一、日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位（论文文献综述）
岳永程[1]（2021）在《东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究》文中研究指明东毕吸虫病是由东毕属的六种虫体引起的一种人畜共患寄生虫病。在中国,主要流行的是土耳其斯坦东毕吸虫,成虫主要寄生在羊和牛的肠系膜静脉和肝门静脉中,病变主要发生在肝脏组织。东毕吸虫寄生在牛羊等终末宿主的血管中,虫体自身需要氧化还原酶来抵抗宿主免疫系统或代谢产生的活性氧自由基（ROS）,而东毕吸虫没有Trx和Grx这两种相互独立的系统,取而代之的是一种多功能酶——硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）系统,该酶具有硫氧还蛋白还原酶（Trx R）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷氧还蛋白（Grx）三种酶活性。鉴于这种独特性质,对寄生蠕虫TGR的研究受到寄生虫学者们的高度重视。本研究以常用的实验动物作为东毕吸虫的终末宿主,对其感染情况进行了探索。在实验室条件下,成功以山羊作为终末宿主维持东毕吸虫生活史循环;在大鼠和豚鼠体内可以获得虫体,但虫体发育迟缓;在小鼠和东方田鼠体内收集不到成虫。在兔子体内可以获得90-120天、发育成熟的虫体,并可用于后续实验;但180天后虫体发育受阻。利用PCR技术从东毕吸虫cDNA中扩增得到TGR基因的ORF序列,并将大肠杆菌含有的硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）插入到东毕吸虫TGR开放阅读框的末端。构建重组原核表达质粒p ET-28a（+）-Ot TGR和p ET-28a（+）-Ot TGRsec,并在在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过His-tag蛋白纯化磁珠对重组表达蛋白r Ot TGRsec和r Ot TGR进行纯化。将纯化的r Ot TGRsec蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用制备的抗体进行蛋白免疫印迹实验和免疫组织化学实验。实验结果表明,在大肠杆菌BL21（DE3）中,r Ot TGR以可溶性蛋白和包涵体形式表达,而r Ot TGRsec主要以可溶性蛋白的形式表达。制备得到了抗r Ot TGRsec的多克隆抗体,Western blotting的结果显示,可以检测到虫体蛋白中Ot TGRsec的存在,免疫组织化学结果显示,该蛋白在虫体中广泛分布,主要集中在虫体体被,其他组织有部分分布。通过TrxR、GR、Grx三种酶活性的检测体系,检测并计算了rOtTGRsec的Trx R、GR和Grx的酶活性。酶活性检测结果显示,r Ot TGRsec的Trx R酶活性为12.30±1.63 U/m L,GR酶活性为8.83±3.15 U/m L,Grx酶活性为0.31±0.07 U/m L。研究了Furoxan衍生物对r Ot TGRsec蛋白Trx R酶活性的抑制作用。利用实验室前期筛选的、对日本血吸虫、大片形吸虫TGR具有较好抑制效果的三种Furoxan衍生物LGM-35、ZWJ-19和CH-33,检测了其对东毕吸虫TGR酶Trx R活性的抑制作用,通过RNA干扰技术对东毕吸虫TGR基因进行了体外干扰,利用实时定量PCR和Western blot,比较分析了不同si RNA分子对该基因的体外干扰效果。结果显示,6个si RNA产生了不同的干扰效果,该基因的转录水平最高可降低46.1%,蛋白表达可降低30.6%。同时对不同浓度LGM-35的体外杀虫效果进行了观察和评价。实验结果表明,LGM-35对东毕吸虫具有一定的杀伤效果,当浓度为400m M,作用96 h后,杀虫效果可达100%,该结果略差于其对日本血吸虫的体外杀虫效果。本研究在实验室条件下维持了东毕吸虫的生活史循环,并对东毕吸虫TGR基因的生物学功能进行了初步研究,为后续开展东毕吸虫的实验室研究及以Ot TGR为靶标研制新的抗东毕吸虫药物奠定了基础。
盛兆安[2]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中研究指明背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
李想[3]（2019）在《猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究》文中研究表明目的:生物信息学分析和预测猪带绦虫（Taenia solium,Ts）14-3-3基因家族及其编码蛋白的序列、结构与进化特征,分析Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达差异,原核表达Ts14-3-3.3基因并制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,分析Ts14-3-3.3蛋白的组织定位情况,为该蛋白的进一步研究奠定基础。方法:1.搜索Gene DB数据库中猪带绦虫全基因组数据,利用生物信息学分析工具及各类软件包,分析和预测Ts14-3-3基因家族的基因结构及其编码蛋白质的理化特性、二级结构、亚细胞定位、三级结构和系统进化树等。2.采集流行区猪带绦虫病人成虫标本,建立囊虫病猪模型,收集猪囊尾蚴,采用实时荧光定量PCR方法检测Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的相对表达量。3.将Ts14-3-3.3基因克隆至原核表达质粒p CznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其表达产物,用His Link亲和层析柱进行纯化,免疫印迹法（Western blot）鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。4.将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的定位。结果:1.通过对猪带绦虫全基因组数据库搜索,共获得6个猪带绦虫Ts14-3-3基因,基因结构均由外显子和内含子组成,其编码蛋白分子质量介于26.8829.33KD之间,蛋白结构均为二聚体形式,分别位于4个不同的进化枝上。2.荧光定量PCR结果表明,6个Ts14-3-3基因在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达,Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3和Ts14-3-3.4在囊尾蚴阶段表达量较高,Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6在成虫阶段表达量较高。3.成功构建猪带绦虫重组表达质粒p CznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 KD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。4.用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了高效价的Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论:1.初步获得了猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员,其编码蛋白包含典型的14-3-3蛋白结构域,具有较高的序列保守性。2.猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。3.成功构建p Czn I-Ts14-3-3.3原核表达质粒,Ts14-3-3.3重组蛋白可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。4.Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。
吴冬丽,胡诗梦,王业富[4]（2018）在《日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究》文中研究表明制备可溶性表达的重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（r Sj14-3-3）并优化表达条件,分析其免疫学特性和免疫诊断价值。成功构建了BL21/p ET30a-r Sj14-3-3表达菌株,最佳的表达体系为细菌生长至OD600为0.61.0时加入IPTG至最佳终浓度0.1 mmol/L,28℃诱导16 h。上清液中可溶性的r Sj14-3-3蛋白纯化后的浓度为2.804 mg/m L。以r Sj14-3-3为抗原,间接ELISA检测显示,48份急性与35份慢性血吸虫病患者血清的抗体阳性率分别为95.6%和92.0%;与27份华支睾吸虫和15份钩虫患者血清的交叉反应率分别为7.4%和6.7%;与30份健康人血清假阳性反应率为0%。抗r Sj14-3-3兔血清及所制备的多抗可被纯化出的r Sj14-3-3蛋白及血吸虫成虫抗原（AWA）和排泄分泌物（ESA）中的天然Sj14-3-3分子的反应,且多抗效价达1:1 280 000。本研究成功表达并纯化出r Sj14-3-3蛋白,优化了其诱导表达条件,且此蛋白具有较高的抗原特异性。
韩倩[5]（2017）在《日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探》文中研究指明血吸虫病是由血吸虫感染引起的危害严重的人畜共患寄生虫病。虫卵是血吸虫病的主要致病因素,同时也是该病的传染源。血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击,在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间,这很大程度与其特异的体被结构有关。血吸虫的体被是一特殊的合胞体结构是虫体与宿主接触的直接界面,由表膜、基质和基膜三部分组成。血吸虫体被表膜是紧密的双单位膜结构,且不断地进行更新,有助于虫体逃避宿主的免疫攻击。血吸虫体被基质中的多膜囊结构通过与表膜的融合,进而帮助表膜形成或更新。膜融合的关键分子是SNARE（N-甲基马来酰胺敏感因子附着蛋白的膜受体）,通过囊泡膜上的v-SNARE与靶膜上的t-SNARE形成SNARE复合物,从而促进了两个膜的接近与融合。VAMP（囊泡膜蛋白）,即v-SNARE,通过N端保守结构域与t-SNARE的N端聚合,级联放大了整个SNARE复合物形成过程的聚合反应,这一反应也是整个膜融合过程中的限速步骤。VAMP2是研究最早、最多的囊泡膜蛋白,在神经信号转导、激素释放、胰岛素依赖的葡萄糖转运等过程中均起着关键的作用。本实验室在前期的日本血吸虫体被蛋白质组学的研究中,鉴定到了VAMP2蛋白分子,本研究旨在探究日本血吸虫VAMP2（Sj VAMP2）的生物学功能,为阐述日本血吸虫的生长发育机制积累知识,为该病的防控提供思路。生物信息学分析表明,日本血吸虫SjVAMP2为单跨膜蛋白,属于囊泡膜蛋白家族的成员之一。该蛋白N端含有一螺旋卷曲的保守结构功能域（N-coiled coil domain）,C端含有一个血吸虫所特有的保守结构,有作为血吸虫病诊断抗原及药物靶点的潜在价值。本文首次克隆出SjVAMP2基因482bp的ORF序列。实时定量PCR分析表明SjVAMP2在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达,但在28d及42d虫体中的转录水平较高,14d和35 d虫体转录水平次之,在42d雌虫中的表达量明显高于42d雄虫,可能与这些阶段虫体处于快速生长期或雌虫产卵的特殊发育阶段有关。此外,SjVAMP2的转录水平在40 mg/kg和200 mg/kg吡喹酮处理的虫体中随时间呈现不同的变化,暗示着SjVAMP2可能参与吡喹酮引起的虫体受损体被表膜的修复过程。构建了重组表达质粒pET-28a-SjVAMP2,并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出约为25 kDa的rSj VAMP2重组蛋白。用该重组蛋白三次免疫BALB/c小鼠制备的抗rSjVAMP2特异性多克隆抗体血清作为一抗,进行免疫组化及免疫电镜分析,结果显示SjVAMP2蛋白主要定位于虫体体被,且主要分布于表膜内陷处及基质中的扁平体和多膜囊等分泌小体中。Western blotting分析结果表明SjVAMP2蛋白具有较好的免疫原性,用rSjVAMP2蛋白三次免疫小鼠,在两次独立的重复试验中,分别诱导小鼠产生了41.5%（P<0.001）和27.3%（P<0.05）的减虫率及36.8%（P<0.01）和23.3%（P<0.05）的肝脏减卵率。ELISA分析显示,第二次免疫之后,小鼠体内抗rSjVAMP2特异性Ig G抗体水平急剧升高,可能与rSjVAMP2诱导的免疫保护力有关。此结果表明,rSjVAMP2重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。利用RNA干扰技术探究SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的作用。实时定量PCR和Western blotting分析结果表明筛选到的SjVAMP2特异siRNA能够在转录水平和蛋白水平有效地抑制SjVAMP2的表达。SjVAMP2 siRNA干扰组虫体的存活率仅为空白对照组为69.7%（P<0.01）,且干扰组雄虫变小（P<0.01）,发育受阻。扫描电镜观察发现约62%干扰组雄虫的体被表膜形态发生了变化,表现为雄虫口腹吸盘间的表膜不同程度的脱落,乳突异常增大增多,中后部的褶嵴发生一定程度的融合。在透射电镜下观察发现,干扰组雌虫的体被变薄,且表膜凹陷内折不全;雄虫的体被中出现大量的空泡,实质组织溶解,体被下组织中也有空泡出现。在体被基质中发现了由7层膜结构包裹的大的多膜囊结构,可能与虫体表膜更新有关。此外,抑制SjVAMP2基因的表达导致SGTP1、SGTP4、SjIR1和SjIR2四个与葡萄糖吸收、转运相关基因转录水平的显着下降,且干扰组虫体在低糖培养基中培养4d和6d的葡萄糖摄取量分别下降33.2%（P<0.001）和39.3%（P<0.01）,雌虫产卵量下降43.8%（P<0.01）。在两次独立的体内干扰实验中,SjVAMP2 siRNA分别诱导小鼠产生了32.8%（P<0.05）,50.4%（P<0.01）的减虫率和48.8%（P<0.05）,40.0%（P<0.05）的肝脏减卵率,且干扰组小鼠肝脏的肉芽肿,纤维化等病理现象明显较对照组轻。进一步利用酵母双杂交技术筛选SjVAMP2的相互作用蛋白。将SjVAMP2基因ORF序列与pGBKT7载体DNA重组,构建了p GBKT7-SjVAMP2重组质粒,并转入Y187酵母菌中。检测结果表明,诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌株无自激活活性、无细胞毒性,且pGBKT7-SjVAMP2重组质粒能够在酵母菌中成功表达,说明该诱饵菌株可应用于筛库。用诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌与18d日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库菌共培养,于SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷型固体培养基上反复转接培养后,得到27个阳性克隆,去除重复克隆,测序分析得到了包括sytaxin1,Olfactory receptor 4-like,Rab 11在内的7个可能互作的蛋白分子。综上,本研究首次对SjVAMP2进行了克隆、表达和特征性分析,动物实验表明该重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。RNA干扰实验发现,SjVAMP2与血吸虫体被结构的维持密切相关,同时在日本血吸虫葡萄糖摄取和雌虫产卵等过程中发挥着重要作用。利用酵母双杂交技术初步筛选出7个可能的互作蛋白。本研究为阐述SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的生物学功能积累了知识,为血吸虫病疫苗候选分子或新药物靶标的筛选提供了思路。
覃婷[6]（2016）在《日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达》文中进行了进一步梳理目的血吸虫病是一种呈全球分布的、危害严重的人兽共患寄生虫病。流行于中国的主要为日本血吸虫病,在我国其仍然是一个值得重视的严重的公共卫生问题。我国现有的吡喹酮化疗、灭螺等血防措施虽然对血吸虫病的防治起到重要作用,但尚不能达到完全控制甚至消除血吸虫病的目的,而血吸虫病疫苗的研究为此带来了希望。由于各种不足,目前为止尚没有一种安全、有效的血吸虫疫苗应用于临床。本研究拟利用日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）14-3-3和Sj32抗原编码基因,以两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,Bb）为“载体”,构建日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗,并研究Sj14-3-3-Sj32融合基因在两歧双歧杆菌中的表达情况,为日本血吸虫病疫苗的研究奠定基础。方法1.以本室保存的质粒pGEX-Sj14-3-3和p ET28α-Sj32为模板,通过PCR扩增出Sj14-3-3和Sj32抗原编码基因,再将得到的两个目的基因用基因拼接技术（gene SOEing）进行剪接,得到Sj14-3-3-Sj32融合基因;再将穿梭表达载体pGEX-1λT与构建的融合基因拼接,得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;采用电穿孔法将pGEX-Sj14-3-3-Sj32转化至大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）BL21（DE3）中,再用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）对其进行诱导表达;最后采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达产物,用蛋白印迹（Western blot）技术对表达蛋白的免疫原性进行分析。2.培养Bb菌,将构建的重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32电转化至B b菌中,构建重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗;用IPTG对疫苗进行诱导表达,再通过SDS-PAGE鉴定表达产物,以及Western blot技术分析表达蛋白的免疫原性。结果1.采用基因拼接技术成功得到长度约为1 750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因;重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经双酶切证实构建成功;SDS-PAGE分析结果显示重组质粒经IPTG诱导表达的产物为Mr约73k Da的重组蛋白;Western blot显示表达的重组蛋白可被Sj感染的兔血清所识别。2.双酶切和PCR均证实重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功转入Bb菌中,r Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗构建成功;SDS-PAGE分析显示,重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经IPTG诱导后可在Bb菌中表达Mr约73KDa的重组蛋白,与预期结果相符,且在诱导后的23d表达水平较高,表达的蛋白占菌体总蛋白的8.2%;Western blot结果显示Sj感染的兔血清可识别所表达的重组蛋白。结论1.成功合成融合基因Sj14-3-3-Sj32,并与穿梭表达载体连接后得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;2.重组质粒在大肠埃希菌中能表达Mr约为73 k Da的重组蛋白,且具有较强的免疫原性;3.日本血吸虫r Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗经证实构建成功,且该疫苗可表达具有抗原特异性的Sj14-3-3-Sj32重组蛋白。
覃婷,李文桂,谭建蓉[7]（2015）在《日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达》文中认为目的构建日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32,探讨重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法以重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所保存的质粒pGEX-Sj14-3-3和pET28α-Sj32为模板,通过PCR扩增Sj14-3-3和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（gene SOEing）剪接Sj14-3-3和Sj32基因,得到Sj14-3-3-Sj32融合基因,定向克隆入穿梭载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32,并采用双酶切法进行验证。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blot）法对表达产物进行分析鉴定。结果基因拼接法得到约1750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因;双酶切证实Sj14-3-3-Sj32融合基因成功插入pGEX-1λT载体中;SDS-PAGE分析显示,表达产物为相对分子质量约为73×103的重组蛋白;Western blot显示,重组蛋白可被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32,该重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中得到了高效融合表达,且表达的融合蛋白具有特异的抗原性。
张旻[8]（2014）在《日本血吸虫体被蛋白质组学研究》文中研究表明日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。体被是血吸虫和宿主物质交换的场所，也是宿主免疫效应分子与虫体直接接触的界面，与血吸虫营养摄取、信号传导和免疫逃避等密切相关。一些体被表膜蛋白，特别是期别和性别差异表达体被表膜蛋白对维持血吸虫在终末宿主体内寄生及完成其生活史至关重要。开展日本血吸虫体被表膜蛋白质的组成和变化分析，及体被蛋白质组的免疫学筛选，鉴定与日本血吸虫生长发育相关的重要分子，及免疫相关分子，可为阐述血吸虫与宿主的相互作用机制提供重要信息，为疫苗候选分子、新治疗药物靶标和诊断抗原分子的筛选提供新思路，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。1．日本血吸虫童虫与成虫体被表膜蛋白质组分析血吸虫的生活史复杂，在不同发育阶段表现出不同的生物学和形态学特征。童虫和成虫体被表膜上差异表达的蛋白，对血吸虫的存活、生长和繁殖具有重要意义。本研究应用非渗透性生物素sulfo-NHS-SS-biotin标记14d童虫和32d成虫的体被表膜蛋白，利用链酶亲和素-生物素系统纯化获得生物素标记蛋白，随后利用液相色谱串联质谱法进行高通量蛋白质组学分析。结果显示，童虫和成虫分别鉴定到了245个和103个蛋白分子，包括59个共有的蛋白，186个童虫高表达的蛋白，及44个成虫高表达的蛋白。90%的差异表达体被表膜蛋白的理论相对分子量为10-70kDa，等电点为4-10。GO分析显示，童虫高表达蛋白主要与RNA代谢过程，基因表达，大分子生物合成过程，RNA结合等相关。而成虫高表达蛋白主要与中性粒细胞凋亡过程的调节，过氧化氢分解代谢过程，丝氨酸型肽酶活性等相关。本研究为揭示血吸虫在终末宿主体内的生长发育机制提供重要信息，为筛选血吸虫疫苗候选分子、药物靶标以及诊断抗原分子提供新思路。2．日本血吸虫雌雄虫体被表膜蛋白质组分析雌雄虫之间的相互作用是雌虫发育成熟以及产卵的先决条件，也与血吸虫的致病和传播有着紧密联系。一些雌雄虫差异表达蛋白在虫体与宿主的相互作用中具有重要的作用。本研究利用链霉菌亲和素-生物素亲和纯化技术以及液相色谱-质谱/质谱联用技术分析了日本血吸虫雌、雄虫体被表膜蛋白质组，二者分别鉴定到了179个和300个蛋白分子，包括119个雌雄虫共有的，60个雌虫高表达的，和181个雄虫高表达的蛋白。生物信息学分析表明，在这些被鉴定的体被表膜蛋白中，有的参与到了血吸虫与宿主的相互作用中，如serpin和CD36-like class B scavenger receptor，有的与雌雄虫之间的相互作用有关，如gynecophoral canal protein。GO分析显示，雌虫高表达蛋白主要与蛋白质糖基化和溶酶体功能等相关，而雄虫高表达蛋白主要与细胞内信号转导、丝状肌动蛋白聚合作用的调控、蛋白酶体复合物功能等相关。该研究结果为分析明确雌雄虫在生理学上的差异及更好地理解雌雄虫相互作用和性成熟机制提供重要的实验依据，同时也可为抗血吸虫病疫苗候选分子和药物靶标的筛选提供基础。3．基于体被抗原免疫蛋白质组学的日本血吸虫病诊断抗原的筛选及应用价值评估由于体被直接暴露于宿主内环境，一些体被抗原分子成为刺激、诱导宿主产生特异性免疫应答的重要分子。本研究以日本吸虫体被蛋白作为抗原，以日本血吸虫感染前，感染后的2周和6周，以及吡喹酮治疗后1，2，3，4，5，6，7，8月的兔血清为一抗，利用免疫蛋白质组学技术筛选具有免疫诊断价值的抗原分子。研究结果显示，有10个蛋白点未被感染前兔血清识别，但在感染后的第2周和6周都呈阳性反应，而在治疗后的早期阶段又转为阴性反应。经质谱鉴定，这10个蛋白点分属于6个不同蛋白质。我们从中挑选磷酸甘油酸酯变位酶（Phosphoglyceratemutase，PGM）进行了克隆、表达。经免疫组织定位分析表明SjPGM为一体被蛋白。ELISA法分析结果显示，实验兔感染日本血吸虫2周后，所有兔子都可检测出抗rSjPGM和SEA的特异性抗体。在吡喹酮治疗后的第2月至第7月，以rSjPGM作为诊断抗原，所有实验兔都陆续转为阴性，而直至吡喹酮治疗后第8月，以SjSEA作为诊断抗原，所有实验兔仍都呈阳性。表明在考核药物疗效，或区分现症感染和既往感染方面，rSjPGM作为诊断抗原要明显优于目前最常用的SjSEA。进一步应用ELISA法检测了104份血吸虫感染阳性水牛血清和60份健康水牛血清，结果以rSjPGM和SjSEA作为诊断抗原，其敏感性分别为91.35%和100.00%，特异性分别为100.00%和91.67%。而在检测14份前后盘吸虫、9份大片吸虫感染水牛血清时，rSjPGM的交叉反应率为7.14%和11.11%，SjSEA为50.00%和44.44%，表明rSjPGM作为牛血吸虫病的诊断抗原具有潜在的应用价值。4．日本血吸虫SjCHMP5的克隆、表达及rSjCHMP5诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价在前期体被蛋白质组学研究的基础上，挑选出一体被蛋白带电多泡体蛋白5（Chargedmultivesicular body protein5，CHMP5）进行克隆、表达、生物学特性分析及重组蛋白诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价。利用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中克隆到了编码SjCHMP5（GenBank accessionno. FN320038）的ORF序列，该序列含675bp，编码224个氨基酸，其理论等电点和分子量分别为4.49及25kDa。构建了该基因的重组表达质粒pET28a（+）-SjCHMP5，在大肠杆菌系统中成功获得表达，重组蛋白rSjCHMP5以可溶性蛋白形式存在，其理论分子量约为29kDa。质谱鉴定结果表明，检测的纯化重组蛋白确实为rSjCHMP5。Western blotting分析表明，rSjCHMP5具有较好的抗原性。免疫荧光染色试验分析显示，SjCHMP5主要定位于日本血吸虫虫体的体被上，为一体被蛋白。应用纯化的rSjCHMP5结合206佐剂免疫BALB/c小鼠，与佐剂对照组相比，诱导了18.96%的减虫率（P<0.05）和42.98%的肝脏减卵率（P<0.01）。ELISA试验表明，重组蛋白二次免疫后针对rSjCHMP5的特异性IgG抗体滴度即达到较高水平。本研究表明rSjCHMP5可诱导小鼠产生部分的抗血吸虫病的免疫保护效果。综上，本研究首次应用生物素链酶亲和素系统分离纯化了日本血吸虫童虫、成虫以及雌雄虫体被表膜蛋白，应用Shotgun技术和生物信息学技术系统分析其组成和变化。同时，首次应用免疫蛋白组学技术，比较分析血吸虫感染前、感染后以及经吡喹酮治疗后不同时期具有免疫原性的血吸虫成虫体被抗原的变化情况。筛选出一个具有血吸虫病诊断价值的抗原分子SjPGM。首次对日本血吸虫体被蛋白SjCHMP5编码基因进行了克隆、表达及生物学特性分析，评估了其重组蛋白在小鼠体内诱导的抗血吸虫感染的免疫保护效果。研究成果为鉴定血吸虫与宿主相互作用的关键分子、阐述日本血吸虫的生长发育机制提供了有价值的信息，为抗血吸虫病疫苗候选分子、新药物靶标和新诊断抗原分子的筛选提供了新思路，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。
王馨茁[9]（2014）在《日本血吸虫肌钙蛋白T（SjTnT）的初步研究》文中指出血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫（Schistosome）感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采用了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺难于消灭以及药物不能防止再感染等原因,血吸虫病仍是我国一个重要的公共卫生问题。研究开发有明确保护作用的抗血吸虫疫苗是目前血吸虫病防控研究中的热点之一。本实验室在前期免疫蛋白质组学的研究中发现,肌钙蛋白T（troponin T, TnT）可以被日本血吸虫感染10天后的东方田鼠血清和小鼠血清所识别,但不被这两种未感染动物的血清所识别,推测其可能在诱导抗血吸虫感染的免疫应答中具有重要作用。本研究在此基础上对SjTnT基因进行了克隆,分析了该基因的生物学特性,在大肠杆菌中表达并纯化了重组抗原,评估其在小鼠中诱导的免疫保护效果,为深入开展该基因的生物学功能研究,及进一步明确SjTnT重组抗原作为疫苗候选分子的潜力提供了基础。本文根据GenBank中SjTnT基因序列,设计特异引物,利用PCR技术从日本血吸虫28d虫体cDNA中扩增得到特异的DNA片段。测序结果表明其为SjTnT的ORF片段,长度为975bp,编码324个氨基酸,与SmTnT同源性达到90%以上。编码蛋白理论分子量为38.4kDa,理论等电点为6.03,生物信息学分析显示该蛋白二级结构主要为超螺旋,亲水性较强,无信号肽和跨膜结构域,具有较强的抗原性。进一步利用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ将SjTnT基因片段定向克隆至pET28a（+）载体中,成功构建了重组表达质粒pET28a（+）-SjTnT,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,并纯化得到重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,收集血清。Western blotting分析结果表明重组蛋白能被重组蛋白免疫血清识别,说明具有良好的抗原性。利用免疫组化方法观察SjTnT蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTnT主要分布在日本血吸虫体被表膜,实质器官也有部分分布。纯化制备重组抗原rSjTnT,结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验,结果和对照组比较,rSjTnT在BALB/c小鼠中分别诱导了33.89%（P<0.05）的减虫率和43.94%的肝脏减卵率。免疫保护机制研究表明,随着免疫次数的增加,免疫鼠血清中特异性的IgG抗体水平持续升高,IgG1/IgG2a比值呈升高趋势。结果提示,重组蛋白rSjTnT可诱导小鼠产生一定的保护作用,是一种有潜力的抗血吸虫病候选疫苗分子。
余琴[10]（2012）在《磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用》文中认为日本血吸虫病在我国主要流行于湖南、湖北、江西、安徽、江苏、四川和云南等7个疫区省、市的110个县。根据2009年全国血吸虫病疫情通报,血吸虫病人365770人,其中晚期血吸虫病人28820人,急性血吸虫病人77例,与2008年相比下降了11.42%。目前,我国血吸虫病流行区域感染率和感染度均呈现大幅度下降,粪检在低度流行区漏检率高,近年来广泛采用血清免疫学诊断方法开展筛查,以提高检测的敏感性,已取得了较好的效果。虽然检测循环抗原既能区分现在感染与既往感染,又具有一定的疗效考核价值,但目前检测的测试系统特异性较差,尤其对于慢性轻度感染者,循环抗原检测的敏感性并不理想。血清抗体检测因敏感性高,成本低廉,简便操作,而被广泛用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情检测。血清抗体检测的诊断抗原主要有粗制的成虫或虫卵抗原,纯化及重组抗原。基因重组抗原成本低廉,制备简便，且周期短,方法易于标准化,因此,更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。缺少准确、快速、简便、并且适合基层现场应用的血吸虫病检测方法已经成为目前血吸虫病防治研究领域的技术瓶颈,已严重阻碍了我国血吸虫病防治的步伐。磁分离酶联免疫技术（magnetic affinity enzyme-linked immunoassay, MEIA）是由瑞士Serono诊断中心在20世纪80年代中期发明的一种检测新技术。其原理是将磁性分离与酶联免疫分析技术相结合,以高度均匀的磁性微球作为固相支持物,采用磁性微球液相分离取代传统酶联免疫酶标板包被法的固相分离,在外加磁场的作用下迅速地分离游离物和结合物。磁性微球具有颗粒小、表面积大等优点,可结合更多的诊断分子,使蛋白吸附能力超出普通酶标板载体的千倍以上,从而使该方法的敏感性高于以普通酶标板为载体的ELISA方法。而且磁微粒可以利用磁性分离器方便地对所形成的复合物进行收集分离,使得洗涤结果更加彻底、干扰物浓度大大降低及靶物质浓度有效聚集,进而可提高检测方法的信噪比和灵敏度。另外,该方法具有操作简单、使用便捷等特点,因而在免疫学检测中具有较好的应用前景。本研究制备了日本血吸虫可溶性虫卵抗原及基因重组抗原,并将抗原与磁球偶联,建立了基于抗原的磁分离酶联免疫分析法。并将其用于检测轻度感染日本血吸虫病患者血清,治疗后血清及肺吸虫病患者血清,从而为提供一种新的可供选择的方法用于检测日本血吸虫抗体。本论文分为以下三部分：（1）SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究本研究利用SEA-MEIA法检测感染日本血吸虫血清中的抗体,进而将其与SEA-ELISA结果相比较。研究发现,SEA-MEIA法与SEA-ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病患者的敏感性分别是96.55%（56/58）和91.38%（53/58）；SEA-ELISA检测为假阴性的5份阳性血清,其中3份被SEA-MEIA检测为阳性；经统计学比较分析,SEA-MEIA比SEA-ELISA具有更高的敏感性（χ2=21.95,P<0.01）。经非参数Pearson’s相关分析,两种方法检测日本血吸虫病患者血清抗体的OD值之间具有显着正相关关系（r=0.845,P<0.01）。SEA-MEIA和SEA-ELISA检测正常人血清均未出现阳性反应（0/30）,与肺吸虫病人的血清出现了交叉反应（3/6）。15例轻度感染血吸虫病患者,经吡哇酮治疗后半年收集血清,粪检显示虫卵为阴性。SEA-MEIA与SEA-ELISA检测的抗体转阴率分别为26.67%（4/15）、33.33%（5/15）,经统计学比较分析,两种方法的检出率具有显着性差异（χ2=10.909,P<0.01）。结果提示SEA-MEIA法是一种敏感性高、简便快速的日本血吸虫抗体检测方法。（2）日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定本研究利用基因重组技术成功构建了重组表达载体pGEX-Sj23突变体,pGEX-Sj23大亲水性片段（pGEX-Sj23-LHD）, pET28a-Sj23突变体,pET28a-Sj26及pET28a-Sj 14-3-3.含有重组质粒pGEX-Sj23突变体、pET28a-Sj23突变体的表达菌株,在IPTG的诱导下都未见明显的重组蛋白表达。含有重组质粒pGEX-Sj23-LHD的表达菌株在IPTG的诱导下可见重组蛋白的表达,且表达产物经GST免疫亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳姐示该融合蛋白分子量约34 kDa,其中包括寄生虫蛋白LHD约8 kDa,载体表达蛋白26kDa。含有重组质粒pET28a-Sj26、pET28a-Sj14-3-3的表达菌株经IPTG诱导后,表达产物经镍柱亲和层析纯化,可获得高纯度的重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示该融合蛋白分子量分别约27 kDa、31 kDa,其中包括6个His-tag,且两种蛋白都主要以可溶性的形式表达。重组蛋白Sj23-LHD、Sj26、Sj14-3-3可特异性的被感染了日本血吸虫的兔血清、小鼠血清所识别,而不能被正常兔血清、正常小鼠血清所识别,且重组蛋白Sj23-LHD可被感染了日本血吸虫3W的小鼠血清所识别。说明纯化的重组抗原具有抗原性,可用于后续的实验研究。（3）基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究研究发现,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA都可检测出感染了日本血清吸虫小鼠血清中的抗Sj26及Sj 14-3-3的特异性抗体,且rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比（P/N）均高于ELISA （3.92 versus 2.66、3.71 versus 2.45）。rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率均为24.14%（14/58）,经相关分析,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系（r=0.658,P<0.01）,这两种方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性清平均OD值之比（P/N）分别为3.61、2.56。rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率为22.41%（13/58）,经相关分析,rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系（r=0.618,P<0.01）,这两种一方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比（P/N）分别为3.65、2.71。经统计比较分析,rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA的阳性检出率之间没有显着性差异（χ2=3.198,P>0.05）。检测治疗后半年且粪检显示虫卵为阴性的血清,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA的阳性检出率均为13.33%（2/15）；rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA均没有检出阳性反应（0/15）。基于这两种抗原的MEIA和ELISA检测肺吸虫病人血清（0/6）、正常人血清均未出现阳性反应（0/30）。上述结果显示,基于rSj26和rSj 14-3-3的MEIA法与ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病具有相似的敏感性,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA具有一定的疗效考核价值及较好的特异性。
二、日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位（论文提纲范文）
（1）东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 东毕吸虫病的现状 |
| 1.1.1 东毕吸虫病的危害 |
| 1.1.2 东毕吸虫病的防治 |
| 1.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.1 生物体的氧化还原系统 |
| 1.2.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.3 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 |
| 1.2.4 谷胱甘肽(GSH)系统 |
| 1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)系统 |
| 1.2.6 硫氧还蛋白(Trx)系统 |
| 第二章 东毕吸虫不同宿主适宜性观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 耳萝卜螺的饲养 |
| 2.3.2 土耳其斯坦东毕吸虫毛蚴孵化与耳萝卜螺感染 |
| 2.3.3 土耳其斯坦东毕吸虫尾蚴的释放、收集与终末宿主的感染 |
| 2.3.4 粪便毛蚴孵化检查 |
| 2.3.5 感染宿主的不同组织虫卵计数 |
| 2.3.6 兔子感染不同时间虫体发育情况统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同实验动物感染东毕吸虫的情况统计 |
| 2.4.2 兔子在感染后不同时间的虫体发育情况 |
| 2.4.3 兔子在感染后不同时间的虫卵分布情况 |
| 2.4.4 东毕吸虫不同时期虫体观察 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 东毕吸虫TGR的克隆表达和纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和实验试剂配制 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 东毕吸虫总RNA的提取和反转录 |
| 3.3.2 东毕吸虫TGR序列的生物信息学分析 |
| 3.3.3 OtTGR基因的扩增和pET-28a(+)-OtTGR表达质粒的构建 |
| 3.3.4 pET-28a(+)-OtTGRsec表达质粒构建 |
| 3.3.5 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.3.6 rOtTGR多克隆抗体的制备与免疫组织化学实验 |
| 3.3.7 蛋白免疫印记实验(Western blot) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OtTGR、OtTGRsec基因的克隆及pET28a(+)-OtTGRsec和 p ET28a(+)-Ot TGR的重组质粒构建与鉴定 |
| 3.4.2 OtTGR的生物信息学分析 |
| 3.4.3 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.4.4 rOtTGR蛋白免疫印迹与重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.4.5 OtTGR的免疫组织化学结果 |
| 3.4.6 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 东毕吸虫TGR的酶特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 rOtTGRsec硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活性检测 |
| 4.3.2 rOtTGRsec谷胱甘肽还原酶(GR)的活性检测 |
| 4.3.3 rOtTGRsec谷氧还蛋白(Grx)的活性检测 |
| 4.3.4 抑制剂对rOtTGRsec TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 rOtTGRsec TrxR的酶活性 |
| 4.4.2 rOtTGRsec GR的酶活性 |
| 4.4.3 rOtTGRsec Grx的酶活性 |
| 4.4.4 抑制剂对rOtTGRsec的 TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 东毕吸虫TGR的体外干扰及抑制实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 生物材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 东毕吸虫收集 |
| 5.3.2 东毕吸虫培养 |
| 5.3.3 体外干扰东毕吸虫虫体实验 |
| 5.3.4 虫体RNA提取 |
| 5.3.5 qPCR分析干扰结果 |
| 5.3.6 Western blot分析siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达水平 |
| 5.3.7 LGM35 对东毕吸虫成虫的抑制效果评价 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 siRNAs干扰后OtTGR的转录水平 |
| 5.4.2 siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达分析 |
| 5.4.3 LGM35 对东毕吸虫成虫的杀伤效果评价 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（3）猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 猪带绦虫Ts14-3-3 基因家族鉴定及生物信息学分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 猪带绦虫Ts14-3-3 基因家族的表达及Ts14-3-3.3 蛋白组织定位研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（4）日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究（论文提纲范文）
| 1 结果与分析 |
| 1.1 r Sj14-3-3蛋白编码基因的扩增和鉴定 |
| 1.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.3 r Sj14-3-3蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 1.4 可溶性r Sj14-3-3蛋白的纯化 |
| 1.5 r Sj14-3-3免疫反应性分析 |
| 1.6 多抗制备及效价检测 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 r Sj14-3-3基因克隆 |
| 3.3 重组质粒p ET30a/r Sj14-3-3的构建 |
| 3.4 r Sj14-3-3蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 3.5 r Sj14-3-3蛋白的纯化 |
| 3.6 r Sj14-3-3免疫学活性分析 |
| 3.7 多抗的制备及免疫原性鉴定 |
（5）日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 血吸虫病的流行现状及防治难点 |
| 1.2 血吸虫的生活史 |
| 1.3 血吸虫的体被 |
| 1.3.1 血吸虫体被蛋白质组学 |
| 1.3.2 血吸虫体被蛋白的研究 |
| 1.3.3 血吸虫的葡萄糖摄取与体被 |
| 1.4 RNA干扰技术的应用及局限 |
| 1.5 囊泡运输 |
| 1.5.1 囊泡运输的过程 |
| 1.5.2 SNARE蛋白复合物 |
| 1.5.3 VAMP2 |
| 1.6 本研究的总体思路 |
| 第二章 SjVAMP2的特征性分析及其重组蛋白的免疫保护效果评估 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要试剂和酶 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 SjVAMP2的生物信息学分析 |
| 2.3.2 实时定量PCR分析SjVAMP2在几个不同发育时期虫体内的转录水平 |
| 2.3.3 SjVAMP2基因的克隆 |
| 2.3.4 重组质粒pET- 28a(+)-SjVAMP2的原核表达及重组蛋白纯化 |
| 2.3.5 rSjVAMP2重组蛋白多克隆抗体制备及免疫原性分析 |
| 2.3.6 SjVAMP2蛋白在虫体的定位分析 |
| 2.3.7 重组蛋白rSjVAMP2诱导小鼠抗血吸虫感染的免疫保护效果评估 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 日本血吸虫SjVAMP2基因的生物信息学分析 |
| 2.4.2 SjVAMP2在不同发育时期虫体中的转录水平分析 |
| 2.4.3 吡喹酮对SjVAMP2转录水平的影响 |
| 2.4.4 SjVAMP2基因的克隆及原核表达 |
| 2.4.5 SjVAMP2蛋白具有较好的免疫原性 |
| 2.4.6 SjVAMP2蛋白在虫体中的定位 |
| 2.4.7 rSjVAMP2重组蛋白诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果 |
| 2.4.8 rSjVAMP2重组蛋白诱导小鼠产生的特异性抗体分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 SjVAMP2的生物学功能初探 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 siRNA浸泡转染效率分析 |
| 3.3.2 RNAi引起SjVAMP2的沉默效果 |
| 3.3.3 SjVAMP2沉默对虫体活力及形态的影响 |
| 3.3.4 SjVAMP2沉默引起的虫体体被表膜及体被结构的变化 |
| 3.3.5 SjVAMP2沉默对葡萄糖摄取相关基因转录水平的影响 |
| 3.3.6 SjVAMP2沉默对虫体葡萄糖摄取能力及雌虫产卵的影响 |
| 3.3.7 体内干扰SjVAMP2表达对虫体发育及雌虫产卵的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交技术筛选Sj VAMP2的互作蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 成功构建了pGBKT7-SjVAMP2诱饵质粒 |
| 4.3.2 重组质粒p GBKT7-SjVAMP2转化Y187酵母菌的PCR鉴定 |
| 4.3.3 诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌株的自激活活性检测 |
| 4.3.4 诱饵pGBKT7-SjVAMP2转染的酵母菌株的细胞毒性检测 |
| 4.3.5 诱饵pGBKT7-SjVAMP2重组质粒在Y187菌株中的蛋白表达 |
| 4.3.6 32d日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库质量检测 |
| 4.3.7 酵母双杂交杂交效率及阳性质粒的分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj1433-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj1433-Sj32)疫苗的构建及其表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（8）日本血吸虫体被蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 血吸虫的生活史与体被 |
| 1.2.1 血吸虫的生活史 |
| 1.2.2 血吸虫的体被 |
| 1.3 血吸虫体被蛋白组学研究及相关研究技术 |
| 1.3.1 血吸虫体被蛋白组分分析 |
| 1.3.2 生物素化作用 |
| 1.3.3 酶溶解作用 |
| 1.3.4 定量分析 |
| 1.3.5 阳离子化铁蛋白的刺激作用 |
| 1.4 用免疫蛋白质组学技术筛选诊断抗原 |
| 1.4.1 用免疫蛋白质组学技术从成虫可溶性蛋白中筛选诊断抗原 |
| 1.4.2 用免疫蛋白质组学技术从虫卵可溶性蛋白中筛选诊断抗原 |
| 1.4.3 用免疫蛋白质组学技术从排泄/分泌蛋白中筛选诊断抗原 |
| 1.4.4 用免疫蛋白质组学技术从体被蛋白中筛选诊断抗原 |
| 1.5 本研究的总体研究思路 |
| 第二章 日本血吸虫童虫与成虫体被表膜蛋白质组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫荧光显微镜检查生物素标记体被表膜蛋白情况 |
| 2.3.2 14d童虫和 32d成虫体被表膜蛋白质组的总体分析 |
| 2.3.3 体被表膜蛋白的理论相对分子量和等电点的预测分析 |
| 2.3.4 GO注释 |
| 2.3.5 具有显着差异性的GO注释条目 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫雌雄虫体被表膜蛋白质组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 雌雄虫体被表膜蛋白质组的总体分析 |
| 3.3.2 体被表膜蛋白的理论相对分子量和等电点的预测分析 |
| 3.3.3 GO注释 |
| 3.3.4 GO注释信息的差异性比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 基于体被抗原免疫蛋白质组学的日本血吸虫病诊断抗原的筛选及应用价值评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血吸虫体被蛋白提取效果的分析 |
| 4.3.2 体被蛋白的双向电泳分析 |
| 4.3.3 不同时期血清的体被蛋白免疫印迹分析 |
| 4.3.4 rSjPGM的表达和纯化 |
| 4.3.5 SjPGM蛋白在虫体的组织定位 |
| 4.3.6 抗rSjPGM特异性抗体消长规律 |
| 4.3.7 评估rSjPGM在牛血吸虫病诊断中的价值 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫SjCHMP5 的克隆、表达及rSjCHMP5 诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SjCHMP5 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5.3.2 重组质粒pET28a(+)-SjCHMP5 的原核表达及其重组蛋白的纯化 |
| 5.3.3 rSjCHMP5 的质谱鉴定 |
| 5.3.4 rSjCHMP5 的抗原性和免疫原性分析 |
| 5.3.5 SjCHMP5 蛋白在虫体的组织定位 |
| 5.3.6 rSjCHMP5 在小鼠体内诱导的免疫保护效果 |
| 5.3.7 免疫小鼠血清抗rSjCHMP5 特异性抗体的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）日本血吸虫肌钙蛋白T（SjTnT）的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 血吸虫的一般生物学特性 |
| 2 血吸虫感染免疫 |
| 3 东方田鼠的抗血吸虫现象研究 |
| 4 血吸虫病疫苗的研究进展 |
| 第二章 日本血吸虫SjTnT基因的克隆、表达 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫重组蛋白SjTnT特性分析及免疫保护效果评估 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（10）磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一部分 SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位（论文参考文献）
- [1]东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究[D]. 岳永程. 中国农业科学院, 2021
- [2]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [3]猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究[D]. 李想. 遵义医科大学, 2019(08)
- [4]日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究[J]. 吴冬丽,胡诗梦,王业富. 基因组学与应用生物学, 2018(07)
- [5]日本血吸虫囊泡膜蛋白2（SjVAMP2）的生物学功能初探[D]. 韩倩. 中国农业科学院, 2017(02)
- [6]日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达[D]. 覃婷. 重庆医科大学, 2016(02)
- [7]日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达[J]. 覃婷,李文桂,谭建蓉. 中华地方病学杂志, 2015(10)
- [8]日本血吸虫体被蛋白质组学研究[D]. 张旻. 中国农业科学院, 2014(10)
- [9]日本血吸虫肌钙蛋白T（SjTnT）的初步研究[D]. 王馨茁. 上海师范大学, 2014(01)
- [10]磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用[D]. 余琴. 华中科技大学, 2012(09)