一、朊病毒和疯牛病中蛋白自由基化学问题的探讨（论文文献综述）
苏畅[1]（2021）在《功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造》文中提出角蛋白（Keratin）作为一种天然生物材料,具有良好的生物相容性与生物可降解性,在组织工程材料领域表现出广阔的应用前景。角蛋白酶（Keratinase）因具备独特的高效降解角蛋白纤维的特性,可有效提取毛发中的可溶性功能角蛋白,在角蛋白质资源的生物降解与角蛋白生物材料制备方面具有重要的研究价值与应用潜力。鉴于角蛋白酶的产量低和稳定性差是限制其工业化应用的主要原因,本研究以高效生产角蛋白酶及改善其热稳定性为目标,首先通过前导肽工程和启动子工程改造策略实现角蛋白酶的高效表达,进而应用计算机辅助设计与分子进化相结合的方法提高角蛋白酶的热稳定性;并以该角蛋白酶为催化剂,探索羊毛角蛋白的生物制备工艺,主要研究结果如下:（1）利用前导肽工程改造提高角蛋白酶的活性前导肽作为分子内伴侣,能够有效指导成熟酶的正确折叠以及活性构象的形成。本研究通过对重组Bacillus subtilis角蛋白酶Ker Bp的前导肽区域进行逐段截短,证明前导肽全长对成熟酶的表达具有至关重要的作用。通过对前导肽切割位点（P1）的氨基酸进行替换,发现芳香族疏水氨基酸苯丙氨酸有利于前导肽的切割,突变体Y（P1）F使角蛋白酶活性提升了1.7倍。另外,基于同源序列比对,对前导肽序列中非保守位点进行定点突变,获得6个酶活性显着提升的突变体,其中I（62）K突变体使角蛋白酶活性提高约2.2倍。进一步对上述6个位点构建饱和突变体文库,经过3轮有效筛选获得15个活性超过800 U·m L-1的突变体,其中突变体M7的酶活可达到1114 U·m L-1,较野生型提高6倍。（2）通过启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程研究发现随着活性和产量的提升,角蛋白酶对菌体内源性蛋白表现出降解能力,影响了B.subtilis宿主细胞正常的生长过程,导致菌体及产酶量的减少。本研究采用启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程,发现通过菌体密度依赖型启动子Papr E代替组成型启动子PHpa II,使产酶生物量获得提升,最高菌浓(OD600 nm)从8提高到10;酶活最高可达到2300 U·m L-1,是使用组成型启动子的2倍。通过对启动子的拷贝数进行优化,获得了重组菌角蛋白酶活性最高的二串联体启动子Papr E-Papr E,酶活可达3080U·m L-1。将启动子的-10区和-35区序列突变为σ因子识别的保守序列,进一步使酶活提高到3500 U·m L-1。另外,对培养基的碳源进行优化,促进了菌体的生长与积累,结果表明添加2%的葡萄糖能够延长菌体的生长时间,最大菌浓可达到15.6。同时产酶量也随着菌体生长时间的延长而增加,培养84 h后达到峰值4200 U·m L-1。（3）借助计算机辅助策略改造关键Loop区域提高角蛋白酶热稳定性角蛋白酶的热稳定性是其在高温下高效降解羊毛纤维等角蛋白质资源的先决条件,本研究基于计算机辅助设计与蛋白质工程改造相结合,提升角蛋白酶Ker Bp的热稳定性。通过计算机辅助计算与分析,预测了角蛋白酶Ker Bp的3段高柔性Loop以及一个与钙离子结合相关的Loop,并定位了其中对稳定性贡献较小的氨基酸残基。另外,基于同源序列比对分析,将Ker Bp序列中出现的“低频氨基酸”残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。共构建了65个单点突变体,采取虚实结合的筛选策略,在保持酶活的基础上,获得了6个热稳定性提升的突变体,进一步通过组合突变构建获得6个位点的协同改造突变体,使角蛋白酶在60℃下的失活半衰期从17.3 min提高至66.1 min,并且最适反应温度从40℃提高至60℃。（4）利用角蛋白酶对羊毛纤维的可控降解制备大分子功能角蛋白角蛋白是性能卓越、极具应用潜力的生物材料,但由于天然的角蛋白结构紧密、可溶性差,难以直接作为生物材料进行应用。而采用化学法制备角蛋白通常会破坏分子上的活性基团,因此探索大分子、可溶性角蛋白的酶法制备具有重要意义。本研究利用自主开发的角蛋白酶水解废弃羊毛,制备出主要分子量约为45 k Da和28 k Da的可溶性角蛋白,其羊毛溶解率达68.1%,角蛋白提取率为33.7%。详细考察了羊毛的酶解过程,发现角蛋白酶能够从羊毛纤维的鳞片层进行逐层水解,最终实现羊毛复杂结构的破坏及溶解,通过对过程条件的控制,能够提取获得大片段可溶性羊毛角蛋白。体外评价结果显示,该角蛋白提取物具有良好的生物相容性,表现出明显的促细胞增殖和迁移的作用,并且具有较强的抗氧化性。为探索角蛋白提取物在生物组织材料领域的应用,研究利用角蛋白自组装特性制备获得水凝胶;小鼠成纤维细胞的体外培养实验结果表明该角蛋白凝胶具有良好的生物相容性,可作为细胞生长的支架材料。小鼠体内伤口促愈实验探究表明其能够通过促进成纤维细胞的增长和迁移以及加速形成新生血管和胶原沉积达到促进伤口修复的效果,证明该角蛋白水凝胶是一种优良的伤口敷料。
张祥毅[2]（2020）在《朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系》文中研究说明正常构象朊蛋白（PrPC）错误折叠后成为朊病毒(PrPSc),这个构象转变过程被认为是朊病毒疾病最基本的致病因素,但其潜在的分子机制至今仍不清楚。PrPC是一种利用C端磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol anchor,GPI anchor）锚定于神经细胞膜“脂筏”区（Lipid raft）,并广泛表达的糖蛋白。已知PrPC与细胞膜脂质体有相互作用,该作用能改变PrPC结构的稳定性。近期研究表明,朊蛋白近N端阳性电荷区（23-28氨基酸位点,CC1）可以促进朊病毒疾病的发展;而以不同株系的野生型朊病毒感染八肽重复区（51-90氨基酸位点,OR）敲除的转基因鼠,会造成宿主两极化的朊病毒疾病发病进程,例如RML-prion会促进敲除鼠的疾病进程,而BSE-prion则延缓疾病进程;因此本文将从上述的两个蛋白质区域着手,探讨朊蛋白N端与脂质体的相互作用对构象转变的影响,以及对朊病毒疾病发生发展的影响。为了探索CC1区在朊蛋白构象转变过程中所起的作用,我们首先制备两种CC1区的重组朊蛋白（recombinant PrPC,rec PrPC）,其中之一是移除该区域氨基酸序列上全部正电荷的Met4-1突变体,另一种则是删除该区域全部氨基酸序列的ΔN6突变体。通过不同的体外生物实验测定,我们发现相较于WT的构象转变能力,Met4-1及ΔN6这两种突变体的转变能力下降,但均能形成蛋白酶K（PK）抗性构象（r PrP-res）,且所有rec PrPSc对野生型小鼠C57BL/6j均具有致病性,造成100%小鼠死亡率;但相较于WT-rec PrPSc诱导的致病小鼠,ΔN6-rec PrPSc显着地延长了小鼠生存期,而Met4-1-rec PrPSc却显着地缩短了生存期,这种不一致的现象很可能是因为三种rec PrPSc各自有不同的构象,从而导致不同的传播与神经毒性模式。其次,我们藉由分析在rec PrPC构象转变过程中CC1区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,证明了CC1区主要通过增强静电作用力与POPG相互作用,促进PrP构象转变;因此CC1区在疾病中可能扮演促进PrP构象转变,加重神经病理损伤的角色。为了进一步了解OR区在朊蛋白构象转变过程中所起作用,我们制备了OR区氨基酸序列全删除的重组朊蛋白ΔOR突变体。通过一轮sPMCA体外扩增,WT-和ΔOR-rec PrPC均能被诱导为具PK抗性的r PrP-res,相较于WT的构象转变能力,ΔOR的转变能力显着上升。其次,我们利用CRISPR-Cas9技术构建的Prnp-ΔOR+/-小鼠自交后代进行朊病毒疾病造模后,发现随着小鼠PrPC-ΔOR表达量逐渐递增（WT<Heter<ΔOR）,其朊病毒疾病模型小鼠的生存期越长,脑组织中PrPSc沉积越少以及神经损伤越轻。接着我们分析在rec PrPC构象转变过程中OR区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,发现OR区主要通过减弱疏水作用力与POPG相互作用,阻碍PrP构象转变;藉此产生构象转变效率下降但却有更强神经毒性的PrPSc。本研究的实验结果阐明了CC1区和OR区在PrPC转变为PrPSc中扮演了不同的角色,也为朊病毒致病进程的分子机制提供了崭新的思路。
严普[3]（2019）在《朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用》文中研究表明朊病毒（Prion Disease,PrD）,又称为可传播性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE）,是一种侵袭人类及其他哺乳动物中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的传染性、神经退行性疾病,具有潜伏期长和100%致死率的特点。目前人类朊病毒病主要分为:克-雅病（Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD）、库鲁病（Kuru）、吉斯特曼-施特劳斯综合症（Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS）和致死性家族型失眠症（Fatal Familial Insomnia,FFI）,以CJD最为常见。CJD又可分为散发型（sCJD）、医源型（iCJD）、家族或遗传型（fCJD or gCJD）及变异型克-雅病（vCJD）。目前临床检测方法有对患者脑组织进行活检,通过检测血液中PRNP基因突变情况判断遗传型克-雅病,以及检测sCJD患者脑脊液中14-3-3蛋白含量的升高来辅助疾病的诊断。脑组织活检对病人身体损伤极大,根据血液中PRNP基因是否突变只可判断遗传型克-雅病,存在很大局限性,而脑脊液中14-3-3蛋白的检测则特异性不强。因此,临床急需有效的朊病毒病诊断方法。微管由微管蛋白和微管相关蛋白（tau蛋白）组成,其中tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,微管系统是神经细胞骨架成分,可参与多种细胞功能。研究证明,tau蛋白与多种神经性疾病存在紧密联系,并在朊病毒病患者及啮齿动物模型脑组织中明显升高,其中含外显子2（tau-exon 2）和外显子10（tau-exon 10）的特异型tau蛋白占总tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并应用于不同类型的朊病毒病患者脑脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10质粒的原核菌体表达出目的蛋白GST tau-exon 2/10,测定目的蛋白浓度,GST tau-exon 2蛋白浓度为0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白浓度为0.473μg/μL,制备单克隆抗体。制备完成的GST tau-exon 2蛋白单克隆抗体编号为1-4（1.8 mg/mL）,4-1（1.7 mg/mL）,GST tau-exon 10蛋白单克隆抗体编号为6-4（2.6 mg/mL）,5-6（1.8 mg/mL）。用已制备的小鼠单克隆抗体使用蛋白免疫印迹方法分别检测GST tau-exon 2/10蛋白,证明所制备抗体特异性,使用蛋白免疫印迹方法在神经细胞模型和小鼠脑组织分别检测tau蛋白证明抗体敏感性。使用已制备的抗体建立更强敏感性的双抗夹心ELISA方法,最终GST tau-exon 2/10蛋白特异性单克隆抗体双抗夹心ELISA方法的条件确定如下:包被抗体H-150浓度为8μg/ml,检测抗体GST tau-exon 2（1-4）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 2（4-1）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10（6-4）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10（5-6）蛋白鼠源单克隆抗体的工作浓度分别选定为1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗稀释比例为1:5,000。应用已建立好的双抗夹心ELISA法对包括sCJD、GSS、FFI、T188K位点突变的gCJD及非CJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量进行检测,结果显示sCJD患者脑脊液中含外显子2的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有极显着统计学差异（p<0.001）,sCJD患者脑脊液中含外显子10的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有显着统计学差异（p<0.01）。T188K位点突变的gCJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者明显增高,具有显着统计学差异（p<0.01）。而GSS和FFI患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者无明显差异,无统计学差异（NS）。本研究建立的特异性tau蛋白双抗夹心ELISA方法可以有效的检测出不同类型朊病毒患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平变化,为朊病毒病的检测提供有效的检验方法并对朊病毒病的机制研究提供理论依据。
宣红霞[4]（2016）在《分子动力学模拟研究铜离子对胰蛋白酶清除自由基能力的影响》文中研究说明胰蛋白酶（Trypsin,TP）是一种典型的蛋白质水解酶,由大小相等的两个桶状结构域A和域B组成,域A中的β-折叠、S1口袋、Loop1和Loop2是其特征性结构。研究发现铜离子对蛋白构象的影响主要表现在铜离子结合蛋白后,能使蛋白的无规则卷曲或者α-螺旋结构转变为规整的β-折叠或者向β-折叠片的方向聚集。铜离子能显着影响蛋白活性部位处的构象,使蛋白构象更紧凑。本实验室通过前期的分子生物学实验发现:胰蛋白酶具有清除自由基的能力,且铜离子对其清除能力有影响。考虑到铜离子对蛋白构象的影响,我们通过分子动力学方法探究铜离子与胰蛋白酶的相互作用,期望从分子层面揭示铜离子对胰蛋白酶清除自由基能力的影响及作用机制。本论文模建了胰蛋白酶结构,包括空载胰蛋白酶、Cu（Ⅱ）-胰蛋白酶和抑制剂-胰蛋白酶三维结构。运用分子动力学模拟方法对三个体系进行动力学模拟。通过体系稳定性分析、溶剂可及表面积的疏水性分析和蛋白分子内主成分分析等,尤其是域A中β-折叠的氢键分析,结果发现（1）铜离子使胰蛋白酶的回转半径变小,胰蛋白酶分子结构更紧密;（2）铜离子使胰蛋白酶的溶剂可及表面积增大,疏水相互作用增多,氨基酸之间的接触数增多;（3）铜离子使胰蛋白酶的活性中心S1口袋内合,氨基酸相关关系增多,构象更紧凑;（4）铜离子使域A中的β-折叠形成的氢键作用增多,β-折叠更规整。氨基酸226Gly、227Val、229Thr、214Ser、160Ala、135Gln、20Tyr、155Leu和156Lys在β-折叠的氢键形成中起关键作用。综上所述,铜离子的存在显着改变了胰蛋白酶的构象,使胰蛋白酶的活性增强,从而提高胰蛋白酶清除自由基的能力。这为研究金属离子对蛋白构象影响及金属离子对蛋白的抗氧化作用提供理论依据,期望为发展一种新的清除自由基的途径和方法提供理论支持。
王婷婷[5]（2015）在《脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究》文中研究表明目的朊病毒病（又称可传播性海绵状脑病,TSEs）是一种能够感染人和其他多种哺乳动物的中枢神经系统性疾病,它典型的神经病理学特征主要有脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和星形胶质细胞增生。BDNF是具有防止神经元死亡功能的特殊蛋白质,BDNF及其受体TrkB在中枢神经系统分布广泛,对神经元的成长、发育、分化和机体损伤修复都具有重要的作用。为了探讨BDNF和TrkB在朊病毒病中可能的变化,我们以朊病毒株—羊瘙痒因子263K颅内感染的仓鼠脑组织以及朊病毒稳定感染的细胞系作为研究对象,以观察BDNF和TrkB在朊病毒感染期间的表达变化,并深入探讨其可能发挥的作用。方法（1）颅内接种羊瘙痒因子263K感染的仓鼠终末期（80天）脑组织、接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织以及朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞中,采用Western Blot方法和免疫组织化学方法检测BDNF和TrkB蛋白的表达水平变化。（2）进一步研究BDNF和TrkB与神经元及PrPSc在感染朊病毒的脑组织和细胞中是否存在作用关系,利用免疫荧光化学双重染色法检测BDNF和TrkB在仓鼠脑组织中的表达分布变化。（3）应用Western Blot和免疫组织化学方法检测颅内接种羊瘙痒因子263K感染的仓鼠终末期（80天）脑组织、接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织、朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞中BDNF下游作用分子p-TrkB、GRB2和p75NTR的表达水平变化,探讨BDNF在朊病毒病中的相关作用机制,探索BDNF-TrkB信号通路的改变在朊病毒病中的作用。结果经Western Blot方法检测显示结果,首次提出了在可传播性海绵状脑病终末期BDNF和TrkB以及下游的作用分子的表达量均显着降低,提示BDNF可能参与TSEs的发病。免疫荧光结果显示BDNF主要与神经元细胞共定位表达,与星形胶质细胞不表达。仓鼠接种感染期不同时间点脑组织样本中BDNF表达量随感染时间延长而逐渐下降,而相互作用的受体TrkB,尤其是磷酸化的TrkB（p-TrkB）随着时间的依赖性也均有递减的下降趋势,这样的下降趋势与神经元的丢失类似。相反,与在体内试验结果不同的是,BDNF和TrkB及其下游的作用分子在朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞及其治愈型正常表达细胞系SMB-PS细胞中的表达量相比并无显着性差异。结论综上所述,我们通过Western Blot,免疫组织化学,免疫组织荧光等一系列实验方法验证了在朊病毒感染的仓鼠脑组织中,BDNF及其相关受体TrkB的表达量均有显着的降低。实验数据表明BDNF的功能及其相关的信号通路的改变在感染朊病毒病动物的大脑中起着至关重要的作用,这可能与大量的神经元丢失有紧密联系,是值得我们进一步探讨和研究的。
梅芳华[6]（2014）在《牛、鼠、兔朊蛋白理化性质比较及朊蛋白的互作蛋白KCTD1的分析》文中认为朊病毒作为一种蛋白侵染因子,导致了人和动物一系列的传播性海绵状脑病（TSE）,如人的库鲁病（Kuru）、吉斯综合症（GSS）、致死性家族失眠病（FFI）、克雅氏病（CJD）以及动物的疯牛病和羊瘙痒病等。这些进行性神经退化疾病的最终结果是朊蛋白（PrP）的结构发生变异,在脑组织中致病型朊蛋白（PrPsc）感染性颗粒大量聚集,到目前为止,两种朊蛋白的结构转变机制尚不清楚。TSE疾病对人和动物健康造成了重大威胁,并影响农业的发展,对我国的牛羊进行筛查,有助于对朊病毒疾病进行监控防范。用自制抗朊蛋白抗体对新疆地区的牛、羊进行检测,尚未发现中国有疯牛病及羊瘙痒病,提示中国的牛羊相对健康。目前人们己获得40多个种属的朊蛋白一级结构序列,同源性较高,在85%以上。兔是至今尚未发现感染TSE的少数几个种属之一。朊病毒在物种之间的传播具有种间障碍性（species barrier）。目前认为种属特异性是由于蛋白质一级结构上少数氨基酸的差异,造成三维构象上的不同,进而导致蛋白质功能域空间结构、氢键、稳定性等发生改变,影响分子间的相互作用,最终影响到朊病毒病在不同种属之间的传播。对兔朊蛋白进行的系列研究较少,理化性质尚不明确。为了进一步揭示兔抗TSE疾病感染的机制,有必要对其理化性质及稳定性进行探讨。鼠和兔的成熟PrPc一级结构同源性为87%,共有22个氨基酸不同。分析、比较兔肌蛋白（23-228aa）与牛朊蛋白（25-242aa）、鼠朊蛋白（23-230aa）酸性环境下理化性质的差异,有助于揭示兔抗传播性海绵状脑病感染的分子机制。本研究首先克隆、表达并纯化三种重组朊病毒成熟蛋白（兔朊蛋白及牛朊蛋白、鼠朊蛋白）,然后通过圆二色谱、荧光光谱等实验测试三种蛋白的二级结构特点、热稳定性、耐酸性,并比较了在酸性条件下聚集的程度及抗蛋白酶K消化能力的区别。理化实验表明,相对牛朊蛋白、鼠朊蛋白来说,兔朊蛋白的Tm值较高,说明兔朊蛋白的热稳定性更高。在酸性条件下,三种蛋白质的二级结构随着pH值的降低发生变化,但兔朊蛋白随pH值降低结构变化较慢,相对耐酸。通过外源荧光ANS实验也证明,兔朊蛋白的结构在酸性环境中也相对稳定,对酸变性更耐受。在酸性环境中,部分变性剂存在时,三种朊蛋白都可形成聚集,也都具有部分抗蛋白酶K消化的能力,相对而言,兔朊蛋白形成的聚合物略少,更易蛋白酶K消化。从蛋白层面上,揭示了兔这一物种不易感染可传播性海绵状脑病（TSE）的可能机制,也将有助于理解TSE的发生机制。在体外证明朊蛋白与钾离子通道蛋白1（KCTDl）有高亲和力,研究了KCTDl的功能及不同物种PrP蛋白与KCTDl结合能力的差异,对揭示疯牛病的传播及其致病机制将有重要意义。本研究克隆表达纯化了KCTDl蛋白,并利用圆二色谱技术研究了KCTDl蛋白的二级结构特点。KCTDl蛋白的结构具有pH依懒性,在不同的pH值下,蛋白的二级结构不同,在偏酸性的环境下,pH4时,二级结构中а-螺旋含量较高,说明KCTDl蛋白在酸性环境下,结构比较稳定。对KCTDl进行热稳定性分析发现,在温度达到80℃时,其二级结构基本没有变化,表明KCTDl蛋白的热稳定性很高。这些结果有助于进一步研究KCTDl在细胞内的功能以及探讨KCTDl与PrP相互作用对朊病毒疾病产生的影响。
宋博翠[7]（2010）在《利用酵母双杂交方法从小鼠脑cDNA文库中筛选朊蛋白的互作蛋白》文中进行了进一步梳理传染性海绵状脑病（TSE）是由异常朊蛋白（或称朊病毒）PrPsc引起的人和动物的一组中枢神经系统变性疾病。PrPsc是由富含α-螺旋的正常朊蛋白PrPc转变而来,PrPsc富含β-折叠,并具有蛋白酶抗性等特征。PrPc是一个靠糖基磷脂酰肌醇锚锚定的高度保守的蛋白质,主要在神经元表达。PrPc向PrPsc转变的分子机制及TSE发病机理至今仍不清楚,研究表明体内存在某种重要蛋白影响PrPc向PrPsc转变,所以,PrPc的互作蛋白筛选研究,将有助于PrPc向PrPsc转变、TSE发病机理及PrPc转变的生理学功能的理解。目前,用于筛选蛋白质的互作蛋白技术很多,而酵母双杂交系统从建立至今己成为筛选蛋白质的互作蛋白强有力的方法之一。CytoTrap酵母双杂交系统采用了一个独特的酵母菌株cdc25H,该基因表达的cdc25突变体抑制其在37℃生长,但允许其在25℃温度生长。这个突变基因失去的功能可以由hSos基因来补充:通过蛋白质之间的相互作用,hSos蛋白可以定位到细胞膜上并激活Ras途径,使得cdc25H菌株可以在37℃生长。由于所有蛋白间的相互作用都发生在细胞质中,所以这个系统可以称作是酵母细胞质双杂交系统。它克服了传统酵母双杂交系统的局限性,扩展了酵母双杂交的应用范围。本实验把诱饵质粒pSos-prp-23-231转入酵母菌cdc25Hα,检测其表达产物在酵母细胞中毒性作用和自激活作用,并利用该诱饵质粒从小鼠脑cDNA文库中筛选PrP的互作蛋白,实验结果表明:构建诱饵质粒pSos-prp-23-231可以用来钓取PrP的互作蛋白,并从小鼠脑cDNA文库中筛选出PrP的10个互作的克隆,进一步验证表明,9个为假阳性克隆,1个为阳性克隆。阳性克隆提取质粒并测序分析表明,PrP互作蛋白为Ras蛋白特异鸟嘌呤核苷酸释放因子1（Ras-grf1）,利用免疫共沉淀方法进一步证明筛选出的Ras-grf1与PrP的互作关系。PrP互作蛋白Ras-grf1的发现将有助于PrPc向PrPsc转变机制及PrP生理功能的研究。
潘永惠,赵节绪[8]（2007）在《朊蛋白病研究进展》文中研究表明
郑艳军,李媛媛,郑艳霞,张国利,朱平[9]（2007）在《朊病毒及生态学意义》文中研究指明
种剑[10]（2007）在《吉林地方牛种PRNP基因多态性研究及疯牛病易感性初步分析》文中提出致病性朊病毒（Prion）蛋白（ PrPsc）是一种不含核酸却能不停复制和沉淀,且具传染性和极强抵抗力的特殊蛋白质粒子,在机体中沉积至一定程度,即可引起人和动物的传染性海绵状脑病（疯牛病）。目前关于编码该蛋白的基因多态性在各国外牛种中已经进行了大量研究,且已经发现了该编码基因表达过程中起重要作用的编码区和部分调控区域序列的单核苷酸多态性,同时研究了这些SNP与该蛋白构象改变和疯牛病易感性之间的相关关系。在国内,仅对一些地方品种做了初步的编码基因的测序与分析,对整个朊蛋白（PRNP）基因包括编码区、上游调控区等做群体上研究分析尚未见报道。本文通过利用基于PCR技术的单链构象多态性（SSCP）分析和插入缺失（I/D）标记方法,系统研究了草原红牛和延边黄牛这两个吉林地方群体PRNP基因的单核苷酸多态性,分析了外显子3全编码序列和上游调控区外显子I和内含子I的变异情况,同时预测了与疯牛病发生可能的相关程度。本课题以国外研究成果为依据,选取PRNP基因全序列上的上游调控区及开放读码框为对象,运用PCR-SSCP和I/D分子标记技术对吉林当地牛种的两个群体进行初步研究,发现了在两个群体中新的编码序列突变点和单倍型分布,为该病的进一步研究及其预防工作打下了分子生物学基础。
二、朊病毒和疯牛病中蛋白自由基化学问题的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、朊病毒和疯牛病中蛋白自由基化学问题的探讨（论文提纲范文）
（1）功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角蛋白概述 |
| 1.1.1 角蛋白的结构 |
| 1.1.2 角蛋白的性质 |
| 1.1.3 角蛋白的应用 |
| 1.1.4 角蛋白的提取 |
| 1.2 角蛋白酶概述 |
| 1.2.1 角蛋白酶的来源和理化性质 |
| 1.2.2 角蛋白酶的降解机制和水解特异性 |
| 1.3 角蛋白酶的应用 |
| 1.3.1 角蛋白的生物降解 |
| 1.3.2 化妆品和药品 |
| 1.3.3 其他应用 |
| 1.4 角蛋白酶的克隆表达 |
| 1.4.1 角蛋白酶序列 |
| 1.4.2 异源表达体系 |
| 1.5 角蛋白酶的分子改造 |
| 1.5.1 角蛋白酶结构 |
| 1.5.2 分子改造策略 |
| 1.6 立项依据和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 前导肽改造提升角蛋白酶活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 基因、菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 角蛋白酶活性的测定 |
| 2.2.6 同源模型的构建 |
| 2.2.7 前导肽工程改造 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 截短突变验证前导肽的功能 |
| 2.3.2 前导肽切割位点氨基酸替换对角蛋白酶表达的影响 |
| 2.3.3 前导肽区域定点突变 |
| 2.3.4 多位点组合饱和突变 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 角蛋白酶对菌体生长的影响探究 |
| 3.2.6 启动子工程改造策略与方法 |
| 3.2.7 角蛋白酶活性的测定 |
| 3.2.8 碳源补充优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 角蛋白酶的表达对宿主细胞生长的影响 |
| 3.3.2 菌体密度依赖型启动子替换组成型启动子 |
| 3.3.3 利用串联apr E启动子提高角蛋白酶产量 |
| 3.3.4 启动子核心区域序列优化提高启动子活性 |
| 3.3.5 补充碳源提高菌体前期积累 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于Loop结构的设计与改造提升角蛋白酶热稳定性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 不稳定Loop区域的预测与分析 |
| 4.2.6 突变位点的选择与分析 |
| 4.2.7 钙离子结合位点的预测与分析 |
| 4.2.8 序列趋同性突变位点及突变类型的确定 |
| 4.2.9 突变体重组质粒构建及转化 |
| 4.2.10 角蛋白酶活性测定 |
| 4.2.11 突变体筛选及热稳定性评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于计算机辅助分析的不稳定Loop区域预测 |
| 4.3.2 基于B-Factor与 RMSF的突变位点选择 |
| 4.3.3 基于ΔΔG的突变氨基酸选择 |
| 4.3.4 突变体重组菌的活性测定与筛选 |
| 4.3.5 钙离子结合相关Loop改造策略的热稳定性提升 |
| 4.3.6 基于序列一致性突变策略的热稳定性提升 |
| 4.3.7 优势位点的组合突变 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 角蛋白酶对羊毛的可控降解及功能角蛋白的表征与应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 可溶性角蛋白的酶法制备 |
| 5.2.4 可溶性角蛋白生物相容性评价 |
| 5.2.5 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.2.6 角蛋白凝胶用于细胞的体外培养 |
| 5.2.7 角蛋白凝胶促创伤愈合的小鼠体内评价 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 角蛋白酶提取羊毛角蛋白 |
| 5.3.2 可溶性羊毛角蛋白提取物的结构表征 |
| 5.3.3 .可溶性羊毛角蛋白提取物的性能表征 |
| 5.3.4 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.3.5 角蛋白凝胶冻干海绵用于细胞体外培养 |
| 5.3.6 角蛋白凝胶促进小鼠创伤愈合 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一节 朊病毒疾病概述 |
| 第二节 朊病毒的发现与研究现状 |
| 第三节 朊蛋白N端研究现状 |
| 第四节 研究朊蛋白N端的意义及其创新点 |
| 第五节 本文实验流程概述 |
| 第六节 朊蛋白其它研究热点简介 |
| 第一章 N端重组突变体朊蛋白的构建及基于sPMCA的重组突变体朊病毒扩增能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第二章 N端CC1区突变型稳定细胞系的建立与基于细胞系的朊病毒感染能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第三章 朊病毒感染小鼠模型的建立与鉴定 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第四章 朊蛋白N端与脂质体的相互作用 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析与讨论 |
| 结论与展望 |
| 第一节 全文结论 |
| 第二节 未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 朊病毒病的主要特征 |
| 1.2 朊病毒的基本特征 |
| 1.3 Tau蛋白基本特征 |
| 1.4 检测朊病毒病的方法 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用缓冲液及溶液 |
| 2.1.2 主要化学试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 实验使用抗体 |
| 2.1.5 神经细胞系及动物模型 |
| 2.1.6 CSF样本 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GST tau-exon2/10蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 GST tau-exon2/10蛋白的纯化 |
| 2.2.3 纯化后GST tau-exon2/10蛋白的透析 |
| 2.2.4 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.5 免疫印迹方法检测蛋白含量 |
| 2.2.6 脑组织匀浆的制备 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞裂解液的制备 |
| 2.2.9 双抗夹心ELISA |
| 2.2.10 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GST tau-exon2/10重组蛋白诱导表达纯化 |
| 3.1.1 GST tau-exon2/10重组蛋白表达 |
| 3.1.2 GST tau-exon2/10重组蛋白纯化 |
| 3.1.3 GST tau-exon2/10重组蛋白鉴定 |
| 3.2 Tau蛋白外显子2和10单克隆抗体的制备及验证 |
| 3.2.1 单抗的制备及特异性评价 |
| 3.2.2 利用神经细胞模型验证制备的单抗 |
| 3.2.3 利用小鼠脑组织验证制备的单抗 |
| 3.2.4 制备的抗体敏感性检验 |
| 3.3 Tau蛋白外显子2和10双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 3.3.1 包被抗体的选择 |
| 3.3.2 包被抗体最佳工作浓度的选择 |
| 3.3.3 检测抗体最佳工作浓度的选择 |
| 3.3.4 实验条件的最终确立 |
| 3.4 建立的ELISA方法在朊病毒感染患者脑脊液中的初步应用 |
| 3.4.1 sCJD患者CSF中含外显子2和10的tau蛋白含量相对于non-CJD患者明显增高 |
| 3.4.2 T188K突变gCJD患者CSF中含外显子2和10的tau蛋白含量高于non-CJD |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）分子动力学模拟研究铜离子对胰蛋白酶清除自由基能力的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胰蛋白酶简介 |
| 1.1.1 胰蛋白酶的结构 |
| 1.1.2 胰蛋白酶的功能 |
| 1.2 自由基清除方式 |
| 1.3 金属离子对蛋白构象的影响及抗氧化作用 |
| 1.3.1 金属离子在蛋白构象稳定中的作用 |
| 1.3.2 金属离子在抗氧化方面的作用 |
| 1.4 铜离子对蛋白构象的影响 |
| 1.5 金属离子对蛋白结构和功能的影响 |
| 1.5.1 金属离子影响蛋白结构的分子动力学研究 |
| 1.5.2 铜离子影响蛋白结构的分子动力学研究 |
| 1.6 研究思路 |
| 第二章 铜离子对胰蛋白酶清除自由基能力的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 主要试剂配制 |
| 2.2.4 K-562细胞缺氧再灌注模型的建立 |
| 2.2.5 MTT比色法检测K-562细胞的增殖 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测K-562细胞的凋亡 |
| 2.2.7 ELISA试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)浓度的变化 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 K-562细胞的增殖情况 |
| 2.3.2 铜离子促进胰蛋白酶对自由基的清除 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 铜离子与胰蛋白酶相互作用的分子动力学模拟 |
| 3.1 研究背景介绍 |
| 3.2 结构模型构建 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 体系结构模型的构建 |
| 3.3.2 抑制剂与胰蛋白酶的分子对接 |
| 3.3.3 分子动力学模拟流程 |
| 3.3.4 溶剂可及表面积分析 |
| 3.3.5 主成分分析 |
| 3.4 结果和讨论 |
| 3.4.1 体系稳定性检测 |
| 3.4.2 氨基酸柔性分析 |
| 3.4.3 回转半径分析 |
| 3.4.4 二级结构分析 |
| 3.4.5 主成分分析 |
| 3.4.6 溶剂可及表面积分析 |
| 3.4.7 氢键分析 |
| 3.4.8 β-折叠构象分析 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、材料与设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验内容 |
| 第一部分 感染羊瘙痒因子 263K的仓鼠脑组织中BDNF和TrkB表达水平变化 |
| 1 实验步骤及结果 |
| 2 讨论 |
| 第二部分 BDNF相关信号通路中蛋白表达量变化及BDNF和PrPSc沉积的关系研究 |
| 1 实验步骤及结果 |
| 2 讨论 |
| 第三部分 BDNF及其相关蛋白与神经元定位及在朊病毒感染细胞系中的关系研究 |
| 1 实验步骤及结果 |
| 2 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）牛、鼠、兔朊蛋白理化性质比较及朊蛋白的互作蛋白KCTD1的分析（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 一、朊病毒疾病的研究 |
| 1.朊病毒疾病的发现及病因假说 |
| 2.朊病毒分了生物学性质 |
| 3.朊病毒感染途径及机理研究 |
| 4.朊病毒疾病的诊断 |
| 5.朊病毒的种间障碍和遗传多样性 |
| 6.展望 |
| 二、朊蛋白构像变化研究 |
| 1.蛋白质折叠研究进展 |
| 2.朊蛋白构像转变研究 |
| 3.展望 |
| 三、朊蛋白PrP的互作蛋白KCTD1及其家族研究进展 |
| 1.BTB域和KCTD家庭成员之间的同源性 |
| 2.作为介导分子的KCTD蛋白质 |
| 3.KCTD家族蛋白的疾病相关性 |
| 4.展望 |
| 第二章 牛、鼠、兔朊蛋白的表达纯化、抗体制备及理化性质比较 |
| 前言 |
| 一、实验试剂、耗材 |
| 1.实验仪器 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验试剂 |
| 二、试验方法 |
| 1.重组MoPrP基因克隆构建 |
| 2.鼠朊蛋白基因与表达载体(pET30a)构建重组克隆 |
| 3.重组兔朊蛋白基因(RabPrP)克隆构建 |
| 4.兔朊蛋白基因与表达载体(pET30a)构建重组克隆 |
| 5.朊蛋白BoPrP、MoPrP、RabPrP的表达 |
| 6.牛朊蛋白BoPrP的鉴定 |
| 7.牛朊蛋白BoPrP的大量表达及纯化 |
| 8.蛋白的浓度测定 |
| 9.牛朊蛋白BoPrP多克隆抗体的制备 |
| 10.用多克隆抗体进行免疫实验来检测牛羊脑组织 |
| 11.牛朊蛋白圆二色光谱测定 |
| 12.牛朊蛋白ANS外源荧光实验 |
| 13.牛朊蛋白ThT荧光激发实验 |
| 14.牛朊蛋白的蛋白酶K消化实验 |
| 三、实验结果 |
| 1.牛朊蛋白的表达纯化及理化分析 |
| 2.鼠朊蛋白克隆构建及表达纯化、理化分析 |
| 3.兔朊蛋白的克隆构建及表达纯化、理化分析 |
| 四、三种动物朊蛋白的理化性质比较分析 |
| 1.荧光检测三种PrP蛋白在酸诱导下的去折叠情况 |
| 2.三种朊蛋白的酸变性CD分析 |
| 3.三种朊蛋白在尿素诱导下的去折叠情况 |
| 4.三种朊蛋白的热稳定性分析 |
| 5.三种肌蛋白的ThT外源荧光检测比较 |
| 6.三种朊蛋白抗蛋白酶K消化的比较 |
| 五、讨论与展望 |
| 第三章 朊蛋白互作蛋白KCTD1的表达纯化及理化性质初步分析 |
| 前言 |
| 一、实验试剂、耗材 |
| 1.组织中总RNA的提取 |
| 2.逆转录合成cDNA第一链 |
| 3.PCR反应 |
| 4.蛋白质的纯化 |
| 二、实验方法 |
| 1.组织中总RNA的提取 |
| 2.测量RNA的浓度和纯度 |
| 3.逆转录合成cDNA第一链 |
| 4.PCR反应 |
| 5.酶切反应 |
| 6.pET30-KCTD1构建 |
| 7.KCTD1蛋白的预表达检测 |
| 8.KCTD1蛋白的大量表达与纯化 |
| 9.蛋白定量 |
| 10.Western blot检测KCTD1蛋白 |
| 11.分子筛检测KCTD1蛋白的纯度 |
| 12.MALDI-TOF质谱分析KCTD1蛋白 |
| 13.圆二色光谱法分析KCTD1蛋白二级结构 |
| 三、实验结果与分析 |
| 1.pET30a-KCTD1质粒的构建 |
| 2.KCTD1蛋白的可溶性表达的条件的选择 |
| 3.分子筛分析KCTD1蛋白 |
| 4.MALDI-TOF质谱分析KCTD1蛋白 |
| 5.CD分析KCTD1蛋白结构 |
| 四、讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 一、牛、鼠、兔朊蛋白理化性质比较分析及兔抗朊病毒感染的分子机制初步分析 |
| 二、朊蛋白PrP的互作蛋白KCTD1的表达纯化及理化性质分析 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（7）利用酵母双杂交方法从小鼠脑cDNA文库中筛选朊蛋白的互作蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 朊蛋白的研究进展 |
| 1.1 朊蛋白的发现和研究简史 |
| 1.2 朊蛋白的生物学特征 |
| 1.3 PRP 的细胞生物学代谢 |
| 1.4 PRPC 与PRPSC 的异同 |
| 1.5 朊蛋白可能的生理功能 |
| 1.6 朊病毒疾病的预防、诊断和治疗 |
| 第二章 酵母双杂交技术研究进展 |
| 2.1 酵母双杂交系统的多样性 |
| 2.2 酵母双杂交系统的发展 |
| 2.3 CYTO TRAP 酵母双杂交系统 |
| 第三章 朊蛋白互作蛋白质的筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 免疫共沉淀技术验证蛋白间的互作 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论及创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 作者简介 |
（8）朊蛋白病研究进展（论文提纲范文）
| 1 朊蛋白病的细胞生物学特点 |
| 1.1 正常朊蛋白的细胞生物学特点 |
| 1.2 异常朊蛋白的细胞生物学特点 |
| 2 朊蛋白病的特点 |
| 3 朊蛋白病的可能发病机制 |
| 4 朊蛋白病的诊断 |
| 5 朊蛋白病的防治 |
| 6 展 望 |
（10）吉林地方牛种PRNP基因多态性研究及疯牛病易感性初步分析（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 朊蛋白基因研究进展 |
| 第二章 分子标记方法及其在研究疾病易感基因中的应用 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第一章 草原红牛和延边黄牛PRNP 基因exon-3 PCR-SSCP 分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 草原红牛和延边黄牛的PRNP 基因外显子I 和内含子I 突变分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
四、朊病毒和疯牛病中蛋白自由基化学问题的探讨（论文参考文献）
- [1]功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造[D]. 苏畅. 江南大学, 2021(01)
- [2]朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系[D]. 张祥毅. 华东师范大学, 2020
- [3]朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用[D]. 严普. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [4]分子动力学模拟研究铜离子对胰蛋白酶清除自由基能力的影响[D]. 宣红霞. 兰州大学, 2016(03)
- [5]脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究[D]. 王婷婷. 内蒙古医科大学, 2015(04)
- [6]牛、鼠、兔朊蛋白理化性质比较及朊蛋白的互作蛋白KCTD1的分析[D]. 梅芳华. 武汉大学, 2014(06)
- [7]利用酵母双杂交方法从小鼠脑cDNA文库中筛选朊蛋白的互作蛋白[D]. 宋博翠. 黑龙江八一农垦大学, 2010(09)
- [8]朊蛋白病研究进展[J]. 潘永惠,赵节绪. 中国人兽共患病学报, 2007(09)
- [9]朊病毒及生态学意义[J]. 郑艳军,李媛媛,郑艳霞,张国利,朱平. 上海畜牧兽医通讯, 2007(03)
- [10]吉林地方牛种PRNP基因多态性研究及疯牛病易感性初步分析[D]. 种剑. 吉林大学, 2007(03)