治及肝纤维化的治疗提供理论依据。目的:本研究围绕miR-181b-5p分别从动物水平和细胞水平探讨血吸虫病肝纤维化的发生、发展机制,明确miR-181b-5p在血吸虫病进程中的动态变化,并通过干预miR-181b-5p的表达进一步研究其对肝纤维化的调控作用,为基于miR-181b-5p的基础与临床血吸虫病防治干预策略提供实验依据。方法:小鼠造模方法:雌性BALB/C小鼠,6-8周龄、体重20-22克,经腹部皮肤感染15-20条日本血吸虫尾蚴,建立血吸虫感染模型。动物实验:（1）明确血吸虫病过程中miR-181b-5p表达的动态变化:随即分为2组:①对照组:不做任何处理;②模型组:尾蚴腹部感染造模。所有小鼠分别于感染后6周、8周、10周取材检测相关指标。（2）探索miR-181b-5p调控血吸虫病肝纤维相关机制:于小鼠尾蚴腹部感染造模10天后,通过尾静脉注射重组8型腺相关病毒（recombinant adeno-associatedvirus8,rAAV8）特异性 miR-181b-5p 抑制载体 miR-181b antagomir,阴性对照组给予对照病毒,空白组给予PBS尾静脉注射,于感染后第8周取材检测。细胞实验:采用TGF-β1诱导人肝星状细胞LX2活化,模拟体内肝纤维化发生过程,以细胞水平miR-181b-5p的表达变化;后期通过转染miR-181b-5p mimic或inhibitor以上调或下调miR-181b-5p表达,进一步探明miR-181b-5p对肝星状细胞活化以及肝纤维化发生的相关作用机制。数据统计:主要采用单因素方差分析及显着性Student-T检验进行分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:（1）血吸虫感染后miR-181b-5p随感染周期延长而逐渐升高（RT-PCR）,Smad7表达随感染周期延长而逐渐降低（Western Blot）;（2）下调miR-181b-5p可显着减轻血吸虫感染小鼠肝肉芽肿及肝纤维化（HE染色/masson染色）,抑制肝纤维化相关基因COL1A1表达（RT-PCR/Western Blot）,降低肝纤维化相关细胞因子 TGF-β1 释放（ELISA）,升高Smad7 蛋白表达（RT-PCR/Western Blot）;（3）不同浓度 TGF-β1（5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml）刺激 LX2 细胞,miR-181b-5p呈升高趋势,以10ng/ml表达最高;10ng/ml TGF-β1处理后6h、12hmiR-181b-5p表达稍有下降,24h、48h后显着上调,以24h升高最为显着;（4）下调LX2细胞miR-181b-5p表达可显着降低TGF-β1诱导的LX2细胞COL1A1表达升高。结论:（1）小鼠感染血吸虫后肝组织miR-181b-5p表达逐渐升高,Smad7表达逐渐降低;（2）下调miR-181b-5p表达可显着减轻血吸虫病小鼠肝肉芽肿及肝纤维化;（3）miR-181b-5p可通过靶向Smad7促进血吸虫病肝纤维化,而抑制miR-181b-5p表达,可促进其下游基因Smad7表达,从而发挥抗纤维化作用。
王小莉[4]（2019）在《吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究》文中认为日本血吸虫病（Schistosomiasisjaponica）是一种由日本血吸虫感染而引起的危害严重的人畜共患寄生虫病,主要流行于亚洲地区。该病的传播需要借助于中间宿主钉螺,其逸出的感染期尾蚴经皮肤侵入人体。成虫寄生于肝门肠系膜静脉系统,产出虫卵,最终可致慢性肝纤维化。全球范围内控制血吸虫病的流行仍是以降低发病率为主的策略,经济条件或地理环境限制了大规模灭螺的开展,因而药物化疗是目前控制血吸虫病主要手段。吡喹酮（Praziquantel,PZQ）自问世以来,因其出色的疗效和广谱的适用性被WHO指定为抗血吸虫病的首选药物。在PZQ长期大范围给药过程中,血吸虫耐药性问题也越来越引起人们的重视。目前在实验室条件下可诱导出对PZQ抗性虫体、临床上PZQ治疗不敏感案例均已有报道。因此,寻找能够替代或补充PZQ的备选新药势在必行。DW-3-15是本实验室拥有知识产权的一种PZQ新衍生物（专利号:ZL201110142538.2）,在PZQ药效基团联合青蒿琥酯活性基团的设计策略上,引入过氧桥键。在前期研究中,实验室合成的DW-3-15已显示出抗日本血吸虫活性。在本课题中,借助药物公司进行商品化大量合成DW-3-15,进一步完善对DW-3-15抗日本血吸虫生物学效应的评价。同时利用蛋白组学、抗体制备等技术,对药物作用后虫体进行蛋白、转录水平检测,为深入阐明DW-3-15抗日本血吸虫作用机制及寻找潜在药物靶点提供科学依据。第一部分吡喹酮衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫的杀伤作用目的探讨DW-3-15体外对日本血吸虫不同发育阶段的杀伤效应。方法1.日本血吸虫双性尾拗经皮肤感染小鼠,感染后14d、21d及35d经肝门静脉灌注法收集童虫、（雌、雄）成虫。挑取5条成虫/孔和8条童虫/孔于6孔板,加入3 ml/孔DMEM培养基,加入终浓度50～100μmol/L DW-3-15。培养24 h后换液,加入不含药物DMEM培养基继续孵育至96 h。在培养期间,每天观察虫体活力情况及统计存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集（雌、雄）成虫,扫描电镜观察体表超微结构变化。2.挑取1对合抱成虫/孔于6孔板,向3 ml/孔DMEM培养基中加入50～100μmol/LDW-3-15共培养24h,1、6、12和24h观察合抱虫体分离情况。24h换液,加入不含药物DMEM培养基继续培养至96h,培养结束收集虫卵,统计雌虫产卵量。结果1.体外实验显示:在24～96h,随着DW-3-15浓度升高日本血吸虫（雌、雄）成虫、童虫的活力度、存活率逐渐下降;与对照组比较,50～100 μmol/LDW-3-15作用下（雌、雄）成虫和童虫活力值均明显降低,差异均有统计学意义（均P<0.001）;100 μmol/L PZQ组雌、雄虫活力降低率为89.6%～98.5%、91.9%～97.8%,100 μmol/L DW-3-15作用下雌、雄虫活力降低率分别为91.1%～97.8%、93.3%～96.3%,两者之间差异均无统计学意义;100μmol/LDW-3-15作用下21d、14d童虫的活力值均明显低于100μmol/L PZQ组（P<0.05）,降低率分别为91.7%～94.4%、95.4%～99.1%;在24～96h,50～100μmol/LDW-3-15可致合抱成虫全部分离,显着降低雌虫体外产卵量（均P<0.001）。2.形态观察显示:在96h,100 μmol/LDW-3-15作用下雌、雄虫呈极度收缩、不透明,似杆状或棒状;21d童虫皱缩而短小,虫体不透明;14d童虫收缩变短,虫体内部出现空泡状改变。在100μmol/LPZQ作用下,（雌、雄）成虫体态僵硬,呈螺旋状卷曲;21d、14d童虫体态柔和,活力正常。3.电镜结果显示:与对照组比较,DW-3-15、PZQ作用下雌、雄虫体表皮层呈多样化损伤改变,如褶嵴融合、渗出、表面剥脱、坑状或腐蚀状或泡状改变,暴露皮下肌层组织,甚至造成肌层组织损伤。结论PZQ衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫成虫、童虫均具有显着的杀伤作用,其抗成虫效果与PZQ相仿,对童虫杀伤作用优于PZQ。第二部分吡喹酮衍生物DW-3-15体内抗日本血吸虫的生物学效应目的探讨DW-3-15体内对日本血吸虫的杀伤效应及对虫卵肉芽肿形成的影响。方法1.感染了日本血吸虫双性尾蚴的小鼠被随机分7组。在感染后35d,实验组分别灌胃100～400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分肝脏消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。2.感染了双性尾蚴的小鼠被随机分3组。在感染后14d,实验组分别灌胃400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。停药后21d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。结果1.成虫阶段治疗:随着DW-3-15用药剂量升高,小鼠体内检获虫体数、虫卵数、肉芽肿平均直径逐渐降低;与未治疗组比较,100～400mg/kg DW-3-15治疗后检获虫体数、虫卵数均显着减少（均P<0.05）;400mg/kg DW-3-15治疗组减虫率、减卵率分别达64.2%、86.2%,低于400mg/kg PZQ治疗组减虫率（98.8%）、减卵率（93.5%）;200～400mg/kg DW-3-15用药可使小鼠肝/体重、脾/体重显着降低（均P<0.05）;400mg/kg DW-3-15治疗可减轻肝脏中虫卵肉芽肿病变,降低肉芽肿平均直径（P<0.01）。2.童虫阶段治疗:与未治疗组相比,DW-3-15治疗组小鼠体内检获虫体数、虫卵数均显着降低（均P<0.05）,减虫率、减卵率分别为77.0%、95.4%,高于PZQ治疗组减虫率（17.4%）、减卵率（14.9%）;DW-3-15治疗组小鼠脾脏变小,肝脏表面可见少量肉芽肿结节,质地变软,肉芽肿平均直径、肝/体重、脾/体重均显着降低（均P<0.001）。结论DW-3-15体内对14d童虫、35d成虫均具有显着的杀伤作用,可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化,具有发展成为抗日本血吸虫新药的应用前景。第三部分吡喹酮衍生物DW-3-1 5体内作用后日本血吸虫成虫的TMT蛋白质组分析目的分析DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的差异蛋白质谱,探讨DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制。方法日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d经肝门静脉灌注法收集成虫,提取虫体总蛋白。应用TMT结合液相色谱-质谱联用技术,鉴定DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的蛋白谱,通过数据库比对,利用生物信息学对虫体表达的差异蛋白进行分析。结果在DW-3-15治疗后,雌虫表达差异蛋白407个,其中上调蛋白187个,有钙结合蛋白、myoferlin蛋白等;下调蛋白220个,有转录相关蛋白、核糖体蛋白、组蛋白乙酰转移酶等;差异蛋白主要参与核糖体代谢、内质网蛋白合成、转录等过程。雄虫表达差异蛋白41个,其中上调蛋白30个,有钙结合蛋白、跨膜蛋白等;下调蛋白11个,有肌动蛋白、鞘脂激活蛋白B等;差异蛋白主要参与钙离子结合、溶酶体代谢等。结论在DW-3-15治疗后日本血吸虫雌、雄虫中分别鉴定到与虫体生长、发育、代谢等相关差异蛋白,为DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制研究提供基础数据。第四部分日本血吸虫组蛋白乙酰转移酶（SjHAT）多克隆抗体的制备及DW-3-15体内对成虫SjHAT的影响目的表达重组SjHAT蛋白,制备抗SjHAT多克隆抗体,分析DW-3-15治疗前后对日本血吸虫成虫SjHAT表达水平影响,探讨DW-3-15抗日本血吸虫作用机制。方法1.采用密码子优化SjHAT表达序列,应用基因化学合成法、同源重组构建表达质粒,通过原核体系大量表达重组蛋白;重组SjHAT蛋白免疫兔4次,制备抗SjHAT多克隆抗体,ELISA检测效价及特异性IgG抗体水平。2.日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,随机分2组。实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组小鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d收集雌、雄虫,提取虫体总蛋白;以抗SjHAT多克隆抗体为一抗,western blotting检测DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT表达水平;实时定量PCR分析DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT基因转录水平变化。结果1.成功构建了重组表达质粒petB2M-SjHAT,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得大量表达;4次免疫可产生较高水平特异性IgG抗体,得到纯化的抗SjHAT多克隆抗体（约50kDa,效价>105）。2.Western blotting分析显示正常雌虫SjHAT表达水平高于正常雄虫（P<0.05）;DW-3-15治疗后雌虫SjHAT表达水平明显降低（P<0.05）。QPCR分析显示正常雌虫SjHAT基因转录水平高于雄虫SjHAT转录水平;DW-3-15可降低雌虫SjHAT基因转录水平（均P<0.05）。结论SjHAT在正常雌、雄虫中均有一定表达,DW-3-15可抑制雌虫SjHAT表达,为阐明SjHAT可能是DW-3-15抗日本血吸虫作用靶点提供依据。综上,PZQ衍生物DW-3-15在体外、内兼有抗日本血吸虫童虫、成虫生物学活性,并可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化;TMT定量蛋白质组学鉴定到DW-3-15治疗前后日本血吸虫雌、雄虫表达的差异蛋白质谱;成功制备抗SjHAT多克隆抗体;从转录、蛋白水平分析DW-3-15作用雌、雄虫SjHAT变化。本研究系统地评价了 DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应,初步探讨了 DW-3-15抗日本血吸虫的分子机制,揭示了 SjHAT可能是DW-3-15抗血吸虫作用靶点,为进一步筛选抗血吸虫新药和新靶点提供参考依据。
战廷正[5]（2019）在《ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制》文中研究指明日本血吸虫病是由日本血吸虫成虫寄生于人和哺乳动物的肠系膜下静脉而引起的严重危害人类健康的传染性疾病。从尾蚴侵入到虫卵排出均可对宿主造成损害,最主要的致病虫期为虫卵。虫卵能沉积在宿主结肠壁和肝脏等组织的小静脉内,通过释放可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）而引起组织出现肉芽肿并继发纤维化。其致病机制为辅助性T细胞（helper T cell,Th）介导的ⅣV型超敏反应。研究证实,Th2细胞、Th17细胞和滤泡辅助性T细胞（Follicular helperT cell,Tfh）可分别分泌特异性的细胞因子白介素4（interleukin-4,IL-4）、IL-17和IL-21发挥促进虫卵肉芽肿和纤维化形成的作用,而Th1细胞和调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）则通过分泌功能性细胞因子干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和IL-10起相反的抑制作用。Th9细胞是一种新的Th细胞亚群,有研究发现Th9细胞参与了乙肝纤维化的发生发展过程,并在CC14诱导的小鼠肝纤维化过程中起到促进作用,但Th9细胞在日本血吸虫病引起的虫卵肉芽肿和继发的肝纤维化过程中是否发挥作用尚未阐明。ICOSL/ICOS信号与Th细胞的分化与极化密切相关。已有研究表明,该信号通路对Th2、Th17和Tfh细胞的极化具有调节作用,从而影响日本血吸虫病虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理变化的发生和发展。但ICOSL/ICOS信号通路对Th9细胞的极化是否同样发挥调节作用还未见报道。本研究应用日本血吸虫尾蚴感染小鼠建立日本血吸虫病实验动物模型,通过特异性的增强ICOSL/ICOS信号通路观察该通路对Th9细胞分化和极化的影响;以及通过体内和体外实验探索Th9细胞与肝纤维化发生和发展之间的相关性;此外,通过探讨Th9与Th2不同的免疫应答特征,为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化发生的分子机制提供科学依据,为有效控制血吸虫病虫卵肉芽肿病变和抑制纤维化的发生提供新思路。一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中Th9及IL-9的动态变化目的:探讨宿主感染日本血吸虫后Th9细胞增殖分化的特征及其免疫调节作用。方法:应用HE染色法制作病理切片,观察并分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周肝脏虫卵肉芽肿的病理变化趋势;应用免疫组织化学方法观察并检测感染前后不同时期肝脏虫卵肉芽肿周围IL-9和转录因子PU.1的表达水平;应用流式细胞术分析不同感染时期的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞所占的比例;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9的表达水平。结果:HE染色结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第4周出现虫卵肉芽肿,在第7周肉芽肿面积最大,随后逐渐减小;免疫组织化学法结果显示IL-9与PU.I在肝脏虫卵肉芽肿周围的表达水平在感染后4周即显着增加并于第7周达到最高水平,随后缓慢下降;流式细胞术检测结果显示小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞的比例从感染后4周明显增高,感染后7周达到峰值,9-12周逐渐降低;酶联反应吸附法检测小鼠血清中IL-9的表达水平趋势与流式细胞术检测Th9细胞的趋势一致。结论:感染日本血吸虫后,小鼠Th9细胞及IL-9水平明显增加,且动态变化趋势与肝脏虫卵肉芽肿体积的变化趋势一致,表明Th9细胞及其细胞因子IL-9参与了日本血吸虫病的免疫应答并与虫卵肉芽肿的发生发展相关。二、Th9细胞在日本血吸虫病虫卵肉芽肿反应及肝纤维化形成中的作用目的:探讨宿主感染日本血吸虫后,Th9细胞及其细胞因子IL-9在肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的发生发展过程中发挥的作用。方法:1.将18只小鼠随机分为3组:对照组、anti-IL-9组和IgG组。对照组为正常小鼠,anti-IL-9组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且感染后每周两次经腹腔注射100 ug anti-IL-9抗体,IgG组为感染日本血吸虫尾蚴小鼠且每周两次经腹腔注射100 ug IgG抗体。日本血吸虫感染后9周,分别应用流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中Th9细胞的比例,ELISA测定各组小鼠血清中IL-9的浓度,HE染色方法和Masson染色法观察并分析肝脏虫卵肉芽肿的病理变化以及肝脏组织内胶原面积的变化情况。2.采用在体原位肝脏灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前小鼠和日本血吸虫尾蚴感染7周后小鼠的原代HSCs。体外培养24小时后,将HSCs分为对照组和刺激组,对照组在DMEM完全培养基中培养,刺激组在含20ng/ml IL-9的DMEM完全培养基中培养,分别于刺激后的48小时和72小时收集细胞,用Western blotting技术分析检测HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平。结果:感染9周后anti-IL-9组和IgG组小鼠肝脏均出现明显的虫卵肉芽肿性炎症和纤维化病变。但与IgG组相比,体内阻断IL-9后小鼠肝脏脾淋巴细胞中Th9细胞的比例以及血清中IL-9的浓度显着下降,并且肝脏虫卵肉芽肿病变和纤维化程度均明显减轻。体外IL-9诱导实验结果显示,在感染前（0周）和感染后7周,分离的原代HSCs经IL-9体外刺激后α-SMA、Collagen-1、Collagen-Ⅲ蛋白的表达水平均明显高于对照组。结论:Th9/IL-9可促进日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的发生和发展,其调控机制可能是通过激活HSCs来实现的。三、日本血吸虫病免疫病理进程中Th9先于Th2发挥免疫调节作用目的:探讨Th9与Th2细胞在日本血吸虫病免疫病理进程中相互之间的免疫网络调节效应。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染小鼠前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周脾脏CD4+ T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例的变化趋势;应用酶联反应吸附法检测不同感染时期的小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测感染不同时期小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞中IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示小鼠感染日本血吸虫后脾淋巴细胞中Th9细胞的比例从第4周开始明显增高并在7周达到峰值,9-12周逐渐下降。Th2细胞则在感染后持续上升,直到12周达到峰值;ELISA与流式细胞术以及免疫组织化学结果保持一致,在小鼠血清和肝脏组织中IL-9的表达的峰值出现在感染后7周,IL-4表达的峰值则出现在感染后12周。结论:在日本血吸虫病的免疫病理过程中,Th9/IL-9可能比Th2/IL-4更早的发挥免疫调节作用。四、ICOSL/ICOS信号通路在小鼠日本血吸虫病免疫病理进程中对Th9细胞和Th2细胞的调控作用目的:探讨ICOSL/ICOS共刺激信号对小鼠日本血吸虫病致病过程中Th9细胞和Th2细胞分化增值的免疫调控作用。方法:应用流式细胞术检测日本血吸虫尾蚴感染前（0周）以及感染后4周、7周、9周和12周ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Th9细胞和Th2细胞所占的比例;应用ELISA检测不同感染时期ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠血清中细胞因子IL-9和IL-4的表达水平;应用免疫组织化学方法观察并检测不同感染时期的ICOS-Tg小鼠及其野生型小鼠肝脏虫卵肉芽肿IL-9和IL-4的表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠与其野生型小鼠相比,Th9细胞在4周、7周和9周显着增高,Th2细胞在7周和9周明显上调;ELISA结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠血清中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周的表达显着高于感染同期野生型小鼠;免疫组织化学结果显示,日本血吸虫感染后ICOS-Tg小鼠肝脏中IL-9在4周、7周、9周和12周的表达以及IL-4在7周、9周和12周的表达均明显高于同期野生型对照小鼠。结论:上调ICOSL/ICOS信号通路可促进日本血吸虫病免疫应答过程中Th9细胞和Th2细胞的分化和增殖。本研究结果表明:Th9细胞极化在日本血吸虫病免疫病理过程中发挥着重要的作用,Th9细胞及其功能因子IL-9能促进日本血吸虫病肉芽肿和肝纤维化发生和发展。通过特异性的增强或减弱ICOSL/ICOS信号通路可调控Th9细胞的极化,从而为有效控制血吸虫病肉芽肿和肝纤维化病变以及防止晚期肝硬化的发生发展提供新思路。
黄帅钦[6]（2018）在《日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析》文中研究说明血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,全世界范围内有超过2.5亿人感染血吸虫,还有78个国家和地区的将近7.79亿人面临着被感染的危险;据不完全统计每年有超过20万人死于血吸虫病,并造成了巨大的经济损失。湖北钉螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸虫（Schistosomajaponicum）唯一的中间宿主,其在血吸虫病的传播和流行过程当中发挥着不可替代的作用。除此之外,湖北钉螺还可作为一种鱼类吸虫-外睾吸虫（Exorchissp.）的中间宿主,研究发现应用无害的外睾吸虫能够成功地在其媒介钉螺体内对血吸虫幼虫进行生物控制,即钉螺在先感染外睾吸虫之后可以拮抗再入侵的血吸虫幼虫,后进入钉螺体内的血吸虫幼虫发育全部不正常、受阻,并最终全部被杀死。本文首先对血吸虫病疫区江西省星子县鄱阳湖流域进行生物控制资源的初步调查,结果显示在2012-2016年间共解剖野生鲶鱼494条,其中感染外睾吸虫的鲶鱼共有325条,总的感染率约为65.79%,总的平均感染强度为14.21条;在2012-2015年间共检查了 19528粒钉螺,其中外睾吸虫阳性钉螺总数为216粒,感染率约为1.11%,血吸虫阳性钉螺为12粒,感染率约为0.06%。从调查结果可以看出鄱阳湖区鲶鱼外睾吸虫感染率很高,湖北钉螺外睾吸虫的感染率也要远远高于血吸虫的感染率,表明外睾吸虫的资源较为丰富,不仅能为后续的研究提供便利,更为重要的是能够为未来生物控制方法的普及和实施提供支持。鉴于目前在湖北钉螺内在分子和细胞机制等方面研究的文献资料极为匮乏,厦门大学生命科学学院的唐崇惕教授和郭跃博士、上海兽医研究所的林矫矫教授、上海交通大学生命科学学院的乔中东教授以及国家人类基因组南方研究中心的王升跃教授共同合作对四种不同感染情况的湖北钉螺转录组进行测序以及差异表达谱进行分析,我们从中筛选出了一些可能在生物控制过程中有着重要作用的蛋白质分子,例如MIF（Macrophage migration inhibitory factor,巨噬细胞迁移抑制因子）和TRX（Thioredoxin,硫氧还蛋白）等;通过数据分析、文献查阅和实验验证,并结合生物控制过程中所观察到的表型,我们确定了本文中所重点研究的目标分子湖北钉螺MIF,即OhMIF。MIF是一种具有多重功能的细胞因子,在宿主抵抗外来微生物和病原入侵以及免疫细胞促炎症反应中均发挥着重要的免疫调节功能。在本文中,我们根据钉螺转录组中得到的湖北钉螺MIF（OhMIF）全长cDNA序列,成功地从钉螺体内对OhMIF进行了克隆,接下来我们利用点突变以及原核表达系统成功地对重组OhMIF蛋白（rOhMIF）和其突变体OhMIFP2G重组蛋白（rOhMIFP2G）分别进行了表达和纯化,并对其互变异构酶活性进行了测定,结果显示rOhMIF呈现出依赖于第二位脯氨酸（Pro2）的D-多巴胺互变异构酶活性,并且该酶活性能够被哺乳动物MIF特异性抑制剂ISO-1所抑制,表明该结合位点是保守的;除此之外,我们又分别对rOhMIF和rHsMIF（人类MIF重组蛋白）的D-多巴胺互变异构酶活性的动力学常数进行测定和比较分析,结果显示出rOhMIF对底物的亲和力以及催化效率要均低于rHsMIF;接下来,我们通过实验证实rOhMIF还呈现出利用DTT作为还原剂来还原胰岛素的氧化还原酶活性,而哺乳动物MIF则是利用GSH作为还原剂;而且,我们还通过体外注射实验证实rOhMIF和其突变体rOhMIFP2G均能够促进ERK1/2的磷酸化和活化,表明rOhMIF的互变异构酶活性对于该功能的发挥并不是必需的。接下来,我们通过实验证实OhMIF在钉螺各个组织中均有表达,在钉螺血淋巴细胞中定位在细胞质;同时我们还发现当钉螺感染血吸虫之后,OhMIF的表达量有着明显的上调,表明其在钉螺对于血吸虫入侵进行免疫防御过程中可能发挥着重要的作用。为了能够更好地探究OhMIF在钉螺免疫系统中的功能,我们首先根据细胞体积和细胞颗粒密度对钉螺血淋巴细胞进行了较为系统的分类,并采用体外喂食法对OhMIF在钉螺体内的表达量进行敲低;实验结果显示OhMIF敲低之后能够显着地降低吞噬性血淋巴细胞在总的循环性血淋巴细胞中的比例,同时较大体积以及较高颗粒密度血淋巴细胞的比例也呈现出明显的降低趋势,表明OhMIF在血淋巴细胞的成熟和分化过程中具有重要的功能。除此之外,我们还通过实验证实OhMIF能够有效地促进吞噬性血淋巴细胞向着血吸虫感染部位进行迁移。由于我们从上述四种不同钉螺样品的转录组测序和差异表达分析中只是拿到了很少一部分数据,为了以后能够更好、更加深入地进行后续的研究,接下来我们又采用转录组与蛋白质组相结合的方式来探究生物控制作用的内在分子机制。结果显示共得到了 46162条独立的湖北钉螺unigene,利用iTRAQ技术共鉴定到了 3811个蛋白,分别对得到的基因和蛋白进行功能分类和注释分析,并以此作为数据库,对四种不同感染情况钉螺中差异表达的蛋白进行鉴定,然后针对其中我们比较感兴趣的两组差异蛋白进行更进一步的分析,即Common组（146个）和Only组（195个）,经过功能分类与注释分析,找到了一些可能在钉螺免疫防御系统中起着关键作用的蛋白。综上所述,本文基于利用外睾吸虫在钉螺体内对血吸虫进行生物控制的表型、四种不同感染情况钉螺转录组测序和差异表达分析以及MIF的研究进展和功能综述,进而确定了本文所要研究的目标分子-OhMIF。接着我们又对OhMIF进行了鉴定及其生物学活性的测定和分析,发现OhMIF在不同吸虫感染情况钉螺体内以及不同时间血吸虫感染钉螺体内的表达量均呈现出显着的差异;接下来我们又通过实验证实OhMIF在钉螺对于血吸虫先天性免疫反应过程中发挥着重要的作用;同时为了以后更广泛、全面地探究该生物控制过程的内在机制,我们还通过转录组与蛋白质组相结合的方式鉴定出了一些可能在此过程中具有重要作用的差异表达分子。本文是首次对湖北钉螺免疫相关分子进行功能性的探究,相信本文中所采用的方法和手段或许可为以后钉螺中其它关键分子的研究提供模板,本文中的内容也将会有助于更进一步地探究和理解宿主与寄生虫的相互关系。但是由于这些方面研究的信息和材料尚且不足,很多的实验研究仍处于早期的探讨摸索阶段,难免会存在许多不足和短缺之处,我们今后会更加仔细、全面地对钉螺的免疫防御系统展开深入的研究,进一步地了解钉螺与寄生虫之间的相互作用关系,为血吸虫在钉螺体内的生物控制提供更加详细的科学依据。
曹红荣[7]（2013）在《基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用》文中研究指明目的血吸虫病仍然是世界上危害最为严重的寄生虫疾病，由于我国政府的高度重视，我国血吸虫病疫情目前已达到基本控制阶段，传统的病原体直接检测技术已失去了金标准作用，低流行区血吸虫病的诊断遇到了严峻的挑战，提高监测敏感性为导向的低流行区监测技术是当前的重中之重，而血吸虫病的正确诊断是血吸虫病监控的第一步，也是最关键步骤。发展一种简便、经济、敏感和特异，尤其适合现场大规模检测的快速血吸虫病诊断方法，为我国血吸虫病的防控并最终消除提供重要的工具。方法制作日本血吸虫感染动物模型，收集日本血吸虫成虫；制备日本血吸虫成虫抗原（AWA），进行两维电泳（2-DE），再雇佣western-blot方法、用混合的血吸虫感染患者血清筛选，最后用抗人IgG4二抗检测血吸虫成虫抗原中能够与患者血清中IgG4抗体反应的抗原分子。切取这些与患者血清中IgG4结合的抗原分子用胰酶消化，进行质谱鉴定，并进行进一步的生物信息学分析，寻找具有诊断价值的候选分子，并克隆重组候选分子。最后将重组抗原包被反应板，用基于IgG4二抗作为检测工具的ELISA方法，来评估候选抗原在血吸虫病诊断中的应用价值。结果建立了日本血吸虫成虫两维电泳图谱，western-blot结果显示，基于IgG4为检测工具的血清蛋白组学筛选出40多个具有免疫反应性的阳性蛋白点，其中有16个点能够与原始的2-DE凝胶相对应。质谱鉴定结果表明，这16个点分属于10个蛋白质，它们分别是日本血吸虫顺乌头酸酶（SjAA）、热休克蛋白70（SjHSP70）、M2型丙酮酸激酶（SjPKM2）、磷酸甘油酸酯激酶（SjPGK1）、α-L-岩藻糖苷酶（SjALF）、无机焦磷酸酶（SjIPP）、谷胱甘肽转移酶（SjGST）、日本血吸虫21.7kDa抗原（Sj21.7）、22.6kDa膜相关抗原（Sj22.6）和曼氏血吸虫肌浆钙结合蛋白（SmSCP）。通过生物信息学分析，SjIPP具有多种潜在的生物学功能，更重要的是，SjIPP含有丰富的B细胞抗原表位，可能预示，SjIPP在血吸虫病的疫苗开发和诊断应用中具有良好的前景。进一步，我们成功克隆并原核表达出了重组SjIPP（rSjIPP），而且纯化的rSjIPP纯度好，浓度也达到了3.5mg/ml。ELISA结果显示，rSjIPP对急性血吸虫感染诊断的敏感性极高，达到了100%，对慢性血吸虫感染诊断也较高，其敏感性为87.1%，其特异性为95%；可喜的是，与其它寄生虫的交叉反应较低，分别是肺吸虫为3.7%、肝吸虫为4.5%、线虫为4.2%。结论利用IgG4为检测工具的血清蛋白质组学，成功从日本血吸虫成虫中筛选出了SjIPP诊断候选分子，并成功重组出rSjIPP。ELISA结果证明，rSjIPP在血吸虫病的诊断中具有良好的应用前景。
叶芳[8]（2013）在《重组日本血吸虫四跨膜蛋白6（Sj-Tsp6）免疫诊断潜能的初步研究》文中认为目的：为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达并纯化日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白,建立重组抗原间接ELISA方法（rSj-Tsp6-ELISA）诊断日本血吸虫病。方法：设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a（+）表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中并用IPTG对该重组菌诱导表达,诱导表达得到MW为28KD带有HIS标签的重组Sj-Tsp6样融合包涵体蛋白,将其纯化、复性,并且用SDS-PAGE验证表达量和Western blot进行鉴定。复性后的rSj-Tsp6样蛋白包被反应板,确定其最适抗原包被量和血清稀释度,用rSj-Tsp6-ELISA方法检测48份感染日本血吸虫的兔血清的阳性率。结果：PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a（+）,经SDS-PAGE可见一条约28KDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,该融合蛋白为包涵体蛋白,经变性、纯化后,用复性的rSj-Tsp6样蛋白作为抗原做ELISA检测48份感染日本血吸虫的兔血清,感染前的兔血清做为正常对照,结果显示：48份标本中,43份为阳性结果,阳性率为89.6%。结论：本研究扩增克隆了Sj-Tsp6样蛋白基因,并将其与表达载体pET28a（+）;连接,在原核细胞中表达并纯化了Sj-Tsp6样蛋白,用rSj-Tsp6-ELISA方法检测48份感染日本血吸虫的兔血清的阳性率,结果。阳性率为89.6%,并且rSj-Tsp6样蛋白制备简便,成本低廉,方法易于标准化,有可能更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。
胡海燕[9]（2011）在《电化学免疫传感器在血吸虫病诊断中的研究和应用》文中提出血吸虫病是一种分布广,种类多,危害性较为严重的病原体寄生虫病,目前检测血吸虫病的方法主要是传统的免疫分析法,但都需要较为复杂、昂贵的仪器及技术熟练的分析人员。同时因为灵敏度低,仅能用于简单的定性或半定量分析,不能完全适应目前血吸虫病防治工作的需要。为了血吸虫病的早期诊断、预防、治疗,开发研制一种灵敏、简便、快捷的检测方法具有较大意义。电化学免疫传感器本身所具有的灵敏、快速、低成本、低能耗等特点,被广泛应用于各种分子诊断中,主要包括核酸（包括DNA和RNA）的分子诊断、蛋白质的分子诊断和代谢物的分子诊断,并逐渐成为非常有潜力的检测技术之一。本论文探讨了电化学生物传感器在血吸虫病诊断中的研究和应用。首先建立了一种新的电化学免疫传感方法,并将其应用于实际样本的检测。用辣根过氧化物酶（HRP）及新型底物邻-氨基苯酚（O-Aminophenol, O-AP）构建了基于“酶-邻氨基苯酚”体系的电化学免疫传感方法,并用于血吸虫抗体检测。邻-氨基苯酚在辣根过氧化物酶（HRP）催化双氧水（H2O2）时被氧化,生成的产物3-氨基吩恶嗪能通过电化学方法检测。实验结果验证了基于“酶-邻氨基苯酚”的新型蛋白检测体系检测人血清中血吸虫抗体的可操作性,实现了实际样本的检测。并且,采用方波伏安法作为最终检测方法,具有更高的灵敏性。随后设计了一种基于血吸虫抗体检测的多通量电化学免疫传感器。类似酶联免疫检测技术,将捕获探针抗原组装在电极上,待检物靶标蛋白和酶标二抗分别反应后,通过检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流实现检测。本系统可以同时进行16个血清样本的检测。另外,这种快速、灵敏、省时、高效的血吸虫病诊断方法不仅实现了实际样本的检测,还为蛋白的检测创建了一个新的平台。
卢艳[10]（2012）在《日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价》文中研究说明血吸虫病是一种严重危害人类健康和阻碍流行区社会经济发展的寄生虫病。诊断是确定感染的有效手段,在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果,还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病防治效果和评估流行趋势等等,均需要以诊断结果作为评判依据之一。传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为可靠和经典的途径,但费时、费力且敏感性不高,难以适应大规模现场防治的需求。免疫学诊断方法具有较高的敏感性、特异性和实用性等优点,在血吸虫病的监测、防治以及疗效考核等方面具有广泛的应用价值。诊断抗原的筛选和鉴定不仅是免疫学诊断研究的核心内容,并且是建立免疫学诊断方法的基础。本研究利用吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人血清分别筛选成虫、虫卵的cDNA表达文库,寻找可用于日本血吸虫病检测或疗效考核的潜在靶点,初步筛选获得了120个阳性克隆。结合阳性克隆的反应强度、分类和插入片段的大小,将所获的17个阳性克隆的插入片段进行测序,对其DNA序列进行生物信息学分析。根据序列分析的结果,选择了10个目的基因片段进行表达,利用生物信息学软件分析编码蛋白的性质并预测其功能。以阳性克隆SJA4-6、SJA6-5、SJE18-4、SJE20-4、SJE22-1、SJE22-4、SJE28-2和SJE28-6为模板,成功构建了10个含有目的基因的重组质粒（GST tag）,重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后获得了9种融合表达的重组蛋白。其中5个重组蛋白含有可溶性表达组分,4个重组蛋白为包涵体。利用亲和层析的方法对含有重组蛋白的菌体裂解液进行纯化,获得了4种纯度较高的重组蛋白,分别为rSjP1、rSjP2、rSjWSC1P和rSjEFCAB。采用免疫学方法初步评估了所获重组蛋白的免疫诊断价值,以rSjP1、rSjWSC1P和rSjEFCAB为包被抗原的间接ELISA方法可明显区分日本血吸虫病人混合血清和正常人混合血清,病人血清反应的OD值（P）均达到正常人的（N）2.1倍以上,其中重组蛋白rSjEFCAB的P/N值达到3.9,表明该蛋白具有良好的应用前景。建立了以rSjWSC1P和rSjEFCAB作为包被抗原的间接ELISA方法。该方法检测日本血吸虫病人的敏感性分别为72%（36/50）、74%（37/50）；检测非流行区正常人的假阳性率为0-3.3%（0/30-1/30）；与并殖吸虫病人无交叉反应,与囊虫病人、旋毛虫病人的交叉反应率分别为10%（1/10）和11%（1/9）,与华支睾吸虫病人的交叉反应率分别为0（0/5）和20%（1/5）。研究结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性,重组蛋白rSjWSC1P和rSjEFCAB是日本血吸虫病潜在的诊断抗原。同时,本研究还采用免疫沉淀反应分离血吸虫病人血清中的循环抗原,利用质谱和生物信息学软件分析循环抗原的蛋白序列,寻找高丰度的循环抗原分子。鉴于禽类与哺乳类动物的遗传距离较远,来源于禽类的抗体不易发生交叉反应,本研究制备和纯化了抗血吸虫成虫抗原的卵黄抗体（IgY）,并建立了基于免疫沉淀反应（以IgY抗体做为捕捉系统）和蛋白质组学技术鉴定日本血吸虫循环抗原的方法。应用该方法从日本血吸虫病人血清中富集循环抗原,鉴定出7种蛋白组分,为循环抗原的深入研究提供了新的途径；同时为发展基于IgY和循环抗原的血吸虫病早期诊断或疗效考核方法奠定了基础。本研究为日本血吸虫病检测或疗效考核诊断抗原的筛选、鉴定以及发展相应的诊断技术提供了新的科学依据。
二、间凝和快速酶标联合检测血吸虫病的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、间凝和快速酶标联合检测血吸虫病的应用（论文提纲范文）
（1）胞外ATP联合日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫概述 |
| 1.1.1 血吸虫病流行病学调查 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史 |
| 1.1.3 血吸虫感染过程中的宿主免疫反应 |
| 1.2 辐照血吸虫疫苗的研究进展 |
| 1.3 血吸虫表面的嘌呤能信号和免疫调节 |
| 1.4 钙网质蛋白研究概述 |
| 第二章 正常及辐照致弱日本血吸虫童虫ATP释放图式 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 童虫的获得与培养 |
| 2.2.2 检测辐照组和正常组童虫胞外ATP表达含量 |
| 2.2.3 检测辐照组和正常组童虫胞内ATP释放图式 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 辐照组和正常组日本血吸虫童虫胞外ATP释放图式结果 |
| 2.3.2 辐照组和正常组日本血吸虫童虫胞内ATP释放图式结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 胞外ATP联合SjCRT活化小鼠DC的功能鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂及仪器 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 骨髓树突状细胞的培养及磁珠分选 |
| 3.2.2 流式细胞术检测DC表型成熟的情况 |
| 3.2.3 ELISA检测DC功能成熟的情况 |
| 3.2.4 磁珠分选CD4+T与DC共孵育 |
| 3.2.5 CCK-8 法检测CD4+T增殖 |
| 3.2.6 流式细胞术检测CD4+T细胞胞内细胞因子的表达水平 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 流式细胞术检测SjCRT联合ATP诱导的DC表型成熟的情况 |
| 3.3.2 SjCRT联合ATP诱导的DC功能成熟的情况 |
| 3.3.3 CD4+T细胞增殖检测情况 |
| 3.3.4 CD4+T细胞胞内细胞因子的检测表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 胞外ATP联合SjCRT诱导致敏小鼠淋巴细胞反应的研究 |
| 4.1 .实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MTT法检测致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞再刺激后细胞增殖 |
| 4.2.2 流式细胞术检测致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞亚群 |
| 4.2.3 致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞再刺激后细胞胞外细胞因子表达含量测定 |
| 4.2.4 检测混合淋巴细胞再刺激后细胞胞内细胞因子的表达情况 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞再刺激后细胞增殖实验结果 |
| 4.3.2 致敏小鼠脾脏混合淋巴细胞亚群实验结果 |
| 4.3.3 酶联免疫吸附实验检测脾脏混合淋巴细胞胞外细胞因子实验结果 |
| 4.3.4 致敏小鼠混合淋巴细胞再刺激后细胞胞内细胞因子检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测血吸虫病的临床意义（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（3）miR-181b-5p靶向Smad7促进血吸虫病肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 研究报告 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 Roles of miRNAs in the pathogenesis, diagnosis and treatment of hepatic fibrosis in schistosomiasis |
| References |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫的杀伤作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 日本血吸虫尾蚴性别鉴定 |
| 1.3.2 DW-3-15体外对日本血吸虫成虫的杀伤作用 |
| 1.3.3 DW-3-15体外对日本血吸虫童虫的杀伤作用 |
| 1.3.4 DW-3-15对日本血吸虫成虫、童虫杀伤效果的比较 |
| 1.3.5 DW-3-15作用日本血吸虫的形态变化 |
| 1.3.6 DW-3-15对日本血吸虫成虫体表超微结构影响的扫描电镜观察 |
| 1.3.7 DW-3-15体外对合抱成虫产卵的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体内抗日本血吸虫的生物学效应 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DW-3-15体内抗日本血吸虫成虫的生物学效应 |
| 2.3.2 DW-3-15体内抗日本血吸虫童虫的生物学效应 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 吡喹酮衍生物DW-3-15体内作用后日本血吸虫成虫的TMT蛋白质组学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.2 日本血吸虫成虫蛋白总体分析 |
| 3.3.3 DW-3-15作用日本血吸虫成虫表达的差异蛋白分析 |
| 3.3.4 差异蛋白的GO注释 |
| 3.3.5 差异蛋白的KEGG分析 |
| 3.3.6 差异蛋白的聚类分析 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 日本血吸虫组蛋白乙酰转移酶(SjHAT)多克隆抗体制备及DW-3-15体内对成虫SjHAT的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SjHAT生物信息学分析 |
| 4.3.2 重组质粒petB2M-SjHAT的原核表达 |
| 4.3.3 抗SjHAT多克隆抗体效价及rSjHAT诱导的特异性IgG抗体检测 |
| 4.3.4 DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT蛋白表达水平分析 |
| 4.3.5 DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 缩写词表 |
| 附录二 常用试剂的配制 |
| 综述 抗血吸虫新药研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（5）ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠免疫病理过程中TH9及IL-9的动态变化 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、TH9细胞在日本血吸虫病肝纤维化中的作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 三、日本血吸虫病免疫病理进程中TH9先于TH2发挥免疫调节作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 四、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠免疫病理进程中对TH9细胞和TH2细胞的调控作用 |
| (一) 主要试剂与材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 常用试剂的配置 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（6）日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血吸虫病与血吸虫 |
| 1.2 日本血吸虫 |
| 1.2.1 日本血吸虫的生活史 |
| 1.2.2 日本血吸虫的形态结构 |
| 1.2.3 日本血吸虫病的症状 |
| 1.2.4 中国血吸虫病的流行趋势及防治情况 |
| 1.3 湖北钉螺 |
| 1.3.1 湖北钉螺的分布及分类 |
| 1.3.2 湖北钉螺的形态结构及发育 |
| 1.4 外睾吸虫及其生活史 |
| 1.5 日本血吸虫幼虫在钉螺体内的生物控制 |
| 1.6 转录组比较分析湖北钉螺MIF (OhMIF)的差异表达 |
| 1.7 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的研究进展 |
| 1.7.1 MIF的发现 |
| 1.7.2 MIF的结构 |
| 1.7.3 MIF的生物学功能 |
| 1.8 立题背景及依据 |
| 第二章 鄱阳湖区生物控制资源初步调查及湖北钉螺MIF的鉴定与序列分析 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鄱阳湖区野生鲶鱼外睾吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.2 鄱阳湖区钉螺外睾吸虫及血吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.3 OhMIF在四种不同感染情况钉螺中表达情况的验证 |
| 2.3.4 OhMIF的编码序列及理化性质分析 |
| 2.3.5 OhMIF多重序列比对及分析 |
| 2.3.6 OhMIF系统进化树的构建与分析 |
| 2.3.7 OhMIF的结构预测及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 湖北钉螺MIF细胞因子生物学活性的检测与分析 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 湖北钉螺总RNA的提取 |
| 3.3.2 OhMIF基因的克隆以及原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 OhMIF基因的原核诱导表达、纯化及浓缩 |
| 3.3.4 重组OhMIF蛋白多巴胺互变异构酶活性初步测定 |
| 3.3.5 氨基酸位点特异性突变 |
| 3.3.6 N端脯氨酸对于重组OhMIF多巴胺互变异构酶活性是必需的 |
| 3.3.7 ISO-1可有效地抑制重组OhMIF多巴胺互变异构酶的活性 |
| 3.3.8 重组OhMIF多巴胺互变异构酶动力学常数的测定 |
| 3.3.9 重组OhMIF氧化还原酶活性的检测 |
| 3.3.10 OhMIF抗血清的制备与纯化 |
| 3.3.11 互变异构酶活性对于OhMIF促进ERK1/2信号通路的活化并不是必需的 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 OhMIF在日本血吸虫感染不同时期的表达量变化 |
| 4.3.2 OhMIF在湖北钉螺体内的组织分布 |
| 4.3.3 OhMIF在湖北钉螺血淋巴细胞中的表达与定位 |
| 4.3.4 dsRNA介导的OhMIF表达水平的敲低 |
| 4.3.4.1 OhMIF dsRNA的合成 |
| 4.3.4.2 OhMIF表达水平的敲低及检测 |
| 4.3.5 湖北钉螺血淋巴细胞的鉴定与分类 |
| 4.3.5.1 基于血淋巴细胞的体积进行分类 |
| 4.3.5.2 基于血淋巴细胞的颗粒密度进行分类 |
| 4.3.6 敲低OhMIF表达水平能明显减少吞噬性血淋巴细胞的比例 |
| 4.3.7 OhMIF在血淋巴细胞的成熟与分化过程中起着重要的作用 |
| 4.3.8 OhMIF能够促进血淋巴细胞对日本血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.3.8.1 OhMIF在湖北钉螺体内能够促进血淋巴细胞向血吸虫感染部位的迁移 |
| 4.3.8.2 OhMIF能够在体外促进血淋巴细胞向血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 湖北钉螺转录组和蛋白质组相结合鉴定生物控制血吸虫过程中差异表达的分子 |
| 5.1 实验目的 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 阴性湖北钉螺转录组分析 |
| 5.3.1.1 湖北钉螺原始转录组测序数据统计 |
| 5.3.1.2 转录组数据的从头组装 |
| 5.3.1.3 转录组数据基因注释信息统计 |
| 5.3.1.4 转录组数据基因功能注释结果分析 |
| 5.3.2 四种不同感染况钉螺全蛋白的完整性鉴定 |
| 5.3.3 利用iTRAQ技术对钉螺蛋白质组的测定与质量评估 |
| 5.3.3.1 肽段匹配误差分布 |
| 5.3.3.2 钉螺蛋白质鉴定的基本信息 |
| 5.3.4 iTRAQ蛋白质组学全谱分析 |
| 5.3.4.1 GO功能分类注释分析 |
| 5.3.4.2 KOG功能注释分类分析 |
| 5.3.4.3 KEGG注释通路分类分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的鉴定与分析 |
| 5.3.5.1 差异表达蛋白统计 |
| 5.3.5.2 差异表达蛋白功能注释分析 |
| 5.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 附录1 图表索引 |
| 附录2 缩略语及中英文对照 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 前言 1. |
| 材料与方法 1.1 |
| 实验材料 1.2 |
| 实验方法 2. |
| 结果 2.1 |
| AWA |
| 抗原浓度 2.2 |
| AWA |
| 的血清蛋白质组学分析 2.3 |
| 免疫反应性抗原的质谱鉴定 2.4 |
| SjIPP |
| 生物信息学分析 2.5 |
| SjIPP |
| 克隆、表达及鉴定 2.6 |
| rSjIPP |
| 的诱导表达 2.7 |
| rSjIPP |
| 的免疫学鉴定 2.8 |
| rSjIPP |
| 纯化 2.9 |
| rSjIPP |
| 在血吸虫病诊断中的评估 3 |
| 讨论 4 |
| 结论 参考文献 个人简历 致谢 综述 参考文献 |
（8）重组日本血吸虫四跨膜蛋白6（Sj-Tsp6）免疫诊断潜能的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 个人简介 |
| 附录二 致谢 |
| 附录三 日本血吸虫病免疫诊断研究进展 |
| 参考文献 |
（9）电化学免疫传感器在血吸虫病诊断中的研究和应用（论文提纲范文）
| 图表目录 |
| 符号与缩略语说明 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 血吸虫病概述 |
| 1.3 血吸虫病的诊断方法 |
| 1.3.1 环卵沉淀试验(COPT) |
| 1.3.2 间接荧光试验(IFT) |
| 1.3.3 间接血球凝集实验(IHA) |
| 1.3.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.3.5 电化学免疫传感器 |
| 1.4 电化学免疫传感器的应用 |
| 1.4.1 电化学免疫传感器的分类 |
| 1.4.2 电化学免疫传感器中抗体(抗原)固定方法 |
| 1.4.3 电化学免疫传感器检测技术 |
| 1.4.4 电化学生物传感器在微生物检测中的应用 |
| 1.4.5 电化学生物传感器在血吸虫病检测中的应用 |
| 1.4.6 电化学生物传感器的前景展望 |
| 1.5 本论文的研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于"酶-邻氨基苯酚"体系的电化学免疫传感方法及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器、材料和试剂 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 实验原理及设计 |
| 2.3.2 基于"酶-邻氨基苯酚"的电化学免疫传感方法的构建 |
| 2.3.3 基于"酶-邻氨基苯酚"的电化学免疫传感方法的应用 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于多通道电化学免疫传感器的血吸虫抗体检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器、材料和试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 实验原理及体系建立 |
| 3.3.2 多通道电化学免疫传感器可行性测试 |
| 3.3.3 组装抗原的选择 |
| 3.3.4 选择最佳封闭液 |
| 3.3.5 选择最佳的二抗稀释度 |
| 3.3.6 反应时间对实验的影响 |
| 3.3.7 实际样本的检测 |
| 3.3.8 ELIES和ELISA相比较 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（10）日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 血吸虫及血吸虫病 |
| 1.2 血吸虫的种类及分布 |
| 1.3 日本血吸虫的形态与生活史 |
| 1.4 血吸虫病的发病机制 |
| 1.4.1 血吸虫尾蚴所致的损害 |
| 1.4.2 血吸虫童虫所致的损害 |
| 1.4.3 血吸虫成虫所致的损害 |
| 1.4.4 血吸虫虫卵所致的损害 |
| 1.5 血吸虫病免疫诊断方法的研究进展 |
| 1.5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.2 酶联免疫印迹技术(ELIB) |
| 1.5.3 胶体染料试纸条法(DDIA) |
| 1.5.4 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) |
| 1.5.5 免疫传感技术 |
| 1.6 血吸虫病免疫诊断抗原的研究进展 |
| 1.6.1 天然抗原 |
| 1.6.2 组分抗原 |
| 1.6.3 重组抗原 |
| 1.6.4 模拟抗原 |
| 1.6.5 循环抗原 |
| 1.7 小结 |
| 1.8 选题的目的、意义 |
| 1.9 实验设计方案 |
| 第2章 日本血吸虫cDNA表达文库的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 cDNA表达文库 |
| 2.2.2 血清 |
| 2.2.3 菌株 |
| 2.2.4 主要试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 筛库血清的处理 |
| 2.3.2 λZAPⅡcDNA表达文库的免疫筛选 |
| 2.3.3 阳性噬菌体删除环化为pBluscript重组质粒 |
| 2.3.4 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.3.5 序列分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 cDNA表达文库的免疫学筛选 |
| 2.4.2 阳性噬菌体删除环化为pBluescript重组质粒 |
| 2.4.3 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.4.4 序列分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 日本血吸虫抗原基因的克隆、表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 阳性克隆 |
| 3.2.2 载体与菌株 |
| 3.2.3 主要试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白溶解性鉴定 |
| 3.3.4 重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 重组蛋白浓度测定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.4.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.4.3 重组蛋白溶解性的鉴定 |
| 3.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.5 重组蛋白浓度测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 日本血吸虫4种重组蛋白诊断价值的初步评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 重组蛋白 |
| 4.2.2 血清 |
| 4.2.3 主要试剂和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 间接ELISA试验条件的优化 |
| 4.3.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性试验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 间接ELISA试验条件优化 |
| 4.4.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性 |
| 4.4.3 间接ELISA方法检测血清抗体的特异性 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 日本血吸虫循环抗原的富集、鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 寄生虫 |
| 5.2.3 血清 |
| 5.2.4 主要试剂和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 日本血吸虫成虫的收集 |
| 5.3.2 成虫抗原的制备 |
| 5.3.3 抗成虫抗原IgY抗体的制备 |
| 5.3.4 IgY抗体的分离、纯化 |
| 5.3.5 IgY抗体效价的测定 |
| 5.3.6 IgY抗体的Western Blotting分析 |
| 5.3.7 免疫沉淀反应 |
| 5.3.8 循环抗原的质谱鉴定分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 成虫抗原的制备 |
| 5.4.2 IgY抗体的制备、纯化 |
| 5.4.3 IgY抗体的效价 |
| 5.4.4 IgY抗体的Western Blotting结果 |
| 5.4.5 免疫沉淀反应 |
| 5.4.6 质谱鉴定结果 |
| 5.5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及申请专利 |
四、间凝和快速酶标联合检测血吸虫病的应用（论文参考文献）
- [1]胞外ATP联合日本血吸虫钙网质蛋白免疫生物学功能的初步研究[D]. 刘飞. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]血吸虫循环抗原联合虫卵抗体检测血吸虫病的临床意义[J]. 孙爱平. 基层医学论坛, 2020(10)
- [3]miR-181b-5p靶向Smad7促进血吸虫病肝纤维化作用及机制研究[D]. 张建强. 长江大学, 2020(04)
- [4]吡喹酮衍生物DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应及作用机制研究[D]. 王小莉. 苏州大学, 2019(06)
- [5]ICOSL/ICOS信号调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制[D]. 战廷正. 苏州大学, 2019(06)
- [6]日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析[D]. 黄帅钦. 厦门大学, 2018(08)
- [7]基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用[D]. 曹红荣. 安徽医科大学, 2013(05)
- [8]重组日本血吸虫四跨膜蛋白6（Sj-Tsp6）免疫诊断潜能的初步研究[D]. 叶芳. 安徽医科大学, 2013(02)
- [9]电化学免疫传感器在血吸虫病诊断中的研究和应用[D]. 胡海燕. 南京农业大学, 2011(06)
- [10]日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价[D]. 卢艳. 华东理工大学, 2012(09)