一、斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析（论文文献综述）
王艳艳[1]（2011）在《影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的因素及机制的初步研究》文中研究表明疟疾是世界上危害最为严重的传染病,该病每年感染1亿多人并造成80多万人死亡。目前,疟疾的防治措施主要是服用抗疟药物及避免或减少蚊虫的叮咬如使用驱避剂或浸药蚊帐等。然而单纯以药物治疗为主要策略,难以达到在全世界范围内消除疟疾的目标。因此,阻断疟疾传播成为控制和消灭全球疟疾的可靠途径和迫切需要。阻断疟疾传播的方法之一是依赖传播阻断疫苗（transmission?blocking vaccines,TBVs）的应用。虽然TBVs的研制已取得阶段性的进展,但是由于抗原的免疫原性弱、佐剂的应用效果不理想及抗原不恰当折叠等因素产生的影响,阻碍了疟疾TBVs的发展,这就迫切需要一种新的阻断传播的策略。阻断传播的前提是对疟原虫—蚊媒相互关系的深入认识和了解。在按蚊-疟原虫相互关系的研究中发现蚊的天然免疫是其抗疟原虫感染的主要机制。近期研究发现,采用抗生素药物抑制蚊肠道菌群后可以导致冈比亚按蚊免疫反应下调,从而促进疟原虫在蚊体内的发育;氯喹导致蚊丝氨酸蛋白酶、抗菌肽表达下调,影响按蚊丝氨酸蛋白酶级联反应,干扰信号转导和抗菌肽转录水平,从而增加了按蚊对疟原虫的易感性,有利于按蚊对疟原虫的传播。我们的前期研究发现抗疟药物-硝喹能诱导斯氏按蚊对约氏疟原虫的黑化,启动按蚊对疟原虫的免疫反应,从而阻断疟原虫在蚊体内的发育,提示诸多干预因素可以调节按蚊免疫系统,影响疟原虫在按蚊体内的发育。本课题利用大劣按蚊/约氏疟原虫不易感模型和斯氏按蚊/约氏疟原虫易感模型,对各种不同因素影响约氏疟原虫在按蚊体内发育及其机制进行初步探讨。1.肠道菌群、TEP1对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育影响及其机制初步研究利用约氏疟原虫/大劣按蚊不易感蚊模型,通过抗生素抑制蚊肠道菌群后,结果显示给抗生素感染组蚊感染卵囊数明显高于正常感染组蚊感染卵囊数（P<0.0001）,卵囊感染度增加7-10倍,感染率增加近1倍,说明抗生素抑制蚊肠道菌群导致约氏疟原虫对大劣按蚊的易感度大大增加,提示肠道菌群在疟原虫感染大劣按蚊的过程中起着重要的作用。RT-PCR结果显示抗生素处理肠道菌群后,使含硫脂蛋白1（ thioester-containing proteins1 , TEP1） cDNA的转录水平明显下调,提示肠道菌群可能通过调节TEP1的表达影响约氏疟原虫在大劣按蚊体内的发育。我们采用RT-PCR方法,观察肠道菌群未经处理情况下,检测大劣按蚊TEP1 cDNA在正常吸糖水、吸正常血和感染疟原虫三种情况下的转录变化,结果显示吸血和感染疟原虫均可诱导TEP1 cDNA的转录上调,其中感染疟原虫明显上调TEP1 cDNA的转录表达,然而在清除肠道菌群后,疟原虫感染却无法明显上调TEP1 cDNA的表达,提示肠道菌群可能通上调TEP1激活抗疟免疫反应,抑制疟原虫在按蚊体内发育,提示TEP1可能作为一重要效应因子参与肠道菌群激活的基础免疫反应。肠道菌群未处理情况下,本实验对按蚊TEP1进行RNAi,结果显示大劣按蚊蚊胃中约氏疟原虫的卵囊数量增加10-15倍,感染率增加1倍,说明在缺少TEP1的情况下,肠道菌群无法抑制约氏疟原虫在大劣按蚊体内的发育,提示在肠道菌群抑制疟原虫发育的过程中TEP1是必不可少的一个环节。本研究提示按蚊肠道菌群可以通过调节TEP1的表达抑制疟原虫在大劣按蚊体内的发育;TEP1作为重要的免疫反应因子可能参与按蚊基础免疫反应,维持按蚊肠道菌群在正常水平。然而,当疟原虫入侵后引起肠道菌群变化刺激上调TEP1表达,识别并结合疟原虫启动杀伤疟原虫机制。对肠道菌群、TEP1影响约氏疟原虫在按蚊体发育的机制的研究,可以改变按蚊对疟原虫的易感性,可能为阻断疟疾在蚊期传播提供一新的切入点。2、蒿甲醚影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育及其机制研究利用约氏疟原虫/斯氏按蚊易感模型,斯氏按蚊吸饲蒿甲醚糖水,结果发现吸饲蒿甲醚糖水斯氏按蚊体内的卵囊数量呈3-5倍的增加,说明蒿甲醚可以促进并有利于约氏疟原虫雌雄配子体在斯氏按蚊体内向卵囊方向的发育。RT-PCR结果显示蒿甲醚明显抑制了斯氏按蚊一氧化氮合成酶（NO synthase, NOS）,TEP1和前酚氧化酶（Prophenoloxidase,PPO）三个重要的蚊抗疟原虫免疫相关基因的表达,提示蒿甲醚可能通过抑制NO合成和黑化包被反应或是裂解反应,致使斯氏按蚊对疟原虫免疫反应减弱,促进疟原虫在按蚊体内更好的发育。本研究通过对影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的因素及其机制的初步探讨,如何降低疟原虫对媒介的易感性为阻断疟疾的传播提供更多的理论依据,为研制新的、高效的阻断传播手段提供一个新的切入点。同时也提示,广泛应用于临床和现场杀红内期药物蒿甲醚反而可以促进按蚊感染疟原虫能力提高,有利于疟疾的流行和扩散。这将对如何控制疟疾流行、媒介传播提出了新的问题,如何合理使用青蒿素类杀红内期药物提出了新的研究课题。
王英,李松,张锡林,陈继德,周桃莉,黄复生[2]（2009）在《大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与疟原虫感染相关性研究》文中认为目的探讨大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶与约氏疟原虫感染的相关性。方法首先利用二维电泳分离感染约氏疟原虫的和吸食正常血的大劣按蚊血淋巴蛋白;然后进行Western blot,用丝氨酸蛋白酶抗体进行识别,并比较感染组与正常对照组间的区别;选择感染后不同时相点对大劣按蚊蚊胃和唾液腺进腺镜检,以观察蚊体内疟原虫情况。结果Western blot显示,正常对照组无阳性蛋白点,感染组有2个阳性蛋白点,分子质量单位分别为44ku和27ku,等电点分别为8.0和5.0;镜检显示,感染7d时可见卵囊颗粒样病变,11d时卵囊发育不同步且黑化明显,之后检出的卵囊数逐渐减少。蚊唾液腺内未见子孢子。结论大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶与约氏疟原虫感染相关,可能参与蚊抗疟原虫感染的黑化包被反应。
张健[3]（2008）在《TEP1在抗疟药—硝喹诱导按蚊黑化反应中机理的研究》文中认为随着疟原虫对抗疟药和蚊虫对杀虫剂抗性的出现,而且疟原虫抗原的多态性、宿主免疫逃避等原因,致使有效疟疾疫苗的缺乏,至此没有完全有效根治疟疾的措施。抗疟药主要研究不同药物对不同期疟原虫的作用,对于预防药是否、如何影响按蚊抗疟原虫免疫反应并不清楚。我们的前期研究发现,抗疟药物-硝喹能诱导斯氏按蚊对约氏疟原虫的黑化,启动按蚊对疟原虫的免疫反应,从而阻断疟原虫在蚊体内的发育,但是如何识别、诱导的机制不清楚。我们研究的目的是认识抗疟药物（硝喹）既能对疟原虫有杀伤作用,又能诱导按蚊产生对疟原虫的黑化免疫反应,疟原虫终止在蚊体的发育,使按蚊不能发挥作为传播媒介的作用。按蚊黑化包被反应中的识别机制的探讨是目前研究疟原虫—蚊媒相互关系分子机制的一个非常活跃的领域。最近研究表明含硫酯键蛋白（ thioester-containing protein,TEP1）能显着地影响冈比亚按蚊的黑化疟原虫的能力,那么TEP分子是否在抗疟药诱导按蚊黑化反应中也有作用、并且发挥关键的识别作用。因此,本课题利用斯氏按蚊—约氏疟原虫模型,从药物干预的角度探讨按蚊是如何识别疟原虫,启动按蚊抗疟原虫的免疫反应。研究结果如下:1、根据果蝇TEP1-4及冈比亚按蚊TEP1分子的保守氨基酸序列比对设计简并引物,成功地克隆了4种斯氏按蚊TEP分子,并分别命名为AsTEP1-4。2、利用Real-time PCR方法研究了AsTEP1-4随按蚊吸血、感染疟原虫、以及抗疟药物诱导条件下的转录变化情况。结果显示AsTEP1在动合子穿过蚊胃上皮细胞的时期（感染24 h）和卵囊形成初期（感染4d和5d）表达上调,以后其表达下降,而抗疟药物-硝喹可以诱导AsTEP1表达上调,并从用药后第3d（感染9d后）开始,AsTEP1的转录显着性高于未用药组的AsTEP1水平。结合抗疟药诱导按蚊黑化疟原虫的观察显示,用药后第3d疟原虫卵囊开始出现黑化,这与抗疟药诱导AsTEP1表达明显上调的时相点一致,表明抗疟药诱导按蚊抗疟原虫黑化反应可能与抗疟药诱导AsTEP1转录上调具有相关性。其它AsTEP cDNAs在以上条件下转录无明显变化,提示AsTEP2-4与按蚊抗疟原虫免疫以及抗疟药物诱导按蚊免疫反应无相关性。3、观察AsTEP1对抗疟药干扰后斯氏按蚊体内约氏疟原虫的识别结合作用。光镜观察发现给药后3d,与对照组相比,用药组卵囊出现明显的黑化现象,卵囊形态各异、皱缩,囊壁与内容物间隙加大,甚至有内容物渗出,沉积的黑色颗粒增多,卵囊颜色渐渐变为灰黑色,最后完全被黑色颗粒或团块物质填充即为完全黑化。共聚焦显微镜观察发现用药组卵囊随黑色颗粒的增多,疟原虫自带的GFP荧光信号逐渐减弱,直至消失;TEP1信号不仅在用药组黑化卵囊表面有显示,而且在黑色颗粒沉积处也有显示。说明AsTEP1可能直接参与了抗疟药诱导按蚊黑化相关成分的募集或者间接地参与激活黑化级联反应。4、通过喂饲抗AsTEP1抗血清,观察与黑化表型相关PO酶的活性变化以及抗疟药诱导按蚊黑化反应的变化情况。结果显示喂饲抗按蚊TEP1的抗血清能使按蚊的PO酶活性以及按蚊的黑化率显着降低,说明抗AsTEP1抗血清进入蚊血淋巴抑制了该分子与疟原虫表面成分或者与下游成分的的结合,从而影响了AsTEP1分子调节的黑化免疫反应。提示AsTEP1与抗疟药诱导按蚊抗疟原虫黑化反应具有相关性。研究结果表明,本课题成功克隆了4种斯氏按蚊TEP cDNA,其中AsTEP1与按蚊感染疟原虫以及抗疟药物诱导按蚊免疫反应相关。进一步分析AsTEP1在抗疟药物-硝喹诱使按蚊黑化反应中的机理:斯氏按蚊是约氏疟原虫的易感蚊种,而硝喹可以影响斯氏按蚊抗约氏疟原虫免疫反应,诱导AsTEP1转录上调,从而改变斯氏按蚊对约氏疟原虫的易感性,使得按蚊免疫系统能够识别疟原虫并引发黑化免疫反应,阻止疟原虫在蚊体内的正常发育。本课题对AsTEP1在抗疟药物诱导按蚊黑化免疫反应中的识别作用的探讨为硝喹启动按蚊抗疟原虫免疫反应提供了理论依据,为现场预防药物的选择提供了重要的信息。这既对发展有效疟疾媒介控制策略和现有药物的更合理使用有意义,又对抗疟药物的设计提供了一条非常有意义的途径。
王英,张健,张锡林,周桃莉,段建华,徐文岳,黄复生[4]（2008）在《大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定》文中提出目的分离大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶并进行鉴定。方法采集感染约氏疟原虫后24h的大劣按蚊血淋巴,利用SDS-PAGE进行血淋巴蛋白的分离。然后,分别用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶PAP1、PAP2和PAP3抗体进行Western blot,检测血淋巴中相应的丝氨酸蛋白酶。结果SDS-PAGE分离出31条血淋巴蛋白带,分子质量单位为10～200ku。Western blot结果显示,44ku蛋白能被PAP1、PAP2和PAP3抗体识别,27ku蛋白能被PAP1和PAP3抗体识别,38ku蛋白能被PAP2抗体识别。结论成功分离和鉴定出了大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶。
王英[5]（2006）在《大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究》文中进行了进一步梳理疟疾目前仍是严重危害人类健康的一种寄生虫病,每年导致100～300万人死亡。近年来,疟原虫抗药性和蚊媒耐药性的产生和迅速扩散,加之有效疟疾疫苗的缺乏,给疟疾防治工作带来很大的困难。传统方法已难于控制该病的流行,迫切需要为疟疾的防治工作提供新的方法和治疗靶点。通过对疟原虫在蚊体内发育过程中关键环节的干扰来阻断疟疾的传播,是控制疟疾的一类有价值的新策略。而这一策略的实施需要对蚊与疟原虫之间的复杂关系有着比较详细的了解,尤其是蚊抗疟原虫感染和疟原虫在蚊体内发育所需的一些关键分子的鉴定至关重要。抗菌肽的产生、细胞吞噬作用和黑化包被反应是蚊抗疟原虫感染中最为重要的三类免疫反应,对其相关分子的鉴定具有重要意义。其中,黑化包被反应是按蚊的一种有效的抗疟机制,反应的某些关键成分（如丝氨酸蛋白酶）来源于血淋巴。目前关于蚊抗疟原虫感染分子机制的研究主要集中于冈比亚按蚊,对大劣按蚊的研究甚少。大劣按蚊是我国及东南亚地区的主要传疟媒介,能够通过卵囊黑化包被的方式杀伤其体内的约氏疟原虫,从而阻断对该疟原虫的传播。因此,大劣按蚊-约氏疟原虫是一个很好的研究模型,利用该模型可以开展疟疾蚊媒阻断策略及医学昆虫免疫的相关研究。本研究即是利用二维电泳（Two Dimensional Electrophoresis,2DE）、原核表达、westernblot、RT-PCR、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）、免疫组化、激光共聚焦等技术对大劣按蚊血淋巴中抗约氏疟原虫感染相关蛋白进行分离、鉴定,并对丝氨酸蛋白酶进行相关研究。整个研究分为三大部分:第一部分:筛选和鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴相关蛋白,并对该相关蛋白的生物学作用进行分析。1、利用2DE技术较好地分离了感染约氏疟原虫前后的血淋巴蛋白,比对后获得37个差异蛋白点。2、对感染前后的部分差异蛋白（DEP1～6）进行质谱分析,并对DEP1进行N端氨基酸测序,根据检测结果在蛋白质数据库中进行检索、分析和生物学特性的预测。结果显示,DEP1～6均为尚无研究的未知蛋白,其中DEP1可能在蚊抗疟原虫感染中起着重要作用。第二部分:对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3（AdSP3）进行原核表达,并检测表达产物与烟草天蛾前酚氧化酶活化酶（PAP）抗血清之间的免疫反应性,同时进行生物信息学分析,以明确利用烟草天蛾PAP抗血清研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的可行性。随之,利用烟草天蛾PAP抗体,对电泳分离的血淋巴蛋白进行了鉴定和与疟原虫感染的相关性研究。1、成功构建了大劣按蚊丝氨酸蛋白酶Pinpoint/AdSP3表达质粒,并在JM109大肠杆菌中进行原核表达,表达获得了一35kDa大小的融合蛋白。Western blot检测结果显示,烟草天蛾PAP抗血清与大劣按蚊丝氨酸蛋白酶具有免疫反应性。对昆虫丝氨酸蛋白酶进行生物信息学分析显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与烟草天蛾PAP之间的氨基酸序列有较高同源性,且关键位点保守。本研究提示,利用烟草天蛾PAP抗血清识别大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可行。2、利用烟草天蛾PAP抗血清,结合SDS-PAGE、2DE和Western blot技术,对大劣按蚊感染约氏疟原虫前后血淋巴中的丝氨酸蛋白酶进行分离、识别和鉴定。结果显示,在大劣按蚊血淋巴蛋白中有分子量不同的两个蛋白能与PAP抗血清反应,且感染前后的差异提示该蛋白可能与疟原虫的感染相关。第三部分:从mRNA水平和蛋白水平分别对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行组织定位和定量研究。1、利用RT-PCR和Real-time PCR技术从mRNA水平对丝氨酸蛋白酶在蚊体内进行组织定位和定量研究。结果显示,血淋巴细胞和唾液腺中有丝氨酸蛋白酶AdSP3的表达,而蚊胃中则难以确定有无该酶的表达;感染前后及吸血后的不同时相点丝氨酸蛋白酶AdSP3的转录水平不同,其变化可能与疟原虫的感染有关。2、从蛋白水平利用免疫组化技术和激光共聚焦技术,确定丝氨酸蛋白酶在大劣按蚊不同组织中的分布及在感染前后不同时相点的蛋白含量。结果显示,在血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃中均有丝氨酸蛋白酶的蛋白分布;其含量于吸血后不同组及不同时相点有所不同,不同组间丝氨酸蛋白酶的蛋白水平变化提示该酶与疟原虫卵囊黑化包被反应相关。本研究旨在寻找大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白,并明确丝氨酸蛋白酶是否疟原虫感染相关蛋白,分析该酶在蚊抗疟原虫感染中的作用。结果显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可能参与了蚊抗疟原虫感染的卵囊黑化包被反应。这将为认识疟原虫和蚊媒的相互关系及进一步明确卵囊黑化机制、探索疟原虫防治新策略奠定试验和理论基础。
张健[6]（2005）在《感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建和差异表达基因的鉴定及分析》文中认为疟疾是世界上主要的传染病之一,在全世界人群中具有很高的发病率和致病率。全球受疟疾威胁的人口超过30 亿,每年死亡的人数超过100 万（WHO:World Malaria Report 2005）。随着疟原虫多药抗性株的出现与迅速扩散、蚊媒对杀虫剂抗性的增加,以及目前尚无有效的抗疟疫苗,因此疟疾的控制工作将面临巨大的挑战,迫切需要发展新的疟疾控制策略。20 世纪90 年代初,WHO 提出了“遗传改造蚊媒”的疟疾防治新策略,而寻找按蚊抗疟原虫感染相关基因,克隆、鉴定并分析其功能,是实现这种新策略的首要工作。按蚊的先天免疫反应主要通过黑化包被反应的激活, NO 和抗菌肽的产生等机制抑制体内疟原虫的发育。但是NO 和抗菌肽只能在一定程度上调节按蚊体内的疟原虫感染率,而黑化包被反应则能完全抑制疟原虫的感染,是能否阻断按蚊感染疟原虫的最主要免疫机制。当疟原虫表面分子与按蚊的可溶性模式识别受体结合而触发该反应,并激活丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase,Sp）级联,最终导致前酚氧化酶（Prophenoloxidase,PPO）分解激活酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）,PO 激活后续成分介导蛋白质发生交联并聚合成黑色素从而固定、隔离或杀死入侵的病原体。目前,已从冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）克隆到几种不同的PPO、Sp 和抗菌肽等。但是究竟如何启动了按蚊抗疟原虫感染的免疫反应,目前仍不清楚。大劣按蚊是我国和东南亚地区的重要传疟蚊媒。研究发现,对恶性疟原虫敏感的大劣按蚊可以黒化包被约氏疟原虫卵囊,所以大劣按蚊-约氏疟原虫模型是研究按蚊抗疟原虫感染机制较好的模型。目前研究按蚊抗疟原虫感染相关分子采用的技术有退化PCR、DD-PCR 等,通过这些方法获得基因的数目有限,而且不能克服基因上调。本实验以大劣按蚊-约氏疟原虫为模型,利用新近建立的SSH 方法构建感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库,通过对差异基因的鉴定和生物信息学分析,预测其在按蚊感染疟原虫的过程中所起的作用,并对与先天免疫相关的差异基因进行半定量实验,分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化,探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。实验内容和结果主要包括以下方面:
杨松[7]（2004）在《斯氏按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系及信号调控机制研究》文中研究指明黑化包裹是按蚊抗疟原虫的一种特异的防御机制,可能是疟原虫表面分子与可溶性模式识别受体结合而触发,并激活丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）级联,最终导致前酚氧化酶（PPO）的分解激活酚氧化酶（PO）,PO和其它蛋白质发生交联而黑化包裹疟原虫。但还不知道PPO是如何到中肠组织内的,如何发生蛋白酶级联的,以及如何参与雌按蚊内疟原虫卵囊黑化过程的。疟原虫在按蚊中肠内外经历了配子体、合子、动合子和卵囊4个阶段,卵囊成熟后,子孢子逸出最后到达唾液腺而发育为感染期。斯氏按蚊是约氏疟原虫的易感媒介,卵囊很少黑化,本文利用斯氏按蚊吸饲硝喹乙酸盐（Nitroquine acetate,NA）诱导产生约氏疟原虫卵囊黑化模型,在血细胞或中肠差异表达的黑化相关蛋白或基因分析基础上初步探讨诱导黑化及其信号调控机制。1.我们利用光镜和透射电子显微镜观察到用药诱导后的约氏疟原虫卵囊黑化颗粒,中肠代谢和超微结构异常改变,细胞间隙增宽。2.利用Bradford法测定不同食源条件下斯氏按蚊雌蚊血淋巴和中肠蛋白浓度差异。统计学分析发现,NA组血淋巴蛋白浓度显着下降,而IB和NA组间中肠蛋白浓度无显着性差异。3.血淋巴SDS-PAGE显示NA、IB、NB和S组均可见到数十条蛋白带,分子量在160kDa和66kDa蛋白差异非常明显,吸正常血及感染1d后66kDa蛋白表达增加,感染6～8d稍减弱,用药1、2d稍增强,3d开始下降。而160kDa蛋白在吸正常血及感染1d后呈上调表达,以后减弱。4.对NA和IB组血淋巴和中肠蛋白进行2-DE和考马斯亮蓝染色,然后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的肽质量指纹图谱从15个血淋巴差异蛋白中初步鉴定出一种SP。利用抗冈比亚按蚊SP22D和PPO抗体进行Western印迹发现在NA和IB组蚊存在SP22D和PPO蛋白,约氏疟原虫感染后斯氏按蚊血淋巴SP22D和PPO表达增强,至6d达到峰值,在NA处理卵囊黑化过程中表达逐渐下降,但是黑化后斯氏按蚊中肠PPO含量呈现上升趋势。2-DE和Western印迹提示雌斯氏按蚊成蚊血淋巴内存在PPO和SP22D基础性表达,PPO和SP22D在体时可能均是以二聚体形式存在。<WP=14>约氏疟原虫感染后,雌斯氏按蚊成蚊血淋巴内PPO和SP22D水平是上升的,约氏疟原虫卵囊黑化后二者呈现下降表达,而中肠内PPO却升高。2-DE及PMF发现,用药后中肠糖代谢、结构和细胞信息联系等蛋白表达水平下降。5.利用PPO和SP兼并引物和RT-PCR技术,成功地从斯氏按蚊雌成蚊全蚊、血淋巴或中肠内克隆到差异表达PPO1、SP1 和SP2基因,三基因均呈现基础性表达,但是吸正常鼠血、约氏疟原虫感染血或用药诱导卵囊黑化后表达水平上表现不同程度的差异,吸正常鼠血、感染血或用药后SP1,PPO1和SP2表达均上调,尤其感染及用药后更明显。ISH进一步证实PPO1、SP1 和SP2均表达于血淋巴和中肠细胞内。6.在约氏疟原虫感染及黑化期间,转录因子Relish也随斯氏按蚊食源的不同而发生基因转录水平的变化。吸正常小鼠血24h Relish转录呈轻微上调,吸感染血6h、12h、24h或48h的Relish表达均明显增加,吸感染血5d和6d的Relish表达逐渐下降而趋近吸糖水水平,然而,吸NA糖水12h或24h的Relish表达呈中等水平增加。研究结果表明,PPO和SP两种蛋白酶是约氏疟原虫卵囊黑化通路中重要的成分,可能同时在参与卵囊黑化包裹反应中发挥了重要作用。从时相点分析,Relish转录因子很可能参与PPO级联的转录调控。NA导致约氏疟原虫和/或斯氏按蚊中肠上皮细胞的化学损伤可能是黑化的始动原因,可能抑制约氏疟原虫蛋白或/和斯氏按蚊中肠蛋白的合成,干扰了疟原虫的正常发育,致使疟原虫逃避按蚊免疫反应的能力受到减弱或者按蚊识别结构变化疟原虫的能力增强,血淋巴和/或中肠PPO级联成分便参与黑化过程。
邱宗文[8]（2004）在《大劣按蚊PPO基因的克隆与抗约氏疟原虫感染免疫防御反应的研究》文中提出蚊媒传播的疟疾是一种危害严重的传染病,在全世界人群中具有很高的发病率和致死率。随着疟原虫多药抗性株的出现与迅速扩散、以及蚊媒对杀虫剂耐受性的增加,目前又无有效的抗疟疫苗。因此,疟疾控制工作将面临巨大的挑战,迫切需要发展新的疟疾控制策略。于上世纪九十年代,WHO提出了基因操纵蚊媒的新策略,而寻找支持或抑制疟原虫在蚊体内发育的相关基因,克隆、鉴定及分析其功能,以及研究按蚊抗疟原虫感染的先天性免疫反应机制是实现这一策略的重要前提。卵囊黑化包被反应是按蚊抵御疟原虫感染的特异性免疫防御机制,也是抗性株冈比亚按蚊或不易感按蚊的最主要表型。而前酚氧化酶（Prophenoloxidase,PPO）是介导卵囊黑化包被反应的一种关键酶,活化后可催化酪氨酸羟基化为二羟基苯基丙氨酸,二羟基苯基丙氨酸和多巴胺可进一步氧化为具有活性的苯醌活性,苯醌即可介导蛋白交联并聚合成黑色素层固定、隔离或杀死入侵的病原体。由于PPO级联反应介导的黑化现象在按蚊及昆虫中非常普遍,除包被的入侵病原体外、还包括卵壳和几丁质的硬化与色素沉积,以及创伤愈合等。因此,据黑化反应的多种功能提示在按蚊及昆虫基因组中可能拥有大量的PPO基因。目前,已从冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）克隆到6种不同的PPO基因,但斯氏按蚊（Anopheles stephensi）与库态按蚊（Anopheles culicifacies）仅克隆到一种,并对其在按蚊抗疟原虫感染中的作用进行了初步研究。大劣按蚊（Anopheles dirus）是我国和东南亚地区的重要传疟蚊媒,为恶性疟原虫的易感蚊种,但可黑化包被中肠内发育的约氏疟原虫卵囊并表现出抗性。目前,有关大劣按蚊种传播恶性疟原虫相关的研究较多,但对其抵御疟原虫感染的先天性免疫防御机制的研究较少,如黑化包被约氏疟原虫卵囊。因此,本课题拟主要进行以下几方面的基础研究工作:一、大劣按蚊PPO基因的cDNA克隆与序列分析。二、吸血与约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO基因转录的影响。三、约氏疟原虫感染斯氏与大劣按蚊前后其中肠内PPO的变化。其实验内容和结果主要包括以下三个方面:1.根据冈比亚按蚊、烟草天蛾和天蚕等9种已知昆虫PPO的保守氨基酸序列设计<WP=12>简并引物,以大劣按蚊2-3龄幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增后获得一条约600bp的条带。将该片段切胶回收、纯化后与pMD18 T-载体连接,转化至XL1-Blue菌株（用CaCl2法制备感受态细菌）,在含氨苄青霉素的LB平板上共获得近70个白斑菌落。随机挑取单个白斑菌落进行培养并抽提质粒,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后可见切下一条略大于600bp的DNA片段。再以10倍稀释经双酶切鉴定为阳性克隆的质粒为模板,利用PPO简并引物经PCR扩增后仍获得一条约600bp的条带,与以cDNA为模板扩增出的条带大小一致。测定阳性克隆质粒内插入的序列为597bp,用DNASIS程序推导目的片段的氨基酸序列,序列两端分别为PPO的两个铜结合位点:CuA:HHWHWHLVYP;CuB:MRDPAFYRWH。由于该两个结合位点的氨基酸序列在各种昆虫PPO中均具有高度的保守性,也是PPO的重要标记,表明克隆所得的片段为大劣按蚊PPO基因的部分序列。根据已获得的PPO基因序列设计一条特异上游引物,再结合按蚊及多种昆虫PPO 3′-端的保守氨基酸序列设计另一条简并下游引物,经RT-PCR及TA克隆后获得一条1163bp的片段,其中5′-端有431bp与已克隆PPO基因3′-端序列基本一致（429/431）,表明该序列与已克隆大劣按蚊PPO基因序列为同一基因序列。将2条序列进行拼接后获得的PPO基因序列长为1329bp,推导可编码443个氨基酸残基。Blast查询结果显示,克隆的大劣按蚊PPO基因序列与冈比亚按蚊PPO4基因序列的同源性达84%（1113/1325）,氨基酸序列的同源性为91%（406/443aa）。由于与冈比亚按蚊PPO4基因序列具有很高的同源性,因此命名为AdPPO4,已提交GeneBank数据库（Access Number:AY347484）。2.根据已克隆AdPPO4基因序列设计特异引物,利用半定量RT-PCR分析吸血与约氏疟原虫感染对其转录的影响,并对AdPPO4在蚊各发育虫期中的转录,以及成蚊血淋巴、中肠与唾液腺组织中的转录进行了研究。结果显示AdPPO4在蚊幼虫与蛹期呈现高丰度转录;成蚊血细胞也可转录AdPPO4,而中肠与唾液腺组织不转录或极低水平转录。成蚊中AdPPO4的转录水平较低,但吸血或吸血感染约氏疟原虫后转录明显增强,提示吸血或吸血感染约氏疟原虫时可诱导AdPPO4基因转录增加。由于大劣按蚊可黑化包被中肠内发育的约氏疟原虫卵囊,而PPO是介导卵囊黑化的一种关键酶,因此成蚊中AdPPO4基因的表达增加可有助于黑化包被约氏疟原虫卵囊,但AdPPO4在卵囊黑化包被中的作用及其具体机制还需要进一步研究。3.按蚊中肠既是一个重要的免疫效应器官,也是PPO介导疟原虫卵囊黑化包被反应的场所。利用美国Oklahoma州立大学Dr. Jiang惠赠的PPO多抗,结合免疫组化与免<WP=13>疫印迹技术,检测斯氏与大劣按蚊在吸血感染约氏疟原虫前后其中肠内PPO的变化。发现斯氏与大劣按蚊在吸血感染前后其中肠内PPO的分布明显不同,感染前PPO主要分布于中肠循环管道内,而感染后PPO聚集于中肠组织细胞间隙之间,表明按蚊吸血感染疟原虫后可导致存在于中肠循环管道内PPO聚集于组织间隙。由于感染后同时间点大劣按蚊中肠内PPO的聚集程度大于
杨松,黄复生,况明书,段建华[9]（2004）在《斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究》文中研究指明目的 探讨斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法 斯氏按蚊分吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组 ,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴 ,解剖后取吸硝喹糖水蚊第 1、2和 3天斯氏按蚊中肠 ,超声提取中肠蛋白 ,Bradford法检测血淋巴总蛋白浓度 ,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS -PAGE ,Western印迹电转移后检测前酚氧化酶。结果 四组血淋巴前酚氧化酶和用药后中肠前酚氧化酶均呈现一条阳性蛋白带 ,分子量分别均约 6 6kDa,与吸糖水组比较 ,吸正常小白鼠血组血淋巴前酚氧化酶表达增强 ,而感染后血淋巴前酚氧化酶表显着增强。硝喹诱导黑化后血淋巴前酚氧化酶表达水平呈逐日下调趋势 ,而硝喹诱导黑化过程中中肠前酚氧化酶量逐渐增加。结论 斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶参与疟原虫卵囊黑化反应。
杨松,黄复生,吴玉章,况明书[10]（2004）在《二维电泳-质谱分析斯氏按蚊中约氏疟原虫卵囊黑化相关的差异表达蛋白》文中提出目的 用 2 DE和PMF分离和鉴定约氏疟原虫卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋白。方法 用固相pH梯度二维电泳分离中肠和血淋巴差异表达蛋白 ,考马斯亮蓝染色 ,ImageMasterVDS CL凝胶扫描和PDQuest2DElite软件分析 ,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果 获得了分辨率和重复性均较好的 2 DE考马斯亮蓝图谱 ,吸硝喹糖水组蚊血淋巴和中肠蛋白点分别有 10 1个和 10 4个 ,感染组分别有 115个和 162个 ,匹配点分别为 5 1个和 44个。斯氏按蚊血淋巴和中肠蛋白质组中蛋白点分别主要分布于酸性端和碱性端 ,血淋巴和中肠差异蛋白也分别主要分布于酸性端和碱性端。随机取2 5个差异蛋白点进行胶内原位酶解 肽质指纹图谱分析得到了 16个蛋白质肽质指纹图 ,查询数据库初步鉴定了 8个蛋白质 ,分别为与抗疟免疫、黑化、结构、糖代谢、细胞通讯等相关蛋白。结论 建立了一套重复性和分辨率较好的斯氏按蚊蛋白质分离和鉴定的二维凝胶电泳 肽质谱指纹分析法 ,约氏疟原虫卵囊黑化前后 ,斯氏按蚊血淋巴和中肠伴随大量差异表达蛋白 ,部分蛋白可能与黑化有关。
二、斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析（论文提纲范文）
（1）影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的因素及机制的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肠道菌群、TEP1 对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育影响及机制初步研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育的影响及机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 The innate immunity of insect |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间已发表和拟发表论文 |
（2）大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与疟原虫感染相关性研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物与虫种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 疟原虫感染和标本的采集与处理 |
| 2.2 二维电泳分离血淋巴蛋白 |
| 2.3 Western blot检测丝氨酸蛋白酶 |
| 2.4 蚊体内疟原虫卵囊黑化情况的观察 |
| 结 果 |
| 1 2DE及Western blot结果 |
| 2 蚊体内卵囊发育情况 |
| 讨 论 |
（3）TEP1在抗疟药—硝喹诱导按蚊黑化反应中机理的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 TEP1 在抗疟药-硝喹诱导按蚊黑化反应中机理的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 斯氏按蚊TEP cDNA 的克隆及序列分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Real-time PCR 检测斯氏按蚊TEP1-4 的转录变化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 激光共聚焦观察AsTEP1 对疟原虫的特异识别 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 鉴定AsTEP1 与黑化反应的相关性 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 与昆虫免疫相关的TEP 家族分子研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 按蚊抗疟原虫先天免疫机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间已发表和拟发表的文章 |
（5）大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 氨基酸缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 大劣按蚊抗约氏疟原虫感染血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 大劣按蚊AdSP3的原核表达及血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离、鉴定 |
| 第一节 大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的原核表达及免疫活性检测 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离、鉴定和疟原虫感染相关性研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的组织定位和定量研究 |
| 第一节 mRNA水平对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行组织定位及定量研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 蛋白水平对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行组织定位及定量研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 昆虫天然免疫的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蚊抗疟原虫的分子机制 |
| 参考文献 |
| 附一:攻读博士学位期间总结及发表的论文 |
| 附二:攻读博士学位期间获得基金资助情况 |
（6）感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建和差异表达基因的鉴定及分析（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建和差异表达基因的鉴定及分析 |
| 前言 |
| 第一节 感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 感染约氏疟原虫大劣按蚊差异基因的鉴定及分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 按蚊感染疟原虫后差异表达基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间撰写的论文 |
（7）斯氏按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系及信号调控机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 斯氏按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系及信号调控机制研究 |
| 前 言 |
| 第一部分 不同食源斯氏按蚊饲养、黑化前后卵囊和中肠结构观察 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 第二部分 斯氏按蚊PPO级联中差异表达蛋白分离和分析 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 第三部分 斯氏按蚊PPO级联效应基因SP和PPO的克隆和分析 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 第四部分 斯氏按蚊Relish基因的克隆和对PPO级联信号调控的初步分析 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 全文总结 |
| 致 谢 |
| 图 片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 附1:博士研究生期间发表的论文 |
| 附2:博士研究生期间获得基金资助情况 |
（8）大劣按蚊PPO基因的克隆与抗约氏疟原虫感染免疫防御反应的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 氨基酸缩写 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 大劣按蚊PPO基因的克隆与抗约氏疟原虫感染免疫防御反应的研究 |
| 前 言 |
| 第一部分 大劣按蚊PPO基因的cDNA克隆与序列分析 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 第二部分 吸血与约氏疟原虫感染对AdPPO4基因转录的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 第三部分 约氏疟原虫感染斯氏与大劣按蚊前后其中肠内PPO的变化 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 全文结论 |
| 致 谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 按蚊抗疟原虫感染的先天性免疫反应 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 疟原虫差异表达基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间撰写的论文 |
（9）斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 按蚊和疟原虫感染 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2 结 果 |
| 2.1 四组雌斯氏按蚊成蚊血淋巴蛋白浓度比较 |
| 2.2 SDS-PAGE蛋白质电转移 |
| 2.3 感染率和黑化率比较 |
| 3 讨 论 |
四、斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析（论文参考文献）
- [1]影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的因素及机制的初步研究[D]. 王艳艳. 第三军医大学, 2011(12)
- [2]大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与疟原虫感染相关性研究[J]. 王英,李松,张锡林,陈继德,周桃莉,黄复生. 中国病原生物学杂志, 2009(07)
- [3]TEP1在抗疟药—硝喹诱导按蚊黑化反应中机理的研究[D]. 张健. 第三军医大学, 2008(03)
- [4]大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定[J]. 王英,张健,张锡林,周桃莉,段建华,徐文岳,黄复生. 中国病原生物学杂志, 2008(03)
- [5]大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白的研究[D]. 王英. 第三军医大学, 2006(03)
- [6]感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建和差异表达基因的鉴定及分析[D]. 张健. 第三军医大学, 2005(01)
- [7]斯氏按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系及信号调控机制研究[D]. 杨松. 第三军医大学, 2004(01)
- [8]大劣按蚊PPO基因的克隆与抗约氏疟原虫感染免疫防御反应的研究[D]. 邱宗文. 第三军医大学, 2004(01)
- [9]斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究[J]. 杨松,黄复生,况明书,段建华. 中国人兽共患病杂志, 2004(04)
- [10]二维电泳-质谱分析斯氏按蚊中约氏疟原虫卵囊黑化相关的差异表达蛋白[J]. 杨松,黄复生,吴玉章,况明书. 第三军医大学学报, 2004(06)