一、长波紫外线对人包皮成纤维细胞影响的实验研究（论文文献综述）
曲莹莹,方嘉琦,欧阳梦婷,王梦瑶,黄羡殷,郑跃,赖维,许庆芳[1]（2022）在《circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究》文中研究表明目的初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织, 分离培养成纤维细胞, 以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d, 建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）, 未经处理的正常成纤维细胞作为对照组, β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达, CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达, qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异, 并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组:空载组、UVA +空载组, circIGF2BP3过表达组、UVA+ circIGF2BP3过表达组, Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显着高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05, t = 9.49、4.26, P < 0.01、< 0.05）, 而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显着低于对照组（100%, t = 7.38, P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显着高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04, 显着低于对照组（1.00 ± 0.03）, t = 5.46, P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显着低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75, P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显着低于UVA +空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47, 均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平, 为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。
毛丽艳,谢一航,施辛,张婷,钱华,吴亚芬,鲁慧,胡翠,李巍[2]（2021）在《miR-26a靶向EZH2在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中的作用机制研究》文中认为目的探讨长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中miRNA-26a的表达情况,以及上调或下调miR-26a表达对全基因组甲基化水平、靶基因组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（EZH2）及细胞老化的影响。方法以10 J/cm2 UVA照射人皮肤成纤维细胞,分别在第0、3、7天提取RNA,实时定量反转录PCR（RT-PCR）检测miR-26a的表达;通过转染miR-26a模拟物（mimic）和miR-26a抑制物（inhibitor）上调或下调miR-26a的表达,通过荧光显微镜观察和实时定量PCR检测miR-26a表达量,并评估转染效率。将人皮肤成纤维细胞分为空白对照组（不做任何处理）、UVA组（UVA照射）、miR-26a-mimic组（转染miR-26a-mimic）、UVA+miR-26a-mimic组（转染miR-26a-mimic后UVA照射）、miR-26a-inhibitor组（转染miR-26a-inhibitor）、UVA+miR-26a-inhibitor组（转染miR-26a-inhibitor后UVA照射）。第7天完成UVA照射后,收集各组细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期,DNA甲基化定量检测试剂盒检测全基因组甲基化水平,RT-PCR检测EZH2、DNA甲基转移酶1（DNMT1）mRNA以及miR-26a的表达,Western印迹检测EZH2以及DNMT1蛋白的表达。采用单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学分析。结果随着培养时间的延长,对比空白对照组,UVA照射组中miR-26a表达量逐渐增高,在UVA照射第7天后,两组间miR-26a表达水平差异有统计学意义（t=5.295,P < 0.05）。miR-26a mimic/miR-26a inhibitor转染HSF后,细胞内均有较高的荧光表达,提示均具有较高的转染效率。流式细胞仪检测显示,空白对照组、UVA组、miR-26a-mimic组、UVA+miR-26a-mimic组、miR-26a-inhibitor组、UVA+miR-26a-inhibitor组G1期细胞比例分别为52.82% ± 2.56%、78.56% ± 4.34%、53.63% ± 3.13%、89.52% ± 4.17%、54.39% ± 3.86%、65.34% ± 4.78%,各组间差异有统计学意义（F=46.728,P < 0.01）,其中UVA组高于空白对照组（t=8.848,P < 0.01）,UVA+miR-26a-mimic高于miR-26a-mimic组（t=11.922,P < 0.01）和UVA组（t=3.154,P < 0.05）,UVA+miR-26a-inhibitor组高于miR-26a-inhibitor组（t=3.087,P < 0.05）,但低于UVA组（t=3.547,P < 0.05）。全基因组甲基化水平检测显示,上述各组甲基化水平（A450值）分别为0.676 ± 0.024、0.323 ± 0.043、0.506 ± 0.035、0.169 ± 0.024、0.602 ± 0.036、0.422 ± 0.029,各组间差异有统计学意义（F=97.402,P < 0.01）,其中UVA组低于空白对照组（P < 0.01）,UVA+miR-26a-mimic低于miR-26a-mimic组（P < 0.01）和UVA组（P < 0.01）,UVA+miR-26a-inhibitor组低于miR-26a-inhibitor组（P < 0.01）,但高于UVA组（P < 0.05）。RT-PCR和Western印迹显示,6组细胞间EZH2、DNMT1 mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）,其中UVA组均低于空白对照组（P < 0.05）,UVA+miR-26a mimic组均低于miR-26a mimic组（P < 0.05）和UVA组（P < 0.05）,而UVA+miR-26a inhibitor组均低于miR-26a inhibitor组（P < 0.05）,但均高于UVA组（P < 0.05）。结论在UVA照射诱导皮肤成纤维细胞光老化中,miR-26a表达上调,细胞增殖活性下降,全基因组甲基化水平降低;上调miR-26a的表达,可下调其靶基因EZH2及甲基化相关基因DMNT1的表达,促进细胞光老化,反之,下调miR-26a的表达,可上调EZH2及DNMT1的表达,抑制细胞光老化。
王海彦[3]（2021）在《非编码RNA在UVA所致人成纤维细胞光老化中的表达谱分析》文中提出目的:反复多次用长波紫外线（UVA）照射成纤维细胞,建立光老化模型,探究长波紫外线（UVA）对人皮肤成纤维细胞（HSF）光老化作用的分子机制。方法:取20-40岁的健康男子包皮组织,胰酶消化法分离真皮成纤维细胞后取第3-8代成纤维细胞进行后续实验,采用0 J/cm2、5 J/cm2、7.5 J/cm2、10J/cm2剂量UVA分别照射HSF,于照射后48h观察成纤维细胞,通过CCK8技术测试细胞的增殖活性,将皮肤成纤维细胞分成7个组,A:空白对照组;B:UVA照射对照组;C组:0.01umol/L染料木素组;D组0.1umol/L染料木素组;E:1umol/L染料木素组;F:10umol/L染料木素组;G:100 umol/L染料木素组,B、C、D、E、F、G组均照射UVA。CCK8技术测定染料木素对成纤维增殖能力的影响;蛋白印迹法（Western-blot）测定空白组、照射组、染料木素组中衰老相关蛋白p21的表达变化;small RNA测序技术检测光老化模型中差异表达的microRNA,用miranda、targetscan、starbase数据库预测部分差异表达microRNA靶基因,对预测得到的目标靶基因进行GO、KEGG富集分析,筛选出占据核心地位的microRNA及microRNA调控的目标靶基因,对结果进行分析。结果:0 J/cm2、5 J/cm2、7.5 J/cm2、10J/cm2UVA照射后,用CCK8试剂检测不同光照强度下HSF的增殖能力变化,UVA处理组HSF出现衰老表现,细胞增殖能力较前降低（P<0.05）,与B组比较,C-F组增殖活性较高,差异有统计学意义（P<0.05）。在5J/cm2UVA照射后,有70%以上的成纤维细胞保持活力,结合先前的文献报道,本研究选取5J/cm2UVA建立光老化模型,每天在固定时间照射1次,一共照射5天。照射后48h检测细胞衰老相关蛋白p21表达量较空白对照组增加。根据差异显着性筛选出7个microRNA:hsa-mi R-1290,hsa-mi R-1307-5p,hsa-hsa-mi R-663a,hsa-mi R-10396a-5p,hsa-mi R-3195,hsa-mi R-9901,hsa-mi R-10401-5p。采用生物信息学技术对筛选出的microRNA分析,miranda、targetscan、starbase数据库预测部分差异表达microRNA的靶基因,提示差异表达的microRNA可能和轴突发生、胚胎器官发育、钙调蛋白结合、金属离子跨膜转运蛋白活性有关。结论:UVA照射可以导致成纤维细胞光老化,一定浓度的染料木素（0.01umol/L-10umol/L）对成纤维细胞光老化具有保护作用,差异表达的microRNA可能通过作用于目标靶基因调控细胞的光老化过程。
王恒旭[4]（2021）在《皮肤光老化领域可视化分析及中药作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:基于文献计量学对涉及皮肤光老化的文献进行可视化分析,揭示该领域发展脉络,找出主要研究机构和热点人物,并预测该领域的发展趋势与研究热点,为科研人员选题提供参考,在此基础上针对其研究热点中药,挖掘治疗皮肤光老化的高频次中药,通过运用网络药理学与分子对接方法探究其对治疗皮肤光老化的潜在活性成分及作用机制。材料与方法:本研究根据研究目的分两部分进行。第一部分:数据主要来自中国知网、万方医学数据库、重庆维普中文期刊数据库。通过对皮肤光老化领域相关的期刊文献与博硕论文中的数据,对其进行可视化分析和描述统计。应用文献计量学方法对中医治疗皮肤光老化领域文献进行一般情况分析。应用可视化软件Citespace和VOSviewer,对该研究领域的作者合作关系、机构合作关系、基金资助情况等方面数据进行共现分析,找出该领域研究的活跃学者和活跃机构;对该研究领域的关键词进行共现分析,预测该领域的研究热点和发展趋势。本研究分析方法主要应用了描述性统计分析、共现分析与聚类分析。第二部分:数据主要来自CNKI、VIP、万方医学等中文数据库,通过中药系统药理学分析平台TCMSP和化学专业数据库搜集前六味高频次中药的活性成分和对应靶点,在Gene Cards、OMIM、Drugbank三个数据库网站下载皮肤光老化的疾病靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药—有效成分—靶点”调控网络,并将中药与疾病交集靶点导入STRING平台构建蛋白互作（protein-protein interaction network,PPI）网络。运用R3.6.0软件对核心靶点进行GO与KEGG富集分析,并绘制前25条KEGG结果的“通路—靶点”网络图。采用Autodock＿vina软件对活性成分与靶点进行分子对接验证,对接结果用Pymol显示。结果:1.该领域发文近年来出现下降,但仍然保持较高发文量;纳入研究的论文受到一定基金资助,期刊文献受基金资助占比30.27%,博硕论文受基金资助占比11.92%,其中期刊文献和博硕论文中受国家自然基金资助的最多,分别为140篇,25篇。纳入研究的期刊文献,其核心期刊231篇,占比22.28%。《中国美容医学》、《中华皮肤科杂志》、《中国皮肤性病学杂志》是该领域很有影响力的杂志,载文量分别为129篇、66篇、40篇。辽宁中医大学授予皮肤光老化领域博硕士学位最多,达到27个;H指数期刊文献为28,博硕论文为12。2.该领域研究地域分布广泛,研究机构间既有内部机构或同地区间合作,也有跨地区机构合作。最主要研究机构是辽宁中医药大学。研究机构主要集中在东北和东南地区。3.该领域形成了五大作者合作网络,网络中包含作者众多,每个合作网络都有其核心作者团队,此外还有人数较小的合作网络。4.皮肤光老化研究的主要治疗方式包括:中药、方剂、针刺、艾灸、强脉冲光、点阵激光、射频、光子嫩肤、光动力疗法等。中药有望成为中医热点治疗方式,包括绞股蓝、灯盏花、红景天、潞党参、黄芪、甘草等。强脉冲光有望成为西医热点治疗方式。热点实验对象为成纤维细胞。长波紫外线、中波紫外线形成皮肤光老化因素的研究较多。信号通路研究以及机制研究将成为研究热点。主要科研方法包括:临床疗效观察、动物实验、综述、理论探讨、流行病学调查等,动物实验为近几年热点科研方法,由于缺少相关临床随机对照试验,该领域系统评价较少,也缺少数据挖掘、知识图谱、网络药理学等新兴研究方法。此外,对于针刺、方剂对于该疾病的研究也有望成为热点。5.筛选出前六味高频次中药为杜仲、甘草、红景天、黄芪、绞股蓝、人参,有效成分分别为24个、88个、3个、16个、15个、17个。药物靶点与皮肤光老化疾病交集靶点73个。根据“中药—有效成分—靶点”网络及PPI网络显示:槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、柚皮素、β-谷甾醇是治疗皮肤光老化的关键成分,TP53、AKT1、MAPK3、TNF、VEGFA、JUN、PTGS2、CASP3是位于前八位的核心靶蛋白。经查阅文献发现红景天苷、人参皂苷Rb1在治疗皮肤光老化上发挥重要作用。GO与KEGG结果显示,主要涉及了氧化应激反应、对活性氧的反应等生物学功能,TNF信号通路、MAPK信号通路与皮肤光老化相关。分子对接结果显示,六味中药的关键活性成分与靶点均有较好的结合,红景天苷、人参皂苷Rb1、槲皮素与PTGS2、AKT1、MAPK3有较好的亲和力。结论:1.近年来该领域期刊以及博硕论文相关文献发文量虽然有小幅度下降,但仍然保持较高热度,具有一定研究价值。2.在期刊文献发表方面,《中国美容医学》、《中华皮肤科杂志》、《中国皮肤性病学杂志》是该领域很有影响力的杂志和是该领域主要的载文期刊。在硕博学位论文发表方面,辽宁中医药大学发文量较多。3.期刊文献和博硕论文均受到一定比重基金资助。说明皮肤光老化领域申请课题成功的项目具有一定数目,国家级基金资助也有一定比例,说明该领域研究逐渐受到国家重视。4.由H指数可知,期刊文献质量普遍较高,博硕论文高质量论文相对缺失。5.机构合作方面,该领域科研机构跨地区,跨机构合作方面都较好。其中辽宁中医药大学是皮肤光老化领域合作最广泛的机构,黑龙江中医药大学,中山大学附属第三医院,南京医科大学,中国医科大学,上海交通大学是比较活跃的机构。6.团队合作方面,辽宁中医药大学吴景东团队,黑龙江中医药大学张宁团队,中山大学赖维团队,广州军区总医院刘仲荣团队,复旦大学毕波团队将有可能在未来几年活跃在皮肤光老化研究领域。7.中医药治疗方向上,绞股蓝、灯盏花、杜仲、红景天等中药将可能成为研究热点;桃红四物汤将成为方剂的研究热点;针刺“足三里”将成为针灸的研究热点。西医药治疗方向上,强脉冲光、点阵激光将成为为该领域的研究热点,自噬、二甲双胍氧为近年来治疗该疾病新兴的西医药治疗方式,为治疗该疾病提供新的科学治疗方式。p38MAPK信号通路将成为研究热点,近几年ER/TGF-β1/Smad3信号通路有望成为新兴的信号通路。科研方法上临床疗效观察、综述以及动物实验研究将可能成为研究热点,系统评价、知识图谱、数据挖掘、网络药理学等新兴研究方法相对缺失。8.槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、柚皮素、β-谷甾醇是治疗皮肤光老化的关键成分,TP53、AKT1、MAPK3、TNF、VEGFA、JUN、PTGS2、CASP3是位于前八位的核心靶蛋白,红景天苷、人参皂苷Rb1在治疗皮肤光老化上发挥重要作用。。9.杜仲、甘草、红景天、黄芪、绞股蓝、人参的关键活性成分与靶点均有较好的结合,红景天苷、人参皂苷Rb1、槲皮素与PTGS2、AKT1、MAPK3有较好的亲和力。10.TNF信号通路、MAPK信号通路与皮肤光老化相关,是研究较多的通路。11.本研究发现高频次中药通过多靶点、多通路参与治疗皮肤光老化的过程,为进一步研究其治疗皮肤光老化的分子作用机制及临床应用提供新思路。
李鹏琴[5]（2021）在《α1抗胰蛋白酶对人成纤维细胞慢性光老化模型的作用及其机制研究》文中指出背景:UVA作为紫外线辐射中重要的组成部分之一,其可深入真皮结缔组织引起人皮肤光老化的发生,并且UVA辐射所诱导的光老化与氧化应激、基质金属蛋白酶表达以及细胞外基质降解等有一定的关系。α1抗胰蛋白酶（Alpha-1 antitrypsin,AAT）具有抵抗多种蛋白酶的作用。此外,它还具有延缓细胞凋亡、调节免疫、抵御炎症等多种作用。课题组之前的研究已经发现AAT对豚鼠皮肤光老化模型有一定的预防和治疗作用。为进一步验证AAT对原代培养的光老化成纤维细胞的影响,该实验模拟光老化形成机制中最重要的一部分,采用UVA灯辐照人皮肤成纤维细胞,建立了细胞老化模型,进行了以下研究。目的:（1）探究AAT能否通过发挥抗氧化作用延缓UVA诱导的人皮肤成纤维细胞慢性光老化进程。（2）探究AAT能否通过影响转录因子活性蛋白-1（Transcription factor active protein-1,AP-1）、基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMPs）、Ⅰ型前胶原的基因（m RNA）和蛋白水平延缓UVA诱导的人皮肤成纤维细胞慢性光老化进程。方法:从健康儿童包皮组织提取的成纤维细胞进行传代培养。在研究过程中,将培养的6代以内的成纤维细胞随机分为空白对照组、AAT组、UVA照射组和AAT+UVA照射组。在AAT组和AAT+UVA照射组中,每次进行UVA照射之前,将细胞用AAT预处理24小时。采用20 m W/cm2UVA灯每天同一时间照射成纤维细胞1次,每日照射剂量达8 J/cm2,共计14次,建立成纤维细胞慢性光老化模型。在最后一次照光结束后,运用β-半乳糖苷酶染色技术检测衰老细胞。为评估AAT对UVA诱导的成纤维细胞慢性光老化模型的保护性作用,运用流式细胞仪检测了细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的含量;运用逆转录PCR检测技术（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测了AP-1（c-Fos/c-Jun）、MMP-1、MMP-3、Ⅰ型前胶原的基因（m RNA）表达;运用酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测了AP-1（c-Fos/c-Jun）、MMP-1、MMP-3、Ⅰ型前胶原的蛋白表达。结果:（1）与空白对照组相比,UVA辐射使得β-半乳糖苷酶染色阳性细胞所占比率显着增高,但经相应剂量AAT（0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml）预处理的成纤维细胞中染色阳性细胞所占比率大约降低了8.23%、15.61%、14.13%,差异存在显着的统计学意义（P<0.001,P<0.001,P<0.001）。此外,与UVA照射组中扁平宽大的成纤维细胞相比,经AAT预处理的细胞变得细长。（2）流式细胞分析结果显示,与UVA照射组中ROS含量相比,在0.5 mg/ml AAT+UVA照射组中ROS含量大约降低了12.73%,差异不存在统计学意义（P>0.05）;而在1.0 mg/ml和1.5 mg/ml AAT+UVA照射组中,ROS含量大约降低了26.06%和44.24%,差异具有显着的统计学意义（P<0.001,P<0.001）。（3）通过RT-PCR检测发现,与UVA照射组相比,在AAT+UVA照射组中,AAT呈剂量依赖性地抑制c-Fos、c-Jun、MMP-1和MMP-3基因（m RNA）表达,促进了Ⅰ型前胶原基因（m RNA）的合成,差异均存在统计学意义（P<0.05）。（4）通过ELISA检测发现,与UVA照射组相比,在AAT+UVA照射组中,AAT呈剂量依赖性地抑制c-Fos、c-Jun、MMP-1和MMP-3的蛋白表达,减弱了对Ⅰ型前胶原蛋白的降解、促进了其合成,差异均存在统计学意义（P<0.05）。结论:AAT可以延缓UVA诱导的人皮肤成纤维细胞慢性光老化进程。这种保护性作用的潜在机制包括:（1）AAT通过发挥抗氧化作用降低了细胞内ROS的水平,并减轻了其对细胞外基质的损害;（2）AAT通过抑制AP-1中c-Fos和c-Jun的表达水平至少部分降低了MMP-1和MMP-3的表达,进一步减弱了对I型前胶原的降解;（3）AAT增强了I型前胶原的基因表达。这些结果提供了有力的证据,表明AAT对光老化皮肤具有保护作用,并表明AAT是防治光老化的潜在候选者。
周桃花,周红艳,陈芳,尹颖,杨玉[6]（2021）在《人参皂苷Rg1抗长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:观察人参皂苷Rg1抗长波紫外线（Ultravio1et A,UVA）对人皮肤成纤维细胞（Human dermal fibroblasts,HDF）的损伤作用,为研究开发光老化防护剂提供依据。方法:分离HDF进行原代培养及冻存;复苏HDF传代培养至第6～8代用于样品活性检测;采用改良MTT法检测UVA照射前后给予人参皂苷Rg1 HDF存活率的变化情况,用维生素C作阳性对照。结果:在照射前24h预先给予人参皂苷单体Rg1,在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率较模型组明显提高,差异有统计学意义（P<0.05）;且5、10μg/ml组的细胞存活率优于阳性对照组（P<0.05）。照射后给予人参皂苷单体Rg1,在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率均较模型组明显提高（P<0.05）。结论:人参皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范围内对HDF的UVA损伤有较好的预防和治疗作用。
罗杰夫[7]（2020）在《ERK/MAPK通路在低剂量ALA-PDT治疗光老化成纤维细胞中的关键作用及机制研究》文中研究说明研究背景及目的:光老化是紫外线长期刺激皮肤,经过复杂的生物学机制造成皮肤的慢性损伤。光老化会引起皮肤抗氧化功能异常,屏障功能受损,出现组织学异常等问题。长期紫外线辐射引起的皮肤光老化表现为皮肤色泽灰暗、不规则色素沉着、皮肤粗糙、松弛、失去弹性。在组织学上可见皮肤尤其是真皮萎缩、变薄。这与紫外线辐射对皮肤的急性效应表现明显不同。急性紫外线辐射后,出现炎症和红斑为主的早期反应,并引起皮肤的真皮、表皮尤其是角质层的增厚。紫外线对皮肤急性效应和慢性效应的不同表现提示我们紫外线急慢性损伤的机制可能存在较大差异。皮肤光老化不仅表现出皱纹、色斑,造成美学上的不良感观,还造成了皮肤屏障功能下降以及防御机制的紊乱,甚至可能引起皮肤良性、恶性肿瘤,给健康带来非常不利的影响。目前预防以及治疗光老化的手段繁多,包括涂抹防晒霜、抗氧化产品、局部使用维生素A衍生物、光电疗法,注射填充等。近年来,许多研究发现光动力疗法是一种有效治疗光老化,改善皮肤状况的治疗方法,但是对其治疗光老化的机制尚不明确。光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）是在光敏剂的介导下,用特定波长的光照射靶细胞,产生氧自由基、单态氧等活性氧物质（rective oxygen specise,ROS）促发氧化应激反应从而达到治疗目的的疗法。目前光动力疗法已经成功用于治疗肿瘤、尖锐湿疣、痤疮等疾病。高浓度、大剂量的光动力疗法能通过光敏剂在增生活跃的靶组织富集,在光的激活作用下在细胞内产生大量活性氧化物,高浓度的ROS具有细胞毒性,使肿瘤细胞以及被病毒感染的细胞发生死亡从而达到治疗肿瘤和病毒疣的作用。临床上使用低浓度、低剂量光动力疗法治疗痤疮,取得非常满意的疗效,同时研究者发现PDT治疗痤疮后,皮肤的色泽和细腻度都得到了改善,推测这可能与低浓度ROS激发细胞产生应激反应,激活转录因子,调节细胞的增殖分化,启动重塑和再生过程相关。因此,人们意识到低剂量光动力治疗具有使皮肤年轻化的作用,但具体的机制还需要进一步探索。既往研究显示,低剂量光动力处理裸鼠皮肤后,鼠真皮内炎性细胞浸润明显减少,I型、III型前胶原蛋白的表达明显增加,真皮基质金属蛋白酶（Matrix metalloproleinase,MMP）-1,MMP-3,MMP-12表达下调,而表皮中TGF-β和TGF-βII型受体也有增加。经过光动力治疗后,皮肤屏障功能恢复、抗氧化能力增强、真皮组织增厚,皮肤呈现年轻化状态。有研究表明,皮肤组织中核因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是调节氧化应激反应的关键因子之一。Nrf2是一种核转录因子,静息状态下与KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein1）结合,当其受到激动后,与KEAP1解离并进入细胞核内,与抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）结合,调控如谷胱甘肽硫基转移酶（glutathione-S-transferses,GSTs）等一系列酶参与氧化应激反应。Nrf2/ARE被认为参与了组织紫外线损伤得防御机制,我们也推测Nrf2相关通路可能也在低剂量光动力治疗光老化中起到重要作用。5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid,ALA）是目前皮肤科最常用的光敏剂,本研究也使用它作为光敏剂,探讨5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法（Photodynamic therapy mediated by 5-amino-ketovalerate,ALA-PDT）对光老化的作用机制。我们实验室通过建立体外成纤维细胞光老化细胞模型,经低剂量ALA-PDT处理及沉默Nrf2基因表达等实验,验证了Nrf2确实在低剂量光动力治疗中起到了重要作用,但是对低剂量ALA-PDT如何激动Nrf2,使其与KEAP1分离入核调控下游转录因子的机制尚不清楚。本文通过比较正常的成纤维细胞,光老化成纤维细胞以及经低剂量光动力处理后的光老化成纤维细胞的基因表达变化,探讨低剂量PDT激活Nrf2的上游通路,达到皮肤年轻化的治疗效果。方法1.分离、培养包皮来源人成纤维细胞,并以UVA处理细胞,制作光老化成纤维细胞模型;2.分别以高剂量以及低剂量ALA-PDT处理成纤维细胞;3.使用β-半乳糖苷酶（sensecence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal）染色试剂盒检测未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及高剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞;倒置显微镜检测各组细胞中的衰老细胞比例;4.使用CellTiter-Lumi?发光法检测未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及高剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞的细胞活力变化;5.按照方法1-2,制备未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞;并用trizol提取细胞核酸,做转录组测序检测;6.根据转录组测序结果分析未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞三组细胞的基因表达差异;7.提取未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导光老化成纤维细胞以及经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞的总蛋白,通过免疫印迹法（Western blot,WB）检测三组细胞中蛋白表达的变化;8.通过细胞免疫荧光染色检测三组细胞中p-ERK蛋白的荧光强度;9.使用不同时程的UVA诱导处理成纤维细胞,提取经不同累积时间UVA诱导的成纤维细胞的总蛋白,进行免疫印迹法检测不同时长UVA处理下细胞中p-ERK等蛋白表达的变化情况;10.使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT共处理光老化纤维细胞;11.使用β-半乳糖苷酶（sensecence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal）染色试剂盒检测UVA诱导光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞和使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞中衰老细胞的比例;12.提取未经UVA诱导的成纤维细胞、UVA诱导的光老化成纤维细胞、经低剂量ALA-PDT处理后的光老化成纤维细胞以及使用p-ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT共处理光老化纤维细胞的总蛋白,通过免疫印迹法检测四组细胞中蛋白表达的变化情况。结果:1.在既往建立的光老化细胞模型上验证了低剂量ALA-PDT的治疗效果。SA-β-Gal染色的结果示经UVA诱导后,成纤维细胞中衰老细胞比例明显上升,细胞活力明显受到抑制;低剂量光动力处理后,光老化成纤维细胞中衰老细胞的阳性率下降;2.根据转录组测序的结果可知在基因表达水平相似度上,经ALA-PDT处理后,光老化的成纤维细胞的基因转录趋近于未光老化的正常成纤维细胞水平。经UVA诱导光老化后,转录水平发生改变的基因中有52个与MAPK密切相关的基因经低剂量ALA-PDT处理后转录水平恢复到正常成纤维细胞水平;3.经UVA诱导光老化后,Nrf2以及p-ERK出现蛋白水平下调,而经ALA-PDT处理后,光老化的成纤维细胞中Nrf2以及p-ERK蛋白水平显着上调,二者的变化趋势具有一致性;而p-P38在低剂量光动力处理后,均出现表达下调;p-JNK则变化不明显;4.免疫荧光染色结果与WB结果一致。相比正常的成纤维细胞,光老化成纤维细胞p-ERK荧光强度低,而经ALA-PDT处理后,荧光强度显着增加;5.在UVA诱导的初期,成纤维细胞中Nrf2以及p-ERK的表达均明显上调,而随着接受UVA处理的时间增加后,Nrf2以及p-ERK的表达逐渐受到了抑制,蛋白水平逐渐降低;6.SA-β-Gal染色结果示:低剂量ALA-PDT处理能降低光老化成纤维细胞蓝染衰老细胞的比例,ERK抑制剂与ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞后衰老细胞的比例下降不明显;7.当UVA诱导光老化后,COL1和COL3的合成显着降低;低剂量ALA-PDT处理处理后,COL1和COL3的合成增加;ERK抑制剂与低剂量ALA-PDT同处理光老化成纤维细胞后COL1、COL3以及Nrf2表达未上调。结论:1.在体外光老化成纤维细胞模型中,采用0.1mM ALA 21J/cm2红光的低剂量ALA-PDT处理能有效治疗成纤维细胞的光老化;2.通过转录组测序,发现MAPK相关基因参与了UVA诱导的光老化以及低剂量ALA-PDT治疗光老化的机制;3.在急性光损伤中,UVA能刺激Nrf2以及p-ERK等表达上调;而慢性光老化中,随着UVA累积作用时间和剂量的增加,导致细胞抗氧化功能障碍,增殖受到抑制,Nrf2以及p-ERK的表达水平下调;4.当抑制了ERK时,低剂量ALA-PDT不能上调Nrf2,亦不能改善成纤维细胞光老化;提示低剂量ALA-PDT可能通过上调ERK/MAPK,引起对Nrf2等下游通路的调控,治疗光老化成纤维细胞。
逯岩松[8]（2020）在《芍药苷对UVA诱导皮肤光损伤的防护作用及机制研究》文中研究说明背景:长波紫外线（UVA）辐射是大自然挑战皮肤健康的重要因素之一。皮肤过度暴露于UVA,会产生活性氧簇（ROS）,包括单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢。ROS与细胞脂膜、酶和DNA相互作用,改变其结构,干扰其功能,产生氧化应激。后者可导致光损伤、光老化和皮肤肿瘤。脂质结合蛋白（PLIN2）又称为为脂肪分化相关蛋白,参与氧化应激的调节。芍药苷具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、免疫调节等药理作用。芍药苷还可以减弱中波紫外线（UVB）引起的角质形成细胞损伤。芍药苷能否抑制UVA导致的皮肤光损伤尚未有研究。目的:本研究旨在探讨芍药苷对UVA照射所致光损伤的防护性能,并探索其潜在分子机制,为研发防护光损伤的药物或护肤品提供新策略。研究方法:1、人包皮组织提取的真皮成纤维细胞作为研究对象。应用不同剂量的UVA（20、22.5、25J/cm2）照射细胞建立光损伤模型,于照射后24小时、48小时、72小时应用MTS法检测细胞活力。给予细胞不同浓度的芍药苷（200、400、800μM）处理后,于不同时间点MTS法检测细胞活力,从而评估芍药苷药物毒性。应用MTS法检测不同药物浓度对UVA所致细胞损伤的抑制作用,筛选出芍药苷最适药物浓度。给予细胞芍药苷预培养24小时后,进行UVA照射,24小时后显微镜下观察细胞形态学变化及应用流式细胞仪检测细胞凋亡。给予C57BL6雄性小鼠芍药苷200mg/kg每日一次灌胃,连续7天后,给予UVA（30J/cm2）急性照射一次,24小时后颈椎脱臼法处死小鼠,留取背部皮肤组织,HE染色后显微镜下观察组织病理变化。2.检测芍药苷对UVA照射成纤维细胞的氧化应激水平的影响。荧光显微镜下观察细胞内ROS的表达,酶标仪检测SOD、MDA的变化,以及应用Western blot方法对细胞内氧化还原转录因子Nrf2及其靶向的抗氧化基因NQ-O1和HO-1进行蛋白水平检测。应用siRNA敲除Nrf2,再对成纤维细胞进行UVA及芍药苷处理,Western blot方法检测Nrf2、NQ-O1和HO-1,MTS检测细胞增殖,酶标仪检测MDA。3.细胞及小鼠给予芍药苷和UVA处理后,应用Western blot及RT-qPCR检测细胞内PLIN2变化,应用免疫组化检测小鼠皮肤组织中PLIN2变化。应用慢病毒在成纤维细胞过表达PLIN2,MTS方法检测细胞活力,EdU染色检测细胞DNA合成情况,酶标仪检测MDA。敲除Nrf2后应用Western blot检测PLIN2表达。过表达PLIN2后再照射UVA,应用MTS法检测细胞活力变化,并应用酶标仪检测MDA变化。结果:1.不同剂量UVA对细胞活力具有损伤作用,选择22.5J/cm2 UVA用于后续实验。芍药苷（200、400、800μM）对细胞无毒性作用,800μM的芍药苷对UVA导致的细胞损伤具有抑制作用。芍药苷预处理可以减少UVA导致的细胞凋亡。与单纯照射UVA的小鼠比较,给予芍药苷灌胃的UVA照射小鼠的皮肤真皮损伤减轻及真皮厚度减小。2.芍药苷减少UVA导致的细胞内ROS、MDA的增加。芍药苷使细胞内抗氧化酶SOD升高,以及抗氧化基因Nrf2、NQ-O1、HO-1增加。敲除Nrf2后,芍药苷不能使抗氧化基因增加,并且失去对MDA的抑制作用,且不能抑制UVA引起的细胞活力损伤。免疫组化结果显示,芍药苷可使小鼠皮肤中Nrf2、HO-1、NQ-O1表达增加。3.在细胞及小鼠皮肤中,UVA照射可使PLIN2增加,芍药苷预处理可使其被抑制。敲除Nrf2后PLIN2增加。过表达PLIN2后,成纤维细胞DNA合成能力及细胞增殖能力增加,细胞内MDA合成减少。过表达PLIN2可抑制UVA导致的细胞活力下降,降低UVA导致的MDA增加。PLIN2过表达联合芍药苷预处理可显着抑制UVA照射诱导的细胞活力下降和MDA生成增加,从而增强单一处理措施的细胞保护功能。结论:1.芍药苷可以抑制UVA导致的人皮肤成纤维细胞及小鼠皮肤光损伤。2.芍药苷通过Nrf2/HO-1/NQ-O1通路来发挥抗氧化作用,从而抑制UVA对成纤维细胞及小鼠皮肤的光损伤。3.UVA照射及敲除Nrf2导致的氧化应激可使PLIN2增加,芍药苷通过抑制氧化应激减少PLIN2,PLIN2在成纤维细胞中具有促进细胞增殖抑制氧化应激的作用,过表达PLIN2的同时加入芍药苷,可显着抑制UVA导致的光损伤。
佘金铭[9]（2020）在《真皮成纤维细胞体外培养优化方案及其促进创面愈合的研究》文中研究指明目的:探讨皮肤组织体外消化培养的优化方案,分析不同体外消化培养方案对获取原代细胞的数量及活性的影响,并在动物模型中分析皮肤细胞活性对创面愈合的影响。方法:取人体皮肤组织,采用胶原酶+胰酶（A组）、单一胰酶（B组）、组织贴壁（C组）三种方法进行体外消化,并贴壁培养,通过以下方法评估不同组织消化方法对细胞获取数量及细胞活性的影响。评估方法:1)观察细胞从组织游离出的时间,第一次传代后细胞数量,绘制生长曲线;2)通过免疫荧光检测细胞Vimentin表达鉴定皮肤细胞的主体成份;3)采用CCK8法检测细胞活性,分析不同组织消化方法对细胞活性的影响;4)采用流式细胞术检测细胞表面标记物CD34、CD45、CD44的表达,以评估不同组织消化方法对皮肤细胞中干细胞比例及成纤维细胞老化的影响;5)建立nu/nu裸鼠局部急性创面模型,创面每天涂抹皮肤细胞、老化的皮肤细胞及生理盐水,通过对创面愈合时间、愈合速度及愈合组织胶原数量的比较,验证不同的状态的皮肤细胞对创面的影响。结果:1)通过胶原酶+胰酶（A组）、单一胰酶（B组）、组织贴壁（C组）三种方法消化皮肤组织,均可成功培养出以成纤维细胞为主的皮肤细胞群,多次传代培养后成纤维细胞呈优势生长,细胞伸展呈梭形或多边形。相比于传统的胰酶及组织贴壁法,采用胰酶+胶原酶消化法,细胞从组织块游离出效率最高,36 h即可观察有成纤维细胞呈放射状从组织块游离出,培养48 h细胞后,融合度达90%以上,且所得细胞产量最多,差异具有统计学意义（P<0.01）。2)通过免疫荧光检测皮肤细胞Vimentin表达,发现几乎所有的细胞均表达波形丝蛋白,HE染色后光镜观察细胞呈长梭形或多边形,胞核为深蓝色,胞浆为嗜碱性染色,说明所得皮肤细胞以成纤维细胞为主。3)通过CCK-8法分析不同消化组皮肤细胞的活性,发现A组细胞增殖活性明显高于B、C两组,差异具有统计学意义（P<0.05）。4)流式细胞术检测细胞表面标志分子CD44以评估皮肤细胞活性,发现胰酶+胶原酶体外消化法（A组）获得细胞CD44阳性表达率最高（100%）,胰酶体外消化法（B组）次之（98.6%）,而贴壁法（C组）CD44表达率最低（91.5%）,三种方法所得细胞CD34、CD45表达均呈阴性,该结果说明不同方法获得体外细胞活性存在差异,胰酶+胶原酶消化法细胞活性最强,胰酶次之,贴壁法获得细胞活性最低。5)成功建立裸鼠急性创面模型,将正常培养的原代皮肤细胞,老化的皮肤细胞细胞及PBS对照每日涂抹创面,记录不同治疗组创面愈合时间,发现复合酶消化法获得细胞可在4天实现创面愈合,生理盐水对照组则需要7天完成创面愈合,老化的成纤维细胞组则需要10天完成创面愈合,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;取创面愈合14天的创面瘢痕组织进行HE染色,结果显示正常皮肤细胞治疗组,创面愈合组织胶原含量较高,胶原纤维增长增粗,排列整齐,更接近于非创面的正常皮肤组织,而老化皮肤细胞治疗组创面组织较薄,真皮层胶原最少,胶原排列稀疏无序。正常细胞治疗组瘢痕皮肤的胶原含量高于生理盐水组和老化细胞治疗组,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论:1)本实验成功验证了此复合酶（胰酶+胶原酶）体外消化法,可以高效的获得皮肤原生代细胞。2)经免疫荧光鉴定,皮肤细胞以成纤维细胞为主,含有少量干细胞样的间充质细胞。3)复合酶消化法获得原代皮肤细胞数量及活性优于传统胰酶消化法及细胞贴壁法,但本实验的三种组织消化法获得的原代细胞的活性均在第4、5代时达到高峰,然后随体外传代的增加,细胞活性逐渐减低,体外培养的第4代、第5代活性较强,可能是细胞治疗较佳的窗口期。4)通过小鼠创面愈合模型证明成纤维细胞的细胞活性是细胞治疗的重要因素,老化的成纤维细胞可能无益于伤口愈合。
谢璟[10]（2019）在《杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制研究》文中研究说明研究背景皮肤光老化（skinphotoaging）是指日光中的紫外线照射皮肤后引起的慢性炎症过程。引起光老化的紫外线主要是长波紫外线（UVA）、中波紫外线（UVB）。目前,由于环境污染、臭氧层被破坏,人们接受紫外线辐射、光老化问题日益严重,成为困扰大众的一个严重的社会问题。因此开发具有高活性成分的防晒产品以及具有抗氧化活性的药物来抵抗紫外线的辐射,预防和延缓皮肤老化已成为当前医学研究的热点。杨梅为杨梅科杨梅属植物,果实甜酸可口,自古以来就被用于食疗。近年来已经证明杨梅提取物中的杨梅黄酮是发挥药理作用的主要化学成分之一。杨梅黄酮具有多种生物学活性,包括抗癌防癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等等。也有研究显示杨梅黄酮可用作皮肤的光保护剂。但是杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制尚不清楚。研究目的1、通过建立体外光老化模型,探索紫外线照射对表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞结构和增殖,氧化损伤作用以及对基质金属蛋白酶MMP-1表达的影响。2、探讨杨梅黄酮对紫外线引起的表皮真皮结构和各种代谢改变的保护作用,进一步探讨其保护机制。研究方法第一部分:杨梅黄酮对紫外线照射后的原代成纤维细胞损伤的保护作用取新鲜皮肤组织用Dispase酶消化,分离上皮和真皮层成纤维细胞,采用组织块贴壁法培养真皮层成纤维细胞。紫外照射剂量分别为UVA+UVB（5mJ/cm2）、UVA+UVB（15mJ/cm2）、UVA+UVB（30mJ/cm2）、UVA+UVB（60mJ/cm2）,观察细胞存活率以及细胞形态,选择照射剂量UVA+UVB（15mJ/cm2）建立成纤维细胞紫外线照射后的光损伤模型。分别用不同浓度杨梅黄酮对细胞进行预处理,24小时后,以UVA+UVB（15mJ/cm2）进行照射,照射后继续以相应浓度杨梅黄酮孵育24小时后,观察细胞形态并进行计数,计算细胞存活率,采用MTT法检测细胞增殖活性,比色法检测成纤维细胞培养上清中羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）含量,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MMP-1分泌水平。第二部分:杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制UVB辐射对角质形成细胞的损伤分别采用不同UVB照射剂量（0、15、20、25、30mJ/cm2）照射人永生化角质形成细胞HaCaT,采用MTT方法检测HaCaT细胞的活力。选择20mJ/cm2（HaCaT细胞的活性降低将近50%）作为造模剂量,UVB照射后分别用不同浓度杨梅黄酮和生理盐水（对照组）处理细胞。采用MTT方法检测HaCaT细胞的活力,流式细胞术分析UVB辐射下的细胞的ROS含量,运用Western Blot和RT-PCR分别检测NF-KB信号通路标志蛋白pIκB和IκB及下游蛋白COX2蛋白及mRNA表达水平。第三部分:杨梅黄酮对紫外线所诱导的小鼠皮肤光损伤的保护作用50只白色雄性小鼠剃除背部绒毛,随机分为5组,每组10只:A组:空白对照组;B组:UVA+UVB照射;C组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮低浓度组（5mg/ml）;D组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮中浓度组（20mg/ml）;E组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮高浓度组（50mg/ml）。小鼠经均匀涂抹生理盐水（对照组）或杨梅黄酮30min后,每组均隔日照射UVA+UVB1次,照射强度UVB为0.18mW/cm2,UVA为1.25mW/cm2,第1周到第7周每次照射时间为30min,自第8周开始后照射时间每周延长1Omin,到第12周时照射时间为80min,到14周停止紫外线照射（最终UVA辐射剂量累计为139.86J/cm2,UVB辐照剂量累计为21.38J/cm2）。在紫外线照射过程中,定期观察各组小鼠背部皮肤,试验结束后采用Glogau法对小鼠背部皮肤进行分级。末次UVA十UVB照射实验结束后,取小鼠背部照射区皮肤组织进行HE染色和胶原纤维染色,倒置显微镜观察小鼠背部皮肤组织形态学及真皮内胶原纤维的变化。照射区皮肤检测SOD、HYP、T-AOC水平。提取照射区皮肤组织总RNA,通过RT-PCR测定MMP-1及IκB mRNA表达水平。研究结果第一部分:杨梅黄酮对紫外线照射后造成的原代成纤维细胞损伤的保护作用与空白对照组相比,UVA/UVB辐射组成纤维细胞后,随着辐射剂量的增加,细胞数量明显减少,并且表现出解体、排列紊乱、脱颗粒现象。随着辐射量的提升,成纤维细胞（fibroblast,FB）的存活率明显变小。即紫外线辐射可以损伤FB细胞的活力,致其凋亡坏死。与单纯照光组相比,杨梅黄酮给药组FB细胞的活力随着杨梅黄酮浓度的增加而逐渐升高。与正常对照组相比,UVA/UVB辐射后胶原蛋白分泌量降低,用杨梅黄酮处理后发现,杨梅黄酮浓度在50μg/ml以下时可提升紫外线照射后成纤维细胞培养上清中总胶原分泌量。在浓度为50μg/ml时,总胶原分泌量显着增加（P<0.05）。研究还发现杨梅黄酮浓度为50μg/ml时可以显着抑制成纤维细胞中的MMP-1分泌（P<0.05）,而当杨梅黄酮浓度大于100μg/ml以上时,MMP-1的分泌水平较单纯照射组反而增加。第二部分:杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制UVB辐射对角质形成细胞的损伤UVB剂量的逐渐增加,HaCaT细胞的存活率随之降低（P<0.05）。即UVB辐射可以损伤HaCaT细胞的活力,致其凋亡坏死。当辐射量达到20mJ/cm2,HaCaT细胞的活性降低将近50%。我们选择20mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞,采用不同杨梅黄酮（0、5、15、25、35、50μM）处理细胞,结果表明,与生理盐水对照组相比,HaCaT细胞的活力随着杨梅黄酮的浓度升高而逐渐提高。低浓度的杨梅黄酮对细胞的保护作用不显着（P>0.05）,而杨梅黄酮浓度达到50μM时,HaCaT细胞的存活率可达80%左右。经UVB照射后,HaCaT细胞的ROS水平上调,不同浓度的杨梅黄酮可逐渐降低HaCaT细胞的ROS水平,表明杨梅黄酮可以有效抑制UVB辐射诱导HaCaT细胞的ROS水平。紫外线照射后的HaCaT细胞的COX2 mRNA和蛋白水平均显着上调（P<0.05）,杨梅黄酮可以有效抑制UVB辐射诱导的COX2 mRNA和蛋白水平,且随着杨梅黄酮含量的升高,COX2的mRNA和蛋白水平逐渐降低。UVB照射后,细胞内的NF-κB信号通路标志蛋白pIκB水平表达上调（P<0.05）,IκB未产生明显变化（P>0.05）,当采用50μM的杨梅黄酮处理细胞,PIκB表达被抑制,IκB未产生明显变化。第三部分:杨梅黄酮对紫外线所诱导的小鼠皮肤光损伤的保护作用白色小鼠背部皮肤脱毛给予UVA+UVB连续照射14周后,背部皮肤出现明显光老化改变:成纤维细胞损伤甚至破碎,胶原纤维断裂,排列紊乱,胶原纤维含量下降,同时伴有单核炎症细胞的浸润。照射前分别外用浓度为5mg/ml、20mg/ml、50mg/ml的杨梅黄酮涂抹,结果显示杨梅黄酮可以不同程度地减轻胶原纤维变性,胶原纤维破坏减少,排列趋于整齐,含量升高,同时炎症细胞浸润明显减少（P<0.05）。小鼠皮肤经紫外线照射后抗氧化酶SOD、T-AOC的活性均有所下降,涂抹杨梅黄酮后各组抗氧化酶活性均有所升高（P<0.05）。超氧化物歧化酶SOD各组比较差异有统计学意（P<0.05）,当杨梅黄酮浓度为5mg/ml,T-AOC活性明显升高,HYP含量显着升高。当浓度为5mg/ml、20mg/ml 时,MMP-1 mRNA 水平显着升高（P<0.05）。结论杨梅黄酮在一定浓度范围内对紫外线照射的皮肤光损伤有一定的防护作用;杨梅黄酮可以增强照射后细胞的增殖活力、提高氧化酶活性;并且杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制细胞因子MMP-1的分泌来发挥抗皮肤光老化的作用。
二、长波紫外线对人包皮成纤维细胞影响的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、长波紫外线对人包皮成纤维细胞影响的实验研究（论文提纲范文）
（3）非编码RNA在UVA所致人成纤维细胞光老化中的表达谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文技术流程图 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验标本与材料 |
| 1.2 实验药物及试剂 |
| 1.3 实验仪器、设备 |
| 1.4 实验相关工作溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 人包皮组织原代成纤维细胞的分离和培养 |
| 2.2 包皮成纤维细胞光老化模型构建 |
| 2.3 CCK8法检测细胞增殖活性 |
| 2.4 Western Blot蛋白印迹法检测标志性抗体p21 |
| 2.5 RNA提取 |
| 2.6 生物信息分析流程 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 不同光照强度对紫外线照射后成纤维细胞增殖活性的影响 |
| 2 染料木素对长波紫外线照射后成纤维细胞增殖的影响 |
| 3 Western blotting检测衰老蛋白p21水平表达 |
| 4 各组细胞总RNA质量分析 |
| 5 MicroRNA差异分析 |
| 6 MicroRNA差异筛选统计 |
| 7 差异microRNA分布火山图 |
| 8 生物信息学分析 |
| 讨论 |
| 1 皮肤成纤维细胞光老化模型建立 |
| 2 p21衰老蛋白与光老化 |
| 3 microRNA与光老化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 植物提取物和天然化合物用于抗紫外线诱导的光老化 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）皮肤光老化领域可视化分析及中药作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 基于文献计量学皮肤光老化领域的可视化分析 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于网络药理学与分子对接探讨皮肤光老化作用机制 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药防治皮肤光老化研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）α1抗胰蛋白酶对人成纤维细胞慢性光老化模型的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 皮肤光老化的研究进展 |
| 2.1.1 光老化的发生机制 |
| 2.1.2 光老化的防护 |
| 2.1.3 光老化的治疗 |
| 第3章 实验材料与实验方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 儿童包皮组织 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 成纤维细胞的分离、培养 |
| 3.2.2 成纤维细胞的分组与照射 |
| 3.2.3 检测方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 AAT对β半乳糖苷酶染色阳性细胞所占百分率的影响 |
| 4.2 AAT对ROS水平的影响 |
| 4.3 AAT对转录因子AP-1(c-Fos/c-Jun)活性的影响 |
| 4.4 AAT对MMP-1、MMP-3表达的影响 |
| 4.5 AAT对Ⅰ型前胶原表达的影响 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 后记与致谢 |
（6）人参皂苷Rg1抗长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的作用研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料： |
| 1.2 样品、试剂与仪器： |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 样品及阳性药物配制： |
| 1.3.2 细胞培养： |
| 1.3.3 UVA损伤HDF体外模型的建立： |
| 1.3.4 人参皂苷Rg1抗UVA对HDF损伤作用： |
| 1.3.5 改良MTT法检测细胞活率： |
| 1.3.6 细胞相对存活率按下式计算： |
| 1.3.7 统计学分析： |
| 2 结果 |
| 2.1 大体观察： |
| 2.2 加人参皂苷Rg1后照射组的HDF存活率： |
| 2.3 照射后加人参皂苷Rg1组的HDF存活率： |
| 3 讨论 |
（7）ERK/MAPK通路在低剂量ALA-PDT治疗光老化成纤维细胞中的关键作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 在体外成纤维细胞光老化模型上验证低剂量ALA-PDT治疗光老化的作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 光老化以及低剂量ALA-PDT治疗光老化的机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 ERK/MAPK在UVA诱导成纤维细胞光老化以及低剂量 ALA-PDT治疗时的作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述皮肤光老化的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）芍药苷对UVA诱导皮肤光损伤的防护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :芍药苷对UVA诱导光损伤的防护作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 原代人真皮成纤维细胞提取 |
| 2.2.2 细胞换液 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 2.2.5 MTS法测定不同剂量UVA对成纤维细胞增殖活性的影响 |
| 2.2.6 MTS法测定不同浓度芍药苷对成纤维细胞增殖活性的影响 |
| 2.2.7 MTS法测定不同浓度芍药苷对UVA诱导成纤维细胞光损伤的保护作用 |
| 2.2.8 显微镜下观察细胞形态学变化 |
| 2.2.9 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.10 给予动物芍药苷及UVA处理 |
| 2.2.11 HE染色观察小鼠皮肤组织病理学变化 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 UVA照射抑制成纤维细胞细胞活力,并呈剂量依赖关系 |
| 3.2 芍药苷对成纤维细胞无毒性作用,并且抑制UVA对成纤维细胞增殖活性的损伤 |
| 3.3 芍药苷抑制UVA对成纤维细胞数量及形态的损伤 |
| 3.4 芍药苷抑制UVA诱导的成纤维细胞凋亡 |
| 3.5 芍药苷减弱UVA对小鼠皮肤光损伤 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :芍药苷对抗UVA诱导光损伤的机制探究 |
| 6 前言 |
| 7 材料和方法 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 实验对象 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 成纤维细胞的培养、换液、传代、冻存与复苏 |
| 7.2.2 细胞内ROS的检测 |
| 7.2.3 蛋白的提取与浓度的检测 |
| 7.2.4 细胞内MDA的检测 |
| 7.2.5 细胞内SOD的检测 |
| 7.2.6 Western blot |
| 7.2.7 RNA的提取与浓度检测 |
| 7.2.8 RNA逆转录及RT-qPCR |
| 7.2.9 siRNA敲除Nrf2 |
| 7.2.10 MTS法检测敲除Nrf2 后给予药物及UVA处理对成纤维细胞增殖活性的影响 |
| 7.2.11 免疫组化 |
| 7.3 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 芍药苷预处理可以抑制UVA诱导的成纤维细胞氧化应激 |
| 8.2 芍药苷增加成纤维细胞内抗氧化基因的表达 |
| 8.3 芍药苷及UVA增加成纤维细胞抗氧剂基因的表达 |
| 8.4 芍药苷及UVA增加小鼠皮肤抗氧基因的表达 |
| 8.5 建立Nrf2敲除成纤维细胞模型 |
| 8.6 芍药苷通过Nrf2 调节抗氧化基因HO-1、NQ-O1 |
| 8.7 芍药苷通过Nrf2 抑制UVA诱导成纤维细胞的氧化应激 |
| 8.8 芍药苷通过Nrf2 抑制UVA诱导成纤维细胞的活力下降 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分 :芍药苷与PLIN2 共同调控UVA诱导的成纤维细胞氧化应激 |
| 11 前言 |
| 12 材料和方法 |
| 12.1 材料 |
| 12.1.1 实验对象 |
| 12.1.2 主要试剂 |
| 12.1.3 主要仪器 |
| 12.2 方法 |
| 12.2.1 成纤维细胞的培养、换液、传代、冻存与复苏 |
| 12.2.2 RNA的提取及RT-qPCR |
| 12.2.3 蛋白的提取、浓度检测及Western blot |
| 12.2.4 免疫组化 |
| 12.2.5 siRNA敲除Nrf2 |
| 12.2.6慢病毒过表达PLIN2 |
| 12.2.7 MTS法检测过表达PLIN2 后给予药物及UVA处理对成纤维细胞增殖活性的影响 |
| 12.2.8 检测过表达PLIN2 后给予药物及UVA处理对成纤维细胞细胞内MDA产生的影响 |
| 12.2.9 EdU染色 |
| 12.3 统计学分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 芍药苷抑制UVA对成纤维细胞中PLIN2 的上调作用 |
| 13.2 芍药苷使PLIN2表达降低 |
| 13.3 芍药苷减少UVA导致小鼠皮肤组织中PLIN2 的表达增加 |
| 13.4 敲除Nrf2后PLIN2 表达增加,并且芍药苷不能抑制UVA诱导的PLIN2的增加 |
| 13.5 建立成纤维细胞PLIN2过表达模型 |
| 13.6 过表达PLIN2促进成纤维细胞增殖 |
| 13.7 过表达PLIN2抑制成纤维细胞氧化应激 |
| 13.8 过表达PLIN2 及联合芍药苷预处理抑制UVA诱导的氧化应激 |
| 13.9 过表达PLIN2 及联合芍药苷预处理抑制UVA诱导成纤维细胞的活力下降 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）真皮成纤维细胞体外培养优化方案及其促进创面愈合的研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 结果 |
| 第一部分 皮肤组织体外原代细胞培养、鉴定及活性分析 |
| 1.1 皮肤原代细胞的生长状态的观察 |
| 1.2 成纤维细胞免疫荧光鉴定及HE染色形态学观察 |
| 1.3 皮肤组织体外原代培养细胞数量分析及活性检测 |
| 1.4 原代培养皮肤细胞表面标记物检测 |
| 第二部分 体外培养皮肤细胞对创面愈合的影响 |
| 2.1 小鼠创面模型的建立 |
| 2.2 动物分组及光老化模型皮肤细胞模型的建立 |
| 2.3 创面愈合时间分析 |
| 2.4 创面愈合处皮肤形态学观察及胶原含量比较 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 紫外线致皮肤光老化及光癌变机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论着 |
（10）杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1、皮肤老化与光老化 |
| 2、紫外线与皮肤光老化 |
| 3、紫外线与氧化应激 |
| 4、紫外线诱导炎性细胞浸润 |
| 5、紫外线促进胶原蛋白降解 |
| 6、光老化药物治疗选择 |
| 7、杨梅黄酮的抗氧化作用及研究进展 |
| 第二章 杨梅黄酮对紫外线照射后的原代成纤维细胞形态及增殖的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 三、结果 |
| 1、人皮肤成纤维细胞的形态学观察 |
| 2、杨梅黄酮对紫外线照射后成纤维细胞生长形态及增殖的影响 |
| 3、杨梅黄酮对UVA/UVB照射的成纤维细胞培养上清中总胶原蛋白的影响 |
| 4、杨梅黄酮对UVA/UVB照射的成纤维细胞MMP-1分泌水平的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三章 杨梅黄酮通过IKB/NF-KB信号通路抑制UVB辐射对角质形成细胞的损伤 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| 1、主要仪器设备 |
| 2、实验材料 |
| 3、方法 |
| 三、结果 |
| 1、杨梅黄酮抑制UVB诱导的细胞凋亡 |
| 2、杨梅黄酮可以显着降低UVB辐射诱导的ROS水平 |
| 3、杨梅黄酮降低UVB辐射诱导COX2的表达 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四章 杨梅黄酮对紫外线所致小鼠皮肤光损伤的防护作用其机制 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| 1、主要仪器和设备 |
| 2、主要试剂 |
| 3、实验方法 |
| 三、结果 |
| 1、小鼠皮肤外观状态的变化 |
| 2、小鼠皮肤组织形态学改变及真皮内胶原纤维的改变 |
| 3、小鼠皮肤抗氧化酶SOD、T-AOC的活性的检测 |
| 4、小鼠皮肤羟脯氨酸含量的检测 |
| 5、小鼠皮肤中MMP-1 mRNA水平检测 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文综述 |
| References |
| 附发表的英文论文 |
四、长波紫外线对人包皮成纤维细胞影响的实验研究（论文参考文献）
- [1]circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究[J]. 曲莹莹,方嘉琦,欧阳梦婷,王梦瑶,黄羡殷,郑跃,赖维,许庆芳. 中华皮肤科杂志, 2022(01)
- [2]miR-26a靶向EZH2在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中的作用机制研究[J]. 毛丽艳,谢一航,施辛,张婷,钱华,吴亚芬,鲁慧,胡翠,李巍. 中华皮肤科杂志, 2021(07)
- [3]非编码RNA在UVA所致人成纤维细胞光老化中的表达谱分析[D]. 王海彦. 青岛大学, 2021
- [4]皮肤光老化领域可视化分析及中药作用机制研究[D]. 王恒旭. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [5]α1抗胰蛋白酶对人成纤维细胞慢性光老化模型的作用及其机制研究[D]. 李鹏琴. 吉林大学, 2021(01)
- [6]人参皂苷Rg1抗长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的作用研究[J]. 周桃花,周红艳,陈芳,尹颖,杨玉. 中国美容医学, 2021(03)
- [7]ERK/MAPK通路在低剂量ALA-PDT治疗光老化成纤维细胞中的关键作用及机制研究[D]. 罗杰夫. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [8]芍药苷对UVA诱导皮肤光损伤的防护作用及机制研究[D]. 逯岩松. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]真皮成纤维细胞体外培养优化方案及其促进创面愈合的研究[D]. 佘金铭. 三峡大学, 2020(06)
- [10]杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制研究[D]. 谢璟. 山东大学, 2019(02)