一、PCR技术应用于外环境水样中霍乱弧菌的监测（论文文献综述）
王云霞,严寒秋,刘海波,史文凤,周海健,王斌[1]（2019）在《一起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学分析》文中研究说明目的对2017年北京市房山区一起霍乱疫情的O1群霍乱弧菌的分子流行病学特征和耐药性进行分析。方法采集患者和有关人员及外环境（包括食物）样本109件,用实时荧光PCR检测碱性蛋白胨水增菌液中O1/O139群霍乱弧菌特异性基因;同时按常规法分离培养鉴定;对鉴定的阳性菌株用实时荧光PCR检测霍乱弧菌CTX基因,用微量肉汤稀释法进行20种药物敏感试验,用Not I和SfiⅠ限制性内切酶进行脉冲场凝胶电泳实验和聚类分析。结果 109件样本增菌液O1群霍乱弧菌特异性基因阳性率19. 27%（21/109,患者、密切接触者中家属和就餐地厨师肛拭子各1件阳性,就餐地后厨外环境样本18件阳性）;常规培养鉴定O1群小川型霍乱弧菌阳性率5. 50%（6/109,患者和就餐地厨师肛拭子各检出1株,就餐地后厨外环境涂抹检出4株）; 6株O1群小川型霍乱弧菌,霍乱CTX基因均阴性,对20种抗生素中12种100%敏感,对头孢唑林100%耐药,PFGE分子分型条带具有一致性。结论该起霍乱疫情的病原为O1群小川型非产毒株; PFGE分子分型溯源表明疫情与厨师有关;应关注霍乱疫情菌株的耐药监测。
董晓妹[2]（2019）在《五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立》文中研究指明弧菌属（Vibrio）为一类嗜盐杆菌,呈革兰氏阴性,广泛分布在河口、海水和海洋动物体内。致病性弧菌主要通过海产品、海水等感染人类,能够引起人体发生感染性腹泻、耳和伤口感染甚至败血症。随着生活质量的提高,人们对海产品的需求量越来越大,弧菌已然成为我国食源性疾病的重要病原菌之一。为能够快速有效地检测样品中的致病性弧菌。本研究将免疫磁分离技术（Immunomagnetic separation,IMS）分别与多重PCR和液相芯片（Luminex xMAP）检测方法结合,建立了能够同时富集五种常见致病性弧菌（副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌以及溶藻弧菌）的免疫磁分离技术与多重PCR和Luminex xMAP检测方法,该方法具有快速、简单、高通量和高灵敏性等优点,为开展弧菌的现场检测提供技术支撑。1、免疫磁珠的制备与目的菌的捕获效果为优化样品前处理这一步骤,本研究将实验室保存的针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及拟态弧菌共同抗原表位的单克隆抗体2-1-D4与磁珠偶联制备免疫磁珠从而建立了针对上述五种弧菌的免疫磁分离快速富集技术。在该技术中,采用碳化二亚胺（3-ethylcarbodiimide,EDC）/琥拍酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide,NHS）化学偶联法制备免疫磁珠对免疫磁珠的制备进行了优化并按实际捕获效果来确定最佳条件;对富集过程中免疫磁珠的工作用量、捕获时间等进行了优化,并评价免疫磁珠的特异性、敏感性及其在食品基质模拟样品中的捕获效果。试验结果表明,1mL体系中免疫磁珠最佳工作量为0.33 mg,最佳捕获时间为60 min;免疫磁珠对副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌的捕获率均在50%以上,且其与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应,显示了该免疫磁珠良好的特异性。免疫磁珠作为样品前处理的步骤不仅能提高传统培养基检测的灵敏度和特异性,还能有效的减少人为操作的误差和提高检测的准确性。2、多重PCR快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立本试验通过筛选引物、优化建立了五种致病性弧菌的多重PCR检测体系。试验根据五种致病性弧菌的种特异性基因设计引物,选择副溶血弧菌toxR基因、霍乱弧菌ompW基因、创伤弧菌vvh基因、拟态弧菌vm-toxR基因和溶藻弧菌va-coL基因作为靶基因设计引物,以细菌16S rRNA片段为扩增内标对照（internal amplification control,IAC）设计了 IAC引物。通过对多重PCR反应体系中退火温度和引物浓度进行了优化,确定了最佳退火温度（57℃）和引物浓度（0.1 μmol/L）。通过对多重PCR的敏感性和特异性评价,确定了多重PCR同时检测五种弧菌模板时检测限度为1.8×105CFU/mL,且试验过程中该方法与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应。因此,建立的该检测方法具有特异性强,灵敏度高,操作简便,并且ICA的存在排除了多重PCR检测致病性弧菌可能导致的假阴性结果,提高了检测的精准度,在诊断与防范水产品食源性致病性弧菌传染方面具有重要意义。3、多重LuminexxMAP快速检测水产品中的五种致病性弧菌方法的建立本研究建立了同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌五种致病性弧菌的多重液相芯片检测技术,并对该方法进行了评价。分别设计带有生物素标记的针对这五种致病性弧菌种特异性基因和毒力基因的特异性引物,利用氨基标记的探针偶联羧基微球,通过该微球与生物素化的PCR产物杂交,Luminex 200分析系统能够分析编码微球的荧光分类和藻红蛋白的中强荧光值。通过对杂交时间和杂交温度进行优化确定了该反应最佳杂交条件为杂交温度52℃、杂交时间25 min。经过多次的实验结果证明,该方法均能对单一菌株样本和混合样本进行准确的检测鉴定。在重复试验中,其组内变异系数（CV%）为2.71%-7.68%,表明该方法具有较好的稳定性。同时对该方法的敏感性进行鉴定。结果表明多重Luminex xMAP在同时检测五种弧菌时,十组探针的敏感性在1.8×102 CFU/mL-1.8×104CFU/mL之间。以流式液相芯片技术为平台建立水产品中5种致病性弧菌的快速高通量检测体系,具有灵敏性高、重复性好、可控性强、节省样本和时间等优点,对于病原体的检测具有良好的应用前景。4、多重IMS-Luminex xMAP检测方法应用于模拟样品的检测及与多重IMS-PCR的比较本试验使用制备的免疫磁珠在最佳条件下捕获样品中的五种弧菌,提取捕获后的样品DNA,分别用多重PCR检测方法和多重Luminex xMAP检测方法进行检测。结果表明,在本次模拟样品检测试验中,当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8 CFU/g时,IMS结合多重Luminex xMAP的检测方法可以在6-7 h内检测出五种弧菌,而IMS结合多重PCR检测方法则检测不出来;但当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8×103 CFU/g时,IMS结合多重PCR检测方法可以在10 h内检测出五种弧菌。该结果证明IMS与多重Luminex xMAP相结合的检测方法,缩短了检测时间,降低了弧菌的检测限,提高了检测的精准度,为检测这五种弧菌提供了快速、简单、高通量及高灵敏性的检测技术。
赵艳婷[3]（2018）在《淡水虾养殖环境中生物污染物的分布特征及其关联性研究》文中研究说明近年来随着我国水产养殖业的迅猛发展,水产养殖污染加剧,造成养殖环境质量不断恶化,引起人们广泛的关注。抗生素在水产养殖中具有不可替代的作用,但长期、大量地滥用抗生素会诱导水产动物体内的微生物携带耐药基因（ARGs）,耐药基因通过不同途径进入到养殖环境及其周围的环境中,不仅会造成潜在的基因污染,而且还会通过可移动遗传元件如质粒、转座子、整合子等的水平迁移作用进入其他微生物中,从而在环境、动物与人类之间相互传播,最终可能会对人类的健康构成潜在的风险。本研究选取江苏省内六个不同地点的淡水虾养殖场,通过采集青虾、养殖水、底泥三种样品,运用16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序技术、并结合生物信息学和生物统计学分析方法,系统、全面地分析青虾肠道、养殖水和底泥三种不同样品中的微生物群落结构分布特征。并以微生物群落结构的数据为基础,进一步解析了青虾肠道及其养殖环境中耐药基因的多样性和丰度;耐药基因与微生物群落结构、可移动遗传元件的相关性;耐药基因与抗生素和环境因子（TN、TP、TOC、DO、T、pH）的相关性;同时,分析了潜在致病菌的丰度和多样性,三种不同样品中潜在致病菌的差异,潜在致病菌与环境因子的相关性以及耐药基因与潜在致病菌的同现性。主要的研究结果如下:（1）16S rRNA基因测序数据表明,变形菌门（89.68%±1.21%）是青虾肠道中的优势菌,其次是厚壁菌门和拟杆菌门,丰度最高的OTU被注释为Dongia。将57个微生物属（在40个不同样品中的比例为38.00～99.48%）定义为青虾肠道的主要菌群。研究结果还表明三种环境因子:水温T（p=0.004）、总磷TP（p=0.010）和溶解氧DO（p=0.007）与微生物群落结构变化显着相关。（2）在青虾肠道、养殖水和底泥样品中分别检测到60个、102个和67个耐药基因,主要的耐药类型是多重耐药基因和杆菌肽类,外排泵和目标修饰类是主要的耐药机理。与耐药基因库进行相似度的比较,发现青虾肠道中的耐药基因序列与基因库的平均相似度为54.89%,高于底泥和养殖水的相似度。气单胞菌属、耶尔森氏菌属和梭状芽胞杆菌与耐药基因的分布有显着相关性（p<0.05）;耐药基因的相对丰度与质粒（R2=0.8852）、整合子（R2=0.8763）和插入序列（R2=0.8907）显着正相关。磺胺嘧啶和甲基苄氧嘧啶抗生素与多重耐药基因、氨基糖苷类、β-内酰胺、氯霉素和多药耐药基因呈正相关关系;四环素类抗生素（土霉素和金霉素）与多重耐药基因（mexF、mexW和acrB）之间也存在显着正相关关系。（3）通过16S rRNA扩增子测序数据与人类致病菌16S rRNA基因库的比对结果表明,青虾肠道、养殖水和底泥中共检测出35个潜在致病菌属、59个潜在致病菌种。养殖水中潜在致病菌的丰度（0.07～9.00%）高于青虾肠道和底泥。三种样品中都普遍存在气单胞菌属,丰度占总致病菌的比例为0.76～99.20%。青虾肠道与养殖水中的潜在致病菌有更高的相似度。探索青虾肠道及其养殖环境中主要的潜在致病菌和环境因子的相关性表明,水温、总磷和溶解氧与潜在致病菌的分布显着相关。Network分析显示了大量的潜在致病菌携带多种耐药基因。综上所述,本研究系统地揭示了青虾肠道及其养殖环境中（养殖水和底泥）中微生物群落结构分布特征,深入解析了三种不同样品中耐药基因、致病菌的多样性及丰度的变化特征及其相关关系,阐述了青虾肠道及其养殖环境中生物污染物可能产生的环境健康风险,为青虾养殖环境中致病菌和耐药基因的风险评估以及污染防控提供了科学的理论依据。
徐丽梅[4]（2017）在《水中病原微生物的紫外线和氯消毒灭活作用机制研究》文中研究指明消毒是水处理过程中杀灭病原微生物、降低水传播疾病传播风险的重要保障。紫外消毒和氯消毒是目前最主流的污水消毒技术,它们对病原微生物的作用机制有明显的差别。病原菌和病毒是两类最主要的病原微生物,在形态结构、大小、生理特性、水环境赋存状态以及对恶劣环境的耐受力方面均存在明显差异。病原微生物的特性、消毒作用机制的差异导致消毒过程中病原菌和病毒的灭活效果的不同。因此,正确的评价消毒方式对病原微生物的损伤对于控制水传播疾病十分重要。检测方法是评价的基础,然而,由于检测方法的局限性,目前尚没有一种方法能够全面、准确地反映出消毒对细菌和病毒的灭活效果。本文以揭示紫外线和氯对细菌和病毒的灭活差异及作用机制为主要目标,分别选用大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）作为水媒病原菌和病毒的模拟病原体,进行了紫外线消毒和氯消毒实验,分析各种检测方法用于评价病原微生物灭活的适用性,论文的主要工作和成果如下:1)试验病原微生物对紫外线耐受力由强到弱依次为:脊髓灰质炎病毒(灭活速率常数k=0.16 cm2·mJ-1)>多重耐药E.coli(k=0.270.34 cm2·mJ-1)>敏感性E.coli ATCC 25922(k=0.53 cm2·mJ-1)。紫外消毒后部分E.coli能进入亚致死状态,经20 mJ/cm2紫外照射后,在可见光和暗处理24 h,其光复活和暗修复百分比分别为0.018%和0.00042%,紫外线辐射剂量增加到80 mJ/cm2时,其光复活和暗修复百分比明显降低,在<0.0013%范围。同样脊髓灰质炎病毒对氯的耐受力明显强于E.coli ATCC 25922,推算达到4-log灭活所需的有效氯浓度分别为1.35和2.56 mg/L。2)分析了紫外线对细菌的灭活作用机制:低剂量的紫外光线能透过细胞膜,直达内部核酸部位导致DNA的损伤,同时能导致mRNA的损伤,阻断染色体复制启动蛋白（dnaA mRNA）和单链DNA交联蛋白（ssb mRNA）功能,扰乱了细菌的DNA复制功能,在50 mJ/cm2时,介导DNA损伤修复功能的RecA mRNA受到严重损伤达到了检测限,同时,编码谷氨酸脱羧酶的gadA mRNA的表达受到轻微抑制,逐步导致细菌丢失了可培养性。>100 mJ/cm2的高剂量紫外处理后,SEM扫描电镜观察细菌表面出现了褶皱、凹陷和孔洞现象,新陈代谢相关的ATP出现耗损。在400 mJ/cm2时,仅有9.9%的细胞膜通透性发生改变。紫外线能改变耐药菌株对抗生素的抑菌环直径,六重耐药E.coli SER6-1对GEN、CHL和NOR 3种抗生素产生的抑菌环直径发生变化,二重耐药E.coli SER2对AMP、STP、GEN、CTX、CHL、CIP和NOR 7种抗生素产生的抑菌环直径发生变化,抗生素耐药的抑菌环直径经紫外消毒后相对稳定,因此六重耐药E.coli SER6-1抑菌环直径变化的种数低于二重耐药E.coli SER2抑菌环直径变化数目。紫外线消毒对抗性基因的损伤较低,然而,高于80 mJ/cm2紫外线剂量能导致ARGs的相对丰度的增加。3)氯对细菌的灭活作用机制:小于等于5 mg/L低浓度的有效氯在起始2 min内迅速造成了细胞膜渗透性的损伤,进而内容物ATP被释放到胞外,在5 mg/L有效氯处理30 min,E.coli胞内ATP几乎完全被释放到胞外,使细胞的新陈代谢功能紊乱、呼吸作用和运动功能受损。同时,次氯酸穿过细胞膜抵达到内部结构,能直接影响mRNA的表达,通过限制染色体复制启动（dnaA）、DNA蛋白交联功能（ssb）、干扰SOS应答修复系统（RecA）、影响氨酸脱羧酶（gadA）的合成多种机制下,促使E.coli失去可培养能力,RecA和ssb基因在5 mg/L时达到检测限水平,dnaA和gadA基因在8 mg/L时达到检测限。高于8 mg/L过量的有效氯进一步加速DNA的损伤导致遗传功能的丧失,被释放到胞外的ATP发生氧化水解作用逐步消亡。4)分析了各种检测方法用于评价细菌灭活的可能性。发现流式细胞仪技术和生物发光检测方法适用于评价氯消毒对细菌的灭活,但无法用于指示紫外消毒对细菌的灭活。而细菌或病毒基因组核酸的定量PCR检测方法由于检测片段长度的限制以及核酸损伤需要高的消毒剂量的原因,不适用于评价微生物的灭活。mRNA的损伤更贴近于培养能力的消失,然而,消毒过程中mRNA的损伤程度也受目标基因的影响,或许SOS损伤修复基因的消失更能反应细菌的失活。5)对比了RT-qPCR、TCID50、ICC-RT-qPCR检测方法用于评价病毒损伤的适用性。3种方法的检测灵敏度为:ICC-RT-qPCR(0.44 TCID50)>RT-qPCR(4.4TCID50)>TCID50(44 TCID50)。消毒过程中基因的片段长度越长损伤越严重,紫外线对5’UTR非编码区的损伤程度高于VP1结构蛋白基因的损伤,而氯消毒过程中病毒的5’UTR非编码区和VP1结构蛋白基因的损伤程度近似相等。紫外消毒过程中,TCID50法和ICC-RT-qPCR方法检测感染性病毒分别在20 mJ/cm2和100mJ/cm2剂量下达到检测限。氯消毒过程中,脊髓灰质炎病毒经2 mg/L有效氯接触30 min后感染性消失,而ICC-RT-qPCR方法在5 mg/L仍能检测到感染性的脊髓灰质炎病毒,采用ICC-RT-qPCR方法来评价病毒的灭活具有更高的保障性。RT-PCR结果显示病毒的感染性消失后仍能检测到核酸的存在,因此,RT-qPCR方法低估了病毒的灭活。6)总结了紫外线和氯两种消毒剂对E.coli的DNA损伤程度低于脊髓灰质炎病毒的RNA损伤,与培养法得到的病毒比细菌更难被灭活的结果正好相反。因此,病毒比细菌更难被灭活的原因在于病毒的衣壳蛋白对消毒剂的抵抗力强于细菌的外层细胞结构。
刘淑文,丁家旺,秦伟[5]（2017）在《海水中致病菌检测研究进展》文中认为海水中致病菌种类繁多、致病性强,对水产养殖和人体健康存在着潜在危害。传统的检测方法培养过程复杂繁琐、耗时长、效率低,难以满足实际工作的需求。因此,建立海水中致病菌的快速、灵敏、准确的检测技术势在必行。本文综述了流式细胞技术、分子生物学方法、免疫学方法和生物传感器技术等在海水致病菌检测中的应用,总结了上述方法在海水致病菌检测中的研究现状。
谢晓红,王洁,蔡卫红,王仁刚,陶力新[6]（2016）在《检测外环境霍乱弧菌的方法探讨》文中进行了进一步梳理目的提高外环境霍乱弧菌的阳性检出率。方法通过荧光定量PCR技术、免疫磁珠分离技术和常规分离培养技术相结合的综合检测方法,与荧光定量PCR技术结合常规分离培养技术和单纯的常规分离培养技术的检测方法进行比较,观察分析其阳性检出率。结果荧光定量PCR技术、免疫磁珠分离技术和常规分离培养技术相结合的综合检测方法,霍乱弧菌阳性检出率（1.05%）明显高于荧光定量PCR技术结合常规分离培养技术的阳性检出率（0.53%）和单纯的常规检测技术的阳性检出率（0.26%）。结论将PCR方法作为筛查的基础,进行免疫磁珠分离技术结合常规分离培养技术应用于霍乱弧菌的检测,可降低工作量,提高工作效率和工作质量,明显地提高阳性检出率。
周进宏[7]（2015）在《肠道病原体在污水处理和回用中的分布及衰变过程研究》文中进行了进一步梳理水环境的病原性污染是全世界危害最严重的问题之一,研究水体的病原性污染对人类健康和环境安全保障具有重要意义。现有标准或规范中涉及的指示细菌并不足以反映水环境中病原体的真实存在情况,正确评价水质的安全性需关注病原体的污染情况。肠道病原体作为水环境中的病原体重要部分,主要来源于人畜粪便等排泄物污染的生活污水,在各种环境水体中普遍存在,且可存活较长时间,对人类健康造成很大的威胁。因此,建立肠道病原体快速、高效的检测方法,研究环境水体的肠道病原体污染迫在眉睫。随着分子生物技术的不断发展,定量PCR方法以快速、准确和灵敏度高等特点为病原体的检测提供了技术手段。因此,利用分子生物学手段,研究环境水体的病原体污染及病原体在污水处理过程中的迁移和衰减对病原体污染的预防和控制具有重要意义。本论文是国家自然科学基金重点项目的部分研究内容。本论文以沙门菌、志贺菌、肠道病毒、人类星状病毒、轮状病毒和诺如病毒为目标病原体,建立了肠道病原体的定量PCR检测方法,并评价了方法的可靠性和实用性。应用建立的肠道病原体检测方法,监测了生活污水中几种肠病毒的浓度并分析了肠病毒的污染特性。此外,本文结合某实际污水再生与循环利用系统,研究了肠道病原体在不同来源污水中的分布特性,分析了A2/O-MBR系统各处理单元对指示细菌、致病菌和病毒的去除特性,研究了再生水循环利用过程中病原体的二次污染问题。论文的主要工作和成果如下:（1）通过比较不同的病毒浓缩方法,确定了对生活污水、二级出水、黑水、灰水、厨房废水、A2/O出水等水样采用PEG沉淀法进行病毒浓缩,并确定了各类水样的病毒回收率;对景观湖水和MBR出水采用0.22μm滤膜的膜吸附-洗脱法和PEG沉淀法进行两次浓缩,并确定了病毒回收率。通过比较不同滤膜孔径对细菌的浓缩,确定了对生活污水、黑水、灰水、厨房废水等水样采用0.45μm的膜吸附-洗脱法浓缩,并确定各类水样中细菌的回收率;采用0.22μm的滤膜浓缩二级出水、A2/O出水、景观湖水和MBR出水等水样中的细菌,并确定各水样的回收率。（2）将巢式PCR的高灵敏性与定量PCR的精确性有效结合,建立了三种主要HFMD病毒（EV71、CVA16和CVA10）的半巢式PCR和实时定量PCR方法。该方法灵敏度高,重现性好,可对环境水体中EV71、CVA16和CVA10病毒进行准确检测。同时,还确立了沙门菌、志贺菌、人类星状病毒、诺如病毒的SYBR Green荧光染料实时定量PCR方法和肠道病毒和轮状病毒的Taq Man探针实时定量PCR方法检测方法。（3）对三个污水处理厂的进水和二级出水进行为期一年的监测,研究结果表明肠道病毒、轮状病毒和诺如病毒在进水中主要分布在102～104copies/mL,人类星状病毒浓度略高,分布在103～104copies/mL;二级出水中除人类星状病毒分布在103copies/mL,其他病毒浓度约为102 copies/mL。生活污水中的病毒呈现明显的季节分布:肠道病毒浓度在秋季最高,三种HFMD病病毒的最高检出率均在春季,人类星状病毒和轮状病毒浓度在冬季最高,诺如病毒在春季和夏季的浓度较高。肠病毒在不同的季节分布规律不同:春季人类星状病毒浓度最高,夏季人类星状病毒和诺如病毒浓度较高,秋季肠道病毒浓度最高,冬季人类星状病毒和轮状病毒浓度较高。研究结果揭示了病毒的分布特性与研究地区的临床流行病学特性相似,统计学分析验证了肠病毒的浓度分布服从对数正态分布特性。（4）研究了三种不同来源污水中（黑水、灰水和厨房废水）指示细菌、致病菌和病毒的分布情况。黑水中粪大肠菌群浓度为104 copies/mL,E.coli浓度为103copies/mL,病原菌浓度约101 copies/mL,病毒约为103 copies/mL。不同来源污水中病原体浓度差异较大,黑水中病原体浓度比灰水和厨房废水中高约2个数量级。与污水处理厂混合污水比较,发现黑水污水中病原体的主要来源,且病原体在收集和运输过程中出现了再生繁殖。（5）研究了指示细菌（粪大肠菌群和E.coli）、致病菌和病毒在A2/O-MBR处理系统的迁移衰变特性。细格栅处理对微生物的去除作用微弱,去除率仅为0.2-log～0.4-log。传统活性污泥工艺对指示细菌、致病毒和病毒的去除效率接近,约为1.4-log～1.7-log;A2/O-MBR工艺对指示菌和病原体的去除效果明显,浓度和检出率大幅度降低。粪大肠菌群、E.coli、致病菌和病毒呈现不同的去除率,粪大肠菌群去除率约为6-log左右,E.coli去除率4-log左右,致病菌和病毒去除率在2-log～3-log范围内。MBR出水经氯消毒后未检出病原体,0.7mg/L的余氯保障了消毒后处理水的微生物安全性。（6）通过对景观湖中病原体的检测,揭示了再生水调节与景观利用过程中景观湖水受到了肠道病原体的二次污染。除粪大肠菌群未检出,景观水体中E.coli和病原体均可检出,且E.coli、沙门氏菌和肠道病毒检出率较高,肠道病毒浓度略高,其他病原菌和病毒浓度相当,各微生物浓度均服从对数正态分布。猜测景观水体中的病原体可能来自于非粪便的面源污染,如气溶胶、降雨、湖底淤泥释放等,而高温和日光照射等自然环境条件对病原体有一定的净化作用。
陈福辉,杨梦,刘晓青,余平,徐晓倩,熊长辉,王鹏,杨富强,宗俊[8]（2015）在《胶体金免疫层析法应用于环境水体中霍乱检测的效果评价》文中进行了进一步梳理目的验证胶体金免疫层析法应用于环境水样本中霍乱检测的特异性、灵敏性和实用性,寻求简便、可靠的环境水中霍乱检测方法。方法环境水样置36.5℃经6 h增菌培养后,用胶体金免疫层析法检测,同时用传统分离培养法,培养后的菌落用血清玻片凝集方法作为鉴别霍乱弧菌的金标准,且用统计学方法对这两种方法检测的结果进行比较。结果 747份水样中胶体金试验阳性19份,分离培养法培养出16株霍乱弧菌,经χ2检验,差异无统计学意义（χ2=0.61,P>0.05）,表明胶体金免疫层析法与传统分离培养法检测外环境水中霍乱的结果之间差异无统计学意义。胶体金免疫层析法检测外环境水中霍乱的灵敏度为100.00%,特异性为99.59%,假阳性率为0.41%,假阴性率为0.00%,与传统分离培养法的结果一致率为99.60%。结论胶体金免疫层析法检测外环境水中霍乱的敏感度好（100.00%）,特异性高（99.59%）,与传统分离培养法的结果一致性较高,对外环境水中霍乱检测具有可靠性、简便性、实用性,适宜在基层作为辅助检测方法推广应用。
黄海,周登仁,王琼妹,邝仕壮,庞燕[9]（2012）在《环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法》文中进行了进一步梳理目的建立环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法。方法对霍乱弧菌的外环境水监测样本进行PCR检测;确定弱电泳条带或无电泳条带的稀释度,将第一次PCR的产物梯度稀释后进行二次PCR。采用琼脂凝胶糖电泳进行分析。结果对378件环境水样分别进行一次、二次PCR检测,有4件水样经两种方法检测均为阳性,有6件水样二次PCR检测为阳性。一次PCR检测霍乱弧菌的阳性率[1.06%（4/378）]低于二次PCR[2.65%（10/378）],差异有统计学意义（P<0.05）。结论二次PCR操作简便快速、检出率高、费用低廉,适用于环境水样中霍乱弧菌的快速监测。
徐丹戈,黄世旺,方叶珍,徐昌平,张政,包芳珍,李剑,蒋雪凤,卢亦愚[10]（2011）在《TaqMan双重荧光PCR用于快速检测模拟临床标本中产毒型O139群霍乱弧菌的研究》文中提出目的:研究建立TaqM an双重荧光PCR技术,用于快速检测模拟临床标本中产毒型O139群霍乱弧菌。方法:以O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb O139和毒力基因CT的特异性序列设计引物和TaqM an探针,建立优化TaqM an双重荧光PCR反应体系,进行特异性与敏感性的研究,并应用于模拟粪便感染和外环境监测标本的快速检测中。结果:该方法对产毒型O139群霍乱弧菌检测具有高度特异性,对rfbO139和CT基因序列检出限达到1.0×102cfu/m l或5 cfu/PCR反应体系,对模拟粪便感染和外环境监测标本的检测结果与实际情况完全一致,整个检测过程最快仅需3 h。结论:本研究建立的产毒型O139群霍乱弧菌双重荧光PCR检测技术具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床粪便标本和外环境监测样本的快速检测。
二、PCR技术应用于外环境水样中霍乱弧菌的监测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR技术应用于外环境水样中霍乱弧菌的监测（论文提纲范文）
（1）一起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样本来源: |
| 1.1.2 试剂: |
| 1.1.3 仪器: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病原菌常规分离培养: |
| 1.2.2 霍乱弧菌实时荧光PCR法: |
| 1.2.3 药物敏感试验: |
| 1.2.4 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 实验及聚类分析: |
| 2 结果 |
| 2.1 霍乱弧菌O1/O139群特异性基因结果 |
| 2.2 常规分离培养结果 |
| 2.3 实时荧光PCR检测霍乱弧菌CTX基因结果 |
| 2.4 药物敏感试验结果 |
| 2.5 PFGE分子分型结果 |
| 3 讨论 |
（2）五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1 研究背景 |
| 2 弧菌简介 |
| 2.1 致病性 |
| 2.2 常见的致病性弧菌 |
| 2.2.1 副溶血弧菌 |
| 2.2.2 霍乱弧菌 |
| 2.2.3 拟态弧菌 |
| 2.2.4 溶藻弧菌 |
| 2.2.5 创伤弧菌 |
| 3 致病性弧菌的分离检测方法 |
| 3.1 传统检测方法 |
| 3.2 免疫学检测方法 |
| 3.2.1 免疫磁珠分离法(Immunomagnetic separation,IMS) |
| 3.2.2 酶联免疫吸附检测技术(ELISA) |
| 3.2.3 免疫荧光技术(IFA) |
| 3.2.4 蛋白质印迹法(Western Blot) |
| 3.3 核酸检测技术 |
| 3.4 液相芯片技术研究概况 |
| 3.4.1 微球编码与反应原理 |
| 3.4.2 检测原理 |
| 3.4.3 液相芯片的特点 |
| 4 本研究的试验目的及试验意义 |
| 研究内容一 针对五种致病性弧菌的免疫磁珠的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试验相关溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 单抗克隆抗体的筛选 |
| 2.2 免疫磁珠的制备 |
| 2.3 免疫磁珠富集菌液 |
| 2.4 免疫磁珠捕获条件的优化 |
| 2.5 免疫磁珠性能的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 单抗克隆抗体的筛选 |
| 3.2 免疫磁珠捕获条件的优化 |
| 3.3 免疫磁珠性能的测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 多重PCR快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌种 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 靶基因的扩增 |
| 3.2 引物特异性验证 |
| 3.3 多重PCR性能测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 多重Luminex xMAP快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针设计 |
| 2.2 PCR扩增 |
| 2.3 杂交偶联验证 |
| 2.4 引物与探针特异性验证 |
| 2.5 优化Luminex测定 |
| 2.6 建立液相芯片技术多重检测方法 |
| 2.7 多重液相芯片性能测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 引物特异性检测 |
| 3.2 优化Luminex测定 |
| 3.3 建立液相芯片技术多重检测方法 |
| 3.4 截止值的确定 |
| 3.5 多重液相芯片性能测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容四 多重 IMS-Luminex xMAP检测方法应用于模拟样品的检测及与多重IMS-PCR的比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌株 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR检测方法对模拟样品的检测 |
| 3.2 多重Luminex xMAP对模拟样品的检测 |
| 3.3 多重Luminex xMAP与多重PCR模拟样品检测结果比较 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）淡水虾养殖环境中生物污染物的分布特征及其关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 环境中生物污染物的多样性与分布特征 |
| 1.1.2 耐药基因的研究进展 |
| 1.1.3 不同环境中人类致病菌的研究进展 |
| 1.1.4 环境中生物污染物的检测方法 |
| 1.1.5 水产养殖环境中生物污染物的潜在健康风险 |
| 1.2 研究内容与研究意义 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究思路与技术路线 |
| 1.3.1 研究思路 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 第二章 青虾肠道及其养殖环境中微生物群落结构解析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 样品采集和水质指标测定 |
| 2.2.2 样品DNA的提取 |
| 2.2.3 16S rRNA扩增子测序 |
| 2.2.4 测序数据的前处理及生物信息学分析 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 青虾肠道及其养殖环境中菌群的多样性和丰度 |
| 2.3.2 青虾肠道及其养殖环境中主要的微生物 |
| 2.3.3 青虾肠道微生物群落结构和环境因子的相关性 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 青虾肠道及其养殖环境中耐药基因分布特征研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 样品采集和化学指标测定 |
| 3.2.2 样品DNA的提取 |
| 3.2.3 16S rRNA扩增子测序及数据分析 |
| 3.2.4 Illumina HiSeq测序及数据前处理 |
| 3.2.5 宏基因组测序数据的生物信息学分析 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 养殖水环境中典型抗生素丰度 |
| 3.3.2 青虾肠道及其养殖环境中耐药基因与基因库相似度比较 |
| 3.3.3 青虾肠道及其养殖环境中耐药基因的丰度及多样性 |
| 3.3.4 青虾肠道、养殖水和底泥中共同和独有的耐药基因 |
| 3.3.5 耐药基因与微生物群落结构、可移动遗传原件的关联性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 青虾养殖环境中潜在致病菌的丰度及耐药性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 样品DNA的提取 |
| 4.2.3 16S rRNA扩增子测序 |
| 4.2.4 测序数据的前处理及生物信息学分析 |
| 4.2.5 人类致病菌16S rRNA对应基因库的建立及数据比对 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 青虾肠道及其养殖环境中潜在致病菌的丰度及多样性 |
| 4.3.2 潜在致病菌在养殖水/底泥/青虾肠道的分布特征 |
| 4.3.3 潜在致病菌与环境因子的相关性 |
| 4.3.4 潜在致病菌与耐药基因的同现性 |
| 4.3.5 青虾养殖环境中致病菌及其耐药性的潜在健康风险 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 项目支持 |
| 攻读硕士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（4）水中病原微生物的紫外线和氯消毒灭活作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩写词与英文对照汇总表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 水环境病原微生物特性差异及迁移转化规律 |
| 1.1.1 水环境中的主要病原微生物及结构、感染性差异 |
| 1.1.2 水环境中病原菌和病毒赋存特性差异 |
| 1.1.3 水处理过程中病原微生物的消减及迁移转化规律 |
| 1.2 病原微生物检测方法及应用现状 |
| 1.2.1 形态观察法 |
| 1.2.2 培养法 |
| 1.2.3 分子生物学方法 |
| 1.2.4 免疫学检测方法 |
| 1.2.5 流式细胞仪检测技术 |
| 1.2.6 三磷酸腺苷生物发光检测方法 |
| 1.3 水处理消毒技术及水质卫生学标准 |
| 1.3.1 紫外线消毒技术 |
| 1.3.2 氯消毒技术 |
| 1.3.3 臭氧消毒技术 |
| 1.3.4 消毒效果比较 |
| 1.3.5 水质卫生学微生物标准 |
| 1.4 课题研究概述 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 研究的目的和意义 |
| 1.4.3 主要研究内容 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 模拟病原体和细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验微生物筛选与培养 |
| 2.2.1 耐药大肠杆菌的筛选 |
| 2.2.2 耐药大肠杆菌的耐药表型研究 |
| 2.2.3 耐药大肠杆菌的抗性基因研究 |
| 2.2.4 大肠杆菌的增殖培养 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 脊髓灰质炎病毒的增殖培养 |
| 2.3 消毒实验过程 |
| 2.3.1 紫外线消毒实验 |
| 2.3.2 光复活和暗修复实验 |
| 2.3.3 氯消毒实验 |
| 2.3.4 微生物灭活和复活百分比的计算 |
| 2.4 细菌损伤的检测方法 |
| 2.4.1 大肠杆菌的可培养能力检测 |
| 2.4.2 细菌形态观察 |
| 2.4.3 细菌细胞膜的通透性分析 |
| 2.4.4 细菌新陈代谢能力检测 |
| 2.4.5 大肠杆菌DNA损伤分析 |
| 2.4.6 大肠杆菌mRNA损伤分析 |
| 2.5 病毒损伤的检测方法 |
| 2.5.1 脊髓灰质炎病毒感染性检测 |
| 2.5.2 脊髓灰质炎病毒RNA损伤分析 |
| 2.5.3 肠道病毒ICC-RT-qPCR方法的建立 |
| 3 紫外线和氯对细菌和病毒的灭活特性 |
| 3.1 紫外线消毒对细菌和病毒的灭活 |
| 3.1.1 耐药大肠杆菌的耐药表型 |
| 3.1.2 紫外线消毒对大肠杆菌的灭活 |
| 3.1.3 紫外线消毒后大肠杆菌的光复活和暗修复现象 |
| 3.1.4 紫外线消毒对脊髓灰质炎病毒的灭活 |
| 3.2 氯消毒对细菌和病毒的灭活 |
| 3.2.1 氯消毒对大肠杆菌的灭活 |
| 3.2.2 氯消毒对脊髓灰质炎病毒的灭活 |
| 3.3 紫外线和氯消毒对细菌和病毒的杀灭效果的比较 |
| 3.4 小结 |
| 4 紫外线和氯对细菌的灭活作用机制 |
| 4.1 细胞外围结构损伤分析 |
| 4.1.1 SEM分析紫外线消毒对大肠杆菌形态学的影响 |
| 4.1.2 SEM分析氯消毒对大肠杆菌形态学的影响 |
| 4.1.3 FCM分析紫外线消毒对大肠杆菌细胞膜渗透性的损伤 |
| 4.1.4 FCM分析氯消毒对大肠杆菌细胞膜渗透性的损伤 |
| 4.2 细菌核酸损伤分析 |
| 4.2.1 大肠杆菌绝对定量PCR方法的建立 |
| 4.2.2 紫外线消毒对大肠杆菌DNA损伤 |
| 4.2.3 氯消毒对大肠杆菌DNA损伤 |
| 4.2.4 大肠杆菌mRNA损伤分析引物的选择 |
| 4.2.5 紫外线消毒对大肠杆菌mRNA的损伤 |
| 4.2.6 氯消毒对大肠杆菌mRNA的损伤 |
| 4.3 细菌新陈代谢能力损伤分析 |
| 4.3.1 ATP生物发光法与大肠杆菌浓度的相关关系 |
| 4.3.2 紫外线消毒对大肠杆菌ATP的影响 |
| 4.3.3 氯消毒对大肠杆菌ATP的影响 |
| 4.4 紫外线对细菌耐药性影响 |
| 4.4.1 紫外线消毒对抑菌环直径的影响 |
| 4.4.2 耐药大肠杆菌绝对定量PCR方法的建立 |
| 4.4.3 紫外线消毒对耐药大肠杆菌耐药基因的损伤 |
| 4.4.4 紫外线消毒对耐药基因相对丰度的影响 |
| 4.5 各种损伤检测方法的适用性分析 |
| 4.6 小结 |
| 5 紫外线和氯对病毒的灭活作用机制 |
| 5.1 TCID_(50)、RT-qPCR、ICC-RT-qPCR方法灵敏度及相关关系 |
| 5.1.1 引物和探针的选取 |
| 5.1.2 肠道病毒定量PCR检测可靠性 |
| 5.1.3 各检测方法的灵敏度 |
| 5.1.4 ICC-RT-qPCR方法、RT-qPCR方法与TCID_(50)方法的相关关系 |
| 5.2 病毒核酸损伤分析 |
| 5.2.1 紫外线消毒对脊髓灰质炎病毒RNA的损伤 |
| 5.2.2 氯消毒对脊髓灰质炎病毒RNA的损伤 |
| 5.3 病毒增殖能力损伤分析 |
| 5.3.1 紫外线消毒对脊髓灰质炎病毒的增殖能力的影响 |
| 5.3.2 氯消毒对脊髓灰质炎病毒增殖能力的影响 |
| 5.4 各种损伤检测方法适用性分析 |
| 5.5 小结 |
| 6 紫外线和氯对病原微生物的作用机制对比 |
| 6.1 紫外线对细菌和病毒的作用机制 |
| 6.1.1 紫外线对细菌和病毒灭活差异分析 |
| 6.1.2 紫外线对细菌的作用机制 |
| 6.1.3 紫外线对病毒的作用机制 |
| 6.2 氯对细菌和病毒的作用机制 |
| 6.2.1 氯对细菌和病毒灭活差异分析 |
| 6.2.2 氯对细菌的作用机制 |
| 6.2.3 氯对病毒的作用机制 |
| 6.3 小结 |
| 7 结论与建议 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：攻读博士期间发表的论文 |
（5）海水中致病菌检测研究进展（论文提纲范文）
| 1 海水中致病菌的检测方法 |
| 1.1 流式细胞技术 (flow cytometry, FCM) |
| 1.2 分子生物学方法 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应 |
| 1.2.1. 1 多重PCR |
| 1.2.1. 2 实时荧光定量PCR |
| 1.2.1. 3 反转录PCR |
| 1.2.2 基因芯片技术 |
| 1.3 免疫方法 |
| 1.3.1 酶联免疫分析法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) |
| 1.3.2 荧光免疫检测技术 (Immunofluorescence Assay, IA) |
| 1.4 生物传感器技术 |
| 1.4.1 光学生物传感器 (Optical Sensor) |
| 1.4.1. 1 表面等离子体共振传感器 (Surface Plasmon Resonance Biosensor, SPR) |
| 1.4.1. 2 荧光传感器 |
| 1.4.2 电化学传感器 |
| 1.4.2. 1 电流型传感器 (Amperometric biosensor) |
| 1.4.2. 2 电位型传感器 (Potentiometric biosensor) |
| 1.4.2. 3 阻抗型传感器 (Impedimetric biosensor) |
| 1.4.3 质量传感器 (Mass-Sensitive Biosensor) |
| 2 总结与展望 |
（6）检测外环境霍乱弧菌的方法探讨（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 常规分离培养法 |
| 1.3.2 荧光定量PCR检测法 |
| 1.3.2. 1 DNA的提取 |
| 1.3.2. 2 荧光定量PCR反应 |
| 1.3.3 免疫磁珠分离方法 |
| 1.3.4 同一样品分组检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 3组阳性检出率 |
| 2.2 B组检出情况 |
| 2.3 C组检出情况 |
| 2.4 霍乱弧菌的分型情况 |
| 3 讨论 |
（7）肠道病原体在污水处理和回用中的分布及衰变过程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写词与英文对照汇总表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 水环境的病原体污染 |
| 1.1.1 水环境中的病原体来源和传播途径 |
| 1.1.2 主要病原体种类及其危害 |
| 1.1.3 肠道病原体的来源及危害 |
| 1.2 病原体在水环境中的存活特性 |
| 1.2.1 病原体在不同环境水体中的分布状况 |
| 1.2.2 病原体在水中的迁移过程 |
| 1.2.3 不同病原体在水中的繁殖和衰变 |
| 1.2.4 病原体存活状态影响因素 |
| 1.3 水中病原体的检测技术 |
| 1.3.1 微生物学检测技术 |
| 1.3.2 免疫学检测技术 |
| 1.3.3 分子生物学检测技术 |
| 1.4 水中病原体污染控制与评价技术的研究进展 |
| 1.4.1 病原体污染源追踪技术 |
| 1.4.2 病原体去除与灭活技术 |
| 1.4.3 病原体健康风险评价技术 |
| 1.5 课题研究概述 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 研究目的与意义 |
| 1.5.3 主要研究内容 |
| 2 水中病原体浓缩方法的确立 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株和病毒株 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 试验仪器设备 |
| 2.1.4 环境样品的采集与预处理 |
| 2.2 水中病毒的浓缩 |
| 2.2.1 病毒浓缩方法概述 |
| 2.2.2 病毒浓缩方法比较 |
| 2.2.3 环境样品病毒浓缩方法的确定 |
| 2.3 水中细菌的浓缩方法 |
| 2.3.1 细菌浓缩方法概述 |
| 2.3.2 细菌浓缩方法的比较 |
| 2.3.3 环境样品细菌浓缩方法的确定 |
| 2.4 小结 |
| 3 水环境中病原体定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1 目标病原体的确立 |
| 3.1.1 肠病毒 |
| 3.1.2 肠道病原菌 |
| 3.2 三种主要HFMD病毒半巢式PCR和定量PCR方法的建立 |
| 3.2.1 引物的设计 |
| 3.2.2 半巢式PCR定性检测方法的建立与优化 |
| 3.2.3 HFMD病毒定量PCR检测方法的建立 |
| 3.2.4 HFMD病毒PCR检测方法的评价 |
| 3.3 肠病毒定量PCR检测方法的确立 |
| 3.3.1 病毒引物的设计与选择 |
| 3.3.2 定量PCR检测方法标线的确定 |
| 3.3.3 病毒定量PCR检测 |
| 3.3.4 病毒检测精度和重现性 |
| 3.4 肠道病原菌定量PCR检测方法确立 |
| 3.4.1 肠道病原菌引物的设计与选择 |
| 3.4.2 病原菌检测定量标线的确定 |
| 3.4.3 病原菌的定量PCR检测 |
| 3.4.4 病原体检测精度和重现性 |
| 3.5 小结 |
| 4 城市生活污水中肠病毒的分布特性研究 |
| 4.1 污水厂选择与水样采集 |
| 4.1.1 污水厂概况 |
| 4.1.2 水样采集 |
| 4.2 肠病毒在污水厂进水和出水中的分布特性 |
| 4.2.1 肠道病毒 |
| 4.2.2 手足口病病毒 |
| 4.2.3 人类星状病毒 |
| 4.2.4 轮状病毒 |
| 4.2.5 诺如病毒 |
| 4.3 肠病毒的季节变化规律 |
| 4.3.1 不同病毒的季节变化规律 |
| 4.3.2 肠病毒的季节分布特性 |
| 4.3.3 肠病毒季节变化规律与临床流行病学的关系 |
| 4.4 小结 |
| 5 肠道病原体在污水再生与循环利用系统中的迁移衰变过程研究 |
| 5.1 污水再生与循环利用系统 |
| 5.1.1 系统概要 |
| 5.1.2 污水再生处理工艺 |
| 5.1.3 再生水景观利用与循环体系 |
| 5.2 肠道病原体在污水再生处理过程中的迁移衰变过程 |
| 5.2.1 肠道病原体在不同来源污水中的分布特征 |
| 5.2.2 污水处理流程中肠道病原体的衰变规律 |
| 5.2.3 再生水生产的肠道病原体控制功效 |
| 5.3 再生水调节与景观利用过程中的肠道病原体二次污染 |
| 5.3.1 景观湖中肠道病原体的检出情况 |
| 5.3.2 气候条件对肠道病原体检出的影响 |
| 5.3.3 不同来源肠道病原体的同异性分析 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与建议 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 建议 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（8）胶体金免疫层析法应用于环境水体中霍乱检测的效果评价（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结 果 |
| 3 讨 论 |
（9）环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 水样的采集 |
| 1.3 霍乱弧菌菌株来源 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 方法 |
| 1.5.1 样本的前处理 |
| 1.5.2 模板DNA的制备 |
| 1.5.3 PCR检测和电泳分析 |
| 1.5.4二次PCR反应的条件优化 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 霍乱弧菌的一次PCR结果 |
| 2.2 霍乱弧菌的二次PCR结果 |
| 2.3 水样的测定 |
| 3 讨论 |
（10）TaqMan双重荧光PCR用于快速检测模拟临床标本中产毒型O139群霍乱弧菌的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和临床标本 |
| 1.2 引物与探针 |
| 1.3 菌种培养和模板DNA提取 |
| 1.4 病原菌的定量标准 |
| 1.5 双重荧光PCR反应体系和反应条件 |
| 1.6 双重荧光PCR的特异性、灵敏度试验 |
| 1.7 结果判定结方法 |
| 1.8 模拟临床标本的制备 |
| 1.9 模拟临床标本DNA的提取 |
| 2 结果 |
| 2.1 双重荧光PCR的特异性 |
| 2.2 双重荧光定量PCR的检测灵敏度 |
| 3 讨论 |
四、PCR技术应用于外环境水样中霍乱弧菌的监测（论文参考文献）
- [1]一起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学分析[J]. 王云霞,严寒秋,刘海波,史文凤,周海健,王斌. 首都公共卫生, 2019(04)
- [2]五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立[D]. 董晓妹. 扬州大学, 2019(01)
- [3]淡水虾养殖环境中生物污染物的分布特征及其关联性研究[D]. 赵艳婷. 南京大学, 2018(01)
- [4]水中病原微生物的紫外线和氯消毒灭活作用机制研究[D]. 徐丽梅. 西安建筑科技大学, 2017(01)
- [5]海水中致病菌检测研究进展[J]. 刘淑文,丁家旺,秦伟. 海洋科学, 2017(02)
- [6]检测外环境霍乱弧菌的方法探讨[J]. 谢晓红,王洁,蔡卫红,王仁刚,陶力新. 中国卫生检验杂志, 2016(11)
- [7]肠道病原体在污水处理和回用中的分布及衰变过程研究[D]. 周进宏. 西安建筑科技大学, 2015
- [8]胶体金免疫层析法应用于环境水体中霍乱检测的效果评价[J]. 陈福辉,杨梦,刘晓青,余平,徐晓倩,熊长辉,王鹏,杨富强,宗俊. 现代预防医学, 2015(03)
- [9]环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法[J]. 黄海,周登仁,王琼妹,邝仕壮,庞燕. 环境与健康杂志, 2012(07)
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