一、腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响（论文文献综述）
李小英[1]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中研究表明不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
华荣茂[2]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中进行了进一步梳理促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
赵会敏[3]（2014）在《巴马小型猪精原干细胞相关问题的研究》文中提出精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）位于动物睾丸的精细小管,是动物体内唯一一种定向分化为精子的成体干细胞。分离、纯化和体外培养SSC,可以为SSC的体外研究提供必要的实验材料。定向诱导SSC分化成精子可以研究精子发生的机理,同时也可以为无精症患者提供生育自己后代的机会。通过转染SSC,诱导其分化成携带有外源基因的精子细胞或精子,利用这些携带外源基因的精子细胞或精子受精就可以产生转基因动物。这种转基因胚胎产生的过程和自然条件下精子、卵子结合产生胚胎的过程一样,不涉及体细胞重编程过程,所以利用SSC生产转基因动物的效率要远远高于体细胞核移植法。本论文的研究内容是巴马小型猪SSC的分离、纯化、鉴定、体外长期培养以及转基因的研究,其结果如下：1.巴马小型猪睾丸的形态学观察和精原干细胞的鉴定本研究首先对巴马小型猪睾丸组织进行了形态学观察和SSC的鉴定。组织学观察结果发现1月龄仔猪睾丸的SSC还没有分化,而2月龄仔猪睾丸中已经有精子产生,所以1月龄仔猪睾丸适合于SSC的分离。已有的研究证明猪的精原干细胞表达UCHL1,并且可以和植物凝集素DBA结合,SSC的免疫组织化学鉴定结果发现巴马小型猪SSC表达UCHL1和CDH1,可以和植物凝集素DBA结合,但不表达C-KIT,从而证明抗体UCHL1、CDH1以及植物凝集素DBA是巴马小型猪SSC的生物标志物,可以用来鉴定体外培养的SSC。所以,本研究选用抗体UCHL1、CDH1和植物凝集素DBA用来鉴定体外培养的精原干细胞。2.精原干细胞的分离和体外培养本实验采用组合酶消化法将巴马小型猪睾丸组织消化成分散的细胞,培养60 h,扩增SSC的数量,然后通过差异贴壁法分选出SSC,将分离出的细胞接种到STO饲养层上进行培养。在培养的前两代,由于细胞的数量少,不能形成细胞簇,从第三代开始,很多细胞聚集在一起形成细胞簇,这些细胞簇的细胞结合不够紧密,边缘不清晰。目前为止,SSC在体外已经传代达30代,维持了细胞簇形成的特性。3.体外培养的精原干细胞的鉴定免疫荧光染色结果显示这些细胞簇表达SSC生物标志物UCHL1和CDH1,并且可以和植物凝集素DBA结合,细胞簇中部分细胞表达OCT4; RT-PCR检测结果证明这些细胞簇表达基因nanog、sox2、vasa、uchl1和thy1,鉴定结果证明这些细胞簇是由SSC组成。在体外培养的SSC中存在着大小不同的UCHL1阳性细胞,说明SSC大小本身存在着差异。SSC超微结构观察发现体外培养的SSC的线粒体脊比组织内SSC线粒体脊丰富。DNA含量分析显示部分巴马小型猪SSC在体外长期培养后经流式细胞仪分析发现单倍体峰。4.精原干细胞转基因方法的初步探索本研究尝试将外源基因导入到SSC中。首先尝试利用脂质体转染法将携带有绿色荧光蛋白基因的质粒转染到SSC中,但结果发现这种转染途径效率低,不能得到阳性细胞簇。之后,我们尝试利用慢病毒感染法将外源基因导入到SSC内,实验发现在MOI（multiplicity of infection）值为50时,可以有效的将GFP基因导入到SSC内,可以得到阳性细胞簇。综上所述,本研究分离纯化了巴马小型猪SSC,这些SSC可在体外培养到30代以上,为精原干细胞的基因操作和精子分化机理的研究提供了充足的实验材料。本研究还发现巴马小型猪SSC在体外长期培养后经流式细胞仪分析发现了单倍体峰,利用慢病毒感染法可以有效的将GFP基因导入到SSC内。这些研究结果为转基因巴马小型猪的生产建立了实验平台,也为其他动物SSC的分离、培养、体外诱导以及转基因动物的生产提供理论和技术支持。
邱峰龙,李碧春[4]（2012）在《精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展》文中提出精原干细胞介导法制备转基因动物是用试验导入的方法将外源基因移入动物细胞并整合到其基因组中,伴随着精原干细胞分化成精子,通过受精最终使外源基因得以表达。近年来,随着对精原干细胞研究的不断深入,人们发现其在建立转基因动物方面具有巨大的应用潜力和优势。作者从精原干细胞的生物学特性及携带外源基因的原理等方面阐述了其应用于转基因动物制备的理论机制,同时介绍了精原干细胞介导法在制备转基因动物方面,特别是转基因羊生产中的应用现状。
张东[5]（2011）在《转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究》文中进行了进一步梳理fat-1基因编码ω-3 PUFAs脱氢酶,可以将PUFAs从ω-6转化为ω-3形式。本研究目的是通过动物转基因技术将fat-1转入绵羊的基因组,再利用动物克隆技术创造能产生ω-3 PUFAs的转基因绵羊,从而培育含ω-3 PUFAs丰富的转基因肉羊新材料。以我区绵羊为对象,摸索了绵羊克隆胚的构建和胚胎移植体系;建立雄性绵羊胎儿的皮肤成纤维细胞系;克隆了秀丽隐杆线虫的fat-1基因,构建目的基因表达载体;再将其转染到绵羊成纤维细胞基因组中,经G418筛选,PCR鉴定后选择阳性细胞建立转基因细胞系;通过体细胞克隆动物技术构建并生产转基因克隆胚并移植,待移植后代出生后鉴定并检测其肌肉中ω-6和ω-3 PUFAs的相对含量及比值;以获得转基因的具有保健功能的肉羊新品种。1.绵羊体细胞克隆体系的优化本实验主要是对体细胞克隆胚移植胚龄的摸索。采用组织块种植法分离培养了三种雌性成年绵羊耳皮肤成纤维细胞系,分三个阶段进行绵羊体细胞克隆体系的优化。第一阶段构建了来源于1号细胞的重构胚272枚,体外发育到桑椹胚期移植入17只受体羊中,有一只妊娠,妊娠率为5.88%,产羔羊1只,经鉴定为克隆羊。第二阶段构建了来源于2号细胞的重构胚683枚,分别在胚胎发育的不同时期进行了胚胎移植,共移植了35只受体羊。结果显示,在3只移入的胚龄是1-细胞期胚胎的羊中,有一只妊娠并产羔1只,经鉴定为克隆羊。第三阶段构建了来源于3号细胞的重构胚197枚,在1-细胞期阶段全部移入了11只受体羊中,结果有两只羊妊娠,妊娠率为18.18%,生产了3只克隆羊,产羔率为27.27%。有效地的重复了第二阶段实验。待克隆羔羊性成熟和体成熟后对其进行了自然交配,成年体细胞克隆羊正常顺产2胎,均是双胞胎。表明获得的克隆羊具有正常的生殖和哺育后代的能力,进一步证明,本实验室建立了相对稳定的的体细胞克隆绵羊技术体系。2.转基因体细胞克隆体系的建立采用组织块种植法分离纯化了约40日龄绵羊胎儿成纤维细胞;克隆了秀丽隐杆线虫fat-1基因,同时对其进行了密码子的优化与合成,构建了pTFK-c和pTFK-o两个真核表达载体。pTFK-o转染绵羊胎儿成纤维细胞,经G418压力筛选后进行转基因细胞的鉴定。结果表明获得的7个细胞克隆中有5个细胞系的基因组中整合有目的基因,对获得的转基因细胞进行染色体数目分析,其核型正常率为69.77% （2n=54）,符合用于转基因克隆的要求。以筛选到的7号转fat-1基因绵羊胎儿成纤维细胞系为核供体,绵羊去核卵母细胞胞质为核受体生产转基因克隆胚。采用抽吸法共回收卵母细胞4881枚,成熟培养18h成熟率为72.87%。实验共进行去核操作绵羊卵母细胞3557枚,用于融合的卵数是3305枚,共融合3040枚,融合率为91.39%。共分三组移植了处于1-细胞期的2909枚胚胎到230只羊体内,1组移植了146只受体羊,妊娠5只,妊娠率为3.42%,产羔5只,产羔率为3.42%;2组移植了60只受体羊,妊娠18只,妊娠率为30%,产羔19只,产羔率为31.67%;3组移植了24只羊,妊娠5只,妊娠率为20.83%,产羔6只,产羔率为25%。后2组实验结果进一步优化了体细胞克隆技术体系。3.转fat-1基因克隆绵羊的出生与鉴定通过实验共产羔30只,其中19只存活。对获得的30只中的29只转基因克隆羔羊进行基因组水平检测,结果显示有27只羔羊基因组中含有目的基因。克隆羊肌肉组织中ω-6和ω-3PUFAs的相对含量检测结果显示,在检测的23只羊中有18只羊都表达了有活性的脂肪酸脱氢酶,其ω-6/ω-3 PUFAs比值都有不同程度的降低,平均值为16.45,其ω-3 PUFAs的平均值为0.194,和对照公羊平均值0.147相比提高了31.97%,有效的改善了绵羊体内ω-6和ω-3 PUFAs的相对比例和含量。
刘中华,王华岩,乔宪凤,郑新民[6]（2009）在《转基因技术在动物遗传改良上的应用进展》文中研究指明简要介绍了几种比较常用的转基因方法,包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精子载体法、卵巢直接注射法。传统的转基因方法与基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰以及线粒体转移技术相结合,在基因功能研究和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。特别是近年来在植物上出现的外源基因清除技术,为我们在动物上彻底去除外源基因的影响提供了新思路。
张仕强[7]（2007）在《新生牛精原干细胞体外增殖调控的研究》文中提出精原干细胞（spermatogonial stem cell）是雄性动物生殖腺内的一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能,能向子代传递遗传信息的细胞。由于精原干细胞在医学、遗传学、转基因动物研究等方面有着广阔的应用前景,近年来已经成为众多学者研究的热点。但是精原干细胞在体外很难长期维持,这成为进一步研究的障碍。本研究通过分离、纯化及鉴定新生牛精原干细胞,对其体外培养体系进行了优化,并且导入人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）基因,以期促进增殖,延长其在体外的细胞寿命。研究获得如下结果:1.通过两步酶消化法分离获得的新生牛睾丸细胞平均存活率为89. 00% ,精原干细胞比率为21.61 % ,细胞贴壁率为23.34%。2.分离的新生牛睾丸细胞经过Percoll密度梯度离心纯化,结果显示:精原干细胞主要分布在27 %～35 % Percoll梯度中,纯度可达69.27%。3.新生牛精原干细胞集落细胞化学和免疫组化鉴定表明:碱性磷酸酶表达呈弱阳性,Integrinβ1和C-kit表达呈阳性;RT-PCR鉴定表明:新生牛精原干细胞表达精原干细胞特异基因gfrα1和c-kit。4.通过优化新生牛精原干细胞体外培养体系表明:在培养基中添加2.5%FBS,10μg/L LIF、20μg/L SCF、80μg/L GDNF以及支持细胞以5.0×105个/mL密度接种作为饲养层时,能显着促进精原干细胞增殖。5.新生牛精原干细胞通过脂质体法转染pCl-Neo-hTERT载体,600μg/mL G418筛选获得阳性细胞。端粒酶活性检测显示:该阳性细胞OD450/630是未转染细胞的4倍;生长曲线表明:该阳性细胞在体外的群体倍增时间缩短了1.9倍。以上结果证明,两步酶消化法结合Percoll密度梯度离心分离纯化新生牛精原干细胞能满足进一步研究的需要;通过优化培养体系和转染hTERT基因能显着促进新生牛精原干细胞在体外的增殖。
叶雄俊[8]（2004）在《腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响》文中研究指明
冷怀明[9]（2002）在《《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中研究指明
李雅惠[10]（2020）在《小鼠生精细胞AAV特异表达载体的构建及表达验证》文中研究表明目的:1.分别构建含有小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2和Prm1的AAV特异表达载体,验证并筛选有效特异启动子。2.构建小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag,并且从体内、外验证其表达特异性。方法:1.筛选小鼠生精细胞特异启动子通过同源重组的方法分别构建含有小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2和Prm1的AAV特异表达载体,分别转染生精细胞GC1细胞,通过比较5种载体在GC1细胞中的表达情况筛选有效的小鼠生精细胞特异启动子。2.构建小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag通过同源重组的方法将小鼠生精细胞特异启动子Dazl片段与酶切后去除CMV启动子的腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag连接,并通过双酶切和基因测序验证小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建。3.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag体外验证将腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag及小鼠生精细胞特异表达载体AAV-DazlRFP-Flag分别转染GC1细胞和293T细胞。收集细胞爬片,通过免疫荧光检测细胞中RFP的表达情况。收集细胞沉淀,通过RT-qPCR和western blot检测细胞中RFP的RNA和蛋白的表达情况。4.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag体内验证将腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag及小鼠生精细胞特异表达载体AAV-DazlRFP-Flag分别进行病毒包装。将包装好的病毒通过显微注射技术注射到3周ICR小鼠睾丸的曲细精管中。1周后取睾丸组织,通过体视显微镜和免疫荧光检测小鼠睾丸中RFP的表达。提取睾丸组织的RNA,通过RT-qPCR检测小鼠睾丸中RFP的RNA表达情况。结果:1.小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2均可以在GC1细胞启动目的基因RFP的表达,并且Dazl启动子启动效率较高。2.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag构建成功。3.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag在GC1细胞与293T细胞中均有表达,但在293T细胞中的表达水平低于GC1细胞。4.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag在小鼠睾丸组织的RNA水平检测到RFP的表达,但未检测到其表型。结论:1.从5个生精细胞特异启动子中筛选出Dazl启动子。2.在生精细胞的RNA水平检测到小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Daz1-RFP-Flag的表达。
二、腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响（论文提纲范文）
（1）基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（2）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）巴马小型猪精原干细胞相关问题的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 巴马小型猪简介 |
| 2. 精原干细胞的研究进展 |
| 2.1 精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSC)研究回顾 |
| 2.2 精原干细胞分离纯化方法 |
| 2.3 精原干细胞体外培养 |
| 2.4 精原干细胞特征性分子(biomarker) |
| 2.5 精原干细胞分子调控机制的研究进展 |
| 2.6 精原干细胞移植 |
| 2.7 精原干细胞体外诱导精子 |
| 2.8 精原干细胞转基因 |
| 3. 巴马小型猪精原干细胞的研究意义 |
| 3.1 通过分离培养和体外分化精原干细胞,可以研究精子形成的机理和过程 |
| 3.2 进行品种保护 |
| 3.3 生产转基因动物 |
| 3.4 挽救濒危动物 |
| 3.5 治疗男性不育 |
| 3.6 诱导精原干细胞分化成其他细胞,为再生性障碍疾病的临床治疗开辟了一条新的途径 |
| 3.7 生产人体可以利用的动物器官 |
| 4. 展望 |
| 第二章 巴马小型猪睾丸形态学观察和精原干细胞的鉴定 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 试剂的配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 石蜡切片的制作 |
| 1.5 H.E染色(hematoxylin and eosin stain) |
| 1.6 巴马小型猪睾丸切片内精原干细胞鉴定 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 巴马小型猪睾丸的组织学观察 |
| 2.2 巴马小型猪睾丸切片精原干细胞的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 巴马小型猪睾丸的组织学观察 |
| 3.2 巴马小型猪睾丸组织内精原干细胞的鉴定 |
| 4. 小结 |
| 第三章 巴马小型猪精原干细胞的分离和体外培养 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 主要药品 |
| 1.2 主要溶液的准备 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. STO饲养层的制作 |
| 2.1 STO饲养层制作条件的探索 |
| 2.2 饲养层细胞的冷冻和复苏 |
| 3. 精原干细胞的分离和培养 |
| 3.1 精原干细胞的分离 |
| 3.2 精原干细胞的体外培养 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 饲养层处理条件的探索 |
| 4.2 解冻后饲养层细胞的存活情况 |
| 4.3 精原干细胞的分离和体外培养 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 第四章 体外培养的巴马小型猪精原干细胞的鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 溶液的配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 免疫荧光染色 |
| 1.4.1 OCT4染色 |
| 1.4.2 UCHL1、DBA双染色 |
| 1.4.3 CDH1、DBA双染色 |
| 1.5 RT-PCR |
| 1.5.1 总RNA的提取 |
| 1.5.2 RNA反转录成cDNA |
| 1.5.3 PCR扩增目的基因 |
| 1.5.4 目的片段的鉴定 |
| 1.6 精原干细胞的电镜观察 |
| 1.7 体外培养细胞的DNA分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 克隆的鉴定 |
| 2.2 RT-PCR结果 |
| 2.3 精原干细胞的电镜观察 |
| 2.4 DNA含量的检测 |
| 2.5 单倍体细胞的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第五章 巴马小型猪精原干细胞转基因条件的初步研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要药品及相关溶液的配制 |
| 1.2 质粒的扩增、提取和鉴定 |
| 1.2.1 质粒的小量扩增 |
| 1.2.2 质粒的提取 |
| 1.2.3 质粒的鉴定 |
| 1.2.4 质粒的扩增和提取 |
| 1.3 脂质体在293T细胞中的表达 |
| 1.4 精原干细胞转基因 |
| 1.4.1 脂质体转染法 |
| 1.4.2 慢病毒转染 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 EGP-N1质粒的鉴定 |
| 2.2 EGFP-N1质粒在293T细胞中的表达 |
| 2.3 脂质体转染精原干细胞 |
| 2.4 慢病毒转染精原干细胞 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 攻读博士期间所获得的基金支持 |
（4）精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展（论文提纲范文）
| 1 精原干细胞的起源和分化 |
| 2 精原干细胞介导法制备转基因动物技术 |
| 2.1 精原干细胞体外介导转基因技术 |
| 2.1.1 供体细胞的分离纯化 |
| 2.1.2 精原干细胞体外培养和基因修饰 |
| 2.1.3 精原干细胞移植 |
| 2.2 精原干细胞体内介导转基因技术 |
| 2.2.1 曲细精管微注射法 |
| 2.2.2 睾丸注射法 |
| 2.3 精原干细胞体外、体内介导转基因技术在制备转基因动物中的比较 |
| 3 精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展 |
| 4 结语 |
（5）转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 动物转基因技术的研究历史 |
| 1.1.1 动物转基因技术研究的初级阶段 |
| 1.1.2 动物转基因技术研究的初级应用阶段 |
| 1.1.3 动物转基因技术研究的高潮阶段 |
| 1.1.4 小结 |
| 1.2 转基因动物制作方法及其发展概况 |
| 1.2.1 显微注射法 |
| 1.2.2 逆转录病毒载体介导的转基因 |
| 1.2.3 精子介导的基因转移 |
| 1.2.4 生殖干细胞法 |
| 1.2.5 胚胎干细胞介导的转基因 |
| 1.2.6 iPS 介导转基因技术 |
| 1.2.7 基因打靶介导的转基因技术 |
| 1.2.8 化学诱变介导的基因敲除技术 |
| 1.2.9 RNA 干涉介导的基因沉默技术 |
| 1.2.10 锌指核酸酶介导的基因沉默技术 |
| 1.2.11 转座子介导的基因转移 |
| 1.2.12 转基因体细胞克隆法 |
| 1.3 动物转基因技术的应用 |
| 1.3.1 动物转基因技术在基础研究领域的应用 |
| 1.3.2 动物转基因技术在生物药剂和生物材料生产中的应用 |
| 1.3.3 动物转基因技术在农业生产中的应用 |
| 1.3.4 动物转基因技术在环保方面的应用 |
| 1.3.5 动物转基因技术在应用方面存在的问题 |
| 1.4 ω-3 PUFAs 的研究概况 |
| 1.4.1 ω-3 PUFAs 的研究背景 |
| 1.4.2 ω-3 PUFAs 的生物学功能 |
| 1.5 小结 |
| 2 绵羊体细胞克隆体系的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物材料 |
| 2.1.2 实验设备 |
| 2.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 2.2.4 绵羊卵母细胞的采集和体外成熟培养 |
| 2.2.5 供体细胞的准备 |
| 2.2.6 受体卵母细胞的准备 |
| 2.2.7 核移植制备重构胚 |
| 2.2.8 重构胚的融合 |
| 2.2.9 重构胚的激活和发育培养 |
| 2.2.10 胚胎移植 |
| 2.2.11 妊娠的确定和克隆羔羊的接产 |
| 2.2.12 克隆羔羊的鉴定 |
| 2.2.13 克隆羊生殖能力检测 |
| 2.2.14 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 2.3.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 2.3.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 2.3.4 绵羊卵母细胞的采集与体外成熟 |
| 2.3.5 克隆胚构建中融合条件的摸索 |
| 2.3.6 绵羊体细胞克隆胚的构建、体外发育和胚胎移植 |
| 2.3.7 克隆羔羊的接产及其鉴定 |
| 2.3.8 克隆羊生殖能力检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 卵巢的运输和保存 |
| 2.4.2 卵母细胞体外成熟与重构胚的制作 |
| 2.4.3 克隆胚移植胚龄的摸索 |
| 3 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 活体材料 |
| 3.1.2 实验设备 |
| 3.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绵羊胎儿性别的鉴定 |
| 3.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.2.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.2.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 绵羊胎儿的性别鉴定 |
| 3.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.3.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 绵羊胎儿成纤维细胞的基因转染 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验设备 |
| 4.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转fat-1 基因表达载体的构建 |
| 4.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究 |
| 4.2.3 绵羊胎儿皮肤成纤维细胞的基因转染 |
| 4.2.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的筛选和纯化 |
| 4.2.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定 |
| 4.2.6 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转fat-1 基因表达载体的构建 |
| 4.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究 |
| 4.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞的转染和筛选 |
| 4.3.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定 |
| 4.3.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 转fat-1 基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 动物材料 |
| 5.1.2 实验设备 |
| 5.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.2.2 转fat-1 基因绵羊胎儿成纤维细胞的准备 |
| 5.2.3 受体卵母细胞的准备 |
| 5.2.4 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备 |
| 5.2.5 转fat-1 基因绵羊克隆胚的融合 |
| 5.2.6 转fat-1 基因绵羊克隆胚的激活和发育培养 |
| 5.2.7 转fat-1 基因绵羊克隆胚的移植 |
| 5.2.8 转fat-1 基因克隆羔羊的接产 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.3.2 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备及其移植 |
| 5.3.3 转fat-1 基因克隆羔羊的接产 |
| 5.4 讨论 |
| 6 转fat-1 基因克隆羊的鉴定 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 活体材料 |
| 6.1.2 实验设备 |
| 6.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养 |
| 6.2.2 羊膜细胞染色体数目的分析 |
| 6.2.3 转基因克隆羊的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养 |
| 6.3.2 羊膜细胞染色体数目的分析 |
| 6.3.3 转基因克隆羊的鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）转基因技术在动物遗传改良上的应用进展（论文提纲范文）
| 1 动物转基因技术 |
| 1.1 显微注射法 |
| 1.2 脂质体介导法 |
| 1.3 电转染法 |
| 1.4 胚胎干细胞法 |
| 1.5 病毒载体法 |
| 1.6 精子载体法 |
| 1.7 卵巢内直接注射 |
| 2 动物转基因技术的应用 |
| 2.1 基因打靶与转基因 |
| 2.2 体细胞核移植与转基因 |
| 2.3 RNA干扰与转基因 |
| 2.4 线粒体与转基因 |
| 3 外源基因清除技术 |
| 4 问题及展望 |
（7）新生牛精原干细胞体外增殖调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 精原干细胞生物学特性概述 |
| 1.1 精原干细胞增殖与分化 |
| 1.2 精原干细胞凋亡 |
| 第二章 精原干细胞的体外培养及冻存 |
| 2.1 精原干细胞分离与纯化 |
| 2.2 精原干细胞鉴定 |
| 2.3 影响精原干细胞体外增殖与分化的因素 |
| 2.3.1 基本培养基 |
| 2.3.2 添加剂的应用 |
| 2.3.3 血清 |
| 2.3.4 激素和维生素的应用 |
| 2.3.5 生长因子 |
| 2.3.6 饲养层 |
| 2.3.7 温度对精原干细胞体外培养的影响 |
| 2.4 精原干细胞的冻存 |
| 第三章 精原干细胞移植研究及应用前景 |
| 3.1 精原干细胞移植技术发展概述 |
| 3.2 受体动物移植前处理 |
| 3.3 精原干细胞移植方法 |
| 3.4 精原干细胞的应用前景 |
| 3.4.1 应用精原干细胞研究精子的发生及机制 |
| 3.4.2 保存生育能力 |
| 3.4.3 治疗雄性不育 |
| 3.4.4 转基因动物 |
| 第四章 新生牛精原干细胞的分离、纯化与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 睾丸组织 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 新生牛精原干细胞分离 |
| 4.2.2 新生牛精原干细胞 Percoll 密度梯度纯化 |
| 4.2.3 新生牛精原干细胞原代培养及生长特性观察 |
| 4.2.4 新生牛精原干细胞鉴定 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 两步酶消化法分离新生牛精原干细胞效果 |
| 4.3.2 新生牛精原干细胞在 Percoll 梯度中的分布 |
| 4.3.3 新生牛精原干细胞在 Percoll 梯度3 中的纯度 |
| 4.3.4 新生牛精原干细胞的培养特性 |
| 4.3.5 新生牛精原干细胞鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 牛年龄对牛精原干细胞分离的影响 |
| 4.4.2 关于新生牛精原干细胞的分离 |
| 4.4.3 牛精原干细胞的纯化效果 |
| 4.4.4 新生牛精原干细胞的鉴定 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 新生牛精原干细胞体外培养体系优化 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 睾丸组织 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 新生牛精原干细胞的分离纯化同4.2.1 和4.2.2 |
| 5.2.2 不同血清浓度对新生牛精原干细胞体外增殖的影响 |
| 5.2.3 不同生长因子对新生牛精原干细胞体外增殖的影响 |
| 5.2.4 不同密度饲养层对新生牛精原干细胞体外增殖的影响 |
| 5.2.5 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 不同血清浓度对新生牛精原干细胞集落数的影响 |
| 5.3.2 不同生长因子对新生牛精原干细胞体外增殖的影响 |
| 5.3.3 不同密度饲养层对新生牛精原干细胞集落数的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 关于血清对精原干细胞的作用 |
| 5.4.2 关于生长因子对精原干细胞的作用 |
| 5.4.3 关于支持细胞的作用 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 新生牛精原干细胞转染PCL-NEO-HTERT 及检测 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 pCl-Neo- hTERT 载体的转化扩增及鉴定 |
| 6.2.2 新生牛精原干细胞阳离子脂质体转染 |
| 6.2.3 pCl-Neo-hTERT 转染阳性细胞生长特性观察 |
| 6.2.4 pCl-Neo-hTERT 转染阳性细胞端粒酶活性检测 |
| 6.2.5 pCl-Neo-hTERT 转染阳性细胞生长曲线绘制 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 pCl-Neo-hTERT 载体的转化扩增及鉴定 |
| 6.3.2 pCl-Neo-hTERT 转染阳性新生牛精原干细胞的生长特性 |
| 6.3.3 pCl-Neo-hTERT 转染阳性新生牛精原干细胞端粒酶活性检测 |
| 6.3.4 pCl-Neo- hTERT 转染阳性新生牛精原干细胞生长曲线 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附:常用溶液配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）小鼠生精细胞AAV特异表达载体的构建及表达验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常见缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠生精细胞AAV特异表达载体的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠生精细胞AAV特异表达载体的构建 |
| 2.2 小鼠生精细胞AAV特异表达载体的筛选 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建及表达验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建 |
| 2.2 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的体外验证 |
| 2.3 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的体内验证 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响（论文参考文献）
- [1]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]巴马小型猪精原干细胞相关问题的研究[D]. 赵会敏. 广西大学, 2014(01)
- [4]精原干细胞介导法制备转基因羊的研究进展[J]. 邱峰龙,李碧春. 中国畜牧兽医, 2012(12)
- [5]转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D]. 张东. 内蒙古农业大学, 2011(11)
- [6]转基因技术在动物遗传改良上的应用进展[J]. 刘中华,王华岩,乔宪凤,郑新民. 湖北农业科学, 2009(02)
- [7]新生牛精原干细胞体外增殖调控的研究[D]. 张仕强. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响[J]. 叶雄俊. 中华泌尿外科杂志, 2004(01)
- [9]《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2002(12)
- [10]小鼠生精细胞AAV特异表达载体的构建及表达验证[D]. 李雅惠. 山西医科大学, 2020(11)