一、高聚生、干扰素-α-2b对不同膀胱癌细胞株量效关系及MHC-I、II类抗原表达影响的实验研究（论文文献综述）
李敏[1]（2021）在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用及机制研究》文中研究说明研究背景黑素瘤在全球发病率快速增长,是致死率最高的皮肤恶性肿瘤。近年来,免疫检查点抑制剂研究及分子靶向药物研究取得了长足进步,但与高加索人种不同,亚洲人皮肤黑素瘤以肢端型和黏膜型为主,我国患者对上述研究获益较少,患者治疗效果有限、不良反应较大、转移和复发率高、且易产生耐药,远未能解决黑素瘤的治疗难题。随着肿瘤基因治疗的迅猛发展,溶瘤病毒也得到了越来越广泛的应用。溶瘤病毒是经过基因修饰改造的一类病毒,可特异性杀伤肿瘤细胞,但对正常二倍体细胞的功能不产生影响。本课题组在前期研究中构建了能在肿瘤细胞中特异性复制、且可特异性杀伤肿瘤细胞的具有双重特异性的抗肿瘤重组腺病毒,Ad-apoptin-h TERTp-E1a（Ad-VT）。后者基于RAPAD.I系统,插入肿瘤特异性启动子（h TERTp,人端粒酶逆转录酶）和特异性杀伤基因（凋亡素,Apoptin）,由h TERTp启动E1A基因（病毒复制必需基因）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）启动子启动Apoptin基因,因此,Ad-VT是一种可在肿瘤细胞中特异性复制和特异性抑制,且对正常体细胞毒副作用小的溶瘤腺病毒。作为研究肿瘤发生发展与转移的重要模型之一,传统裸鼠模型为及时获得相关实验数据,往往需要在不同时间处死小鼠或摘除肿瘤,且不能实时监测到肿瘤发生发展与转移情况。活体成像技术能够无创实时地监测肿瘤的发生发展以及转移。尤其以荧光素酶标记肿瘤细胞建立的移植瘤、转移瘤和原位瘤模型,利用活体成像技术观察测定肿瘤区域的生物发光强度、位置变化,直接反应肿瘤的体积变化与转移情况,是当前最常用的可视化动物模型技术。因此,本研究拟以高水平表达荧光信号强度的luc2型萤火虫荧光素酶基因为报告基因,构建可稳定表达荧光素酶的人黑素瘤细胞A375-luc和M14-luc,并建立用于活体成像技术观察的人黑素瘤裸鼠模型。采用双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤进行体内、体外抑制作用研究,并对机制进行深入探讨,为临床应用提供理论依据。研究目的探讨双特异性溶瘤腺病毒对荧光素酶标记人黑素瘤的体内、体外抑制作用及效应机制,为临床应用提供理论依据。研究方法与结果1.转染带有luc2型荧光素酶基因的质粒p GL4.51,构建表达荧光素酶的人黑素瘤细胞,通过G418加压、荧光素酶活性检测和遗传稳定性分析进行细胞筛选,获得可稳定表达荧光素酶的人黑素瘤细胞A375-luc和M14-luc。2.分别测定构建细胞与原肿瘤细胞的生长曲线、细胞周期、迁移与侵袭能力,探讨荧光素酶的引入是否会影响黑素瘤细胞的生物学特性?结果表明,能够稳定表达荧光素酶的人黑素瘤细胞与原黑素瘤细胞生物学特性基本一致,荧光素酶的引入不会明显改变其生物特性。3.利用体外活体成像技术检测A375-luc和M14-luc荧光素酶表达情况,明确荧光素酶标记细胞数与生物发光强度之间存在一定的线性关系。4.构建A375-luc和M14-luc裸鼠皮下移植瘤模型,利用活体成像技术检测A375-luc和M14-luc荧光素酶体内表达情况,成功构建出可用于活体成像技术监测黑素瘤发生发展的裸鼠动物模型,且肿瘤区域的生物发光强度随瘤体积的增大而增加,二者之间存在一定的正相关线性关系。5.通过MTS法检测Ad-VT对A375-luc和M14-luc生长抑制效果,结果表明Ad-VT对A375-luc和M14-luc抑制效果明显的高于Ad-mock,且抑制效果具有一定的量效关系和时效关系,同时Ad-VT对表达荧光素酶的黑素瘤细胞与正常黑素瘤细胞的抑制效果基本一致,荧光素酶的引入不会明显改变Ad-VT对其的抑制效果。6.划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验用于探讨Ad-VT对A375-luc和M14-luc迁移和侵袭能力的影响,结果表明,Ad-VT可显着抑制A375-luc和M14-luc的迁移和侵袭能力。7.通过Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI流式检测、JC-1染色和Western-blot检测线粒体凋亡相关的表达,来探讨Ad-VT对A375-luc和M14-luc抑制途径以及机制。结果表明Ad-VT可以通过改变线粒体膜电位,诱导线粒体凋亡通路相关蛋白AIF、ARTS和Cyto-C表达,诱导黑素瘤细胞凋亡,且Ad-VT对表达荧光素酶的黑素瘤细胞与正常黑素瘤细胞的抑制途径基本一致,荧光素酶的引入不会明显改变Ad-VT对其的抑制途径。8.构建A375-luc和M14-luc裸鼠皮下移植瘤模型,通过测定肿瘤生长趋势和存活率,利用活体成像技术测定肿瘤区域的生物发光强度,旨在评价Ad-VT对A375-luc和M14-luc的体内抑制效果。结果表明,与对照组相比,Ad-VT可显着性降低裸鼠移植瘤肿瘤区域的平均生物发光强度和平均肿瘤生长速度,且可显着延长裸鼠的平均存活率。9.通过免疫组化检测体外实验有差异性表达的线粒体凋亡通路相关蛋白（AIF、ARTS和Cyto-C）的表达,探索体内抑瘤可能效应机制。结果表明,Ad-VT组能够显着性降低肿瘤组织中KI67的表达,并能够显着性增加肿瘤组织中Tunel、AIF、ARTS和Cyto-C的表达。研究结论体外和体内实验结果表明,重组溶瘤腺病毒Ad-VT能够显着性抑制A375-luc和M14-luc增殖,并通过线粒体凋亡途径诱导人黑素瘤细胞凋亡,同时可用于活体成像技术观测的裸鼠皮下移植瘤模型的建立,也为黑素瘤发生发展和转移以及Ad-VT体内抗肿瘤效果的研究提供保障。综上,重组腺病毒Ad-VT具有特异性杀伤肿瘤细胞以及特异性复制功能,可抑制人黑素瘤细胞生长并促进其凋亡。在本研究构建的2株稳定表达荧光素酶的人黑素瘤细胞（A375-luc和M14-luc细胞）和可视化动物模型中,抑瘤效果显着,为黑素瘤的综合治疗与机制研究提供了新的线索,为黑素瘤的治疗转化提供了新的途径。本论文创新点1.成功构建了2株能够稳定表达荧光素酶、且生物学特异性与原肿瘤细胞无明显差异的人黑素瘤细胞A375-luc和M14-luc。2.利用荧光素酶标记的人黑素瘤细胞A375-luc和M14-luc成功构建出可用于活体成像系统实时地、无创地、连续地检测肿瘤生长和转移的荷瘤裸鼠模型。3.从体内和体外水平检测了Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用。4.探讨了Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制效应机制,为临床应用提供了理论依据。不足之处本研究重组腺病毒Ad-VT诱导黑素瘤细胞凋亡的机制研究相对薄弱,体内、体外实验证实了凋亡信号通路下游的3种蛋白（AIF、ARTS和Cyto-C）参与,但有关PARP-1/AIF或ROS/Cyto-C/Caspase-3通路上游研究尚需进一步探索。
张芷毓（Chang Chihyu）[2]（2013）在《榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液临床研究的系统评价》文中认为研究背景恶性浆膜腔积液（Malignant serous effusions,MSE）是中晚期恶性肿瘤的常见并发症,干扰呼吸、循环以及消化功能,往往严重地影响抗肿瘤治疗和患者的生存质量,部份患者治疗困难,预后较差,生存期短。有文献报道,恶性积液确诊后,平均存活期为（3.1±0.5）个月,6个月病死率为84%。在临床上有些恶性浆膜腔积液的治疗十分棘手,尽管目前局部治疗的方法较多,如利尿、浆膜腔穿刺放液或引流、腔内注射化疗药物、或生物制剂等疗效常不尽人意、复发率高且有不同程度的毒副反应。榄香烯（Elemene）是从温莪术中提取的具有抗癌活性的倍半萜烯化合物,为现代中药制剂。该药疗效确切,毒副作用轻微,在延长生存期,改善生活质量,提高病人生存受益和抗转移复发方面与化疗比较有明显优势,并具有高效安全的双向性,可以增强疗效,联合用药既可有效增加疗效,又能在一定程度上减轻不良反应。并可用于介入、腔内化疗及癌性胸、腹水、心包积液的治疗。经循征医学系统评价证实安全有效的广谱靶向抗肿瘤植物药[3]。现阶段单药应用榄香烯或联合化疗对恶性胸、腹、心包腔积液治疗均对其临床疗效进行了大量的研究与报道。但由于肿瘤的特殊性,迄今尚未见到多中心、大样本的临床试验结果,亦未见这种增效减毒作用的循证医学证据。根据临床流行病学和循证医学评价文献指导原则,本研究收集1996～2012年间已发表的榄香烯乳注射液（Elemene Emulsion Injection）单药与联合化疗治疗恶性浆膜腔积液的临床随机对照试验（RCT）,主要采用系统评价和Meta分析的方法,严格评价研究证据的真实性,进行方法学质量和临床疗效及安全性评价,客观评估研究质量的总体水平及治疗上的优势与不足,并基于GRADE系统作出证据水平分级及推荐等级,以期为临床治疗提供更可靠的循证医学证据。目的系统评价（systematic review, SR）榄香烯乳注射液对恶性浆膜腔积液患者治疗的临床疗效、生活质量、毒副反应的影响,并严格评价研究证据的真实性、可靠性及临床适用性,为临床实践决策提供可靠的科学证据。方法1.纳入研究文献1.1.系统检索中文科技期刊数据库（VIP）,和中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据知识平台和文献追溯的方法,收集国内1996～2012年间公开发表的关于榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液的临床研究文献。1.2制定检索策略：采用主题词、关键词相结合的检索方法进行检索：#1榄香烯、#2治疗、#3疗效、#4积液、#5胸水、#6腹水、#7:#1AND#4、#8:#1AND#5、#9:#1AND#6。1.3确定纳入和排除标准：纳入文献的研究目标为在榄香烯治疗上或联合化疗药物对恶性浆膜腔积液临床观察其治疗获益。排除重复发表、未设立对照组的研究和动物实验,并排除无法判断疗效综述、经验总结、理论探讨、个案报道等类型的研究,并剔除不符合要求的文献。本研究只纳入随机对照试验（RCT）。1.4干预措施：①榄香烯乳（大连金港制药有限公司制品-国药准字H10960114）vs.化疗药;②榄香烯乳+化疗药vs.化疗药。对照组使用和治疗组相同的常规化疗（药物种类不限）。2组患者采取腔内积液置管闭式引流,然后作腔内注药,同时辅以止吐及其他对症处理的药物,如地塞米松及利多卡因等。2.判效结局指标2.1疗效评定标准：采用世界卫生组织（WHO）制定的标准评价：分为CR、PR、SD、NC4组,总有效率=（CR例数+PR例数）/总例数×100%。2.2生活质量评价指数（quality of life,QOL）:采用karnofsky performance status （KPS）评分标准,分为好转、稳定、恶化。2.3安全性评价：按照WHO抗癌药物急性与亚急性毒副反应分级标准。3.文献质量评价3.1严格评价各个相关纳入研究的方法学质量,采用按照Juni等对随机对照试验的4条质量评价标准进行分析评价,质量等级为A级；B级;C级;3.2按照Cochrane系统评价员手册（5.1.0版）中RCT的偏倚风险评价标准评价纳入研究的方法学质量;3.3并采用GRADE系统对证据质量和等级推荐进行分级、循证医学（EBM）证据质量进行评价。4..数据录入及统计分析在严格质量评价后,对收集的各相关研究进行结局测量指标的数据提取,采Cochrane协作网提供的Revman5.0统计软件进行Meta分析。a.异质性检验（齐性检验）。根据异质性结果选用进一步的系统评价方法。b.统计合并效应量（加权合并以相对危险度（Relative Risk, RR）表示）,计算效应尺度及95%的置信区间（Confidence Interval,CI）并进行统计推断。c.图示（森林图）单个试验的结果和合并后的结果。以P<0.05表示具有显着的统计学意义,以P<0.01表示具有非常显着的统计学意义。d.敏感性分析：测试各个临床试验的疗效结果经Meta整合之后,所得出总体的关于干预的疗效结果,如果各临床试验结果之间差异很大,异质性测试显示有显着性差异,则排除某纳入研究,重新进行Meta分析,其结果与未排除前的结果进行比较,以检验个别研究结论对合并效应量的影响。d.采用“倒漏斗图”或通过“失安全数”的计算了解潜在的发表偏倚。e.结果解释、作出结论及评价。结果本研究共纳入符合榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液的临床随机对照试验（RCT）31篇中文文献,共纳入1763名患者,其中治疗组903例,对照组860例。治疗组的联合用药或对照组化疗药物以顺铂、金葡素、卡铂、5-FU、IL-2等为主进行治疗。各研究纳入治疗组和对照组的基线条件和基础治疗一致。1.榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液的Meta分析纳入的17篇文献,对榄香烯乳单药治疗与单用化疗治疗进行对比,并能获得近期疗效、生活质量、不良反应及生存数据的随机对照试验。967例入组。其中仅1篇文献能提供1年生存率。纳入文献研究质量均为C级。1.1近期疗效的Meta分析1.1.1对纳入分析的17项研究近期疗效的Meta分析,综合结果显示,榄香烯组治疗恶性浆膜腔积液疗效优于化疗组RR＝1.03,95%CI：（0.93～1.14）,P=0.61。但各组之间差异无统计学意义。1.1.2对纳入的17项研究近期疗效的总有效率（CR+PR）的Meta分析,两组有效率为84.31%vs.63.44%,RR=1.32,95%CI（1.22,1.43）,P<0.01。差异有统计学意义。揭示榄香烯治疗恶性浆膜腔积液的临床疗效明显优于化疗组。1.2生存质量的Meta分析对纳入4项研究的Karnofsky评分改善率比较,两组生质存量改善率为69.52%vs.35.23%,RR=1.97,95%CI（1.48,2.64）,P<0.01,2组差异有统计学意义,说明榄香烯对恶性浆膜腔积液患者生活质量的改善率明显高于化疗组。1.3生存率的Meta分析对纳入1项研究1年生存率的Meta分析,2组1年生存率分别60.00%,31.03%,RR=1.93,95%CI（1.04,3.58）,P<0.05。差异有统计学意义。榄香烯合并化疗组的1年生存率高于化疗组。1.4不良反应的Meta分析17项研究分为6个组的不良反应发生率的Meta分析,主要为胸痛、腹痛、发热、胃肠道反应、骨髓抑制、肝臀功能损害等。1.4.1对纳入14项研究胸痛发生率的Meta分析,两组胸痛发生率为29.41%vs.8.97%,RR=2.62,95%CI（1.28,5.37）,P<0.01。差异有统计学意义。显示注射榄香烯引起胸痛发生率明显高于化疗药物腔内注射治疗。1.4.2对纳入2项研究腹痛发生率的Meta分析,两组发生率为8.45%vs.2.73%,RR=3.15,95%CI（0.69,14.42）,P=0.14。显示注射榄香烯组与化疗组,两组间腹痛发生率相似,差异无统计学意义。1.4.3对纳入10项研究发热发生率的Meta分析,两组发生率为21.15%vs.4.64%,RR=3.32,95%CI（1.24,8.84）,P<0.05。注射榄香烯治疗恶性浆膜腔积液发热发生率高于化疗药物腔内注射治疗,差异有统计学意义。1.4.4对纳入15项胃肠道不良反应发生率的Meta分析,两组发生率为6.26%vs.40.52%,RR=0.20,95%CI（0.10,0.37）,P<0.01。差异有统计学意义。显示榄香烯组胃肠道反应发生率明显低于化疗组。1.4.5对纳入14项研究骨髓抑制反应率的Meta分析,两组发生率为0.24%vs.20.66%,RR=0.08,95%CI（0.04,0.17）,P<0.01。显示榄香烯组骨髓抑制发生率明显低于化疗组,差异有统计学意义。1.4.6对纳入9项研究肝、肾功能损害发生率的Meta分析,两组发生率为0.33%vs.8.44%,RR=0.17,95%CI（0.07,0.43）,P<0.01。差异有统计学意义。显示榄香烯组肝、肾功能损害低于化疗组。2.榄香烯乳注射液联合化疗药治疗恶性浆膜腔积液的Meta分析纳入的14篇文献,是对化疗同时加用榄香烯治疗与单用化疗治疗进行对比,并能获得近期疗效、生活质量、不良反应及生存数据的随机对照试验。796例入组。其中无1篇文献能提供生存率数据。纳入文献研究质量：仅1篇为B级,其馀皆为C级。2.1近期疗效的Meta分析2.1.1对纳入分析的14项研究近期疗效的Meta分析,综合结果显示,榄香烯与化疗药物联合组和单纯化疗组治疗恶性浆膜腔积液疗效优于单纯化疗组[RR=0.98,95%CI：（0.79-1.22）,P=0.86]。但各组间差异无统计学意义。2.1.2对纳入的14项研究近期疗效的总有效率（CR+PR）的Meta分析,两组有效率为82.52%vs.58.85%,RR=1.41,95%CI（1.19,1.68）,P<0.01。差异有统计学意义。揭示榄香烯可以明显提高化疗药物对恶性浆膜腔积液治疗的临床疗效。2.2生存质量的Meta分析对纳入4项研究的Kamofsky评分改善率比较,两组生质存量改善率为65.80vs.33.33%,RR=2.06,95%CI（1.40,3.04）,P<0.01。说明榄香烯联合化疗对恶性浆膜腔积液患者生活质量的改善率明显高于单纯化疗组。2.3不良反应的Meta分析14项研究分为5个组的不良反应发生率的Meta分析,主要为胸痛、发热、胃肠道反应、骨髓抑制,以及肝肾功能损害等。2.3.1对纳入7项研究胸痛发生率的Meta分析,两组胸痛发生率为28.70%vs.19.41%,RR=3.15,95%CI（0.81,12.24）,P=0.10。差异无统计学意义。显示注射榄香烯与化疗药物联合组与单纯化疗组引起胸痛发生率无明显差异。2.3.2对纳入5项研究发热发生率的Meta分析,两组发生率为39.39%vs.17.28%,RR=3.71,95%CI（0.80,17.19）,P=0.09。差异无统计学意义。显示注射榄香烯与化疗药物联合组与单纯化疗组引起发热发生率无明显差异。2.3.3对纳入8项胃肠道不良反应发生率的Meta（?）分析,两组发生率为35.39%vs.53.36%,RR=0.66,95%CI（0.54,0.81）,P<0.01。2组差异有统计学意义。显示注射榄香烯与化疗药物联合组胃肠道不良反应发生明显低于单纯化疗组。2.3.4对纳入4项研究骨髓抑制反应率的Meta分析,两组发生率为13.79%vs.50.00%,RR=0.24,95%CI（0.08,0.76）,P<0.05。显示榄香烯与化疗药物联合组骨髓抑制发生率低于单纯化疗组。差异有统计学意义。2.3.5对纳入3项研究肝、肾功能损害发生率的Meta分析,两组发生率为4.65%vs.10.11%,RR=0.49,95%CI（0.17,1.44）,P>0.05。差异无统计学意义。显示榄香烯与化疗药物联合组和单纯化疗组肝、肾功能发生无明显差异。结论本系统评价结果表明,榄香烯乳注射液单药及联合化疗治疗恶性浆膜腔积液具有明显的优势。治疗组患者的总有效率（CR+PR）、生活质量（KPS）、生存期明显高于对照组患者。榄香烯乳注射的不良反应主要为低热和局部胸痛,同时对症处理可能减轻或避免不良反应的发生。该药避免了应用顺铂等化疗药物所产生的胃肠道反应,骨髓抑制及肝肾功能损害等,增加了疗效。两者联合治疗比单一应用更能有效地控制浆膜腔积液,可以减轻患者的症状,提高生活质量,延长患者生存期,显示出明显的治疗作用。经本研究Meta分析提示榄香烯乳注射液单药及联合化疗对恶性浆膜腔积液是一种安全、有效的治疗方法,鉴于系统评价和Meta分析属于二次证据,其重要性按级别划分属于一级证据,临床参考价值最大。纳入研究分析的原始文献的异质性明显影响较大,基于纳入研究的文献质量评价为C及GRADE系统的证据质量为2B,可能存在部份偏倚等局限性,尚需进一步开展大规模、高质量的基础和临床研究取得高级别的循证医学证据,指导临床实践。
杨雄[3]（2011）在《重组hIFN-α-2b-BCG对hPBMC的TLR4信号通路的调节及其在肿瘤免疫治疗中作用机制的研究》文中进行了进一步梳理BCG腔内灌注是防治膀胱肿瘤的重要辅助手段,但其所致的膀胱局部与全身并发症使得BCG膀胱腔内灌注的应用受到一定的限制,本实验室成功研制的重组人IFN-α-2b-BCG是一种新型菌苗,与野生BCG比较,除了保留野生BCG的基本特性外,优势在于可以持续分泌IFN-α-2b, BCG和IFN-α-2b二者同时作用可以产生最佳的免疫诱导效应,抗肿瘤作用更明显,副作用发生较少,更适合病人长期灌注。对于BCG的抗癌作用机制,目前多认为与BCG对免疫系统的作用有关,Toll样受体是机体免疫系统的重要组成部分,通过识别并结合相应的病原相关分子模式启动激活信号转导途径,诱导某些免疫效应分子表达,并且通过TLRs信号通路介导肿瘤的免疫治疗。研究目的：本实验室在前期研究中,已证实了重组人IFN-α-2b-BCG在抗肿瘤生物学效应方面的作用优于野生BCG,并对TLR4在BCG诱导hPBMC的抗肿瘤效应作用中的表达及意义做了初步探讨,为进一步揭示重组人IFN-α-2b-BCG抗肿瘤生物学效应的机制,我们进行了以下两方面研究：第一部分主要探讨重组人IFN-α-2b-BCG诱导hPBMC分泌hTNF-α、hIL-12、hlFN-γ的剂量-效应作用关系。第二部分应用TLR4特异性功能阻断抗体深入研究重组人IFN-α-2b-BCG、野生BCG和干扰素对hPBMC的TLR4信号通路的调节及对TNF-α、IL-12、IFN-γ表达的影响。实验方法：第一部分：应用重组人IFN-a-2b-BCG对hPBMC进行免疫刺激,并用ELISA方法检测重组人IFN-α-2b-BCG刺激不同细胞浓度的hPBMC产生TNF-α、IL-12、IFN-γ表达量随时间的变化；以及不同细菌浓度时刺激三种细胞因子分泌的量效关系；实验设空白对照组（hPBMC+PBS）,实验组为hPBMC+rBCG。第二部分：应用TLR4功能阻断抗体对hPBMC的TLR4信号通路进行干预,然后用重组人IFN-α-2b-BCG、野生BCG、干扰素和PBS对TLR4信号通路阻断和未阻断的hPBMC进行刺激,并运用ELISA方法比较阻断组和未阻断组TNF-α IL-12、IFN-γ表达量的变化,并利用RT-PCR的方法检测TLR4信号通路中的关键调节因子NFκB、MyD88的变化。实验设空白对照组（hPBMC+PBS）,实验组为hPBMC+rBCG; hPBMC+wBCG; hPBMC+hIFN-a-2b。研究结果：第一部分：hIFN-α-2b-BCG对不同浓度hPBMC的作用,在hPBMC浓度小于1.6×106个/ml时,rBCG（终浓度0.010D）并不能增强hPBMC的hTNF-α、 hIL-12、hIFN-γ的表达量,当hPBMC浓度大于1.6x106个/ml时,rBCG（终浓度0.010D）可以有效的上调THl型细胞因子hIFN-γ、hTNF-α、hIL-12的表达,且随着hPBMC细胞浓度的增加,这种促进作用也随之加强。不同浓度的rBCG有效刺激了hPBMC,在刺激24h检测发现hTNF-α、hIL-12、hlFN-γ表达量发生明显变化,且这种变化与rBCG浓度具有明显的剂量效应关系,且各浓度组与空白对照相比均有显着优势（p<0.05）。hIFN-α-2b-BCG调节免疫反应中,不同细胞因子的生成有其最适rBCG刺激浓度,本实验所测的rBCG刺激hPBMC24h后分泌hTNF-α、hIL-12、hIFN-γ的最佳浓度分别为0.02OD、0.04OD和0.00250D。第二部分：重组BCG、野生BCG、干扰素和PBS分别刺激hPBMC后,各组在3h时NFκB、MyD88的RNA表达量显着高于6h和12h,提示NFκB、MyD88的RNA表达峰值出现在6h之前。TLR4抗体阻断后3h, NFκB、MyD88的RNA表达量明显受到抑制,但在6h和12h时,TLR4抗体阻断组和对照组NFκB、MyD88的RNA表达变化无显着差异。刺激3h后NFκB、MyD88的RNA表达量比较：rBCG组>wBCG组>IFN组>PBS组。rBCG组、wBCG组、IFN组与PBS组在6h、12h、48h和72h时,TLR4抗体阻断组较未阻断组,hIFN-y、hTNF-α、hIL-12的表达量明显受到抑制（p<0.05）。rBCG能显着上调hTNF-α,的表达量,作用优于wBCG、IFN-α-2b和空白组（p<0.05）；rBCG对hIFN-γ的上调作用与wBCG无显着差异（p>0.05）,但两者均明显优于IFN-α-2b和空白组（均p<0.05）。rBCG、wBCG和IFN均能显着增强hPBMC的NFκB、MyD88的RNA表达,这一增强作用均被TLR4抗体明显抑制,这一变化与hIFN-y、hTNF-α、hIL-12的表达量变化一致。结论：重组人IFN-κ-2b-BCG诱导1iPBMC分泌hTNF-α、hIL-12、hIFN-γ存在剂量-效应作用关系；TLR4信号通路在重组hIFN-α-2b-BCG介导的肿瘤免疫反应中发挥重要作用,本研究结果提示重组BCG通过TLR4-MyD88-NFκB信号通路对hPBMC分泌Th1细胞因子的表达量进行调节。
李锐[4]（2011）在《CD40信号调控胃癌免疫编辑的作用及机制》文中进行了进一步梳理目的探讨CD40在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者预后转归的关系。方法采用免疫组化法检测73例胃癌组织和51例正常胃黏膜组织中CD40的表达,利用逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）法分别检测11例胃癌和正常胃黏膜组织中CD40 mRNA的表达。应用Kaplan-Meier法和Log—rank检验评价CD40与胃癌患者生存时间的关系,并用Cox风险模型进行多因素分析。结果免疫组化检测显示CD40在胃癌组织中的阳性表达率为47.9%（35/73）,与正常胃黏膜组织相比,差异有统计学意义（P=0.0063）;RT-PCR检测发现CD40 mRNA在胃癌组织中的阳性表达率为72.7%（8/11）,在正常胃黏膜组织中无表达。随访5年后,CD40阴性组存活57.9%（22/38）,CD40阳性组存活5.7%（2/35）,差异有统计学意义（P=0.0022）。胃癌组织中CD40阴性表达、弱中等阳性表达和强阳性表达患者中位生存时间分别为56、29和11个月,生存率差异有统计学意义（P=0.0085）。Cox回归多因素分析显示,CD40表达、淋巴结转移及临床分期是影响胃癌患者预后的独立因素。结论CD40在胃癌组织与正常胃黏膜中差异表达,可能参与胃癌的转移扩散,可作为预测胃癌患者预后的重要指标。目的对前期研究获得的胃癌AGS细胞CD40信号活化前后基因表达谱进行生物信息学分析,筛选并鉴定与肿瘤免疫编辑相关信号转导通路,进一步构建基因沉默载体,用于特异性阻断相关信号途径,为进一步研究CD40调控胃癌免疫编辑奠定基础。方法前期研究已经获得AGS细胞CD40信号活化前后的基因表达谱芯片,利用层次式系统聚类分析法（Hierarchical Cluster）对差异表达基因群聚类分析,筛选出与胃癌免疫编辑相关的信号转导通路,并采用Real-time PCR和蛋白印迹法（Western blot ）验证相关分子表达变化。设计短发夹结构的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K） siRNA对应模版DNA序列,克隆至Psilencer1.0-U6质粒,构建Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA质粒载体。将重组质粒转染人胃癌AGS细胞,利用免疫荧光染色观察转染情况,并采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测PI3K表达。结果生物信息学分析结果显示差异表达基因414个,包括上调基因209个,下调基因205个,其中PI3K和JNK/SAPK信号通路相关基因均显着上调,并经Real-time PCR和Western blot检测验证。酶切及测序证实Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA质粒载体构建成功。转染重组质粒后可以显着抑制AGS细胞PI3K mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论人胃癌AGS细胞CD40信号活化后可激活多条不同的信号转导通路,其中PI3K/Akt和JNK/SAPK信号通路异常活化可能是CD40信号调控胃癌细胞双重生物学行为的重要分子机制。PI3K/Akt信号通路可诱导Survivin、VEGF等基因表达上调,可能促进胃癌侵袭、转移,参与胃癌免疫编辑。靶向性PI3K siRNA基因沉默载体能特异性抑制PI3K表达。目的探讨应用小分子干扰RNA （ small interfering RNA, siRNA）沉默磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K）基因对CD40信号活化介导的胃癌细胞生长、侵袭及Survivin、VEGF、Fas等相关蛋白表达的影响。方法将已成功构建的重组质粒Psilencer1. 0-U6-PI3K-siRNA稳定转染胃癌AGS细胞。实验共分4组:A. sCD40L+PI3K siRNA细胞组;B. sCD40L+AGS细胞组;C.生理盐水+PI3K siRNA细胞组;D.生理盐水+ AGS细胞组。四氮唑蓝（MTT）比色还原法检测细胞生存率,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡率变化,细胞划痕实验和Transwell实验分析细胞侵袭、转移能力,Western blot检测PI3K、Survivin、VEGF及Fas蛋白的表达。结果sCD40L+PI3K siRNA联合干预组较其余各组细胞周期阻滞及凋亡率明显增加,生存率及侵袭、转移能力明显下降, PI3K、Survivin、VEGF表达显着下调,Fas表达显着上调,差异有统计学意义（P <0. 05）。结论CD40信号活化联合PI3K基因沉默可明显抑制胃癌细胞生长,促进凋亡,抑制肿瘤血管生成。其可能机制在于PI3K siRNA可特异性阻断PI3K/Akt信号通路,下调凋亡抑制蛋白及VEGF蛋白分泌,上调Fas表达。CD40介导PI3K/Akt信号活化可能通过调控Survivin、VEGF及Fas等效应蛋白表达,促进肿瘤免疫对抗/逃逸,参与胃癌免疫编辑。目的探讨CD40信号活化联合PI3K基因沉默对胃癌裸鼠移植瘤的生长和肿瘤微环境中血管生成及相关蛋白表达的影响。方法选用BALB/c nu/nu裸鼠24只进行体内实验,随机分为4组,每组6只:Ⅰ. sCD40L+PI3K siRNA组;Ⅱ. sCD40L+AGS细胞株组;Ⅲ.生理盐水+PI3K siRNA组;Ⅳ.生理盐水+ AGS细胞株组。取呈对数生长期的AGS细胞、PI3K基因沉默细胞以5×106个细胞/100μl/只分别接种于相应各组裸鼠右胁腹前肢皮下。术后连续观察42d后处死裸鼠。观察并计算各组肿瘤平均体积。测定瘤块中微血管密度（MVD）;TUNEL法检测肿瘤的凋亡指数;Western blot检测PI3K、Survivin、Fas及VEGF蛋白表达的变化。结果sCD40L+PI3K siRNA联合干预组肿瘤平均体积较其余各组均明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。联合干预组与对照组相比,肿瘤原位凋亡明显增加,MVD明显减小,差异有统计学意义（P<0.01）。联合干预组肿瘤组织中PI3K、Survivin、VEGF表达显着下调,Fas表达显着上调,差异有统计学意义（P <0.010. 05）。结论CD40信号活化联合PI3K基因沉默能显着抑制胃癌裸鼠移植瘤生长及血管生成,促进凋亡。其可能机制在于PI3K siRNA可特异性阻断PI3K/Akt信号通路,下调肿瘤微环境中凋亡抑制蛋白及VEGF蛋白分泌,上调Fas表达,进而增强CD40信号诱导的特异性抗肿瘤效应。目的本研究拟提取、纯化黄芪多糖（astragalus polysaccharides,APS）并分析其化学结构,探讨APS对胃癌大鼠模型的免疫调节和抑瘤作用,以及对CD40、PI3K信号通路的影响,为临床应用APS调控CD40信号相关胃癌免疫编辑,进行胃癌生物治疗提供实验依据。方法采用NaOH醇提醇沉法从天然黄芪中提取APS。利用薄层色谱法（TLC）和葡聚糖凝胶G色谱法进一步分离、纯化APS。采用高效液相色谱（HPLC）和红外线光谱技术（IR）定量测定APS分子量及分子结构。40只雄性Wistar大鼠分为5组,每组8只,除空白对照组外,其余4组均经免疫抑制处理（注射阿糖胞苷与全身照射60CO）,皮下接种胃癌细胞悬液,制成胃癌大鼠模型。其中3组分别用APS低、中、高剂量灌胃治疗,正常对照组和模型对照组分别用相应剂量的生理盐水灌胃。10 d后,观察各组肿瘤生长情况并计算抑瘤率,检测裸鼠脾淋巴细胞能力和NK细胞活性,利用ELISA法测定外周血IgA、IgM、IgG及IL-2等的浓度,流式细胞技术检测胃癌大鼠外周血T细胞亚群含量,Western blot检测各组胃癌大鼠肿瘤组织CD40、PI3K蛋白表达。结果APS能显着提高胃癌大鼠脾淋巴细胞增生率、外周血IL-2水平及NK细胞活性,且呈剂量依赖性,P < 0.01;APS能显着提高胃癌大鼠血清IgA、IgG及IgM水平,且呈剂量依赖性,P < 0.01;APS治疗后,胃癌大鼠CD4+和CD4+/CD8+较模型对照组明显上升,且呈剂量依赖性,P < 0.01。APS各剂量组平均瘤重较模型对照组均明显降低,P < 0.010.05;APS高剂量组抑瘤率明显高于低、中剂量组,P < 0.01。与模型对照组相比,APS各剂量组胃癌组织中CD40蛋白表达均显着增加,PI3K蛋白表达降低,P < 0.05。结论作为中药黄芪的天然提取物,APS的主要成分为葡聚糖。APS能显着提高胃癌大鼠的细胞和体液免疫功能,并抑制肿瘤生长。APS与CD40信号关系密切,表现为APS既能活化CD40信号,增强其所诱导的机体特异性抗胃癌效应;亦能阻断PI3K信号途径,抑制其相关的胃癌免疫编辑作用。APS较之于传统化疗药物,无明显毒副作用,且不易产生耐药性。因此,APS在胃癌免疫治疗领域具有良好的应用前景。
兰卫华[5]（2007）在《选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤作用的体外实验研究和临床初步研究》文中提出膀胱肿瘤是我国泌尿外科最常见的肿瘤,其中多数为非肌层浸润性膀胱癌。膀胱肿瘤的主要特点是复发率高,可能的原因是膀胱肿瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下、使得残存肿瘤容易逃避免疫监视,得以生存和形成复发。因此,非肌层浸润性膀胱肿瘤术后常辅以膀胱灌注化疗或免疫疗法以预防肿瘤复发和进展。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是目前最有效的免疫治疗,有效激活膀胱粘膜局部免疫应答是其抗肿瘤作用的主要机制,但BCG膀胱灌注等治疗仍不能完全预防肿瘤的复发和进展。预防膀胱肿瘤复发和进展仍是尚未完全解决的难题。近年来,环氧化酶2（Cyclooxygenase,COX-2）逐渐成为膀胱肿瘤研究领域的研究热点。研究表明,COX-2在正常人膀胱上皮细胞中几乎无表达,在人膀胱肿瘤细胞中表达则显着增强,它与肿瘤的分化、凋亡、血管生成等生物学行为有关,且与肿瘤分级分期、进展预后等有关。因此,COX-2可以作为膀胱肿瘤治疗的新靶点。有关COX-2与膀胱肿瘤的研究是本实验室近年来的研究重点之一。本课题通过研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布对BCG感染的人脐血源性树突状细胞（Cord blood derived dendritic cell,CBDC）体外抗膀胱肿瘤免疫功能及对人膀胱肿瘤细胞株T24的体外增殖和凋亡的影响,探讨塞来昔布的抗膀胱肿瘤效应及其可能机制,并通过一个小规模临床研究,初步了解塞来昔布对BCG膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤的潜在的辅助治疗效果。本研究主要研究内容及结果如下:第一部分,塞来昔布对BCG感染的人CBDC体外抗膀胱肿瘤免疫功能的影响1.首先,从人脐血中分离单个核细胞,体外诱导培养为树突状细胞（DC）,BCG刺激使其成熟。经鉴定所培养细胞具有典型DC形态学和表型特征。2.分别加入培养基（空白对照）、BCG、BCG+PGE2、BCG+塞来昔布等与DC共培养。ELISA法测定各组培养上清中Th1型细胞因子（IL-12）和Th2型细胞因子（IL-10）水平,结果显示BCG可同时增加DC的IL-12和IL-10分泌,提示无免疫漂移作用发生,而塞来昔布剂量依赖性地显着增强BCG感染DC的IL-12的表达,抑制其IL-10表达;PGE2的作用与此相反,提示塞来昔布可诱导偏向Th1型而PGE2可诱导偏向Th2型免疫应答的免疫漂移作用。3. MTT法测定各组DC的混合淋巴细胞反应性（MLR）,结果显示塞来昔布显着增加、而PGE2则明显抑制BCG感染的DC的混合淋巴反应性。4.乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定各组DC激活的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对人膀胱肿瘤细胞株T24的细胞毒活性。结果显示,塞来昔布显着增强、而PGE2则明显抑制BCG感染的DC激活CTL的抗膀胱肿瘤细胞毒活性。第二部分,研究塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24体外增殖和凋亡的影响1.将贴壁生长的T24细胞,分别与不同浓度塞来昔布、PGE2以及PI-3K抑制剂LY294002共培养,MTT法测定塞来昔布及PGE2对T24细胞增殖活性的影响;分别与CM,DMSO（0.1%）,塞来昔布、PGE2以及LY294002共培养,流式细胞仪测定塞来昔布及PGE2处理后T24细胞的凋亡率。结果显示塞来昔布呈剂量依赖性显着抑制贴壁生长的T24细胞的增殖,增加T24细胞的凋亡;而PGE2和对贴壁生长的T24细胞增殖和凋亡无明显影响。2.建立细胞悬浮培养体系,将悬浮生长的T24细胞,分别与CM,DMSO,塞来昔布、PGE2以及LY294002共培养,流式细胞仪测定塞来昔布及PGE2处理后T24细胞的凋亡率（失巢凋亡,即脱壁作用诱导的凋亡现象）;分别与塞来昔布、PGE2共培养,Western blot法检测塞来昔布及PGE2对PI-3K/Akt途径活化的影响。结果表明,塞来昔布和LY294002显着增加T24的失巢凋亡,而PGE2显着抑制T24细胞的失巢凋亡。Western blot结果提示,塞来昔布抑制、而PGE2明显增加Akt磷酸化,提示塞来昔布和PGE2对PI-3K/Akt途径活化分别具有降低或增强作用,并且这种作用可能是对失巢凋亡的增强或抑制作用机制之一。第三部分,口服塞来昔布胶囊对BCG膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤疗效影响的临床初步研究。42例非肌层浸润性膀胱癌术后患者随机分为2组,分别接受单纯BCG治疗和BCG膀胱灌注加塞来昔布胶囊口服联合治疗。ELISA法测定治疗前后尿液细胞因子水平,观察复发和进展以及治疗相关副作用等情况,分析影响对塞来昔布治疗的反应性的因素。结果显示:1.两组患者治疗前尿液IL-12、IL-10水平的差异无显着性统计学意义,治疗后联合治疗组IL-12水平以及其治疗前后增加值均显着高于单纯BCG组,而治疗后IL-10水平以及其治疗前后增加值均显着低于单纯BCG组,提示塞来昔布可诱导BCG激活的膀胱局部免疫应答发生偏向Th1型的免疫漂移,从而增强膀胱局部的抗肿瘤免疫功能。2.由于随访时间较短,目前尚不能得出塞来昔布对BCG膀胱灌注预防膀胱肿瘤复发和进展疗效影响的准确结论。3.单纯BCG治疗组与联合治疗组比较,治疗副作用无明显差异。4.对尿液细胞因子水平进行的预后因素影响分析结果提示:65岁以上年龄组对塞来昔布治疗的反应性强于65岁以下年龄组;男性患者治疗反应性强于女性患者;高分期、分级以及多发、直径大的肿瘤治疗反应性降低。其机制有待研究。全文结论:1.塞来昔布可增强BCG激活的Th1型免疫应答,抑制Th2型应答,诱导向Th1型应答漂移,从而增强BCG激活的抗肿瘤免疫效应。其机制是通过抑制COX-2活性下调PGE2的表达,从而抑制PGE2诱导的DC的Th2型细胞因子IL-10分泌及其对Th1型细胞因子IL-12的拮抗作用,使得IL-12表达升高。2.塞来昔布具有双重抗肿瘤作用,即对BCG激活的免疫应答的增强作用,以及直接对膀胱肿瘤细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。两种作用均与塞来昔布对COX-2的抑制有关。3.塞来昔布对膀胱肿瘤失巢凋亡诱导作用具有重要的临床意义,提示其潜在的降低膀胱肿瘤术后复发和转移的作用。这种诱导作用可能是通过其对PI-3K/Akt途径活化的抑制实现的。4.临床初步研究证实,塞来昔布可诱导BCG激活的膀胱局部免疫反应产生向Th1免疫应答的极性漂移,提示塞来昔布可增强BCG膀胱灌注治疗膀胱肿瘤临床疗效。年龄、分级分期、肿瘤数目和大小等均可影响对塞来昔布治疗的反应性,但其影响机制有待研究。
朱浩波[6]（2007）在《IFN-α2b及IL-2对不同膀胱癌细胞株生长及HLA-DR抗原表达影响的实验研究》文中研究表明目的：探讨膀胱移行细胞癌细胞株5637、T24细胞表面抗原HLA-DR的表达与肿瘤病理分级之间的关系，并分析IFN-α2b及IL-2对肿瘤细胞增殖及HLA-DR表达的影响，以初步揭示膀胱移行细胞癌发生、发展的分子机制。材料与方法：应用MTT法，在96孔板细胞培养环境中加入不同浓度的IFN-α2b和IL-2，分别在24h、48h及72h时间点检测各浓度组肿瘤细胞的吸光度（OD值），计算并比较不同浓度IFN-α2b及IL-2在各时间点对肿瘤细胞的抑制率；应用免疫组织化学方法（生物素检测法，SP-9000）检测两种膀胱移行细胞癌细胞株5637、T24 HLA-DR抗原的表达，分析相同浓度的IFN-α2b、IL-2和IFN-α2b+IL-2刺激后HLA-DR在两种膀胱癌细胞株中的积分光密度（Integrated optical density，IOD）值，以比较IFN-α2b及IL-2对肿瘤细胞HLA-DR表达的影响。结果：1．加入不同浓度IFN-α2b后，膀胱移行细胞癌细胞株5637生长明显受抑制，在各个时间点上不同浓度组间的OD值间有显着性差异（p＜0.05），1000U／ml组、5000U／ml组OD值均高于10000U／ml组，而1000U／ml组与5000U／ml组OD值间无显着性差异；加入不同浓度IL-2后，细胞癌株生长抑制不明显，甚至出现负值，在各个时间点上不同浓度组OD值之间均无显着性差异（p＞0.05）；加入相同浓度的IFN-α2b和IL-2后，IFN-α2b对肿瘤细胞的抑制率明显高于IL-2，在各个时间点上IFN-α2b组肿瘤细胞的OD值均低于IL-2组，两者之间有统计学差异（p＜0.05）。2．IFN-α2b或IL-2刺激之前，膀胱移行细胞癌细胞株5637、T24两种细胞株中很少甚至无HLA-DR表达；刺激之后，两种细胞株的HLA-DR的表达（IOD值）均有所增强。三种处理组间IOD值存在统计学差异，IFN-α2b组及IFN-α2b+IL-2组的IOD值均显着高于于IL-2组（p＜0.01），而IFN-α2b组与IFN-α2b+IL-2组之间无显着差别（p＞0.05）。结论：HLA-DR的表达与膀胱癌的病理分级无关，所以不能作为提示预后的指标；IFN-α2b可诱导膀胱癌细胞的凋亡，对肿瘤细胞有直接杀伤能力，且呈浓度依赖性，而IL-2却不能抑制肿瘤细胞生长；IFN-α2b可上调膀胱癌细胞HLA-DR的表达，IL-2对膀胱肿瘤细胞株HLA-DR的表达无明显作用，且IL-2对IFN-α2b的增强HLA-DR表达作用无影响。
徐银祥[7]（2007）在《非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究》文中研究表明背景与目的恶性肿瘤的发展变化在某种程度上取决于肿瘤与免疫系统之间的相互作用。机体免疫能力下降是肿瘤发生、发展的一个重要原因。因此,增强机体免疫力,促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一个重要目标。研究发现细胞凋亡主要有线粒体和死亡受体两条途径。FasL是重要凋亡分子,与死亡受体Fas结合后诱导细胞膜表面Fas分子聚集形成三聚体启动细胞凋亡的信号传递诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas广泛表达于体细胞,而FasL在正常情况下仅表达于活化T细胞,以及眼、睾丸、胎盘等特殊组织。Caspase是执行凋亡的主要酶类,Caspase-3是一种特异性半胱氨酸蛋白酶,在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。研究发现恶性肿瘤间质内存在以T淋巴细胞为主的淋巴细胞群体,称之为肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。TILs通过表达FasL蛋白诱导肿瘤细胞凋亡发挥其杀瘤活性。然而,TILs与非小细胞肺癌均表达FasL,非小细胞肺癌表达FasL和Caspase-3与肿瘤浸润淋巴细胞凋亡之间存在什么关系?肿瘤细胞高表达FasL能否引起宿主TILs凋亡,从而发挥反杀伤作用,逃避宿主免疫监视?肿瘤细胞高表达FasL是否与肿瘤浸润淋巴细胞分泌的细胞因子有关?表达FasL是不是NSCLC在接受来自TILs分泌细胞因子刺激后采取的一种反击宿主免疫系统的措施?相信深入研究非小细胞肺癌FasL、Caspase-3表达与肿瘤微环境中TILs的关系可能具有重要生物学意义。方法本研究采取以下方法:1.将手术切除45例非小细胞肺癌标本及远癌肺组织作为研究对象,应用免疫组织化学方法检测FasL、Caspase-3蛋白表达。2.应用激光微切技术获取非小细胞肺癌周边区和非周边区域肿瘤细胞,共10例,应用RT-PCR技术检测不同区域肿瘤细胞FasL和Caspase-3 mRNA表达。3.应用免疫组织化学技术标记肿瘤浸润淋巴细胞45例,结合应用TUNEL法检测肿瘤浸润淋巴细胞凋亡情况,原位检测非小细胞肺癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡比例。4.筛选出4份HLA-A2+ PBL;A549细胞转染质粒后稳定表达HLA-A2+,表达HLA-A2的PBL成为A549细胞的特异性TILs。HLA-A2+ PBL培养后细胞计数为3×105/ml,共246ml,离心后共获得96ml上清液。分别应用50μl、100μl、150μl、200μl、250μl和500μl肿瘤浸润淋巴细胞上清液与A549细胞共培养30min、60min、120min、180min和240min,设立阴性对照组,应用RT-PCR和Western blot技术分别检测A549细胞在不同时间、不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞上清液共培养时FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白表达。5.所得结果采用SPSS 10.0进行相应的统计学分析。结果本课题研究主要结果如下:1.非小细胞肺癌FasL表达检查结果:⑴肺腺癌FasL表达率为73.3%±15.8%,肺鳞状细胞癌FasL表达率为60.4 %±15.8 %,腺癌FasL表达显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化肺癌FasL表达率为60.6 %±15.8 %,低分化肺癌FasL表达率为70.1 %±16.9 %,低分化肺癌FasL表达显着高于中高分化肺癌（p<0.05）;⑶伴淋巴结转移组NSCLC FasL表达阳性率为62.4 %±15.6 %,无淋巴结转移组肺癌FasL表达阳性率为55.8 %±11.9 %,伴淋巴结转移组肺癌FasL表达率显着高于无淋巴结转移组（p<0.05）;⑷本组单纯以肺癌pTNM分期统计分期,各期间统计比较无显着差异,将Ⅰ+Ⅱ期、ⅢA+ⅢB期分别合并后再进行统计分析,前者FasL表达阳性率为62.4%±15.6 %,而后者FasL表达阳性率为72.8 %±18.0 %,ⅢA+ⅢB期非小细胞肺癌FasL阳性率显着高于Ⅰ+Ⅱ期非小细胞肺癌FasL表达阳性率（p<0.05）。⑸NSCLC周边区FasL表达阳性率为74.4 %±18.4 %,而肿瘤非周边区FasL表达率为64.4 %±13.1 %,肿瘤周边区FasL表达显着高于非周边区FasL表达（ p<0.05 ）。2. NSCLC不同部位FasL、Caspase-3 mRNA表达检测结果:⑴NSCLC周边区FasL mRNA表达强度为0.926 + 0.41;肿瘤非周边区FasL mRNA表达强度为0.892 + 0.26。两组间存在显着差异,（P<0.05 ）。⑵肿瘤周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.912 + 0.07;肿瘤团非周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.923 + 0.04。两组间无显着统计学差异,（P>0.05 ）。3.非小细胞肺癌Caspase-3蛋白表达检测结果:⑴肺鳞状细胞癌Caspase-3蛋白平均阳性表达率为76.9 %,腺癌Caspase-3阳性表达率为47.4 %,鳞癌Caspase-3表达水平显着高于腺癌（p<0.05）;⑵中高分化NSCLC Caspase-3阳性表达率为70.0%,低分化非小细胞肺癌Caspase-3阳性表达率为64.0%,中高分化非小细胞肺癌与低分化NSCLC Caspase-3表达无显着差异（p>0.05）;⑶Caspase-3蛋白表达与N分期有关,无淋巴结转移组Caspase-3阳性表达率为81.8%,淋巴结转移NSCLC组Caspase-3阳性率为61.8%,无淋巴结转移组Caspase-3表达水平显着高于淋巴结转移组NSCLC（p<0.05）;⑷比较肺癌周边区与非周边区Caspase-3蛋白表达无显着差异（p>0.05）。4. NSCLC肿瘤浸润淋巴细胞凋亡检测结果:⑴肺腺癌组织肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为5.51±1.56,肺鳞状细胞癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为4.11±2.03,腺癌组织TILs凋亡指数显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化非小细胞肺癌组织中TILs凋亡指数为3.84±1.71,低分化非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数为5.38±1.90,低分化肺癌TILs凋亡指数显着高于中高分化NSCLC （p<0.01）;⑶不同pTNM非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数统计比较无显着差异（ P >0.05）;⑷TIL凋亡指数随NSCLC FasL表达强度增强而增加,与其表达强度呈显着正相关（r = 0.707, p<0.01）。5.肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养后FasL和Caspase-3 mRNA及蛋白检测结果:⑴将TILs上清液250μl与A549细胞共培养60min时,FasL mRNA表达水平显着高于对照组（p<0.05）;⑵将TILs上清液200μl和250μl分别与A549细胞共培养90min时,FasL mRNA表达水平均显着高于对照组（ p<0.05 ）,两组间无显着差异（p>0.05）;⑶其他不同剂量TILs上清液与A549细胞共培养时肿瘤细胞FasL mRNA表达水平无显着变化（p>0.05）;⑷不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养时各组FasL蛋白表达与对照组比较均无显着差异（p>0.05）;⑸各组A549细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均无显着差异（p>0.05）。结论本研究得出如下结论:1. FasL蛋白在NSCLC中特异性高表达,而且与NSCLC生物学特点有关,FasL高表达可能是肺腺癌容易早期转移、预后较差的原因之一。2. FasL蛋白在NSCLC肿瘤组织呈不均匀分布,肿瘤细胞周边区FasL蛋白及FasL mRNA表达高于非周边区域。推测肿瘤团外部微环境因素可能影响肿瘤细胞FasL表达。NSCLC周边区细胞可能首先接受来自机体肿瘤浸润淋巴细胞分泌的淋巴因子,或其他体液因子刺激,上调FasL表达,对进入肿瘤团块的肿瘤浸润淋巴细胞实施反制措施,杀伤机体免疫细胞,进而在与机体免疫系统的杀伤与反杀伤战斗中争取生存空间,并进一步生长和发展。3.非小细胞肺癌FasL表达与TILs凋亡率存在密切关系,FasL蛋白表达水平越高,肿瘤浸润淋巴细胞凋亡率越高。高表达FasL蛋白可能意味着该组类型肺癌更容易应用FasL蛋白反杀伤机体肿瘤浸润淋巴细胞及免疫系统。4.肿瘤细胞与TIL上清液共培养时FasL表达上调,提示肿瘤细胞接受来自TIL分泌的某种细胞因子影响或调控。肿瘤细胞在加入TIL上清液6090min后上调FasL表达,反应较快,但在更长时间的共培养观察中未发现FasL高表达,并且,更大剂量TIL上清液加入肿瘤培养液中反而未发现FasL表达上调现象,其机制不明。参与细胞凋亡因素很多,调控机制复杂,TIL分泌细胞因子参与肿瘤细胞FasL表达尚需要进一步深入研究。
杨静悦[8]（2007）在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytocoxic T lymphocyte,CTL）反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞（Dendritic cell,DC）的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell,MNC）为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8（加TNF-α活化48h）,各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a（ 71.45士4.39）%、CD11c（ 89.68士3.16）%、CD86（91.17士4.43）%、CD80 （ 91.37士4.12）%、HLA-DR（ 94.03士3.01 ）%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a（ 68.45士5.02）%、CD11c（ 91.09士2.01）%、CD86（92.19士4.36）%、CD80 （ 90.81士3.15）%、HLA-DR（ 93.49士4.18 ）%,二者间无显着性差异（P>0.05 ）。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数（ SI）与健康对照DC的SI无显着差异（P>0.05 ）。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率（multiplicity of infection, MOI）为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第三部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测三组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞（PBMC ）中非贴壁细胞（淋巴细胞,L）,调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h （设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照）,再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显着高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显着高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
孟祥俊[9]（2007）在《HSV-1糖蛋白B基因疫苗的构建及其预防单纯疱疹病毒性眼病的初步研究》文中研究说明单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染在全世界都非常普遍,其感染眼部可引起单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）、急性视网膜坏死综合征（ARNS）等。其中HSK是当今世界上一种常见的致盲性眼角膜疾病, ARNS是疱疹家族类病毒引起的相对常见的影响视功能的眼病。近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用和滥用,HSV-1感染所致的眼病有明显上升趋势。本研究拟构建抗HSV-1的基因疫苗pgB,以期将来用于预防和治疗单纯疱疹病毒感染所致的眼病。实验采用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1 gB的基因片断,定向插入到真核表达载体pcDNA3中,成功构建出重组真核表达质粒pgB。重组质粒pgB免疫接种动物后,可以诱导机体产生特异性免疫反应,具有免疫保护作用。在动物实验中初步显示重组质粒pgB具有作为基因疫苗的潜能,可有效预防HSV-1的原发感染和潜伏感染。本研究的创新性在于成功地构建了重组真核表达质粒pgB,并在动物实验中观察到pgB能预防HSV-1性角膜炎和视网膜病变（视网膜坏死）的形成。
杨巍[10]（2005）在《pEgr-IFNγ-Endostatin双基因-放射治疗的抑瘤效应及机制的研究》文中研究说明基因-放射治疗是一种新的癌症治疗模式,它将基因治疗与放射治疗有机结合,发挥协同作用,对于实体肿瘤的治疗具有良好的应用前景。本研究根据Egr-1 启动子的辐射诱导特性,构建了辐射诱导双基因共表达质粒pEgr-IFNγ-Endostatin,比较了双基因-放射治疗方案与单基因-放射治疗方案的体内抑瘤效应并探讨其机理。结果表明,pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗的体内抑瘤效应明显优于pEgr-IFNγ或pEgr-Endostatin 单基因-放射治疗,其抑瘤效应机制可能与联合发挥IFNγ的免疫调节作用、Endostatin 的抗肿瘤血管生成作用以及射线对肿瘤的直接杀伤作用有关。本研究为进一步提高基因-放射治疗效果开辟了新的途径,为基因-放射治疗的临床应用提供理论和实验依据。
二、高聚生、干扰素-α-2b对不同膀胱癌细胞株量效关系及MHC-I、II类抗原表达影响的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高聚生、干扰素-α-2b对不同膀胱癌细胞株量效关系及MHC-I、II类抗原表达影响的实验研究（论文提纲范文）
（1）双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 指导教师对博士论文的评阅意见 |
| 指导小组对博士论文的评阅意见 |
| 答辩决议书 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 恶性黑素瘤研究进展 |
| 2.1.1 恶性黑素瘤简介 |
| 2.1.2 黑素瘤的病因与发病机制 |
| 2.1.3 黑素瘤的临床表现 |
| 2.1.4 黑素瘤的诊断与鉴别诊断 |
| 2.1.5 黑素瘤的治疗策略与发展方向 |
| 2.2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.2.1 溶瘤腺病毒简介 |
| 2.2.2 溶瘤腺病毒构建策略 |
| 2.2.3 溶瘤病毒免疫作用机制 |
| 2.2.4 总结 |
| 第3章 可用于活体成像检测的裸鼠黑素瘤模型的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 携带萤火虫荧光素酶质粒pGL4.51的特异性酶切鉴定结果 |
| 3.2.2 明确G418的最佳筛选浓度 |
| 3.2.3 荧光素酶活性检测结果 |
| 3.2.4 遗传稳定性检测结果 |
| 3.2.5 Western-blot检测荧光素酶表达 |
| 3.2.6 A375-luc和M14-luc的生长曲线检测结果 |
| 3.2.7 A375-luc和M14-luc的迁移能力检测结果 |
| 3.2.8 A375-luc和M14-luc的侵袭能力检测结果 |
| 3.2.9 A375-luc和M14-luc的细胞周期检测结果 |
| 3.2.10 A375-luc和M14-luc的体外活体成像检测结果 |
| 3.2.11 A375-luc和M14-luc的体内活体成像检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 生物发光活体成像技术简介 |
| 3.3.2 基于生物发光的活体成像技术在抗肿瘤中的研究进展 |
| 3.4 小结 |
| 3.4.1 确定了G418的最佳筛选浓度,即A375和M14细胞G418的最佳筛选浓度均为300μg/mL |
| 3.4.2 通过荧光素酶检测、遗传稳定性分析以及Western-blot检测成功获得能够稳定表达荧光素酶的人黑素瘤细胞A375-luc和M14-luc |
| 3.4.3 通过细胞生长曲线、迁移与侵袭实验以及细胞周期检测明确了荧光素酶的引入对A375和M14细胞的生物学特性无显着性影响 |
| 3.4.4 通过体外生物发光实验确定了A375-luc和M14-luc可用于小动物活体成像系统检测 |
| 3.4.5 通过体内生物发光实验完成了可用于小动物活体成像系统检测的裸鼠黑素瘤移植瘤模型的构建 |
| 第4章 双特异性溶瘤腺病毒对A375-luc和M14-luc体外抑制作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MTS检测实验结果 |
| 4.2.2 划痕检测实验 |
| 4.2.3 迁移检测实验 |
| 4.2.4 侵袭检测实验 |
| 4.2.5 Hoechst染色结果 |
| 4.2.6 Annexin V-FITC/PI流式细胞检测结果 |
| 4.2.7 JC-1 膜电位定性检测结果 |
| 4.2.8 JC-1 膜电位定量检测结果 |
| 4.2.9 线粒体凋亡通路相关蛋白Western-blot检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 4.4.1 MTS实验结果表明,Ad-VT能够显着性抑制A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的增殖,均具有一定的时效关系和量效关系。该结果表明荧光素酶的引入不会显着影响Ad-VT对人黑素瘤细胞的抑制效果 |
| 4.4.2 划痕和迁移实验结果表明,Ad-VT能够显着抑制A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的迁移。该结果表明荧光素酶的引入不会显着影响Ad-VT对人黑素瘤细胞的迁移抑制 |
| 4.4.3 侵袭实验结果表明,Ad-VT能够显着抑制A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的侵袭该结果表明荧光素酶的引入不会显着影响Ad-VT对人黑素瘤细胞的侵袭抑制 |
| 4.4.4 Hoechst染色结果表明,感染了Ad-VT的A375-luc、A375、M14-luc和M14的细胞核出现了明显的染色质边集及核碎裂等典型的凋亡现象 |
| 4.4.5 Annexin V-FITC/PI结果表明,Ad-VT在48h和72h能够显着诱导A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的凋亡,Ad-VT可能通过诱导人黑素瘤细胞凋亡来抑制其增殖该结果表明荧光素酶的引入不会显着影响Ad-VT对人黑素瘤细胞的抑制方式 |
| 4.4.6 JC-1膜电位定性和定量结果表明,Ad-VT能够显着性降低A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的膜电位该结果表明荧光素酶的引入不会显着影响Ad-VT对人黑素瘤细胞的线粒体膜电位的改变 |
| 4.4.7 Westerm-blot检测线粒体凋亡通路相关蛋白结果表明,Ad-VT能够显着诱导A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的线粒体凋亡通路相关蛋白AIF、ARTS和Cyto-C的表达 |
| 4.4.8 这些实验结果表明,Ad-VT能够显着性抑制A375-luc、A375、M14-luc和M14细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 第5章 双特异性溶瘤腺病毒对A375-luc和M14-luc体内抑制作用及机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠活体成像检测结果 |
| 5.2.2 荷瘤裸鼠瘤体积测量结果 |
| 5.2.3 荷瘤裸鼠的生存率检测结果 |
| 5.2.4 荷瘤裸鼠瘤组织免疫检测结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 5.4.1 荷瘤裸鼠的活体成像结果表明,Ad-VT组与Ad-mock组和生理盐水对照组相比能够显着性抑制生物发光强度的增强 |
| 5.4.2 荷瘤裸鼠的瘤体积测量结果表明,Ad-VT组与Ad-mock组和生理盐水对照组相比能够显着性抑制瘤体积的增长 |
| 5.4.3 荷瘤裸鼠的生存率检测结果表明,Ad-VT组与Ad-mock组和生理盐水对照组相比能够显着性降低荷瘤裸鼠的死亡率,延长荷瘤裸鼠的生存周期 |
| 5.4.4 荷瘤裸鼠的瘤组织免疫组化检测结果表明,Ad-VT组与Ad-mock组和生理盐水对照组相比能够显着性降低肿瘤组织中KI67的表达,并能够显着性增加肿瘤组织中Tunel、AIF、ARTS和Cyto-C的表达 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液临床研究的系统评价（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部份 文献回顾 |
| 综述一 恶性浆膜腔积液的中西医研究及治疗概况 |
| 参考文献 |
| 综述二 榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液的临床与药理研究概况 |
| 参考文献 |
| 第二部分 榄香烯乳注射液的循证医学证据---榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液随机对照试验的系统评价 |
| 一、研究目的 |
| 二、研究内容 |
| 三、资料与方法 |
| 1. 技术路线图 |
| 2. 系统评价(system review,SR)技术路线图 |
| 3. 检索策略 |
| 4. 文献纳入标准 |
| 5. 文献排除标准 |
| 6. 判效结局指标 |
| 四、研究方法 |
| 1. 文献质量评价标准与方法 |
| 1.1 评价方法 |
| 1.2 各研究评价标准 |
| 1.3 偏倚风险评估 |
| 1.4 系统评价证据质量及推荐等级 |
| 1.5 循证医学(EBM)证据质量评价 |
| 2. 数据录入及统计分析 |
| 2.1 Meta分析 |
| 2.2 偏倚的测量 |
| 2.3 解释系统评价结果 |
| 结果 |
| 一、榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液：随机对照试验的系统评价 |
| 1. 资料收集情况 |
| 2. 纳入文献研究方法学质量 |
| 3. Meta分析结果 |
| 4. 漏斗图及结果分析 |
| 二、榄香烯乳注射液联合化疗治疗恶性浆膜腔积液：随机对照试验的系统评价 |
| 1. 资料收集情况 |
| 2. 纳入文献研究方法学质量 |
| 3. Meta分析结果 |
| 4. 敏感性分析 |
| 5. 亚组分析 |
| 6. 漏斗图及结果分析 |
| 第三部份 讨论 |
| 1. 文献质量分析 |
| 2. 关于发表性偏倚 |
| 3. 疗效分析 |
| 4. 安全性分析 |
| 5. 局限性分析 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）重组hIFN-α-2b-BCG对hPBMC的TLR4信号通路的调节及其在肿瘤免疫治疗中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、rBCG对hPBMC的剂量-效应作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 重组人IFN-α-2b-BCG和淋巴细胞的培养 |
| 1.2.2 重组BCG对不同浓度hPBMC作用后细胞因子表达量的变化 |
| 1.2.3 不同浓度重组BCG作用hPBMC后细胞因子表达量的变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 BCG治疗膀胱癌的作用机理 |
| 1.3.2 rBCG对膀胱癌的免疫治疗 |
| 1.4 小结 |
| 二、rBCG对hPBMC的TLR4信号通路的调节 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NFκB和MyD88实时定量RT-PCR检测结果 |
| 2.2.2 TLR4抗体对hPBMC作用后细胞因子表达量的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BCG和rBCG对膀胱癌的免疫治疗机理 |
| 2.3.2 Toll样受体在肿瘤免疫治疗中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 1、rBCG对hPBMC的剂量-效应作用研究 |
| 2、重组hIFN-a-2b-BCG对hPBMC的TLR4信号通路的调节及对TNF-a、IL-12、IFN-y表达的影响 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（4）CD40信号调控胃癌免疫编辑的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CD40 信号表达与胃癌患者预后的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 胃癌细胞 CD40 相关信号转导通路的筛选、验证及基因沉默载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 P13K 基因沉默对 CD40 信号介导的胃癌细胞生长、侵袭及相关蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 sCD40L 联合P13K siRNA 对胃癌裸鼠移植瘤生长和肿瘤微环境的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 黄芪多糖对胃癌大鼠模型的免疫调节和抑瘤作用及对 CD40-P13K 信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本文研究结果及结论 |
| 创新点 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研课题及成果 |
| 攻读博士学位期间公开发表论文 |
| 攻读博士学位期间获奖情况 |
| 致谢 |
（5）选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤作用的体外实验研究和临床初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 选择性环氧化酶2 抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤作用的体外实验研究和临床初步研究 |
| 前言 |
| 第一部分 选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对卡介苗感染的人脐血源性树突状细胞体外抗膀胱肿瘤免疫功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 选择性环氧化酶2 抑制剂塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24 体外增殖和凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 口服塞来昔布胶囊对BCG 膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤疗效影响的临床初步研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 附录 BCG膀胱灌注治疗膀胱肿瘤的循证医学研究(Meta 分析) |
| 参考文献 |
| 文献综述 环氧化酶2 在膀胱肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（6）IFN-α2b及IL-2对不同膀胱癌细胞株生长及HLA-DR抗原表达影响的实验研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、英文缩略词表 |
| 四、前言 |
| 五、材料与方法 |
| 六、结果 |
| 七、讨论 |
| 八、小结 |
| 九、参考文献 |
| 十、综述 |
| 十一、致谢 |
（7）非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文非小细胞肺癌FasL 和Caspase-3 表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究 |
| 前言 |
| 第一部分 非小细胞肺癌FasL、Caspase-3 蛋白表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 肿瘤浸润淋巴细胞上清液对FasL、Caspase-3 表达的影响 |
| 分题一 A549 细胞特异性肿瘤浸润性淋巴细胞构建 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 分题二 肿瘤浸润淋巴细胞上清液对Fasl，、Caspase-3 表达的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分NSCLC 肿瘤浸润淋巴细胞凋亡及其与FasL 表达的关系 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Fas／FasL 系统在肿瘤发展过程中的生物学作用参考文献 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肿瘤免疫逃避机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 1 人HBsAg、AFP基因Adeno-X~(TM)腺病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 1.7 结论 |
| 2 树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结 果 |
| 3.5 讨 论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（9）HSV-1糖蛋白B基因疫苗的构建及其预防单纯疱疹病毒性眼病的初步研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 单纯疱疹病毒性眼病的发病机制 |
| 第二节 单纯疱疹病毒性眼病的治疗进展 |
| 第三节 单纯疱疹病毒I 型疫苗的研究进展 |
| 第四节 单纯疱疹病毒I 型糖蛋白的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 单纯疱疹病毒I 糖蛋白B 基因疫苗的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 重组质粒pgB 生物活性的体外鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 重组质粒pgB 生物活性的体内鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四节 重组质粒pgB 预防单纯疱疹病毒性眼病的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 重组质粒pgB 预防单纯疱疹病毒性角膜炎的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 重组质粒p g B 预防单纯疱疹病毒性视网膜病变（急性视网膜坏死）的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（10）pEgr-IFNγ-Endostatin双基因-放射治疗的抑瘤效应及机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1 基因治疗研究进展 |
| 1.1 基因治疗发展概述 |
| 1.2 基因治疗的研究现状 |
| 1.3 基因治疗的基因导入系统 |
| 1.4 基因治疗中有待解决的关键问题 |
| 1.5 基因治疗的应用前景 |
| 2 肿瘤基因治疗研究进展 |
| 2.1 肿瘤基因治疗概述 |
| 2.2 肿瘤的免疫基因治疗 |
| 2.3 肿瘤抗血管生成基因治疗 |
| 2.4 肿瘤的联合基因治疗 |
| 2.5 肿瘤基因-放射治疗 |
| 3 内皮抑素和γ干扰素的抗肿瘤作用 |
| 3.1 内皮抑素 |
| 3.2 γ干扰素 |
| 4 立题依据 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 主要试剂及器材 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 器材 |
| 2 仪器 |
| 3 质粒与菌种 |
| 4 细胞株 |
| 5 实验动物 |
| 6 照射条件 |
| 7 表达载体构建 |
| 7.1 转化 |
| 7.2 质粒的提取 |
| 7.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 7.4 限制性内切酶酶切反应 |
| 7.5 DNA 片段回收 |
| 7.6 连接反应 |
| 7.7 重组子的鉴定 |
| 8 目的基因的表达 |
| 8.1 转染 |
| 8.2 ELISA 检测细胞上清中IFNγ和Endostatin |
| 9 荷瘤动物模型的建立 |
| 9.1 接种及分组 |
| 9.2 肿瘤测量 |
| 10 免疫学指标检测 |
| 10.1 睥脏单细胞悬液的制备 |
| 10.2 睥细胞特异性CTL 细胞毒活性检测 |
| 10.3 睥脏NK 细胞毒活性检测 |
| 10.4 腹腔巨噬细胞(Mφ)TNF-α的诱生及活性检测 |
| 11 肿瘤胞浆蛋白的提取 |
| 12 免疫组织化学染色检测肿瘤间质微血管密度 |
| 12.1 载玻片的处理 |
| 12.2 石蜡切片、HE 染色 |
| 12.3 免疫组织化学染色 |
| 13 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 重组质粒的构建 |
| 1.1 重组单基因表达质粒pEgr-Endostatin 的构建 |
| 1.2 重组单基因表达质粒pEgr-IFNγ的构建 |
| 1.3 重组双基因共表达质粒pEgr-IFNγ-Endostatin 的构建 |
| 2 重组双基因共表达质粒PEGR-IFNγ-ENDOSTATIN在体外培养的LEWIS肺癌细胞中的辐射诱导表达 |
| 2.1 不同剂量X 射线照射重组质粒转染的Lewis 肺癌细胞上清中IFNγ和Endostatin 表达水平变化 |
| 2.2 2Gy X射线照射重组质粒转染的Lewis肺癌细胞上清中IFNγ和Endostatin表达时程变化 |
| 3 IFNγ和ENDOSTATIN 双基因-放射治疗的体内抑瘤效应探讨 |
| 3.1 单次双基因-放射治疗的体内抑瘤作用 |
| 3.2 多次双基因-放射治疗的体内抑瘤作用 |
| 4 IFNγ和ENDOSTATIN 双基因-放射治疗的抑瘤效应机制探讨 |
| 4.1 双基因-放射治疗抑瘤效应免疫学机制 |
| 4.2 基因-放射治疗后瘤内IFNγ和Endostatin 的表达 |
| 4.3 免疫组化法检测基因-放射治疗后肿瘤间质微血管密度 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、高聚生、干扰素-α-2b对不同膀胱癌细胞株量效关系及MHC-I、II类抗原表达影响的实验研究（论文参考文献）
- [1]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用及机制研究[D]. 李敏. 吉林大学, 2021
- [2]榄香烯乳注射液治疗恶性浆膜腔积液临床研究的系统评价[D]. 张芷毓（Chang Chihyu）. 南京中医药大学, 2013(05)
- [3]重组hIFN-α-2b-BCG对hPBMC的TLR4信号通路的调节及其在肿瘤免疫治疗中作用机制的研究[D]. 杨雄. 天津医科大学, 2011(03)
- [4]CD40信号调控胃癌免疫编辑的作用及机制[D]. 李锐. 苏州大学, 2011(06)
- [5]选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤作用的体外实验研究和临床初步研究[D]. 兰卫华. 第三军医大学, 2007(03)
- [6]IFN-α2b及IL-2对不同膀胱癌细胞株生长及HLA-DR抗原表达影响的实验研究[D]. 朱浩波. 天津医科大学, 2007(06)
- [7]非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究[D]. 徐银祥. 第三军医大学, 2007(03)
- [8]腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究[D]. 杨静悦. 第四军医大学, 2007(04)
- [9]HSV-1糖蛋白B基因疫苗的构建及其预防单纯疱疹病毒性眼病的初步研究[D]. 孟祥俊. 吉林大学, 2007(03)
- [10]pEgr-IFNγ-Endostatin双基因-放射治疗的抑瘤效应及机制的研究[D]. 杨巍. 吉林大学, 2005(06)