一、意大利蝗痘病毒超微结构及DNA酶切图谱(英文)（论文文献综述）
刘志刚[1]（2020）在《患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究》文中研究表明长江江豚是生活在长江中下游及鄱阳湖、洞庭湖等沿江大型湖泊的淡水豚类物种。近年来,随着工农业经济的快速发展,长江生态遭受严重破坏,长江江豚的栖息地环境持续恶化,导致其种群数量快速下降,由20世纪90年代的2700头,下降至2017年的1014头。目前,长江江豚处于极度濒危状态。迁地保护是进行长江江豚保护的重要举措之一,在江豚保种和科学研究中发挥了重要作用。然而,疾病感染和饲养管理技术欠缺严重制约了迁地保护区江豚的健康生长和种群繁育。近年来,长江江豚疾病频发,而关于长江江豚病原学（细菌和病毒）方面的研究几乎处于空白,迁地保护区饲养管理不当又时常引起江豚死亡率高和繁殖效率低。因此,有必要对长江江豚感染性疾病和迁地保护区江豚的饲养管理开展系统性研究,初步了解长江江豚细菌性疾病和病毒性疾病的流行病原,掌握长江江豚主要致病菌的生物学特性;建立迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病防治的技术规范。本研究开展了长江江豚细菌性疾病的病原学调查;长江江豚病料样本的病毒群落研究;长江江豚6种危害较大细菌的生物学特性研究;迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究,研究结果如下:1长江江豚细菌性疾病流行病学调查通过细菌的分离培养、染色镜检、理化鉴定、PCR鉴定等,对462份长江江豚呼吸孔、粪便、血液、内脏组织、皮肤病灶、腹腔积液、胸腔积液等样品进行了细菌的分离鉴定,同时使用16S r DNA高通量测序对患病长江江豚和健康长江江豚的肠道菌群进行了研究。结果从462份长江江豚样本中,获得655个细菌纯培养,分离鉴定成功31种细菌,分别为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、微球菌（Micrococcus）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、变形杆菌（Proteus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、嗜麦芽窄杆菌（Stenotrophomonas maltophilia）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、链球菌（Streptococcus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、诺卡氏菌（Nocardia）、弧菌（Vibrio）、不动杆菌（Acinetobacter）、魔氏摩根菌（Morganella morganii）、肠球菌（Enterococcus）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、弯曲杆菌（Campylobacter）、黄杆菌（Flavobacterium）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、志贺样邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）和丹毒丝菌（Erysipelothrix）,其中产气荚膜梭菌、弧菌、爱德华菌等11种细菌在长江江豚属首次发现,大肠杆菌、气单胞菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌在所有样品中检出率相对较高;肠道内容物高通量测序,共检测到菌属340种,其中15种为潜在致病菌属,分别为埃希氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、绿脓杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、诺卡氏菌属、弧菌属、巴氏杆菌属、葡萄球菌属、魔氏摩根菌、肠球菌、幽门螺旋杆菌、弯曲杆菌。2长江江豚主要致病菌生物学特性研究利用微生物学、分子生物学、兽医药理学和兽医病理学方法对分离自长江江豚的6种主要致病菌（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌、魔氏摩根菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）进行了生物学特性研究。结果显示,分离菌株按照常规方法进行培养,均可良好生长,与其他动物源细菌无明显差异;生化研究和16s r RNA序列测定结果与各菌最初鉴定结果表型一致;细菌耐药性研究结果显示,6种菌均存在一定程度的耐药性,以大肠杆菌的耐药性最强,金黄色葡萄球菌的最弱,气单胞菌属不同菌之间耐药性存在一定差异;BALB/c小鼠致病性试验证实,6种菌对小白鼠均有致病性,以维氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌的致病力最强,金黄色葡萄球菌的致病力最弱,感染小白鼠剖解病理变化存在一定差异,但主要以肺脏瘀血、出血和肝脏瘀血、变性和坏死为主。3长江江豚病毒性疾病研究初探通过病毒宏基因组学研究方法,对收集自2017-2019年野外患病死亡的长江江豚组织病料（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤等）进行了病毒群落研究和分析。结果共获得10600个重叠序列（contigs）,检测到病毒65个,其中,基于参考序列鉴定出病毒25种,Denovo序列鉴定病毒42种。科水平上,两种方法鉴定出的优势病毒为肌尾噬菌体科（Myoviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）、长尾噬菌体科（Siphoviridae）、线头病毒科（Nimaviridae）、阿克曼病毒科（Ackermannviridae）、痘病毒科（Poxviridae）、丝状噬菌体科（Inoviridae）、短尾噬菌体科（Podoviridae）、砂粒病毒科（Arenaviridae）、有尾噬菌体目未分类病毒科（Caudovirales unclassified）。除疱疹病毒外,噬菌体病毒、逆转录病毒、线头病毒、痘病毒和砂粒病毒等均为首次在长江江豚上发现。4迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究通过临床大量实践和数据分析,分别对迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中生长的长江江豚的饲养管理和疾病防治技术进行了研究,结果,总结制定出迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中长江江豚饲养管理的技术规范,计算统计出长江江豚血常规和血液生化的正常阈值,发现了长江江豚各生理生化指标与江豚疾病诊断间的相关性,建立了长江江豚健康体检的技术规范和健康评价标准,基本形成了长江江豚常见疾病诊断与治疗的方法技术体系,其中通过静脉滴注对患病长江江豚进行治疗的技术在国内处于领先水平。综上所述本研究首次系统阐明了长江江豚细菌性疾病的流行特点;初步探明了长江江豚病料样本病毒群落的结构和组成,并首次发现了大量的长江江豚源病毒;揭示了6种常见致病菌的生物学特性,提供了细菌性疾病药物治疗和疫苗研发的参考信息;建立了迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病诊疗的技术规范。饲养管理和疾病防控是迁地保护区长江江豚管理的两个重要方面,也是当前长江江豚保种面临的主要问题,知己（不断提高长江江豚的饲养管理和疾病防治水平等）和知彼（掌握长江江豚传染性疾病的流行特点、病原的生物学特性、长江江豚生长特性和各个生长阶段的饲养管理要点等）,方能有效解决长江江豚在迁地保护过程中疾病防控盲目和饲养管理欠缺的现状,为长江江豚、中华白海豚等鲸类动物的健康成长和种群繁育提供理论支持。
李国华[2]（2017）在《羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备》文中认为羊口疮又称羊传染性脓疱性皮炎,由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起,ORFV属于痘病毒科副痘病毒属,主要侵袭皮肤和黏膜。ORFV主要感染绵羊和山羊等动物,严重影响养羊业的发展,对人类健康也造成威胁。可以通过接种疫苗来控制羊口疮的发生,但存在灭活苗效果差,弱毒苗毒力返强等问题,而且不同地区的羊口疮毒株存在差异,不能很好的保护羊群。因此,对本地区的ORFV开展研究具有重要意义。1.采集海南某场羊口疮水泡痂皮,克隆ORFV的B2L、VIR和F1L基因,进行遗传进化树分析。结果表明,发现其与福建株和西北株的亲缘关系较近。2.以ORFV基因组为模板,通过PCR技术扩增B2L和F1L片段,构建原核表达质粒 pET28a-B2L 和 pET28a-F1L,通过 Ni-NTA 柱纯化 His-B2L 和 His-F1L 融合蛋白,进行SDS-PAGE和Western Blot检测。结果表明,成功构建重组质粒pET28a-B2L和pET28a-F1L,经IPTG诱导成功表达了带His标签的融合蛋白,融合蛋白His-B2L分子量约47 kDa,融合蛋白His-F1L分子量约44 kDa。3.通过PCR技术扩增B2L和F1L片段,构建真核表达质粒pEGFP-N1-B2L和pEGFP-N1-F1L,转染羊睾丸细胞,进行荧光显微镜观察,qRT-PCR检测和Western Blot鉴定。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-B2L和pEGFP-N1-F1L,成功表达了 EGFP-B2L和EGFP-F1L融合蛋白,为B2L和F1L蛋白的研究奠定基础。4.用纯化的融合蛋白制备抗原,经皮下多点注射新西兰大白兔,制备兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价。结果表明,获得的兔抗多克隆抗体效价均在1:12800以上且具有较好的特异性。
吴英[3]（2015）在《鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究》文中提出鸭瘟（duck plague）又称鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis）,是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。本病发病快、死亡率高,是目前世界各国水禽业危害最严重的传染病之一。该病的病原鸭瘟病毒（Duck Plague virus, DPV）是疱疹病毒科（Herpesvirales）、α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、马立克氏病毒属（Mardivirus）的成员之一。但由于DPV的研究起步晚,其分子生物学研究远远落后于其它疱疹病毒。一段时间以来对于DPV的研究多集中于流行病学、诊断和防治等方面；与其分子生物学特性相关的基础研究,如病毒的基因组结构、物理图谱、病毒基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制及致病机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。因此本论文的主要目的就是希望对本实验室测序获得的鸭瘟病毒基因组序列进行解析；并通过构建一个可以对DPV进行细菌遗传学操作的平台,为DPV的基因功能研究提供技术手段的支持,此外利用该平台用两步RED重组敲除UL55基因,验证此平台的可行性并初步阐释UL55功能。主要研究内容如下：1鸭瘟病毒中国强毒株基因组信息解析对本实验室测序获得的鸭瘟中国强毒株的基因组序列进行生物信息学分析。鸭瘟病毒中国强毒株基因组组成为双股线状双链DNA:UL-IRS-US-TRS,是典型的D型疱疹病毒基因组结构。DPV CHv基因组全长162,175 bp,GC含量为44.89%,包括潜在的76个能编码功能蛋白的ORF。BLAST搜寻相似性序列发现五条与DPV CHv同期或之后提交的其他鸭瘟病毒毒株全基因组序列,他们间具有高度同源性,进化树分析显示六株DPV病毒按地域和毒力差异进行分类,DPV CHv处于进化树的中间位置。对基因组编码区的ORF进行扫描分析发现,六株DPV在UL、US区域分别有23、5个ORF在核苷酸水平上存在整个ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情况出现,这些突变的产生可能是造成六株不同来源毒株毒力和地理差异的主要原因。而DPV基因组中不存在核苷酸序列插入或缺失的53个ORF在氨基酸水平上高度同源,多为DPV基因组的保守性基因,不受病毒传代致弱及地域差异的影响,编码蛋白大多为与病毒DNA代谢相关的结构蛋白。密码子使用模式分析结果显示其在基因组密码子的使用上偏向A/T结尾的密码子,其密码子使用模式主要受突变压力的影响。将其与人类、大肠杆菌、酵母的密码子使用模式进行比较,结果表明鸭瘟病毒的密码子使用模式与酵母系统更为接近。2鸭瘟病毒UL55基因生物信息学分析DPV UL55基因由561bp核苷酸组成,包括一个完整的开放性阅读框,编码一个由186个氨基酸组成的20.7981kDa蛋白质。UL55蛋白没有信号肽及跨膜区。密码子分析显示UL55基因偏向A/T结尾的密码子,密码子使用模式与人类最接近。UL55蛋白整体表现出亲水性,抗原表位主要集中在相应亲水区域的无规则卷曲,其功能与病毒的装配、出芽、成熟和释放相关。基于核苷酸序列的进化树分析显示DPV属于马立克氏病毒基因属的一员。3鸭瘟病毒UL55基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备通过将UL55基因通过克隆到表达载体pET32a（+）上实现对UL55蛋白的原核表达,试验表明重组UL55基因能在大肠杆菌BL21（DE）中进行融合表达。通过优化诱导表达条件,UL55重组蛋白能在37℃条件下,通过0.8mmM的IPTG诱导表达4h产生大量非可溶形式的包涵体蛋白。将包涵体蛋白通过裂解后进行纯化及复性处理再与兔抗DPV CHv多克隆抗体进行免疫印迹反应,结果表明纯化复性后的UL55蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。复性后的UL55蛋白免疫兔子制备的高免血清能够与UL55重组蛋白发生良好的免疫反应。4原核表达UL55蛋白作为抗原检测DPV血清的间接ELISA方法的建立本方法是基于纯化的重组UL55原核表达蛋白建立的可以检测DP血清的间接ELISA法,该方法特异性强,对抗鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏菌（RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭源沙门氏菌（Salmonella）、肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测,结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。将其与经典的中和试验及DPV全病毒包被的ELISA同时检测50份感染了DPV的临床鸭血清样本,发现其对DPV IgG的检出率介于中和试验和DPV-ELISA之间。由于其制备方法简便、操作简单,特异性、灵敏性较高。且不存在散毒的风险,具有良好的应用前景,为进一步组装成试剂盒奠定了基础。5鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析以β-actin基因作为内参基因,用相对荧光定量方法对UL55基因在体外感染宿主细胞中的转录情况进行了分析。转录时相分析结果表明UL55基因在转录后的0-8h内处于一个较低的水平；12h后开始迅速增加直至在感染后36h达到转录峰值,之后开始逐步下降,直到感染后的60h仍然可以检测到大量转录的UL55基因,UL55基因的转录过程可以被核酸抑制剂更昔洛韦抑制,说明UL55基因是严格依赖于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析体外感染宿主细胞中UL55基因的表达时相表明UL55蛋白的表达水平也表现出相似的规律,进一步佐证了UL55基因为γ2基因的结论。6细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建通过多步克隆构建了含TK基因同源臂、报告基因EGFP和细菌人工染色体核心功能元件的重组鸭瘟病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11,将其与DPV CHv病毒核酸共转染获得了重组病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP报告基因的指示作用,通过8轮噬斑纯化获得了纯化的重组病毒。提取环化时期的重组病毒DPV CHv-BAC-G,电击转化至DH10B细胞中,获得了能够在细菌中复制的重组病毒转化子。将克隆化的病毒质粒pBAC-DPV转染至宿主细胞DEF,成功拯救出重组病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出的重组病毒可以以细菌和病毒两种形式存在,能够实现在细菌和宿主细胞内的同时复制,有利于利用原核系统成熟的基因操作手段研究原本仅能在细胞水平研究的鸭瘟病毒,成功建立细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台。7重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究在构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台基础上,利用大肠杆菌细胞内的两步RED重组技术构建UL55基因缺失株及其回复突变株。构建的回复突变株克隆能够通过转染DEF细胞获得拯救产生与亲本相同的致细胞病变,酶切图谱与亲本株DPV CHv-BAC-G无差异,是为真正的回复突变株。空斑试验、一步生长曲线和致病性比较结果表明,构建的UL55缺失株和回复突变株与预期结果一致,能产生与亲本株DPV CHv-BAC-G相似细胞病变效应、形成形态及大小相似的空斑、在感染细胞中展现出相同的增殖周期。8 DPV UL55基因在感染宿主细胞体内的定位分析以制备的兔抗UL55多克隆抗体作为一抗,用间接免疫荧光的方法检测UL55基因编码蛋白在感染细胞内的动态分布。结果显示,UL55蛋白最早在感染后的5.5h内开始在细胞质大量表达,并随着时间的推移表达量逐渐增多,其表达量在感染后的22.5h达到峰值。之后UL55蛋白的表达量逐步下降,并从细胞质内的散在分布颗粒逐渐形成荧光斑向核膜周边转移,大量存在于核膜两极。之后随着时间的推移,UL55蛋白的荧光逐渐消失,推测其随着病毒复制周期的结束和细胞的崩解而消失。9 DPV UL55与UL26.5基因在感染宿主细胞体内的定位分析UL55蛋白和UL26.5蛋白在细胞内的共定位结果显示,UL26.5和UL55蛋白在感染细胞内邻接并部分重叠,但当DPV不表达UL55蛋白时,UL26.5蛋白的定位没有变化,表明UL55基因的缺失并不影响UL26.5在核内的定位和其功能的发挥,预示着UL26.5蛋白形成的核衣壳的装配由包括UL55在内的多个蛋白完成,UL55蛋白参与病毒的装配,但并不是必需。
杨帆[4]（2013）在《CTV强毒分离物对柑橘基因表达的影响及其与寄主互作蛋白的鉴定》文中进行了进一步梳理柑橘是一类重要的经济果树,全球年均贸易额已经达到90亿美元。由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）引起的柑橘衰退病被公认为柑橘栽培中最具威胁的病毒病害。病毒的成功侵染是病毒与寄主相互作用的结果,其在复制增殖过程中产生的病毒蛋白、核酸等分子引起寄主正常生理代谢的改变,并最终导致症状的产生。CTV侵染后能够诱导寄主植物表现茎陷点、苗黄、衰退等明显症状。然而,对于症状表现过程中CTV与寄主互作的分子机制仍然了解较少。为了分析CTV在转录和蛋白质水平上对寄主代谢造成的影响,本研究以CTV强毒株系N21为研究对象,对CTV侵染过程中寄主基因的转录应答反应和部分基因的时空表达动态进行了分析,并对CTV与寄主间的互作蛋白进行了筛选。取得的主要研究结果如下：1、以感染CTV-N21并表现茎陷点的墨西哥株檬以及健康株檬植株为材料,采用抑制差减杂交技术（SSH）构建了一个库容量为14000个克隆的差减文库。通过反向Southern杂交筛选,共得到807个差异表达EST片段。测序及同源比对分析结果表明：这些EST片段代表430个寄主基因。其中上调表达基因282个,下调表达基因148个。使用荧光定量PCR技术对随机挑选25个基因在感染CTV-N21墨西哥株檬植株中的相对表达量进行的定量分析结果表明：正向文库中14个基因上调表达倍数为1.2-10倍,而反向文库中11个基因的下调表达倍数为1.1-7倍。以差异表达1.5倍为选择标准,则正向和反向文库的阳性率均在80%以上。对这430个基因进行功能注释并依据分子功能将其分为9类。其中,主要代谢和蛋白质代谢所占比例最大,分别占基因总数的26%和15.1%。在拟南芥数据库Tair中对这430个基因进行比对后共找到351个拟南芥同源基因。蛋白质互作预测结果显示这些基因编码产物在拟南芥代谢中形成复杂的互作网络。所占比例最大的互作来源于能量代谢。2、对6个防御以及能量代谢相关基因在墨西哥株檬不同部位叶片组织中随CTV侵染时间（17-177dpi）的相对表达量变化进行了分析。3个防御相关基因分别编码几丁质酶（acidic class Ⅱ chitinase）、奇果类蛋白（miraculin-like protein）和Rsdv抗性类似蛋白（rsdvl resistance like protein）;3个能量代谢相关基因编码蛋白为：碳酸酐酶（carbonic anhydrase）、1,5-二磷酸核酮糖脱氢酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO）以及光捕捉复合体蛋白Lhca4（light-harvesting complex Ⅰ protein Lhca4）。荧光定量PCR分析结果显示：这些基因的表达量随CTV-N21侵染时间的延长表现出较大的波动性,在上部和下部叶片组织中的表达也存在差异。几丁质酶和奇果类蛋白基因均在接种后97d达到上调表达最大值。但两者在不同部位叶片中的表达量均存在差异；Rsdv抗性类似蛋白编码基因在上部叶片中表现为下调表达且呈总表达量呈持续下降趋势,而在下部叶片中则在接种后137d后表现为持续上调表达。光捕捉复合体蛋白编码基因在上部和下部叶片中的诱导表达量总体均呈下降趋势,并在接种后137d表现为下调表达。碳酸酐酶和RuBisCO编码基因总体呈下调表达,两者在不同部位叶片中的表达量存在较大差异。3、通过RT-rPCR和体外融合方法分别构建了墨西哥株檬和枳壳的cDNA质粒文库,并利用酵母双杂交技术对CTV与寄主互作蛋白进行了筛选。初步筛选得到与病毒蛋白p20和p23互作的3个寄主蛋白。其在拟南芥中的同源蛋白分别为：碳硫裂合酶（Carbon-sulfur lyases）、蛋白质磷酸化酶（Protein phosphatase）和同源结构域亮氨酸拉链家族蛋白（Homeodomain leucine zipper family IV protein, HD-ZIP）。 BiFC荧光观察结果显示：p20与HD-ZIP沿细胞壁能够产生明显的互作信号,并在部分区域大量积累呈亮斑状。显示其互作可能发生在胞间连丝或细胞质特殊区域。
郭良兴[5]（2012）在《吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制》文中研究指明羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma, CE）又名羊接触传染性脓疱性口炎、羊传染性脓疱性皮炎、羊口疮等，是由传染性脓疱病毒（Orf virus, ORFV）感染引起山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。目前，该病广泛存在世界各养羊国家和地区，我国北方、西北等主要的养羊省区羊群中也不断有该病发生和流行的报道，因此该病的发生给世界养羊业造成了巨大的经济损失。由于ORFV具有较强的抵抗力，羊群在被感染后不易于清除，可持续多年对羊群造成危害。此外，ORFV也可通过直接接触感染人，尤其是牧民、兽医师及从事剪毛、屠宰、饲养及皮毛加工的工作人员，严重威胁着人类的健康，成为影响我国乃至世界公共卫生安全的一个重要隐患。近年来，该病的发生呈不断上升的趋势，成为当前严重危害养羊业的主要疫病之一。为了解近年来羊传染性脓疱病在吉林省的流行情况，本研究采用PCR方法对2006～2010年间采自吉林省9个不同市县85个养羊户疑似羊传染性脓疱病毒感染的628份痂皮样本（背部、乳房、四肢以及尾根等部位皮肤）进行羊传染性脓疱病毒核酸的检测，应用间接ELISA方法对同期采集自上述地区羊群中的2160份血清样本进行羊传染性脓疱病毒抗体检测。通过调查其在吉林省羊群中的感染分布情况，初步阐明其流行规律。这不仅为研究病毒的分子致病机制奠定基础，而且将为针对感染现状日益严重的羊传染性脓疱病科学防控措施的制定提供重要的理论依据。分子流行病学调查结果显示，在各地区不同年龄段不同品种羊的痂皮组织中均可检测出ORFV核酸，羊群中ORFV感染的平均阳性率为56.47%（48/85），痂皮样品中平均阳性检出率为24.36%（153/628），且各地区羊群中ORFV阳性率从16.42%～32.60%不等，其中以松原、白城地区的阳性率较高；血清学调查结果显示，吉林省各市县的ORFV血清抗体阳性率从18.95%～53.49%不等，其中农安、松原和白城地区的羊群中ORFV抗体阳性率相对较高。以上的调查结果表明，ORFV在吉林省羊群中长期带毒存在，感染非常普遍，且呈持续性流行状态。此外，本研究还对不同日龄、不同性别以及不同品种羊的ORFV感染情况进行了调查分析，以上的流行病学调查结果将为吉林省针对ORFV的防控提供重要的理论依据。为了探明吉林省ORFV地方流行毒株的类型和分子特征，进而为当地针对羊传染性脓疱病的防控工作提供科学依据和物质基础，本研究通过病原分离、电镜负染观察、动物回归试验、PCR等方法对ORFV病毒核酸检测为阳性的病料进行系统的病原分离及鉴定。本研究对2010年白城地区某羊群中疑似ORFV感染病例进行了系统的病原分离与鉴定，以从病原学角度证实该病在羊群中发生的原因。首先，分别利用原代胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）和牛肾细胞（MDBK）进行病原的分离，OFTu细胞在盲传至第2代时即出现典型的CPE；而MDBK细胞用于病毒分离时，在盲传至第五代时出现CPE；将细胞病变液经蔗糖密度梯度（W/V）离心纯化后进行电镜负染观察，可见到呈椭圆形、毛线团样外观的典型的副痘病毒粒子，结果表明我们成功分离获得了1株病毒；为进一步鉴定该病毒分离株，本研究设计合成了针对ORFV、CPV、BTV、FMDV的特异性引物以进行类症鉴别，PCR或RT-PCR检测结果显示，仅ORFV引物的扩增结果为阳性，排除了CPV、BTV、FMDV感染的可能性，从而证实了该病毒分离株为ORFV。为进一步了解该分离株在OFTu细胞中的增殖能力及其动态的侵袭过程，本研究制作了ORFV感染OFTu细胞后不同时间段的超薄切片对感染细胞的超微结构和病毒粒子的形态学发生过程进行观察，在感染初期，以对损伤最为敏感的线粒体的变化较为显着，线粒体肿胀、变形严重，线粒体嵴断裂、消失；至感染后期，粗面内质网也发生高度扩张，核周隙增大，感染细胞胞浆中可见有大量椭圆形的成熟病毒粒子，这表明ORFV在感染细胞胞浆中成功地进行了复制。此外，本研究还利用OFTu细胞对其毒力进行了测定，结果显示，该ORFV分离株在OFTu细胞上的感染滴度为10-8.33/0.1mL，该结果表明该分离株的毒力较强；为进一步确定该分离株的致病性，本研究利用对ORFV易感的家兔和本源动物羔羊进行动物回归试验，均复制出与自然感染相类似的临床症状。以上我们对ORFV白城分离株进行了系统全面的鉴定，并从病原学角度对其致病性进行了初步的研究分析，据此从而确诊该病的发生是ORFV野毒感染所致。由于目前吉林省羊群中ORFV感染的状况仍非常普遍，且目前尚无有效的方法用于该病的防治，因此利用ORFV地方分离毒株研制安全高效的疫苗对于该病的防治具有重要的现实意义。本研究选用分离获得的ORFV吉林省地方分离毒株作为疫苗研制的候选毒株，通过优化体外增殖条件，确定利用OFTu细胞进行ORFV的增殖传代。在确定ORFV最佳增殖条件的基础上，本研究将经分离鉴定后冻干保存的ORFV吉林白城分离毒株定为F0代，接种于OFTu细胞中进行复苏传代，制备出原始种子库（F3代）和基础种子库（F6代），并对其第3代培养物（原始种子：F6；基础种子：F9）的培养特性、纯净度、毒力等进行测定，检测结果表明，所建立的ORFV原始种子库和基础种子库符合“兽用新生物制品质量标准”。之后，取基础种子库的病毒液制备生产种子用于生产疫苗用抗原，收集病毒效价（TCID50）达10-7.0/0.1mL以上的病毒液，经0.4%甲醛灭活后制备ORFV油乳剂灭活疫苗。随机抽取疫苗样本的检测结果表明，其物理性状检验、无菌检验和支原体检验均符合《中国兽药典》和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》；安全性试验结果显示，所制备的3批疫苗均较为安全。以上结果表明，本研究制备出了安全合格的ORFV油乳剂灭活疫苗。动物免疫试验结果表明，所制备的ORFV油乳剂灭活疫苗主要刺激机体的Th1型免疫应答反应，而诱导产生的抗体水平较低；攻毒保护性试验结果显示，所制备的ORFV油乳剂灭活疫苗能够产生有效的免疫保护力。以上研究成果的取得将为临床上针对羊传染性脓疱病的防控以及在羊群中的清除提供重要的物质基础和技术支撑。
赵魁[6]（2010）在《羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究》文中进行了进一步梳理养羊业是我国畜牧业的一个重要内容,然而,长期以来,养羊业并未象养猪业、养鸡业等一样受到人们的重视,因此仍处于较为落后的状况。此外,羊群密度的增大、频繁的从外地引种以及粗放的饲养管理等因素的存在导致羊痘、羊传染性脓疱病、蓝舌病、坏死杆菌病等一些严重危害养羊业发展的疾病的频繁发生。羊传染性脓疱病作为羊群中常见的病毒性传染病之一,严重威胁着养羊业的健康发展。近年来,该病的发生呈上升趋势,因此不断有该病发生和流行的报道。本研究对长春市郊养羊户饲养羊群中一起疑似羊传染性脓疱病例进行分析,根据流行病学特点、临床症状和系统的病理学观察以及分子生物学检测等实验室诊断结果,证实该病为羊传染性脓疱病。然后利用原代犊牛睾丸细胞从病羊唇部痂皮中成功分离获得1株病毒,并通过形态学观察、理化学测定、动物回归试验和PCR等方法对该病毒进行鉴定,证实其为羊传染性脓疱病毒（ORFV）,被命名为ORFV/JL/08/CC。将经超速离心纯化的病毒免疫家兔制备出多抗,通过免疫组织化学检测病原在各组织脏器中的分布情况,结果显示,在感染唇部皮肤棘细胞的胞浆中表现出阳性反应,从而进一步证明了该病的发生原因为感染ORFV所致。而对ORFV/JL/08/CC分离株的分离鉴定为进行针对羊传染性脓疱病的疫苗研制提供物质条件。然后利用PCR扩增获得该病毒株的主要免疫原性基因ORFV 011（B2L）和ORFV 059（F1L）,测序后提交Genbank收录（登录号分别为FJ808074和FJ808075）。此外,从氨基酸和核苷酸水平上对其同源性进行分析,同时对两基因进行了遗传进化分析。结果表明,该分离株的ORFV 011（B2L）和ORFV 059（F1L）基因高度保守,可作为核酸疫苗研制的目的基因。在获得ORFV 011（B2L）和ORFV 059（F1L）的基础上,利用一编码（G4S）2多肽的碱基linker连接并通过重叠PCR的方法扩增获得ORFV 011（B2L）-linker-ORFV（F1L）融合基因,在此基础上,利用pcDNA3.1（+）真核表达载体成功构建了相应的疫苗质粒,通过脂质体法将其分别转染MDBK细胞,并通过RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE以及Western-blotting等方法从mRNA水平和蛋白水平上证实了目的基因在动物细胞的转录和表达,这将为我们后续进行的动物免疫试验提供理论依据。采用初免-加强免疫的策略,将制备纯化的疫苗质粒经肌肉注射免疫Balb/c小鼠,之后通过间接ELISA、淋巴细胞增殖试验、流式细胞术等方法对疫苗质粒引起机体特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答水平进行检测,结果表明,构建的疫苗质粒能够诱导免疫小鼠产生特异性的细胞免疫应答和体液免疫免疫应答,且以Th1型免疫应答为主;攻毒试验结果表明所构建的疫苗质粒安全性好,且能提供有效的免疫保护,该研究结果将为后续进行羊只免疫试验及其在临床上的应用奠定基础。
周洪旭[7]（2009）在《两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定》文中研究表明围食膜（peritrophic matrix,PM）是大多数昆虫中肠内壁的一层厚薄均匀的长管状薄膜,成圆桶状把肠腔和中肠壁细胞分开,自中肠前端一直延伸至后肠。它主要由几丁质和蛋白质组成,是昆虫中肠天然的防御体系,具有保护中肠上皮细胞、阻止有害物质侵入和帮助消化等多种功能,是害虫生物防治的潜在靶标。鳃金龟是我国重要的地下害虫,其幼虫（蛴螬）在土壤中生活,取食植物的地下部分,并把周围的土壤颗粒、病原微生物等物质一同带入消化道,因此围食膜对蛴螬的生长发育具有重要的作用。本文采用生化和分子生物学技术等手段,对华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）和暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）围食膜的形态结构和化学组成进行了研究,构建了华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库,分离鉴定新的PM靶标蛋白,明确其生理功能,并研究生物防治促进因子对围食膜的作用与影响,寻找生物防治新靶标,为发展新的高效生物杀虫剂和鳃金龟的生物防治提供理论依据。1.通过光学显微镜和电子显微镜观察发现,鳃金龟幼虫围食膜位于中肠两端的两个“液囊环”（sac-circles）之间,是一层厚薄均匀的长管状薄膜,表面平滑致密,无孔无缝,具有一定弹性,但与鳞翅目昆虫围食膜相比,韧性较差,解剖时其围食膜易破碎。应用Bradford法和苯酚-硫酸法,测定华北大黑鳃金龟围食膜蛋白含量为36.38%,糖含量为8.84%;暗黑鳃金龟围食膜蛋白含量为38.26%,糖含量为9.08%。2.SDS-PAGE分析发现华北大黑鳃金龟PM蛋白至少有28条多肽,暗黑鳃金龟比较清楚的PM蛋白带有15条,而鳞翅目昆虫粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和粘虫PM蛋白分别有19、17、16和9条,与鳞翅目昆虫围食膜相比,华北大黑鳃金龟围食膜蛋白种类相对较多。肠粘蛋白（insect intestinal mucin, IIM）是昆虫围食膜中的重要蛋白,而应用TnPM-IIM特异性抗血清对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜蛋白做Western blot检测,未发现两种鳃金龟围食膜中有类似于鳞翅目昆虫的粘蛋白。3.应用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit、Oligotex mRNA Mini Kit以及Stratagene公司cDNA Synthesis Kit,成功构建了华北大黑鳃金龟3龄幼虫中肠cDNA表达文库,原始文库滴度为1.9×106 pfu/mL,扩增后滴度为1.4×109pfu/ml,文库重组率为99.97%,插入片段在0.8-2.3kb之间,平均长度为1.6kb。4.应用Western blot检测发现棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体、粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白之间有交叉反应,并用这两种抗体免疫筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库,得到122个阳性克隆,测序及序列比对后得到Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin3、Ho-Peritrophin4四个华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因,Genbank登录号分别是FJ393548、FJ393549、FJ393550和FJ573145,最长读码框（ORF）分别编码729、477、528和324个氨基酸,含有9、6、5和4个几丁质结合功能域（CBD）,不含粘蛋白功能域,含有1-4个N-连糖基化位点,N端不含有信号肽。Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin4的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点大部分位于CBD内部,受到保护,不会被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解。而Ho-Peritrophin3的第5个CBD下游区域富含大量的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。通过构建重组表达质粒,Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2和Ho-Peritrophin3在大肠杆菌中分别表达出78、51和57KD的目的蛋白,几丁质结合实验表明Ho-Peritrophin1和Ho-Peritrophin3具有几丁质结合活性。5.从华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库中筛选得到了HoSP1和HoSP2两种华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶全长基因,在Genbank登录号分别为FJ573146和FJ573147,开放阅读框（ORF）长783和786bp,编码260和261个氨基酸,均含有3对半胱氨酸残基,与CzSP3相似性最高,分别为52.47%和51.52%,催化活性中心位于His80、Asp125、Ser215,His80、Asp125、Ser216。通过构建重组表达质粒,HoSP1和HoSP2在大肠杆菌中表达出26.7kDa和27.1kDa的蛋白。筛选得到了华北大黑鳃金龟羧酸酯酶基因HoCL,在Genbank登录号为FJ573148,开放阅读框（ORF）长1599bp,编码532个氨基酸,含有3个半胱氨酸残基,具有Ser207,Asp333和His422的催化活性中心,推导的蛋白质分子量为59.5kDa,属于B类羧酸酯酶。6.以棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白和荧光增白剂FB28为先导物,测定了其对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜的作用和影响,发现棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白在不同浓度和不同时间下均不能降解两种鳃金龟的围食膜;采用液滴法喂食华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟10uL 1%的FB28,2.5h时,PM前端破损,扫描电镜观察中后段围食膜,发现围食膜上出现一些分布均匀的空洞;喂食至6h时,PM完全崩解,喂食至12h,PM基本恢复。可见,荧光增白剂FB28能够破坏鳃金龟围食膜,但破坏作用是短暂的、可修复的。为进一步研究荧光增白剂与病原微生物联合使用防治鳃金龟提供了理论依据。
何来[8]（2007）在《传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立》文中进行了进一步梳理禽传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是鸡的一种以呼吸困难、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿出血并导致糜烂为主要特征的病毒性呼吸道传染病，可致感染鸡的死亡和产蛋下降，是危害养禽业的重要疫病之一。传染性喉气管炎病毒（ILTV）野毒和弱毒疫苗都可以造成潜伏感染，成为传染源，使本病持续存在，并形成区域流行。本研究通过表达ILTV三个重要结构蛋白并纯化和建立间接ELISA方法，以筛选合适的诊断抗原并建立间接ELlSA方法，用于ILTV野毒感染的血清学检测。本研究首先克隆和测序了ILTV WG株gJ基因，gJ完整开放阅读框大小为2988bp，比ILTVUSDA株多30bp，推测编码的氨基酸序列单独形成一个表位。随后，通过PCR扩增出ILTV三重要囊膜糖蛋白gD、gE和gJ的主要抗原性区域，连接到原核表达载体pET-32a（+）中，经IPTG诱导在E．coli BL21（DE3）中表达，三重组蛋白r-gD、r-gE和r-gJ都有可溶性蛋白存于上清中，经His单克隆抗体鉴定后，非变性条件下用Ni树脂纯化r-gD、r-gE和r-gJ，ILTV阳性血清和制备的兔抗r-gD、r-gE、r-gJ单因子血清证实r-gD、r-gE和r-gJ都保留了抗原性。然后，对纯化的r-gD、r-gE和r-gJ进行了间接ELISA条件的探索，优化抗原浓度，血清稀释度，酶标二抗稀释倍数和封闭液；根据36份SPF阴性血清，按阴阳性临界值=阴性血清OD405平均值+3×SD，确立了r-gD、r-gE和r-gJ间接ELISA判定标准；完成了特异性试验和符合性试验，r-gD、r-gE和r-gJ间接ELISA对139份血清样品的检测结果与全病毒间接ELISA的符合率分别为92.8％、77.0％和77.0％；对试验感染ILTV WG株的SPF鸡血清进行检测，r-gD、r-gE和r-gJ间接ELISA都能检测出明显的抗体变化曲线，其中r-gD间接ELISA能够更合理的反映ILTV感染后机体的体液免疫状况。根据试验结果，我们选择r-gD为ILTV野毒感染的血清抗体检测ELISA抗原，并确立了间接ELISA方法。本研究筛选r-gD为ELISA抗原，确立间接ELISA方法，为ILTV野毒感染与弱毒疫苗免疫的血清检测提供基础。
张强[9]（2007）在《表达亚洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株构建及其复制非必需区筛选》文中进行了进一步梳理羊痘（Capripox，CP）是由绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GTPV）引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。病畜以体温升高，全身性丘疹或结节、水疱、内脏病变、乃至死亡为特征。口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and moth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫和羊痘都是危害性非常严重的疾病，均被世界动物卫生组织（OIE）列为A类重大传染病。本研究利用已经在我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株（AV41），利用病毒在细胞内的同源重组，构建表达Asial型口蹄疫P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株。同时，为了构建表达多个外源基因的重组山羊痘弱毒株，还采用随机克隆的方法，筛选出该毒株（AV41）的一个复制非必需区。（1）选择胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因区域作为外源基因插入位点构建重组病毒。提取GTPVAV41株基因组DNA，设计特异性引物扩增TK基因及其两侧翼片段，获得了长度为2078bp的TK基因及两侧的同源臂。其中TK基因的ORF为534bp，编码178个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，GTPVAV41株TK基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5％-100.0％之间，说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。（2）为了使重组病毒能高效表达外源基因，构建一个真核生物基因表达盒P7.5-EGFP-P，通过痘苗病毒P7.5启动子来启动绿色荧光蛋白和FMDV Asial/YNBS-58株衣壳蛋白前体P1-2A3C的表达。以山羊痘病毒TK基因序列中的kpnⅠ酶切位点为插入点，将整体表达盒插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中，构建了共表达FMDVP1-2A3C基因和绿色荧光蛋白基因的重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-EGFP-P。（3）病毒转移载体pTK-P7.5-EGFP-P转染GTPV AV41株感染的BHK-21细胞，转染后24h就可见到特异性荧光。经绿色荧光筛选重组病毒，RT-PCR检测FMDV P1-2A、3C基因，抗原捕获ELISA检测FMDV抗原，结果表明，成功获得了能稳定、正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV。毒价测定结果表明，重组毒在BHK-21细胞上的毒价为105.5TCID50/0.1mL。（4）提取GTPVAV41株病毒基因组用HindⅢ酶切，酶切片段克隆到pUC18质粒中，得到6个不同大小的HindⅢ片段Puc18-A、Puc18-B、Puc18-C、Puc18-D、Puc18-E和Puc18-F，分别插入P7.5-P7.5-LacZ报告基因构建了PUA1，PUB1，PUC1，PUD1，PUE1，PUF1等6个重组转移载体质粒，转移载体转染GTPVAV41株感染的BHK-21细胞。在X-gal存在条件下通过蓝白斑筛选，获得了一株稳定表达LacZ基因的山羊痘病毒重组弱毒株，筛选出了GTPV AV41株的1个复制非必需基因片段。本研究首次在国内外尝试用山羊痘弱毒疫苗毒株为活载体表达FMDV基因，为反刍动物烈性传染病的防治开创了新的思路。羊痘病毒活载体的构建，将为反刍动物疾病基因工程活载体疫苗的研究奠定基础。
丁芳[10]（2006）在《柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究》文中研究指明柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界性柑橘生产上的毁灭性病害。易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎叶病；病原分别为Citrus tristeza virus（CTV），Citrus exocortis viroid（CEVd），Citrus tatter leaf virus（CTLV）。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV为对象，从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究；目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系；在分子水平上明确其部分分子特性。另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及机理。主要获得结果如下： 1．HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化。以长春花和椪柑为指示植物，部分待检材料表现了明显HLB症状。通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整，建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测技术；并对三种方法的检测灵敏度进行比较，结果发现Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测灵敏度远高于常规PCR，是常规PCR的104倍。运用Nested-PCR技术在黄皮上检测出HLB病菌（Candidatus Liberobacter asiaticus），在国内外属于首次报道。 2．不同引物检测HLB病菌灵敏度比较。对基于rplA／rplK，β-operon，16SrDNA和16S／23SrDNA不同基因组序列设计的5对引物依次为fP400／rP400，fP535／rP535，fA2／rJ5，fOI1／rOI2c，fOI2／r23S1检测HLB病菌灵敏度进行了比较，结果发现不同引物检测灵敏度不一样，其检测灵敏度由高到低依次为：fP400／rP400＞fP535／rP535＞fA2／rJ5＞fOI1／rOI2c＞fOI2／r23S1。 3．HLB菌亚洲株系分子鉴定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-SSCP分析及基于16SrDNA序列中国柑橘黄龙病菌属分类地位的确立，分析结果显示来自中国7省区9个代表性的分离物16SrDNA高度保守，全部属于亚洲菌系（Candidatus Liberobacter asiaticus）。HLB病菌16S／23SrDNA间区序列分析及系统进化树分析结果显示：来自中国7省区分布在不同的寄主体内、导致寄主表现不同症状的18个分离物在该区段没有发生显着变异，各分离物之间的同源性达99％以上，全部与亚洲菌系（Candidatus Liberobacter asiaticus）高度同源，而与非洲菌系（Candidatus Liberobacter africanum）差异较大。 4．HLB病菌Southern blotting检测。利用α-32P-dCTP标记16SrDNA探针进行HLB病菌Dot-blotting检测，结果发现Dot-blotting检测灵敏度高于常规PCR而低于Semi-Nested PCR及Nested-PCR，最低检测下限为30fg总核酸。 5．CTV生物学鉴定、RT-PCR检测技术的建立及来自不同寄主的21个分离物3’端、5’端分子特性分析。以墨西哥莱檬和甜橙为指示植物，待检样品表现典型的CTV致病症状。核苷酸序列多重比对分析结果显示：21个CTV分离物的5’端和3’端共4个变异区（A区，F区，CP，P20）存在明显的差异。A区的核苷酸序列
二、意大利蝗痘病毒超微结构及DNA酶切图谱(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、意大利蝗痘病毒超微结构及DNA酶切图谱(英文)（论文提纲范文）
（1）患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 长江江豚概况 |
| 1.1 江豚分类 |
| 1.2 江豚的地理分布 |
| 1.3 长江江豚的生活习性及特征 |
| 1.4 长江江豚现状 |
| 1.5 长江江豚保护生物学研究进展 |
| 2 长江江豚迁地保护概述 |
| 2.1 迁地保护 |
| 2.2 江豚迁地保护历史 |
| 2.3 长江江豚迁地保护现状 |
| 2.3.1 湖北石首天鹅洲江豚保护区天鹅洲故道江豚繁育群体 |
| 2.3.2 安徽铜陵淡水豚保护区夹江江豚繁育群体 |
| 2.3.3 安徽安庆西江迁地保护区江豚繁育群体 |
| 2.3.4 湖北何王庙/湖南集成垸迁地保护区江豚繁育群体 |
| 2.3.5 中国科学院水生生物研究所白鱀豚馆人工养殖种群 |
| 2.4 长江江豚迁地保护面临的问题 |
| 2.4.1 半自然水域长江江豚的繁殖生物学研究欠缺 |
| 2.4.2 长江江豚疫病防控体系不健全 |
| 2.4.3 人工调控和生态补偿机制不足 |
| 2.4.4 人为伤害和气候条件是潜在的致危因素 |
| 3 鲸豚类动物疾病研究进展 |
| 3.1 海洋鲸豚类动物细菌性疾病研究进展 |
| 3.2 海洋鲸豚类动物病毒性疾病研究进展 |
| 3.2.1 鲸豚源麻疹病毒 |
| 3.2.2 鲸类痘病毒 |
| 3.2.3 鲸类乳头状瘤病毒 |
| 3.2.4 疱疹病毒/类疱疹病毒 |
| 3.2.5 流感病毒 |
| 3.2.6 其他病毒 |
| 3.3 海洋鲸豚类动物真菌性疾病研究进展 |
| 3.4 海洋鲸豚类动物寄生虫性疾病研究进展 |
| 4 长江江豚疾病研究概况 |
| 4.1 长江江豚疾病研究现状 |
| 4.1.1 解剖学研究 |
| 4.1.2 血液生理学研究 |
| 4.1.3 饲养管理研究 |
| 4.1.4 疾病相关研究 |
| 4.2 有关长江江豚疾病防控的几点讨论 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第一章 长江江豚细菌性疾病流行病学调查 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 长江江豚源细菌的分离鉴定 |
| 2.2.3 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 长江江豚细菌性样品采集结果 |
| 3.2 细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.1 呼吸孔样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.2 粪便样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.3 内脏组织细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.4 皮肤病灶细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.5 腹腔积液细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.6 胸腔积液细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.7 血液样本细菌分离鉴定结果 |
| 3.3 细菌分离培养形态及染色镜检结果 |
| 3.4 细菌理化鉴定结果 |
| 3.5 细菌PCR鉴定结果 |
| 3.6 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定结果 |
| 3.6.1 测序数据处理 |
| 3.6.2 OTU分析和物种注释 |
| 3.6.3 各样品细菌多样性及相关性分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 长江江豚样品采集方法和处理方法的选择 |
| 4.2 水生哺乳动物细菌性疾病检测方法 |
| 4.3 长江江豚细菌性疾病流行情况 |
| 4.4 江豚呼吸道菌群与疾病的相关性 |
| 4.5 江豚胃肠道菌群与疾病的相关性 |
| 4.6 长江江豚的主要致病菌 |
| 5 总结 |
| 第二章 长江江豚主要致病菌生物学特性研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细菌样本 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌培养特性观察 |
| 2.2.2 细菌理化特性鉴定 |
| 2.2.3 PCR扩增和测序 |
| 2.2.4 基因序列分析 |
| 2.2.5 药物敏感性试验 |
| 2.2.6 细菌致病性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.1.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.1.2 嗜水气单胞菌YHA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.1.3 嗜水气单胞菌YHA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.1.4 嗜水气单胞菌YHA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.1.5 嗜水气单胞菌YHA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.2.1 维氏气单胞菌YVA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.2.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.2.3 维氏气单胞菌YVA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.2.4 维氏气单胞菌YVA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.2.5 维氏气单胞菌YVA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.3.1 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株细菌培养特性 |
| 3.3.2 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株遗传进化关系 |
| 3.3.4 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.3.5 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.4.1 魔氏摩根菌YMM-AQ株细菌培养特性 |
| 3.4.2 魔氏摩根菌YMM-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.4.3 魔氏摩根菌YMM-AQ株遗传进化关系 |
| 3.4.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.4.5 魔氏摩根菌YMM-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.5 大肠杆菌YE-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.5.1 大肠杆菌YE-AQ株细菌培养特性 |
| 3.5.2 大肠杆菌YE-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.5.3 大肠杆菌YE-AQ株遗传进化关系 |
| 3.5.4 大肠杆菌YE-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.5.5 大肠杆菌YE-AQ株小鼠致病力试验 |
| 3.6 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株生物学特性研究结果 |
| 3.6.1 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株细菌培养特性 |
| 3.6.2 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株理化特性鉴定结果 |
| 3.6.3 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株遗传进化关系 |
| 3.6.4 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株药物敏感性试验结果 |
| 3.6.5 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株小鼠致病力试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 长江江豚常见致病菌的培养特性 |
| 4.2 长江江豚源细菌的鉴定方法 |
| 4.3 长江江豚源细菌的耐药性 |
| 4.4 长江江豚源细菌的致病性 |
| 5 结论 |
| 第三章 长江江豚病毒性疾病研究初探 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 病毒性疾病对人和动物的危害 |
| 1.2 长江江豚病毒性疾病研究现状 |
| 1.3 未知病毒检测方法研究进展 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料样本 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验试剂耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验流程 |
| 2.2.2 测序数据质控 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据质控 |
| 3.2 去除宿主污染 |
| 3.3 病毒组成分析 |
| 3.4 数据组装 |
| 3.5 病毒序列鉴定 |
| 3.5.1 基于参考序列的鉴定 |
| 3.5.2 Denovo病毒序列鉴定 |
| 3.5.3 基于参考序列鉴定与Denovo序列鉴定的比较 |
| 3.6 病毒丰度 |
| 3.7 基因预测 |
| 3.8 功能分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 高通量测序技术与未知病毒检测 |
| 4.2 长江江豚病毒宏基因组学样本的处理 |
| 4.3 检测相关病毒分析 |
| 5 总结 |
| 第四章 长江江豚的饲养管理与疾病防治研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 长江江豚的饲养管理 |
| 2.2.2 长江江豚血液学研究 |
| 2.2.3 长江江豚健康体检方法的建立 |
| 2.2.4 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究 |
| 2.2.5 长江江豚典型病例诊治分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.1 围网环境下长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.2 迁地保护区大面积水域长江江豚的饲养管理 |
| 3.1.3 疗养池长江江豚的饲养管理 |
| 3.2 长江江豚血液学研究 |
| 3.2.1 长江江豚血常规和血液生化指标测定方法的建立 |
| 3.2.2 长江江豚正常生理生化指标参考范围的确定 |
| 3.2.3 长江江豚生理生化指标与其疾病的相关性 |
| 3.2.4 长江江豚健康体检技术规范 |
| 3.2.5 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究 |
| 3.2.6 长江江豚典型病例诊治分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 羊口疮研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 ORFV的流行病学与临床症状 |
| 1.3 ORFV的病原学特征 |
| 1.3.1 痘病毒的分类 |
| 1.3.2 ORFV的形态结构 |
| 1.3.3 ORFV的基因组 |
| 1.3.4 ORFV的体外培养特征 |
| 1.4 抗病毒免疫和免疫逃避 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 ORFV的分离与间接免疫荧光检测 |
| 1.5.2 组织病理学检测 |
| 1.5.3 电子显微镜观察 |
| 1.5.4 病毒中和试验 |
| 1.5.5 PCR检测(Polymerase chain reaction,PCR) |
| 1.5.6 酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 1.5.7 限制性内切酶片段长度多态性(Restricted fragment length polymorphisms,RFLP)分析 |
| 1.5.8 环介导等温扩增快速检测(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP) |
| 1.6 羊口疮的防治 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 ORFV B2L、VIR和F1L基因的遗传进化树分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病料、质粒及菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病料采集与处理 |
| 2.2.2 痂皮悬液的鉴定 |
| 2.2.3 病理组织切片的制备 |
| 2.2.4 遗传进化树分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 痂皮悬液的鉴定 |
| 2.3.2 病理组织切片观察 |
| 2.3.3 遗传进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 ORFVB2L和F1L基因的原核表达及纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 疫苗、菌株及器材 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 基因组的提取 |
| 3.2.2 重组质粒pET28a-B2L和pET28a-F1L的构建及鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒pET28a-B2L和pET28a-F1L的表达及条件优化 |
| 3.2.4 融合蛋白His-B2L和His-F1L的纯化及鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 B2L、F1L基因PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒pET28a-B2L和pET28a-F1L的鉴定及测序 |
| 3.3.3 重组质粒pET28a-B2L和pET28a-F1L的表达及条件优化 |
| 3.3.4 融合蛋白His-B2L和His-F1L的纯化及鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 4 ORFVB2L和F1L基因的真核表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株和载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 真核表达质粒pEGFP-N1-B2L和pEGFP-N1-F1L的构建及鉴定 |
| 4.2.2 无内毒素真核表达质粒的提取 |
| 4.2.3 羊睾丸细胞的培养和冻存 |
| 4.2.4 重组质粒转染羊睾丸细胞 |
| 4.2.5 融合蛋白EGFP-B2L和EGFP-F1L的表达检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 B2L、F1L基因PCR扩增结果 |
| 4.3.2 真核表达质粒pEGFP-N1-B2L和pEGFP-N1-F1L的鉴定及测序 |
| 4.3.3 荧光显微镜观察结果 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测结果 |
| 4.3.5 融合蛋白EGFP-B2L和EGFP-F1L的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 抗B2L和F1L多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验器械 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.1.5 主要试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫原的制备 |
| 5.2.2 兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体的制备 |
| 5.2.3 兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体效价测定 |
| 5.2.4 兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体特异性鉴定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体效价测定结果 |
| 5.3.2 兔抗His-B2L和His-F1L多克隆抗体特异性鉴定结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 引言 |
| 1 鸭瘟病毒分子生物学研究概况 |
| 1.1 鸭瘟病毒病原 |
| 1.2 鸭瘟病毒粒子形态结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 鸭瘟病毒编码蛋白 |
| 1.4.1 结构蛋白 |
| 1.4.2 非结构蛋白 |
| 1.5 鸭瘟病毒的复制周期 |
| 2 细菌人工染色体技术研究进展 |
| 2.1 细菌人工染色体技术 |
| 2.2 细菌人工染色体的修饰技术 |
| 2.2.1 Red/ET介导的同源重组 |
| 2.2.2 RecA蛋白介导的同源重组 |
| 2.2.3 Cre/LoxP介导的同源重组 |
| 2.2.4 Tn转座子介导的随机插入和突变技术 |
| 2.3 细菌人工染色体在疱疹病毒研究研究中的应用 |
| 3 疱疹病毒UL55基因及编码蛋白功能研究进展 |
| 3.1 疱疹病毒UL55基因及其编码蛋白的特点 |
| 3.1.1 UL55基因序列的特点 |
| 3.1.2 UL55基因的基因类型 |
| 3.1.3 UL55基因编码蛋白的类型 |
| 3.1.4 UL55编码蛋白的性质 |
| 3.2 疱疹病毒UL55编码蛋白的定位 |
| 3.2.1 UL55蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.2 UL55蛋白在病毒自身内的定位 |
| 3.3 疱疹病毒UL55蛋白的功能 |
| 3.3.1 UL55蛋白与病毒复制 |
| 3.3.2 UL55蛋白与转录调节 |
| 3.3.3. UL55蛋白与免疫 |
| 3.3.4 UL55同系物蛋白在DIPs感染中的作用 |
| 3.3.5. UL55蛋白与核基质(细胞核骨架)的作用 |
| 3.3.6 UL55蛋白与ICP35的关联 |
| 3.3.7 UL55缺失的影响 |
| 3.4 展望 |
| 4 本研究目的及意义 |
| 第二章 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 |
| 2.2 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 2.2.1 DPV CHv基因组基本特性分析 |
| 2.2.2 DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 |
| 2.3 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 2.3.1 DPV CHv密码子使用分析 |
| 2.3.2 密码子参数之间的关联性分析 |
| 2.3.3 DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类密码子对比分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组图谱构建 |
| 3.2 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 3.2.1 DPV CHv基因组基本特性分析 |
| 3.2.2 DPV CHv与参考鸭瘟毒株的同源性比较分析 |
| 3.3 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 3.3.1 DPV CHv密码子使用分析 |
| 3.3.2 密码子参数之间的关联性分析 |
| 3.3.3 DPV CHv基因组密码子与大肠杆菌、酵母及人类的密码子比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析 |
| 4.2 DPV CHv基因组密码子使用模式分析 |
| 第三章 鸭瘟病毒中国强毒株UL55基因生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、鸭胚 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 试剂、材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL55基因T克隆 |
| 2.1.1 鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备 |
| 2.1.2 鸭瘟病毒的增殖 |
| 2.1.3 DPV DNA提取 |
| 2.1.4 UL55基因的PCR扩增 |
| 2.1.5 DH5α化学感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 UL55基因的T克隆 |
| 2.1.7 UL55基因T克隆质粒pMD18T/UL55的提取 |
| 2.1.8 质粒PCR鉴定 |
| 2.1.9 酶切鉴定 |
| 2.2 DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 |
| 2.2.1 开放性阅读框搜素及分子特性分析 |
| 2.2.2 基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 |
| 2.2.3 UL55基因密码子偏好性分析 |
| 2.3 DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL55基因分子克隆 |
| 3.1.1 DPV UL55基因的PCR |
| 3.1.2 DPV UL55基因T克隆pMD18-T/UL55的鉴定 |
| 3.2 DPV UL55基因核酸序列分子特性分析 |
| 3.2.1 开放性阅读框搜素及分子特性分析 |
| 3.2.2 基于UL55基因核苷酸序列的分子进化树分析 |
| 3.3 DPV UL55基因编码蛋白分子特性分析 |
| 3.3.1 DPV UL55基因编码蛋白基本特性分析 |
| 3.3.2 DPV UL55基因及同系物氨基酸序列比对 |
| 3.3.3 DPV UL55基因编码蛋白信号肽切割位点预测 |
| 3.3.4 DPV UL55编码蛋白跨膜区预测 |
| 3.3.5 DPV UL55编码蛋白亲疏水性分析 |
| 3.3.6 DPV UL55编码蛋白磷酸化位点预测 |
| 3.3.7 DPV UL55基因氨基酸序列N-糖基化位点预测 |
| 3.3.8 DPV UL55基因编码蛋白功能位点预测 |
| 3.3.9 DPV UL55基因编码蛋白抗原性分析 |
| 3.3.10 DPV UL55基因编码蛋白质的细胞内定位 |
| 3.3.11 DPV UL55基因氨基酸序列的二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因及编码蛋白基本特性分析 |
| 4.2 DPV UL55基因进化树分析 |
| 4.3 DPV UL55基因密码子偏好性分析 |
| 第四章 鸭瘟病毒UL55基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、鸭胚、试验动物 |
| 1.2 菌株、载体 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 1.4.1 IPTG溶液 |
| 1.4.2 SDS-PAGE电泳相关溶液 |
| 1.4.3 Western-Blot相关溶液 |
| 1.4.4 蛋白纯化、复性试剂 |
| 1.4.5 抗体制备、纯化试剂 |
| 1.4.6 其他试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 原核表达质粒pET32a(+)/UL55的构建 |
| 2.1.1 pMD18-T/UL55及pET32a(+)的质粒提取及酶切 |
| 2.1.2 连接回收产物,构建pET-32a(+)/UL55重组表达质粒 |
| 2.1.3. DH5α化学感受态细胞的制备 |
| 2.1.4 重组表达质粒的转化 |
| 2.1.5 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组表达质粒pET32a(+)/UL55的诱导表达 |
| 2.2.1 重组表达质粒的提取 |
| 2.2.2 重组表达质粒转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3) |
| 2.2.3 重组质粒的诱导表达 |
| 2.2.4 重组质粒表达产物的可溶性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET32a(+)/UL55表达诱导条件的优化 |
| 2.3.1 诱导剂IPTG浓度优化 |
| 2.3.2 诱导时间优化 |
| 2.3.3 诱导温度优化 |
| 2.4 重组UL55蛋白的大量制备、纯化与复性 |
| 2.4.1 菌体的大量培养 |
| 2.4.2 重组UL55蛋白的包涵体洗涤法大量纯化 |
| 2.4.3 重组UL55蛋白的复性和检测 |
| 2.5 重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的反应原性 |
| 2.5.1 兔抗DPV CHv IgG的纯化 |
| 2.5.2 重组UL55蛋白与DPV全病毒抗血清的免疫印(western-blot) |
| 2.6 兔抗UL55蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.6.1 重组UL55蛋白抗原的制备 |
| 2.6.2 免疫程序 |
| 2.6.3 琼扩测定兔抗UL55蛋白抗体效价 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 原核表达质粒pET-32a(+)/UL55的构建与鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒pET3-2a(+)/UL55的诱导表达 |
| 3.3 重组质粒pET-32a(+)/UL55诱导表达条件的优化 |
| 3.4 重组UL55蛋白的纯化 |
| 3.5 重组UL55蛋白与DPV抗血清的反应原性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 UL55重组蛋白表达系统的选择 |
| 4.2 蛋白的表达和包涵体形成 |
| 4.3 蛋白的纯化、复性 |
| 4.4 兔抗多克隆抗体的制备和纯化 |
| 第五章 原核表达UL55蛋白作为抗原检测抗DPV血清的间接ELISA方法的建立及应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 蛋白 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组UL55蛋白的原核表达蛋白、纯化及复性 |
| 2.2 基于重组UL55蛋白的间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法的基本程序 |
| 2.2.2 抗原和血清最佳稀释度的选择 |
| 2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度优化 |
| 2.2.4 UL55-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 2.2.5 UL55-ELISA敏感性试验 |
| 2.2.6 UL55-ELISA特异性试验 |
| 2.2.7 阻断试验 |
| 2.2.8 重复性试验 |
| 2.2.9 UL55-ELISA的应用 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 重组UL55蛋白包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2 酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 3.3 UL55-ELISA方法阴阳临界值的确定 |
| 3.4 UL55-ELISA敏感性试验 |
| 3.5 UL55-ELISA特异性试验 |
| 3.6 UL55-ELISA阻断试验 |
| 3.7 UL55-ELISA重复性试验 |
| 3.8 UL55-ELISA与中和试验、DPV-ELISA对临床样本检测的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 包被抗原和血清对间接ELISA的影响 |
| 4.2 酶标二抗对间接ELISA的影响 |
| 4.3 pUL55-ELISA方法的条件优化 |
| 4.4 基于UL55重组蛋白的间接ELISA方法与诊断标准方法的比较 |
| 第六章 鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 |
| 2.1.1 质粒模板的制备 |
| 2.1.2 引物特异性检测 |
| 2.1.3 定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.1.4 RNA提取和cDNA合成 |
| 2.1.5 样品的定量检测 |
| 2.1.6 药物抑制试验 |
| 2.2 DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相分析 |
| 2.2.1 DEF制备与病毒增殖 |
| 2.2.2 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 Western-blot分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV体外感染宿主细胞UL55基因转录时相分析 |
| 3.1.1 引物特异性检测 |
| 3.1.2 标准曲线的建立 |
| 3.1.3 RNA纯度及完整性检测 |
| 3.1.4 样品的定量检测 |
| 3.1.5 药物抑制试验 |
| 3.2 Western-blot分析DPV体外感染宿主细胞UL55基因表达时相 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因转录时相分析 |
| 4.2 DPV UL55基因在感染宿主细胞中的表达时相分析 |
| 第七章 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚/试验动物/血清 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 血清 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 1.7 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 |
| 2.1.1 EGFP绿色荧光蛋白表达盒的克隆 |
| 2.1.2 DPV CHv TK区域左右侧同源臂的克隆 |
| 2.1.3 重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 |
| 2.2 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 |
| 2.2.1 转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的提取 |
| 2.2.2 转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11与DPV DNA共转染 |
| 2.2.3 重组病毒DPV CHv-BAC-G的初步筛选、富集和纯化 |
| 2.2.4 重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 |
| 2.3 重组鸭瘟病毒电转化克隆的获取 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 DPV CHv-BAC-G环化基因组DNA的提取 |
| 2.3.3 电击转化筛选重组BAC克隆 |
| 2.3.4 BAC转化子的鉴定 |
| 2.3.4.1 菌落PCR |
| 2.4 重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 |
| 2.4.1 转染用pBAC-DPV的提取 |
| 2.4.2 将pBAC-DPV转染进DEF |
| 2.4.3 拯救DPV全基因组感染性克隆 |
| 2.4.4 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的鉴定 |
| 2.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 |
| 2.5.1 病毒定量(TCID50测定) |
| 2.5.2 空斑试验 |
| 2.5.3 一步生长曲线 |
| 2.5.4 DPV CHv和DPV Chv-BAC-G对鸭的致病性比较 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建 |
| 3.1.1 EGFP表达盒的扩增、克隆 |
| 3.1.2 DPV左右同源臂的克隆 |
| 3.1.3 重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建 |
| 3.2 细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建 |
| 3.2.1 重组病毒的初步筛选和纯化 |
| 3.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 3.3 重组鸭瘟病毒电转化克隆子的获取 |
| 3.4 重组DPV全基因组感染性克隆的拯救 |
| 3.4.1 拯救重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.4.2 拯救病毒的IFA鉴定 |
| 3.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G的体内外生物学特性分析 |
| 3.5.1 空斑试验 |
| 3.5.2 一步生长曲线测定 |
| 3.5.3 DPV CHv和DPV CHv-BAC-G对鸭的致病性比较 |
| 4 讨论 |
| 第八章 重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体内外生物学特性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 菌株/载体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 血清 |
| 1.5 试剂、材料 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 1.7 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 第一轮RED重组敲除UL55基因 |
| 2.1.1 同源打靶片段的扩增、回收 |
| 2.1.2 将pKD46转化至包含DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B中 |
| 2.1.3 包含pKD46和DPV CHv-BAC-G感染性克隆的DH10B电转感受态细胞的制备 |
| 2.1.4 电转化将线性打靶片段转入表达RED重组酶基因的菌株 |
| 2.2 第二轮RED重组去除Kana抗性基因 |
| 2.2.1 去除kana抗性基因 |
| 2.2.2 第二轮RED重组鉴定 |
| 2.3 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55 |
| 2.3.1 中量提取DPV CHv-BAC-GAUL55质粒 |
| 2.3.2 拯救DPV CHv-BAC-GAUL55病毒 |
| 2.3.4 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-GAUL55的鉴定 |
| 2.4 DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 |
| 2.4.1 UL55-Kana线性打靶片段的获取 |
| 2.4.2 第一轮RED重组(将UL55-Kana重组到DPV CHv-BAC-G△UL55基因组) |
| 2.4.3 第二轮RED重组(去除Kana) |
| 2.4.4 RFLP分析 |
| 2.4.5 DPV CHv-BAC-GAUL55/R的拯救及拯救病毒的鉴定 |
| 2.5 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 第一轮RED重组敲除UL55基因 |
| 3.1.1 同源打靶片段的扩增 |
| 3.1.2 转化pKD46的克隆子鉴定 |
| 3.1.3 UL55基因缺失第一轮RED重组鉴定 |
| 3.2 第二轮RED重组去除Kana抗性基因 |
| 3.3 UL55基因缺失株DPV CHv-BAC-G△UL55的拯救 |
| 3.4 DPV CHv-BAC-GAUL55R回复突变构建 |
| 3.4.1 UL55-Kana线性打靶片段的获取 |
| 3.4.2 构建DPV CHv-BAC-G△UL55R回复株第一轮RED重组鉴定 |
| 3.4.3 构建DPV CHv-BAC-GAUL55R回复株第二轮RED重组鉴定 |
| 3.4.4 RFLP分析 |
| 3.4.5 DPV CHv-BAC-G△UL55R的拯救及拯救病毒的鉴定 |
| 3.5 DPV CHv-BAC-G△UL55、DPV CHv-BAC-GAUL55/R的体外生物学特性分析 |
| 3.5.1 空斑试验 |
| 3.5.2 一步生长曲线测定 |
| 4 讨论 |
| 第九章 DPV UL55基因在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株/鸭胚 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位 |
| 2.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL55蛋白的表达和亚细胞定位方法的建立 |
| 2.1.2 间接免疫荧光检测条件优化 |
| 2.1.3 间接免疫荧光检测UL55蛋白表达的结果判定 |
| 2.1.4 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞中的动态定位监测 |
| 2.2 与UL26.5的共定位情况分析 |
| 2.2.1 鼠抗UL55多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 鼠抗UL55多克隆抗体和兔抗UL26.5多克隆抗体的纯化 |
| 2.2.3 UL55与UL26.5在DPV CHv感染宿主细胞内的共定位 |
| 2.2.4 UL55蛋白对UL26.5蛋白在细胞内定位的作用分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 3.2 DPV UL55基因编码蛋白与UL26.5的共定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL55基因编码蛋白在感染宿主细胞内的定位分析 |
| 4.2 UL55蛋白与UL26.5蛋白的共定位分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（4）CTV强毒分离物对柑橘基因表达的影响及其与寄主互作蛋白的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 柑橘衰退病的发生及危害 |
| 1.2 CTV的生物学特性 |
| 1.2.1 CTV的寄主范围 |
| 1.2.2 CTV的症状表现与株系划分 |
| 1.2.3 CTV的扩散和传播 |
| 1.3 CTV的分子生物学特性 |
| 1.4 CTV的诊断技术 |
| 1.5 病毒对寄主基因表达的影响 |
| 1.6 分离差异表达基因的方法 |
| 1.6.1 mRNA差异显示 |
| 1.6.2 基因表达系列分析 |
| 1.6.3 抑制差减杂交 |
| 1.6.4 基因芯片技术 |
| 1.6.5 RNA sequencing |
| 1.7 病毒与寄主的蛋白质互作 |
| 1.8 蛋白质互作筛选方法 |
| 1.8.1 酵母双杂交 |
| 1.8.2 免疫共沉淀 |
| 1.8.3 Pull-down |
| 1.8.4 双分子荧光互补 |
| 1.8.5 蛋白质芯片 |
| 1.9 蛋白质互作预测 |
| 1.10 此研究课题的目的与意义 |
| 第二章 CTV强毒株系N21诱导墨西哥梾檬差异表达基因的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 试验中用到的主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 墨西哥株檬总RNA的提取 |
| 2.2.4 mRNA的分离 |
| 2.2.5 差减文库的构建 |
| 2.2.5.1 双链cDNA的合成 |
| 2.2.5.2 Rsa I酶切及接头连接 |
| 2.2.5.3 两轮杂交反应 |
| 2.2.5.4 两轮抑制性PCR扩增 |
| 2.2.5.5 PCR产物的回收及连接 |
| 2.2.5.6 差减效率的评价 |
| 2.2.6 差减文库克隆的筛选 |
| 2.2.6.1 EST片段的PCR扩增 |
| 2.2.6.2 PCR产物在尼龙膜上的固定 |
| 2.2.6.3 放射性同位素(α-32P)标记探针的制备 |
| 2.2.6.4 预杂交及杂交 |
| 2.2.6.5 洗膜及显影 |
| 2.2.6.6 差异表达EST克隆的筛选 |
| 2.2.7 差异表达EST片段的荧光定量PCR验证 |
| 2.2.7.1 Tester及Driver样品总RNA的提取 |
| 2.2.7.2 总RNA的DNase I消化 |
| 2.2.7.3 cDNA的合成 |
| 2.2.7.4 荧光定量PCR扩增 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 差减文库的构建 |
| 2.3.1.1 Tester和Driver样品总RNA的分离及质量检测 |
| 2.3.1.2 mRNA的分离及质量检测 |
| 2.3.1.3 cDNA合成及酶切效果检测 |
| 2.3.1.4 接头连接效率检测 |
| 2.3.1.5 两轮抑制性PCR扩增 |
| 2.3.1.6 PCR产物的回收及连接 |
| 2.3.1.7 差减效率的评价 |
| 2.3.2 差异表达EST片段的筛选 |
| 2.3.2.1 差减文库插入片段的PCR扩增 |
| 2.3.2.2 未差减cDNA探针反向Southern杂交结果 |
| 2.3.2.3 差减cDNA探针反向Southern杂交结果 |
| 2.3.3 差异表达EST片段的序列同源性比对及生物学功能分析 |
| 2.3.4 差异表达EST片段的qRT-PCR验证 |
| 2.3.5 不同CTV分离物诱导寄主差异表达基因的比较 |
| 2.3.6 差异表达基因编码蛋白的互作预测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CTV-N21诱导墨西哥株檬差异表达基因的时间及空间表达分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 试验用到的主要试剂及试剂盒 |
| 3.2.3 总RNA的提取 |
| 3.2.4 总RNA的DNase I消化及cDNA的合成 |
| 3.2.5 寄主基因的相对定量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 防御及抗逆相关基因的时空表达动态 |
| 3.3.2 能量代谢相关基因的时空表达动态 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CTV-N21与墨西哥株檬及枳壳互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 试验用到的主要试剂及试剂盒 |
| 4.2.3 CTV-N21病毒蛋白钓饵载体的构建 |
| 4.2.3.1 CTV-N21基因的克隆 |
| 4.2.3.2 病毒蛋白钓饵的自激活和毒性测试 |
| 4.2.4 墨西哥株檬及枳壳cDNA酵母文库的构建 |
| 4.2.4.1 总RNA的提取及mRNA的纯化 |
| 4.2.4.2 墨西哥株檬及枳壳mRNA的RT-rPCR扩增 |
| 4.2.4.3 RT-rPCR扩增产物与载体的同源重组 |
| 4.2.5 酵母双杂交 |
| 4.2.6 质粒拯救 |
| 4.2.7 寄主互作蛋白编码基因的RACE全长扩增 |
| 4.2.8 寄主候选互作蛋白编码基因的序列分析 |
| 4.2.9 候选互作蛋白的酵母双杂交验证 |
| 4.2.10 互作蛋白的双分子荧光标记(BiFC)验证 |
| 4.2.10.1 荧光标记载体的构建 |
| 4.2.10.2 农杆菌介导转化本氏烟 |
| 4.2.10.3 寄主及病毒基因的瞬时表达 |
| 4.2.10.4 转化烟草细胞的荧光观察 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 病毒钓饵载体的构建 |
| 4.3.2 墨西哥梾檬及枳壳cDNA质粒文库的构建 |
| 4.3.2.1 总RNA的提取及mRNA的纯化 |
| 4.3.2.2 mRNA的RT-rPCR扩增 |
| 4.3.3 互作蛋白的酵母双杂交筛选及验证 |
| 4.3.3.1 病毒与寄主互作蛋白的酵母双杂交筛选 |
| 4.3.3.2 寄主候选基因BD及AD载体的构建 |
| 4.3.3.3 病毒与寄主互作蛋白的酵母双杂交验证 |
| 4.3.3.4 互作蛋白编码基因的生物信息学分析 |
| 4.3.4 互作蛋白的BiFC验证 |
| 4.3.4.1 病毒及寄主基因的BiFC载体构建 |
| 4.3.4.2 病毒及寄主基因瞬时表达的RT-PCR检测 |
| 4.3.4.3 BiFC荧光观察 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 抑制差减杂交所用接头和引物 |
| 附录2 pSPYNE和pSPYCE载体信息 |
| 附录3 pGBKT7的限制性酶切图谱及多克隆位点 |
| 附录4 pGADT7的限制性酶切图谱及多克隆位点 |
| 附录5.差减文库中上调及下调表达基因的功能分类 |
| 附录6.CTV强毒及弱毒株系在不同寄主上诱导差异表达基因的比较 |
| 附录7 主要试剂及溶液的配制 |
| 附录8 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 羊传染性脓疱病毒的研究进展 |
| 1.1 病毒基因组特征 |
| 1.2 流行病学特点 |
| 1.3 诊断方法研究 |
| 1.4 免疫调节机制 |
| 1.5 宿主抗病毒免疫 |
| 1.6 ORFV 载体的应用 |
| 1.7 灭活 ORFV 的免疫增强作用 |
| 1.8 小结 |
| 第2章 羊传染性脓疱病毒的致病机理、免疫特性及疫苗研究 |
| 2.1 ORFV 的致病机理 |
| 2.2 抗副痘病毒免疫反应 |
| 2.3 副痘病毒的免疫逃逸 |
| 2.4 痘病毒编码的免疫调节蛋白 |
| 2.5 灭活副痘病毒的调节机制 |
| 2.6 副痘病毒疫苗免疫和重组疫苗 |
| 2.7 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 吉林省羊传染性脓疱病流行病学调查及分析 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 吉林省羊传染性脓疱病毒的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 羊传染性脓疱病毒白城分离株油乳剂灭活疫苗的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 羊传染性脓疱病毒油乳剂灭活疫苗的免疫试验研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的论文 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（6）羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第1章 羊传染性脓疱病毒基因组结构与功能 |
| 1.1 ORFV 发现简史 |
| 1.2 ORFV 基因组结构 |
| 1.3 ORFV 编码蛋白功能 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 羊传染性脓疱病毒免疫学及疫苗研究进展 |
| 2.1 ORFV 的免疫机制 |
| 2.2 ORFV 疫苗研究进展 |
| 2.3 小结 |
| 研究内容 |
| 第1章 一起绵羊暴发传染性脓疱病的诊断及病因分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2 章 羊传染性脓疱病毒JL/08/CC 株的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 羊传染性脓疱病毒DNA 疫苗表达质粒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 ORFV 重组DNA 疫苗对小鼠的试验免疫研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师及作者简介 |
（7）两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 昆虫中肠防御体系-围食膜 |
| 1.1.1 围食膜的结构组成 |
| 1.1.2 围食膜的功能 |
| 1.1.3 围食膜的形成及机理 |
| 1.2 生物防治促进因子 |
| 1.2.1 病毒增效蛋白 |
| 1.2.2 荧光增白剂 |
| 1.2.3 几丁质酶及几丁质合成抑制剂对围食膜的作用 |
| 1.2.4 外源凝集素对围食膜的作用 |
| 1.3 cDNA 文库—研究新基因的有效工具 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试昆虫病原微生物 |
| 2.1.3 供试菌株及试剂盒 |
| 2.1.4 供试抗体 |
| 2.1.5 常用培养基 |
| 2.1.6 常用试剂及溶液 |
| 2.1.7 常用蛋白与DNA Marker |
| 2.1.8 常用仪器设备 |
| 2.2 方法步骤 |
| 2.2.1 围食膜的形态观察 |
| 2.2.2 围食膜组分含量测定 |
| 2.2.3 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 2.2.4 围食膜蛋白的筛选 |
| 2.2.5 围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 2.2.6 丝氨酸蛋白酶的原核表达 |
| 2.2.7 增效蛋白对PM 的作用 |
| 2.2.8 荧光增白剂FB28对PM的作用与影响 |
| 2.2.9 低温对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 3.1.1 PM 的生理位置 |
| 3.1.2 PM 的结构组成 |
| 3.2 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 3.2.1 总RNA 的提取 |
| 3.2.2 cDNA 第一链、第二链的合成 |
| 3.2.3 cDNA 分级分离及定量 |
| 3.2.4 文库的容量及重组率 |
| 3.2.5 PCR 鉴定文库插入片段大小 |
| 3.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的筛选 |
| 3.3.1 利用棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.2 利用粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.3 华北大黑鳃金龟PM 蛋白基因序列分析 |
| 3.4 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 3.4.1 重组表达质粒 PET-21b-Ho-Peritrophin 的构建 |
| 3.4.2 重组子的鉴定 |
| 3.4.3 围食膜蛋白在原核系统的表达 |
| 3.4.4 重组围食膜蛋白的几丁质结合活性 |
| 3.5 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.1 丝氨酸蛋白酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.2 羧酸酯酶的筛选与序列分析 |
| 3.6 生物防治促进因子对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3.6.1 增效蛋白对PM 的影响 |
| 3.6.2 荧光增白剂 FB28 对 PM 的作用与影响 |
| 3.7 低温对PM 的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 4.1.1 PM 的形态与结构分析 |
| 4.1.2 PM 蛋白及糖含量分析 |
| 4.2 cDNA 文库的构建 |
| 4.2.1 高质量的RNA 和载体 |
| 4.2.2 cDNA 文库质量 |
| 4.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的分离及鉴定 |
| 4.3.1 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的筛选 |
| 4.3.2 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因克隆及鉴定 |
| 4.4 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶 |
| 4.4.1 丝氨酸蛋白酶 |
| 4.4.2 羧酸酯酶 |
| 4.5 增效蛋白及荧光增白剂对PM 的作用 |
| 4.5.1 增效蛋白对PM 的作用 |
| 4.5.2 荧光增白剂对PM 的作用与影响 |
| 4.6 问题与展望 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ILT和ILTV |
| 1.1.1 ILT的历史与ILTV的分类地位 |
| 1.1.2 ILTV的基本结构 |
| 1.1.3 ILTV的理化特征 |
| 1.1.4 ILTV的生物学特征 |
| 1.1.5 ILTV的免疫学特征 |
| 1.2 ILTV分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 ILTV基因组结构 |
| 1.2.2 ILTV的转录 |
| 1.2.3 ILTV的复制 |
| 1.2.4 ILTV主要功能蛋白的特性 |
| 1.2.5 ILTV感染和致病的分子机制 |
| 1.2.6 ILTV的分子检测技术 |
| 1.2.7 ILTV的基因工程疫苗 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 第二章 ILTV糖蛋白gD、gE、gJ的部分表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 质粒、细胞、病毒和实验动物 |
| 2.1.2 试剂和抗体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 ILTV gJ基因的克隆 |
| 2.1.5 ILTV gJ基因序列分析与比较 |
| 2.1.6 ILTV糖蛋白gD、gE、gJ部分表达载体的构建 |
| 2.1.7 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的SDS-PAGE分析 |
| 2.1.8 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的Western blot分析 |
| 2.1.9 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的纯化 |
| 2.1.10 纯化重组蛋白的Western blot分析 |
| 2.1.11 兔抗r-gD、r-gE、r-gJ单因子血清的制备 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ILTV gJ基因扩增 |
| 2.2.2 ILTV gJ基因序列分析与比较 |
| 2.2.3 ILTV gD、gE、gJ抗原性分析与引物设计结果 |
| 2.2.4 PCR扩增结果 |
| 2.2.5 ILTV gD、gE、gJ表达载体鉴定 |
| 2.2.6 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的SDS-PAGE结果 |
| 2.2.7 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的Western blot结果 |
| 2.2.8 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ纯化结果 |
| 2.2.9 纯化重组蛋白的Western blot结果 |
| 2.2.10 兔抗r-gD、r-gE、r-gJ单因子血清制备结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 ILTV r-gD、r-gE、r-gJ间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物、试验血清和病毒 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 溶液的配制 |
| 3.1.4 重组蛋白r-gD、r-gE、r-gJ的制备和纯化 |
| 3.1.5 酶标二抗最适稀释度的确定 |
| 3.1.6 抗原最适包被浓度与阴阳性血清最适工作浓度的确定 |
| 3.1.7 封闭液的选择 |
| 3.1.8 重组蛋白间接ELISA程序的确定 |
| 3.1.9 间接ELISA判定标准的制定 |
| 3.1.10 特异性试验 |
| 3.1.11 符合性试验 |
| 3.1.12 试验感染ILTV鸡血清抗体变化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 酶标二抗最适稀释度 |
| 3.2.2 抗原最适包被浓度与阴阳性血清最适工作浓度 |
| 3.2.3 最适封闭液 |
| 3.2.4 重组蛋白间接ELISA程序 |
| 3.2.5 间接ELISA判定标准的制定 |
| 3.2.6 特异性试验结果 |
| 3.2.7 符合性试验结果 |
| 3.2.8 试验感染ILTV鸡血清抗体变化 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）表达亚洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株构建及其复制非必需区筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪言 |
| 1.1 羊痘病毒的研究进展 |
| 1.1.1 羊痘病的流行概况 |
| 1.1.2 羊痘病毒的基本特征 |
| 1.1.3 羊痘病毒基因组结构 |
| 1.1.4 羊痘病毒重要基因、蛋白研究 |
| 1.1.5 羊痘诊断技术研究进展 |
| 1.1.6 羊痘病毒与宿主免疫系统相互关系研究 |
| 1.1.7 羊痘疫苗研究进展 |
| 1.2 口蹄疫病毒基因组结构概述及活载体疫苗研究进展 |
| 1.2.1 FMDV基因组结构概述 |
| 1.2.2 FMDV活载体疫苗研究进展 |
| 1.3 疫苗研究中应用的载体病毒 |
| 1.3.1 痘病毒 |
| 1.3.2 腺病毒 |
| 1.3.3 甲病毒 |
| 1.3.4 脊髓灰质炎病毒 |
| 1.3.5 疱疹病毒 |
| 1.3.6 其它病毒 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 山羊痘病毒AV41株胸苷激酶基因及侧翼片段的克隆和序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒载体与宿主菌 |
| 2.1.2 毒株与细胞 |
| 2.1.3 主要试剂与设备 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GTPV的增殖 |
| 2.2.2 GTPV基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.2.4 目的DNA片段的纯化回收 |
| 2.2.5 扩增片段与T载体的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 重组质粒提取 |
| 2.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因PCR扩增产物 |
| 2.3.2 重组质粒酶切鉴定和PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒序列分析 |
| 2.3.4 氨基酸序列比较 |
| 2.3.5 同源性分析与遗传进化树构建 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 含Asia 1型FMDV P1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 FMDV P12A、3C基因的获得 |
| 3.2.2 痘苗病毒启动子与荧光蛋白(EGFP)筛选基因获得 |
| 3.2.3 整体表达盒的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FMDV P12A、3C基因的获得鉴定 |
| 3.3.2 痘苗启动子P7.5基因与荧光蛋白(EGFP)筛选基因获得与鉴定 |
| 3.3.3 整体表达盒的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 含外源基因的转移载体的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转移载体骨架的构建及鉴定 |
| 4.2.2 含FMDV P1-2A、3C及EGFP基因的山羊痘病毒转移载体的构建 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转移载体骨架鉴定 |
| 4.3.2 共表达FMDV P12A3C及EGFP基因的山羊痘病毒转移载体的构建鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 表达Asia 1型FMDV P1-2A和3C基因的GTPV弱毒株构建与鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒株和细胞 |
| 5.1.2 细胞培养用品、试剂 |
| 5.1.3 GTPV AV41株适应细胞传代 |
| 5.1.4 GTPV AV41与脂质体共转染BHK-21细胞 |
| 5.1.5 重组病毒的筛选和纯化 |
| 5.1.6 重组病毒的提纯与电镜观察 |
| 5.1.7 RT-PCR检测目的基因 |
| 5.1.8 抗原捕获ELISA检测目的蛋白 |
| 5.1.9 重组病毒的遗传稳定性试验 |
| 5.1.10 有限稀释法测定重组GTPV毒价 |
| 5.1.11 实验动物免疫 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 羊痘病毒感染BHK-21细胞后的病变图 |
| 5.2.2 绿色荧光标签筛毒 |
| 5.2.3 提纯后羊痘病毒的电镜照片 |
| 5.2.4 RT-PCR鉴定 |
| 5.2.5 抗原捕获ELISA检测 |
| 5.2.6 重组GTPV毒价测定 |
| 5.2.7 重组GTPV的遗传稳定性试验 |
| 5.2.8 血清抗体检测结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 GTPV AV41株复制非必需区筛选及表达LacZ基因的突变株的构建 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 病毒与细胞 |
| 6.1.2 菌种、载体 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器、设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 GTPV的增殖 |
| 6.2.2 GTPV基因组DNA的提取 |
| 6.2.3 GTPV AV41毒株部分HindⅢ片段的克隆和鉴定 |
| 6.2.4 GTPV复制非必需片段的筛选 |
| 6.2.5 重组病毒遗传稳定性试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 病毒基因组的提取和鉴定 |
| 6.3.2 重组质粒鉴定 |
| 6.3.3 P_(7.5)-P_(7.5)-LacZ基因框的获得 |
| 6.3.4 含有P_(7.5)-P_(7.5)-LacZ基因框的重组载体质粒的获得 |
| 6.3.5 CPV复制非必需片段的筛选 |
| 6.3.6 复制非必需区的遗传稳定性试验 |
| 6.4.讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.柑橘黄龙病国内外研究进展 |
| 1.1 柑橘黄龙病分布、危害 |
| 1.2 柑橘黄龙病生物学特性 |
| 1.3 柑橘黄龙病菌的认识过程 |
| 1.4 柑橘黄龙病菌的诊断及检测 |
| 1.5 柑橘黄龙病菌分子进化特性研究 |
| 2.其它主要柑橘病毒病及类似病害研究概况 |
| 2.1 柑橘病毒病及类似病害的种类 |
| 2.2 柑橘病毒病及类似病害的危害及主要生物学特性 |
| 2.2.1 柑橘衰退病分布、危害及生物学特性 |
| 2.2.2 柑橘裂皮病分布、危害及生物学特性 |
| 2.2.3 柑橘碎叶病分布、危害及生物学特性 |
| 2.3 柑橘病毒病及类似病害病原性质及分子特性 |
| 2.3.1 CTV的主要性状及分子特性 |
| 2.3.2 CEVd的主要性状及分子特性 |
| 2.3.3 CTLV的主要性状及分子特性 |
| 2.4 柑橘病毒病及类似病害病原鉴定及检测技术研究概况 |
| 2.4.1 生物学鉴定法 |
| 2.4.2 镜检法 |
| 2.4.3 血清学方法 |
| 2.4.4 分子生物学方法 |
| 2.5 柑橘病毒病及类似病害病原脱除研究 |
| 2.5.1 热处理脱毒 |
| 2.5.2 茎尖培养 |
| 2.5.3 茎尖微芽嫁接脱毒 |
| 2.5.4 热处理结合茎尖嫁接脱毒 |
| 2.5.6 珠心胚培养 |
| 2.5.7 超低温处理脱毒 |
| 2.6 柑橘病毒病及类似病害的防治 |
| 2.6.1 交互保护作用 |
| 2.6.2 抗病毒基因工程 |
| 3 研究的目的和意义 |
| 第2章 HLB病菌PCR检测体系建立及亚洲株系(Candidatus Liberobacter asiaticus)分子鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 材料与方法 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 方法 |
| 1.4.结果与分析 |
| 1.4.1 生物学性状观察结果 |
| 1.4.2 HLB病菌显微镜观察结果 |
| 1.4.3 分子生物学检测结果 |
| 1.4.4 HLB病菌亚洲株系(Candidatus Liberobacter asiaticus)分子鉴定 |
| 1.4.5 Southern blotting检测结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 HLB病菌显微镜观察 |
| 1.5.2 HLB病菌PCR检测 |
| 1.5.3 HLB病菌16S rDNA片断PCR-RFLP及序列分析 |
| 1.5.4 HLB病菌16S／23S rDNA间区序列分析 |
| 1.5.5 HLB病菌Southern blotting检测 |
| 第3章 CTV、CEVd、CTLV检测技术建立及分子特性研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 生物学性状观察及鉴定结果 |
| 1.3.2 分子生物学检测结果 |
| 1.3.3 CTV分离物分子特性分析 |
| 1.3.4 CEVd分离物分子特性分析 |
| 1.3.5 CTLV RT-PCR检测及3'端分子特性分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 CTV,CEVd,CTLV生物学鉴定 |
| 1.4.2 CTV,CEVd,CTLV RT-PCR检测 |
| 1.4.3 HLB,CTV,CEVd多重RT-PCR检测 |
| 1.4.4 CTV分离物分子特性分析 |
| 1.4.5 CEVd分离物分子特性分析 |
| 1.4.6 CTLV分离物分子特性分析 |
| 第4章 超低温处理脱除HLB病菌、CTV、CEVd的初步研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 柑橘成年态茎段离体培养 |
| 1.3.2 玻璃化法超低温技术条件摸索 |
| 1.3.3 玻璃化法超低温处理脱毒 |
| 1.3.4 玻璃化法超低温脱毒机理的初步探讨 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 柑橘成年态茎段的离体培养 |
| 1.4.2 柑橘茎尖玻璃化法超低温技术的影响因素 |
| 1.4.3 超低温技术脱毒 |
| 参考文献 |
| 图版与图版说明 |
| 附录1 发表文章 |
| 附录2 GenBank登陆序列号 |
| 致谢 |
四、意大利蝗痘病毒超微结构及DNA酶切图谱(英文)（论文参考文献）
- [1]患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究[D]. 刘志刚. 华中农业大学, 2020
- [2]羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备[D]. 李国华. 海南大学, 2017(02)
- [3]鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究[D]. 吴英. 四川农业大学, 2015(12)
- [4]CTV强毒分离物对柑橘基因表达的影响及其与寄主互作蛋白的鉴定[D]. 杨帆. 华中农业大学, 2013(12)
- [5]吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制[D]. 郭良兴. 吉林大学, 2012(03)
- [6]羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D]. 赵魁. 吉林大学, 2010(08)
- [7]两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定[D]. 周洪旭. 山东农业大学, 2009(03)
- [8]传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立[D]. 何来. 中国农业科学院, 2007(06)
- [9]表达亚洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株构建及其复制非必需区筛选[D]. 张强. 中国农业科学院, 2007(05)
- [10]柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究[D]. 丁芳. 华中农业大学, 2006(02)