一、不同亚型干扰素抗体对乙型肝炎病毒疗效的影响（论文文献综述）
武喆[1]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
王鑫[2]（2019）在《颗粒型免疫增强剂对病毒致死性攻毒小鼠的非特异性保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理固有免疫和适应性免疫系统是机体抵抗外部病原入侵的关键,但是固有免疫持续时间相对较短,且无特异性,而适应性免疫具有显着的特异性和相对更长的免疫持续时间。由于固有免疫和适应性免疫的上述特征,对机体进行疫苗接种可以达到预防相关病原体的作用。但是对于具有高度突变性的病原体,只要其关键表位出现了改变,就会导致适应性免疫产生的抗体失去中和能力,造成“脱靶”,从而使得这些高突变病毒的疫苗接种变得效率相对低下。这说明了适应性免疫反应的特异性对保守的病毒而言,是一个非常强大的宿主免疫系统,但是对于容易突变的病毒,适应性免疫系统只能发挥相对有限的能力。流感病毒就是其中一种具有高度突变能力的病毒。每年,世界卫生组织都要基于世界范围的流感病毒流行情况,预测并推荐流感疫苗成份,导致流感疫苗的生产成为相对繁琐而紧张的过程,甚至可能由于预测错误导致“脱靶效果”。因此,探索新型流感疫苗的预防制剂和预防手段成为非常重要且具有实际需求的工作。而相比之下,同样是引起呼吸系统疾病的呼吸道合胞病毒虽然相对突变性并不强,但是其疫苗研发经过了惨痛的经历,曾导致疫苗接种者的住院率显着上升,甚至有两名婴儿接种了疫苗后反而由于感染呼吸道合胞病毒而死亡。直到目前,世界范围内仍然没有呼吸道合胞病毒疫苗上市,也没有特效药治疗。目前呼吸道合胞病毒所带来的危害在中国并没有得到足够重视,许多人并不熟悉该病毒,甚至医院有时也会将呼吸道合胞病毒感染误诊为流感病毒感染。由于流感病毒和呼吸道合胞病毒对人类社会的危害以及相对有限的预防和治疗手段,本论文旨在研发新型的广谱预防性制剂,为流感病毒和呼吸道合胞病毒的预防提供具有潜力的储备制剂。基于这个目标,本研究通过前期的筛选,发现了一种新型预防制剂FH-001。该制剂是以世界范围内广泛应用了 80多年的铝佐剂为基础,在制备过程中添加一定比例的锌,共沉淀生成非定型的颗粒性免疫增强剂。通过使用课题组前期已经建立完善的小鼠攻毒模型发现,FH-001通过滴鼻给药后可以有效保护小鼠免受甲型流感病毒、乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒的攻毒,具有良好的预防效果和广谱性。进一步实验结果表明,FH-001滴鼻给药产生的保护效果起效比疫苗接种更快,滴鼻给药后最多三天即可在小鼠模型中产生针对乙型流感病毒100%的保护效果,而健康人接种疫苗后至少需要半个月左右时间才能起到保护效果。保护效果的持续时间分析表明,FH-001滴鼻给药后产生的保护效果可以持续至少半个月（保护效果仍为100%）。更有意思的是,FH-001滴鼻给药后也能在重症联合免疫缺陷的小鼠中产生与上述一致的预防保护效果,使其具有抵抗流感病毒致死性攻毒的能力。进一步通过分子细胞水平的机制研究以及流式质谱技术的应用,最终确定了与FH-001制剂保护效果有关的关键细胞亚群以及相关信号通路,分别是肺部驻留的肺泡巨噬细胞以及I型干扰素信号通路。这些结果综合说明:FH-001制剂在不含抗原的情况下即可激活固有免疫系统并产生具有广谱预防流感病毒和呼吸道合胞病毒攻毒的能力,这种保护效果不依赖于适应性免疫。由于FH-001制剂滴鼻给药表现出了良好的保护效果,加上其制备流程与铝佐剂一致,具有成本低、制备简单、批次间稳定性好的特点,这种“老药新用”的方式也将大幅提高该制剂的成药性,为应对新发突发的流感或呼吸道合胞病毒提供一种策略性的预防制剂储备,并有潜力进一步开发成为具有广泛应用前景的常用的流感或呼吸道合胞病毒预防性制剂;此外,除了研究固有免疫系统抵抗流感和呼吸道合胞病毒的能力,本论文在适应性免疫的激活方面,基于本实验室研发并转移给合作单位生产获批上市的第一支重组戊型肝炎病毒样颗粒疫苗,开展了与适应性免疫相关的关键表位免疫化学分析方法的应用,为戊肝疫苗上市后的生命周期管理提供更多支持。
郑燕凤[3]（2019）在《慢性乙肝肝郁脾虚与脾胃湿热证Th细胞相关因子表达差异及与H2BE基因相关性研究》文中指出目的:基于Th细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表达差异,分析慢性乙肝肝郁脾虚证和脾胃湿热证细胞免疫学差异,在此基础上,结合前期高通量筛选两证型差异表达mRNA H2BE,对该基因表达差异进行临床样本验证,并对两证型Th细胞因子差异与该基因表达差异相关性进行初步探究,为进一步证候分化与本质的分子机制研究奠定基础。方法:依据中、西医纳入标准,纳入慢性乙肝肝郁脾虚和脾胃湿热证患者共22例,同时纳入健康志愿者9例,分别采集其外周血作为研究标本,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ水平,RT-qPCR法检测各组中H2BE表达水平,采用SPSS24.0进行数据分析,基于GeneMANIA数据库构建蛋白作用网络关联图。结果:1.与健康组比较,IL-2、IL-4、INF-γ表达水平在慢性乙肝肝郁脾虚证与脾胃湿热证中均升高（P<0.05）;IL-4、IL-10、INF-γ表达水平在两证型间有显着差异（P<0.01）,IL-2表达水平在两证型间无差异（P>0.05）。2.与健康组比较,H2BE表达水平在慢性乙肝肝郁脾虚证与脾胃湿热证中均升高（P<0.05）,且两证型间存在显着差异（P<0.01）。3.H2BE、IL-2、IL-4、IL-10及相关分子间主要通过物理相互作用、共表达、共定位、信号通路相关联。结论:1.慢性乙肝肝郁脾虚证和脾胃湿热证Th细胞免疫功能有差异,两证型均存在细胞免疫抑制,肝郁脾虚证细胞免疫抑制更显着,这可能与慢性乙肝肝郁脾虚证免疫耐受状态的形成有关;IL-4、IL-10、INF-γ可能是两证型差异的免疫学依据。2.H2BE基因可能是慢性乙肝肝郁脾虚证与脾胃湿热证证型差异的生物学依据,该基因的水平变化可能与Th细胞分化有关;H2BE基因与IL-4、IL-10相关联,其中可能是以GATA3为中间节点,共同参与了相关作用途径,这一结果为后续信号通路研究提供了潜在的研究靶点。
周兵[4]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究指明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
陈国琪[5]（2008）在《《中华传染病杂志》2008年第26卷主题词索引》文中研究指明说明:①主题词索引按汉语拼音字母顺序排列;②冠有阿拉伯数字、西文字母、西文姓氏的主题词,按其后汉字的拼音排序,如汉字相同,按数字、英文字母、希文字母顺序先后排列;③缩略词及未译出的原文英文字母顺序排在各（字母）部之后;④文题、作者后括号内数字为期号,最后为起页。关键词（Key words）的主题标引是为文献检索所要求,便于一些二级情报刊物或计算机数据库储存所用,日后检索方便。编写时,可在摘要的下面选择3～7个最能从本质上表达出文献主要内容的词或词组,所选用的关键词应参照美国国立医学图书馆编辑的最新版《医学主题词表》（Medical Subject Headings,MeSH）中所列的叙词。所以,标引过程也是将文献内容主题的自然语言转换成规范化的检索语言的过程,且词与词之间的关系是逻辑组配关系,并按各类检索标识的一定顺序排列,构成完整的检索体系。但由于中文的特殊性,至今仍没有成熟的计算机技术能解决医学文献的主题分析、概念提取等问题,手工标引有不妥之外,敬请批评指正。MeSH网址http://members.shaw.ca/chenguoqi。
徐志一,李子华,蒋慧惠,刘佩莉,胡善联,李婉先,黄敬亨,周元江,俞顺章,王正伦,战师珍,来则民,王慧垣,任铁生[6]（1977）在《病毒性肝炎的进展》文中研究表明 本报告的目的是要使读者了解在肝炎研究领域内的迅速进展,特别是上次世界卫生组织会议以后的新进展。其中一个进展是术语的简化,这些术语的简化是因为直接看到了甲、乙两型肝炎病毒并考虑了其生化学、生物物理学的特性。本报告也提到了病毒性肝炎特异性诊断方面的重要进展,由于这些进展,发现了与甲、乙两型病毒无关的新型肝炎。在某些地区,这种新型肝炎是输血后
刘悦[7]（2020）在《宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切。目前抗HBV的药物主要为干扰素类药物及核苷酸类似物,虽能取得一定疗效,但由于其治愈率仍旧较低,以及各种副作用（如骨髓抑制、神经精神症状加重等）和耐药性的产生,使得大多数患者需要接受无限期的治疗。因此,进一步研究HBV感染与人体相互作用机制,寻找新的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。乙型肝炎病毒是一种具有包膜的嗜肝性病毒,是最小的通过逆转录进行复制的部分双链环状DNA病毒,基因组长度约3.2kb。在HBV病毒感染细胞过程中,其疏松的环状DNA（rc DNA）进入细胞核修复成高度稳定的共价闭合环状DNA（ccc DNA）,之后以ccc DNA为模板转录出各种HBV病毒的RNA,包括前基因组RNA（pg RNA）。HBV的包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）三种形式,在HBV的生活周期中起到重要的作用。病毒与宿主间复杂的相互作用关系,提示我们深入地研究病毒与宿主之间相互作用机制,通过机制揭示,可以为开发针对HBV的创新型药物提供更多的新的药物作用靶点。在对人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）的研究中,人们发现了人体内一系列能够拮抗HIV的宿主蛋白,称为宿主限制性因子。作为科学家们竞相研究的前沿热点科学问题,宿主限制性因子主要包括APOBEC3家族,TRIM5α,BST-2,SAMHD1,Mx2,GBP5等。宿主限制性因子能够干扰包括病毒脱衣壳、核酸进入、基因组复制、病毒粒子释放及融合等在内的病毒复制各个阶段,并且其抗病毒能力往往具有广谱性。2015年,科学家发现了一种新的限制性因子—丝氨酸整合因子5（serine incorporator 5,SERINC5）对HIV病毒感染的抑制作用。证明了HIV辅助蛋白Nef缺失的情况下,分布在细胞膜上的SERINC5会在HIV子代病毒释放过程中整合入病毒粒子包膜,使其在进入下一个靶细胞时受阻,从而降低HIV的感染性,抑制HIV病毒的复制。而Nef则通过将SERINC5限制在核周的囊泡阻止其包装入子代病毒包膜,帮助病毒逃避SERINC5的限制。鉴于宿主限制性因子抗病毒的广谱性,结合SERINC5是通过影响HIV包膜蛋白的组成结构从而降低HIV感染性的机制,那么SERINC5对其它具有包膜的病毒粒子是否具有类似影响?本研究将SERINC5应用于同样具有包膜的HBV,探讨SERINC5对HBV复制的调控作用,得出了以下实验结果及结论:1.SERINC5能够抑制HBV的分泌;本研究在Hep G2细胞中转染HBV感染性克隆质粒,同时呈剂量梯度分别共转SERINC5、SERINC3和SERINC1质粒,用ELISA方法检测上清中HBV表面抗原（HBs Ag）的含量。与对照组相比,SERINC5组细胞上清中HBV HBs Ag明显减少,而SERINC3组及SERINC1组无此现象。同时,本研究用免疫共沉淀的方法提纯上清中HBV完整病毒粒子,并使用实时定量PCR检测病毒粒子DNA水平,发现SERINC5组上清中HBV完整病毒粒子明显减少。那么,SERINC5是在HBV复制的哪一个阶段发挥了抑制作用呢?本研究使用Southern blot及Northern blot技术分别检测发现细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA的含量均未受到影响。这说明,SERINC5抑制了HBV完整病毒粒子及表面抗原的分泌。本研究同时使用RNA干扰技术,在Hep G2细胞中下调SERINC5的表达,发现上清中HBs Ag及HBV完整病毒粒子的含量均有所增加,而细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA含量均无变化。在Hep G2.2.15细胞中过表达SERINC5,得到与Hep G2细胞中相同的结果。本研究同时建立了感染体系,在Hep G2-NTCP细胞中过表达SERINC5,并用Hep AD38产生的HBV病毒进行感染,同样得到SERINC5抑制HBs Ag及HBV完整病毒粒子分泌的结果。以上结果说明,SERINC5能够抑制HBV的分泌。2.SERINC5影响HBV包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）的糖基化修饰;为了探究SERINC5抑制HBV分泌的机制,本研究考察了SERINC5对HBV各种功能蛋白的影响。发现SERINC5能够影响HBV包膜蛋白包括LHBs、MHBs、SHBs的糖基化修饰,使其糖基化形式减少,而非糖基化形式增加。3.SERINC5通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,达到抑制HBV病毒粒子分泌的作用本研究设计了HBV包膜蛋白糖基化位点突变体,发现SERINC5对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似,同时也与衣霉素对LHBs,MHBs和SHBs糖基化的抑制作用相似。根据前人研究已经指出的包膜蛋白去糖基化严重损害HBV病毒粒子的分泌,本研究又使用p HBV1.3-ENV-质粒,野生型LHBs质粒及LHBs N146A糖基位点突变质粒,设计病毒合成包装分泌实验,考察SERINC5对HBV分泌的影响。确定SERINC5是通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌这一观点。4.SERINC5与LHBs共定位在细胞的高尔基体;蛋白质糖基化修饰过程中,翻译后的蛋白质首先在内质网腔内或内质网膜被连接上糖链,随后被运送到高尔基体中,经过一系列糖基转移酶及糖苷酶继续添加糖链并对合成的糖链进行剪切等进一步修饰,最后成为成熟的糖蛋白。为了进一步探究SERINC5影响HBV包膜蛋白糖基化修饰的机制,本研究选用了免疫荧光共定位技术,分析SERINC5与LHBs在Hep G2细胞中的亚细胞定位。发现当LHBs单独存在时,其在细胞质中均匀分布,但在SERINC5存在的情况下,LHBs则与SERINC5完全定位在高尔基体中而不是内质网。并且免疫共沉淀技术证实SERINC5能够分别与LHBs、MHBs、SHBs结合。因此,本研究分析认为SERINC5影响了HBV包膜蛋白在细胞中的定位,从而影响其糖基化修饰。5.对SERINC5抑制HBV功能区进行鉴定。SERINC5属于膜蛋白,据推测具有10个跨膜螺旋结构。本研究设计了不同的SERINC5截短体、磷酸化突变体及糖基化突变体,目的是鉴定SERINC5抑制HBV分泌的功能区。实验发现SERINC5的第四至第六穿膜结构域对于其抑制HBV的功能是不可或缺的。对预测的SERINC5两处磷酸化位点S34、T333分别进行突变后,其抑制HBV的功能有轻度的减低。但由于SERINC5分别缺失34和333的两个截短体（145-461和1-311）仍保留完整的抗HBV活性,说明这两个点突变并不是通过影响磷酸化修饰来影响SERINC5抗HBV活性。另外两个SERINC5保守的糖基化位点N133和N294与其对HBV的抑制作用无关。综上所述,本研究运用病毒学、分子生物学及细胞生物学手段,证明了SERINC5对HBV分泌的抑制作用,并揭示了SERINC5通过与HBV包膜蛋白结合,改变其亚细胞定位,使其重新分布在高尔基体,从而影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,抑制HBV病毒分泌的这一机制。SERINC5是一种潜在的抗HBV内在因子,对SERINC5的深入研究可能为我们提供一条抗HBV的新途径,并对研究其他病毒起到启示作用。
马宁[8]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中提出第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
王贵强,段钟平,王福生,庄辉,李太生,郑素军,赵鸿,侯金林,贾继东,徐小元,崔富强,魏来[9]（2020）在《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》文中指出为了实现世界卫生组织提出的"2030年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁"的目标,中华医学会感染病学分会和肝病学分会于2019年组织国内有关专家,以国内外慢性乙型肝炎病毒感染的基础、临床、预防研究进展为依据,结合现阶段我国的实际情况,更新形成了《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》,为慢性乙型肝炎的预防、诊断和治疗提供重要依据。
范晶华[10]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中进行了进一步梳理[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
二、不同亚型干扰素抗体对乙型肝炎病毒疗效的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同亚型干扰素抗体对乙型肝炎病毒疗效的影响（论文提纲范文）
（1）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（2）颗粒型免疫增强剂对病毒致死性攻毒小鼠的非特异性保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.1.1 流感病毒的结构及其编码的蛋白 |
| 1.1.2 流感病毒的感染传播 |
| 1.1.3 流感病毒的进化 |
| 1.1.4 流感病毒感染的治疗 |
| 1.1.5 针对流感病毒的适应性免疫预防手段 |
| 1.1.6 针对流感病毒的固有免疫预防手段 |
| 1.2 呼吸道合胞病毒概述 |
| 1.2.1 呼吸道合胞病毒的编码蛋白 |
| 1.2.2 呼吸道合胞病毒的流行情况 |
| 1.2.3 呼吸道合胞病毒感染的预防 |
| 1.3 戊型肝炎病毒概述 |
| 1.4 本研究的背景概述 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 本研究的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究中用到的主要仪器 |
| 2.2 主要试剂及实验动物 |
| 2.2.1 流感病毒 |
| 2.2.2 呼吸道合胞病毒 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 分子及细胞生物学实验相关试剂与细胞 |
| 2.3 实验相关的培养基与缓冲液的配置 |
| 2.3.1 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.3.2 细胞培养实验相关溶液的配制 |
| 2.3.3 抗原和分子检测用溶液的配置 |
| 2.3.4 流感病毒的培养及检测相关溶液和缓冲液配置 |
| 2.4 相关实验方法流程 |
| 2.4.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.4.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.4.3 流感病毒相关实验方法 |
| 2.4.4 呼吸道合胞病毒相关实验方法 |
| 2.4.5 戊型肝炎病毒鼠单抗制备与纯化 |
| 2.4.6 酶联免疫吸附法 |
| 2.4.7 肺部支气管肺泡灌洗液抗体标记及流式检测 |
| 2.4.8 质谱流式细胞实验 |
| 2.4.9 小鼠肺部组织苏木素伊红染色 |
| 2.4.10 小鼠动物实验方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 非特异激活小鼠肺部固有免疫系统抵抗呼吸道病毒的研究 |
| 3.1.1 铝佐剂或复合佐剂滴鼻给药可快速预防致死剂量乙型流感病毒的攻毒 |
| 3.1.1.1 铝佐剂或复合佐剂的给药途径与抗流感保护效果的关系 |
| 3.1.1.2 铝佐剂或复合佐剂的保护效果具有量效关系 |
| 3.1.1.3 复合佐剂保护效果的起效时间和持续时间 |
| 3.1.1.4 铝佐剂或复合佐剂滴鼻给药组小鼠攻毒后肺部组织学分析 |
| 3.1.1.5 铝佐剂或复合佐剂滴鼻给药预防致死剂量乙型流感病毒攻毒的小结 |
| 3.1.2 复合佐剂的预防保护效果与适应性免疫的相关性研究 |
| 3.1.2.1 复合佐剂给药后和攻毒后的功能性抗体水平及各亚型抗体变化分析 |
| 3.1.2.2 复合佐剂给药后肺部支气管肺泡灌洗液中B细胞出现募集 |
| 3.1.2.3 复合佐剂给药后肺部支气管肺泡灌洗液中T细胞出现募集 |
| 3.1.2.4 复合佐剂滴鼻给药对重症免疫联合缺陷小鼠具有保护效果 |
| 3.1.2.5 复合佐剂的预防保护效果与适应性免疫的相关性研究的小结 |
| 3.1.3 复合佐剂的预防保护效果与固有免疫的相关性研究 |
| 3.1.3.1 自然杀伤细胞不是复合佐剂保护效果的关键细胞亚群 |
| 3.1.3.2 复合佐剂滴鼻后小鼠肺部单核细胞显着募集 |
| 3.1.3.3 复合佐剂滴鼻后小鼠肺泡巨噬细胞比例减少 |
| 3.1.3.4 复合佐剂滴鼻给药后的关键细胞亚群为肺泡巨噬细胞 |
| 3.1.3.5 复合佐剂的预防保护效果与固有免疫的相关性研究小结 |
| 3.1.4 复合佐剂的预防保护效果与干扰素信号通路的相关性研究 |
| 3.1.4.1 复合佐剂的预防保护效果与Ⅰ型干扰素信号通路有关 |
| 3.1.4.2 Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β的预防保护效果 |
| 3.1.4.3 复合佐剂的预防保护效果与干扰素信号通路的相关性研究小结 |
| 3.1.5 铝佐剂和复合佐剂的治疗效果研究以及预防效果广谱性研究 |
| 3.1.5.1 铝佐剂和复合佐剂的治疗效果研究 |
| 3.1.5.2 铝佐剂和复合佐剂滴鼻给药具有广谱的抗病毒预防效果 |
| 3.1.5.3 铝佐剂和复合佐剂治疗效果研究以及预防效果广谱性相关性研究小结 |
| 3.1.6 非特异激活小鼠肺部固有免疫系统抵抗呼吸道病毒的研究总结 |
| 3.2 重组疫苗刺激适应性免疫的关键表位免疫化学平台的应用 |
| 3.2.1 冷冻保存后戊肝疫苗成品抗原性不稳定 |
| 3.2.2 无添加抗生素和硫柳汞工艺生产的戊肝疫苗成品抗原性存在下降趋势 |
| 3.2.3 戊肝疫苗成品五十度热加速后相对抗原性无显着下降 |
| 3.2.4 重组疫苗刺激适应性免疫关键表位免疫化学平台应用研究小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 复合佐剂滴鼻给药后对固有免疫和适应性免疫系统的影响 |
| 4.2 非特异激活肺部固有免疫预防呼吸道相关病毒的前景与挑战 |
| 4.3 重组疫苗刺激适应性免疫关键表位免疫化学平台的重要性 |
| 4.4 本研究的局限性 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果和奖励 |
| 致谢 |
（3）慢性乙肝肝郁脾虚与脾胃湿热证Th细胞相关因子表达差异及与H2BE基因相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1.慢性乙肝中医证候研究 |
| 2.乙肝病毒免疫逃逸及持续感染机制研究 |
| 3.慢性乙肝细胞免疫相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1.病例收集 |
| 1.1 西医诊断标准 |
| 1.2 中医诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 2.ELISA检测IL-2、IL-10、IL-4、INF-γ水平 |
| 2.1 标本收集 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 实验原理 |
| 2.5 试剂准备 |
| 2.6 实验步骤 |
| 3.实时荧光定量检测 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 4.数据分析 |
| 4.1 分析方法 |
| 4.2 基线情况分析 |
| 4.3 细胞因子差异分析 |
| 4.4 H2BE组间水平差异分析 |
| 4.5 H2BE基因与各细胞因子间关联性分析 |
| 5.讨论 |
| 5.1 Th细 胞相关因子水平差异讨论 |
| 5.2 H2BE水平差异讨论 |
| 5.3 H2BE与IL-4、IL-10关联性讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件1:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（7）宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 乙型肝炎病毒包膜蛋白 |
| 1.1.3 宿主限制性因子概述 |
| 1.1.4 SERINC家族介绍及SERINC5 抗病毒作用 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 菌株及培养基 |
| 2.1.2 质粒构建与载体信息 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.1.4 抗体与siRNA |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.2 DNA的纯化回收 |
| 2.2.3 连接反应及感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 HBV病毒的制备及病毒感染 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.9 HBV核心颗粒DNA(Core particle DNA)的提取 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.12 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.13 细胞上清中HBV完整病毒粒子纯化及DNA提取 |
| 2.2.14 实时定量PCR |
| 2.2.15 Western blot及显色 |
| 2.2.16 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.17 免疫荧光共定位 |
| 2.2.18 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 SERINC5 抑制HBV的分泌 |
| 3.1.1 SERINC5 降低HBV分泌到上清中的HBsAg水平 |
| 3.1.2 SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子的分泌 |
| 3.1.3 下调SERINC5 的表达, HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌增加 |
| 3.1.4 HepG2.2.15 细胞中,SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.5 HepG2-NTCP细胞中SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.6 小结 |
| 3.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.1 SERINC5 对HBx、Core蛋白表达无影响 |
| 3.2.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.3 SERINC5 不会通过泛素蛋白酶体途径或自噬溶酶体途径影响HBV包膜蛋白表达量和糖基化修饰 |
| 3.2.4 SERINC5 不影响HIV-1 包膜蛋白Env糖基化修饰 |
| 3.2.5 SERINC1 不影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.6 小结 |
| 3.3 SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.1 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似 |
| 3.3.2 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与衣霉素对包膜蛋白糖基化的抑制作用相似 |
| 3.3.3 确认SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 SERINC5 与LHBS在细胞高尔基体共定位,并能与LHBS, MHBS和SHBS结合 |
| 3.4.1 SERINC5 与LHBs在细胞高尔基体共定位 |
| 3.4.2 SERINC5 能够分别与LHBs, MHBs和SHBs在细胞内结合 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 SERINC5 抑制HBV功能区的鉴定 |
| 3.5.1 SERINC5 截短突变体对HBV分泌的抑制 |
| 3.5.2 SERINC5 截短突变体对LHBs及MHBs蛋白糖基化修饰的影响 |
| 3.5.3 SERINC5 磷酸化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.4 SERINC5 糖基化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）（论文提纲范文）
| 一、术语 |
| 二、流行病学和预防 |
| （一）流行病学 |
| （二）预防 |
| 1. 保护易感人群： |
| 2. 管理传染源： |
| 3. 切断传播途径： |
| 三、病原学 |
| 四、自然史及发病机制 |
| （一）自然史 |
| （二）发病机制 |
| 五、实验室检查 |
| （一）HBV血清学检测 |
| （二）HBV病毒学检测 |
| 1. HBV DNA定量： |
| 2. HBV基因分型： |
| 3. 耐药突变株检测： |
| （三）HBV新型标志物检测 |
| 1抗-HBc抗体定量： |
| 2. HBV RNA定量： |
| 3. 乙型肝炎病毒核心相关抗原（hepatitis B core-related antigen,HBcrAg): |
| （四）血清生物化学检查[71] |
| 1. ALT和AST: |
| 2. 总胆红素： |
| 3. 血清白蛋白： |
| 4. 凝血酶原活动时间（prothrombin activity time, |
| 5. 血清γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase,GGT): |
| 6. 血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP): |
| 7. 甲胎蛋白及其异质体L3: |
| 8. 维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ诱导蛋白（proteininduced by vitamin K absence or antagonist-II,PIVKA-Ⅱ）： |
| 六、肝纤维化无创诊断技术 |
| （一）天冬氨酸转氨酶和血小板比率指数(aspartate aminotransferase to platelet ratio index,APRI）评分 |
| （二）肝纤维化4因子指数（fibrosis 4 score,FIB-4) |
| （三）其他指标 |
| （四）肝脏硬度值测定 |
| 七、影像学诊断 |
| （一）腹部超声检查 |
| （二）电子计算机断层扫描（computed tomography,CT) |
| （三）磁共振成像（magnetic resnane iamge,MRI) |
| 八、病理学诊断 |
| 九、临床诊断 |
| （一）慢性HBV携带状态 |
| （二）HBe Ag阳性CHB |
| （三）非活动性HBs Ag携带状态[105-106] |
| （四）HBe Ag阴性CHB |
| （五）隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virusinfection,OBI)[107] |
| （六）乙型肝炎肝硬化[108-109] |
| 十、治疗目标 |
| 十一、抗病毒治疗的适应证 |
| 十二、NAs治疗 |
| （一）NAs药物的疗效和安全性 |
| 1. 恩替卡韦（entecavir): |
| 2. 富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate,TDF): |
| 3. 富马酸丙酚替诺福韦片（tenofovir alafenamide fumarate tablets,TAF): |
| 4. 其他药物： |
| （二）NAs的选择 |
| （三）NAs耐药的预防和处理 |
| 2. 治疗中：定期检测HBV DNA定量，以便及时发现病毒学突破，并尽早给予挽救治疗（表5）。对于NAs发生 |
| （四）NAs治疗的监测 |
| 1. 治疗前相关指标基线检测： |
| 2. 密切关注患者治疗依从性问题: |
| 3. 少见或罕见不良反应的预防和处理： |
| 4. 耐药监测及处理： |
| 十三、干扰素-α治疗 |
| （一）Peg-IFN-α治疗的方案及疗效 |
| （二）Peg-IFN-α抗病毒疗效的预测因素 |
| （三）Peg-IFN-α的不良反应及其处理[6,112-113] |
| （四）Peg-IFN-α治疗的禁忌证[6,112-113] |
| 十四、其他治疗 |
| （一）抗炎、抗氧化、保肝治疗 |
| （二）抗纤维化治疗 |
| 十五、慢性HBV感染者的监测和随访管理[6,112-113] |
| （一）慢性HBV携带状态和非活动性HBs Ag携带状态患者的管理 |
| （二）抗病毒治疗过程中的监测 |
| （三）抗病毒治疗结束后的随访 |
| 十六、特殊人群抗病毒治疗的推荐意见 |
| （一）应答不佳患者 |
| （二）应用化学治疗和免疫抑制剂治疗的患者 |
| （三）妊娠相关情况处理 |
| （四）儿童患者 |
| （五）肾功能损伤患者 |
| （六）HBV和HCV合并感染患者 |
| （七）HBV和HIV合并感染患者 |
| （八）HBV相关肝衰竭患者 |
| （九）HBV相关肝细胞癌患者 |
| （十）肝移植患者 |
| 十七、尚待研究和解决的临床问题 |
（10）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
四、不同亚型干扰素抗体对乙型肝炎病毒疗效的影响（论文参考文献）
- [1]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)
- [2]颗粒型免疫增强剂对病毒致死性攻毒小鼠的非特异性保护作用及其机制研究[D]. 王鑫. 厦门大学, 2019(08)
- [3]慢性乙肝肝郁脾虚与脾胃湿热证Th细胞相关因子表达差异及与H2BE基因相关性研究[D]. 郑燕凤. 成都中医药大学, 2019(04)
- [4]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [5]《中华传染病杂志》2008年第26卷主题词索引[J]. 陈国琪. 中华传染病杂志, 2008(12)
- [6]病毒性肝炎的进展[J]. 徐志一,李子华,蒋慧惠,刘佩莉,胡善联,李婉先,黄敬亨,周元江,俞顺章,王正伦,战师珍,来则民,王慧垣,任铁生. 国外医学参考资料.流行病学传染病学分册, 1977(03)
- [7]宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究[D]. 刘悦. 吉林大学, 2020(01)
- [8]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）[J]. 王贵强,段钟平,王福生,庄辉,李太生,郑素军,赵鸿,侯金林,贾继东,徐小元,崔富强,魏来. 实用肝脏病杂志, 2020(01)
- [10]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)