一、秀丽纤杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用（论文文献综述）
吴飞[1]（2021）在《Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究》文中研究表明寄生性线虫能在动物群体中造成相当高的发病率和死亡率,其中,捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是世界范围内具有重大经济意义的小型反刍动物寄生性线虫之一,无论是在发展中国家还是发达国家其流行率均居高不下。该虫感染后引起的捻转血矛线虫病（haemonchosis）能够造成宿主生长发育障碍、生产力低下,严重时亦可导致死亡,极大地威胁了反刍动物的健康,另外,高昂的防治费用也制约了畜牧业的可持续发展。虽然,目前仍有数种广谱抗蠕虫药物单独或联合用药对捻转血矛线虫感染有较好的治疗效果,但长期过度依赖这些药物使得不同地区的捻转血矛线虫对抗蠕虫药物产生了不同程度的耐药性,这将导致可用的药物越来越少。另外,由于缺乏可投入生产的疫苗,使得目前寄生性蠕虫的防控形势极为严峻。因此,寻找新的关键药物靶位及疫苗候选基因,开发无污染、无残留的新型药物和研制安全、高效的疫苗是目前线虫病防治的重要研究方向。丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitors,SPIs）在寄生性线虫寄生阶段高表达,是其长期与宿主相互作用的进化表现,可抑制宿主丝氨酸蛋白酶从而保障自身生存需要和逃避宿主的杀伤机制。明确SPIs在寄生虫-宿主交互过程中的作用,能为寄生虫病的防治提供新的方向。本研究从课题组前期的蛋白质组学数据中筛选出一种在捻转血矛线虫L4期高表达的SPI,扩增获得了Hc-spi-i8a和Hcspi-i8b两个剪切体,并对其表达特性进行分析;通过血液凝固和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）实验研究Hc-SPI-I8A的功能;利用酵母双杂交、Co IP、GST pull-down和共定位技术筛选并验证Hc-SPI-I8A与绵羊含TSP1结构域蛋白（Ovis aries TSP1-containing protein,Oa TSP1CP）间的互作关系,初步分析Hc-SPI-I8A发挥抗凝血功能的机制;结合泛素化、p65入核和点突变等实验初步明确Hc-SPI-I8调控RACK1/IKKs/NF-κB/TNF-α通路的机制。研究结果为深入研究捻转血矛线虫抗凝血和抑制宿主免疫反应的机制奠定了坚实的理论基础和现实依据,同时也为新型疫苗和药物的研发提供了新的靶标。1.捻转血矛线虫Hc-spi-i8基因表达特性分析为分析捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i8的表达特性,本研究通过Blast获得Hc-spi-i8的CDS序列,结合信号肽与结构域预测以及同源性与进化树分析结果,推测Hc-SPI-I8可能发挥的功能;利用真核转染技术在HEK293T细胞中对其信号肽活性进行初步验证;通过荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）检测该基因在不同发育阶段虫体内的转录特征;使用免疫荧光组织化学（immunohistofluorescence,IHF）呈现Hc-SPII8在虫体中的定位。结果显示,Hc-spi-i8具有两个剪切体,分别为Hc-spi-i8a和Hc-spi-i8b,两者均有一个N端的信号肽,前者在C端还有一个与吸血性寄生虫（如钩虫）高度相似的TIL结构域;两者在捻转血矛线虫寄生阶段的转录水平均显着高于自由生活阶段,且Hc-SPI-I8主要表达于虫体肠道、性腺和皮下组织,说明Hc-SPI-I8可能具有抑制宿主血液凝固的功能,为后续实验指明了研究方向。2.Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制为明确Hc-SPI-I8抗凝血功能及其分子机制,本研究通过绵羊全血抗凝血实验验证其功能;截断表达Hc-SPI-I8蛋白,探究TIL结构域对Hc-SPI-I8抗凝血功能的重要性;通过酵母双杂交实验筛选羊全血中可能与Hc-SPI-I8存在相互作用的凝血相关因子;经过昆虫杆状病毒表达系统表达Hc-SPI-I8的互作蛋白Oa TSP1CP,并分析其在Hc-SPI-I8发挥抗凝血功能中的作用;利用c DNA末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA ends,RACE）扩增Oa TSP1CP、绵羊主要凝血因子（II、VII、X和XI）。结果显示,Hc-SPI-I8A能通过TIL结构域影响外源性和内源性途经;Hc-SPI-I8可与四种绵羊血液中的蛋白结合,其中Oa TSP1CP可能参与凝血途经且特异性结合Hc-SPI-I8A进而帮助后者干扰外源性凝血途经;RACE获得了Oa TSP1CP和绵羊凝血因子的CDS全长。综合上述结果,本研究初步解析了Hc-SPI-I8A影响外源性凝血途经的机制,为全面揭示Hc-SPI-I8A抑制血液凝固的机制奠定坚实的基础。3.Hc-SPI-I8抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制为明确Hc-SPI-I8是否能通过与Oa RACK1互作而调控NF-κB活性进而抑制TNF-α型炎症反应,本研究验证了Hc-SPI-I8、RACK1和MKRN1间的互作关系并分析RACK1与两者结合的区域;利用进化树分析和p65入核实验验证RACK1/IKKs/NF-κB通路在不同物种间的保守性;经多种实验确定Hc-SPI-I8和MKRN1对NF-κB活性的影响;明确Hc-SPI-I8和MKRN1是否通过RACK1影响NF-κB活性;经过泛素化实验确定MKRN1和Hc-SPI-I8对RACK1泛素化以及MKRN1对Hc-SPI-I8泛素化的影响,进而阐明两者及RACK1泛素化对RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应的影响。结果表明,Hc-SPII8、RACK1和MKRN1能够两两结合且RACK1结合Hc-SPI-I8和MKRN1的位置相同;RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守且Hc-SPI-I8和MKRN1能通过RACK1影响NF-κB活性;MKRN1能促进RACK1和Hc-SPI-I8泛素化,Hc-SPII8能够抑制RACK1泛素化,且两者均影响RACK1 K183和K185位点的泛素化,而这两个位点的泛素化影响了RACK1在RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应中的作用。综合上述结果表明,Hc-SPI-I8可能够通过抑制MKRN1对RACK1的泛素化进而抑制TNF-α型炎症反应,研究结果能为后续更深入探究Hc-SPI-I8抑制TNF-α型炎症反应的分子机制奠定基础。综上所述,本研究从捻转血矛线虫蛋白质组学中筛选到一种在寄生阶段显着高表达的TIL型SPI,其主要表达于肠道、性腺和皮下组织;Hc-SPI-I8A依赖TIL结构域干扰宿主外源性和内源性凝血途经且与Oa TSP1CP互作有关;MKRN1、RACK1和Hc-SPI-I8间两两互相结合且MKRN1和Hc-SPI-I8结合RACK1相同的区域,RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守,且MKRN1和Hc-SPI-I8通过作用于RACK1的两个关键泛素化位点进而影响其在RACK1/IKKs/NF-κB通路中的功能。研究结果不仅进一步揭示了捻转血矛线虫抑制宿主凝血和炎症反应的机制,也为捻转血矛线虫新型药物开发和疫苗研制提供了新的靶位点。
刘阳[2]（2020）在《捻转血矛线虫转录组和蛋白组学分析及耐IVM候选基因功能研究》文中指出捻转血矛线虫是寄生于反刍动物皱胃的一种常见胃肠道代表性线虫,给包括我国在内的大部分国家和地区造成了不可估量的经济损失。对于该类寄生虫病的防治目前主要依赖于使用伊维菌素等驱虫药物。然而,伊维菌素的反复使用和滥用造成了大范围的耐药性问题产生。寄生虫对伊维菌素类药物产生耐药性的机制十分复杂,目前还未明确。据报道耐药性的形成需要耐药基因的存在,且具有多基因性。因此,探究伊维菌素类药物的耐药机制,发掘可能的耐药基因是寄生虫耐药性研究的关键。本研究首先通过幼虫发育抑制试验、幼虫移行抑制试验和运动行为检测等寄生虫耐药性检测方法,对捻转血矛线虫分离株YC-S和WS-R进行了耐药性检测。结果显示:在幼虫发育抑制试验中,YC-S株耐伊维菌素的LD50为2.17ng/mL,小于已报道的伊维菌素LD50敏感阈值9 ng/mL,表明捻转血矛线虫YC-S株为伊维菌素敏感株;而WS-R株的伊维菌素LD50为15.28ng/mL,高于伊维菌素LD50敏感阈值,且与YC-S株的耐药比率（RR）大于7,显着高于已报道耐药株的耐药比率值（1.7）,表明捻转血矛线虫WS-R株为伊维菌素耐药株。结合幼虫移行抑制试验和运动行为检测结果,进一步证实了捻转血矛线虫分离株WS-R为伊维菌素耐药株,YC-S为伊维菌素敏感株。随后对伊维菌素作用前后,捻转血矛线虫敏感株和耐药株的转录组变化进行了研究。结果显示有39个基因在四个比较组中均被显着调控,这些基因的GO注释大多与代谢过程、催化活性和热应激等功能相关。KEGG通路分析发现这些基因被显着富集到物质和能量代谢、TCA循环、药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源物质代谢等通路,表明伊维菌素作用后,机体开启了对外源性物质的转运、代谢或外排过程。此外,研究发现,MRPs、P-gps和细胞色素P450s（CYPs）等已报到的耐药基因以及UDP-糖基转移酶（UGT）等基因也均被显着调控。在转录组学研究的基础上,进一步研究了伊维菌素作用前后捻转血矛线虫敏感株和耐药株的蛋白质组学。分析结果显示:伊维菌素作用后,敏感株有354个差异表达蛋白,耐药株有89个差异表达蛋白被显着调控;这些蛋白被注释到氧化还原、分解代谢、物质运输等功能,被富集到多种物质代谢和生物合成、ABC转运蛋白、TCA循环等通路。将蛋白质组学与转录组学关联分析发现CYPs、P-gps、unc以及glc等众多耐药基因在伊维菌素作用后的捻转血矛线虫中被显着调控。此外,敏感株在给药前后有3个基因及其相应的蛋白表达发生变化,其中1个上调,2个下调;耐药株在给药前后有1个基因及其相应的蛋白表达被下调。给药前的耐药株与给药前的敏感株相比,有10个基因及其相应的蛋白呈现相同的表达趋势,其中1个上调,9个下调。给药后的耐药株与给药后的敏感株相比,有3个基因及其相应的蛋白表达下调。对这些基因和蛋白的KEGG Pathway分析发现,显着富集到药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源物质代谢以及谷胱甘肽代谢等多种相关通路中,表明这些基因在伊维菌素与虫体的相互作用中起到一定的作用。之后,从这些差异基因和蛋白中筛选了 GST、UGT、Hsp70、TRINITYDN30265c0g1i51以及已知耐药相关基因pgp-9,作为捻转血矛线虫耐伊维菌素候选基因。最后对上述候选基因进行功能探究。首先验证了通过浸泡法来进行RNAi的可行性,进而对5个基因进行基因沉默,然后对基因沉默后幼虫的运动行为和摄食情况进行检测,结果显示Hsp70和TRINITYDN30265c0g1i51基因沉默前后幼虫对伊维菌素的敏感性无显着变化,而Pgp-9、UGT和GST基因沉默后的幼虫对伊维菌素的敏感性显着上升,表明这3个基因与捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性相关。综上所述,本研究通过几种耐药性检测方法,对捻转血矛线虫两个分离株的耐药性进行了检测。再利用高通量测序技术（转录组和蛋白质组）,研究了伊维菌素作用下,捻转血矛线虫在基因和蛋白水平上的变化。并最终通过组学关联分析及RNAi等确定GST、UGT以及pgp-9与捻转血矛线虫耐伊维菌素相关。本研究不仅为更好地理解伊维菌素与捻转血矛线虫的相互作用机制和耐药相关基因的研究提供了有用的生物学信息,也进一步为捻转血矛线虫药物靶点的预测及耐药性的鉴别诊断与防控,提供了一些有价值的数据。
单嘉男[3]（2020）在《粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析》文中研究说明线虫是后生动物中种类丰富的动物之一。由于线虫的结构简单,一些线虫已被用作神经和进化研究的模型生物,如秀丽隐杆线虫。然而,在线虫类中,有一类感染动物的线虫,又称寄生线虫,给农业生产和人类健康带来了极大的危害。据WHO报道,全球约八分之一的人感染有寄生性线虫,而粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）正是其中一种。由粪类圆线虫引起的疾病称为粪类圆线虫病,是一种广泛存在却易被忽视的热带疾病（Neglected Tropical Diseases,NTD）,主要在非洲等卫生条件落后的地区流行。到目前为止尚且没有简单快捷的诊断手段,也没有疫苗可用于预防粪类圆线虫病。虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动植物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用,有望成为新的检测和制备疫苗的靶位点。本项目首先通过分析粪类圆线虫在各个时期的转录组数据并从中筛选出假定为虾青素金属蛋白酶的蛋白,再通过与已经报道过的金属蛋白酶进行氨基酸序列比对来选定所要研究的基因,最后选定粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶Ss-ast-1作为研究对象。本项目以原核表达的方式体外重组表达了该蛋白,并对该蛋白酶的活性进行了探究,此外又通过显微注射的方法对Ss-ast-1的表达特征进行了探究。（1）选定粪类圆线虫Ss-ast-1作为目标基因由粪类圆线虫的全转录组数据中可以得到49个标注为金属蛋白酶的基因,将这些金属蛋白酶与之前在线虫中已报道过的虾青素金属蛋白酶放在一起构建进化树的方式对49个金属蛋白酶进行筛选,最终选定Ss-ast-1作为研究目标。（2）粪类圆线虫Ss-ast-1金属蛋白酶基因序列和氨基酸序列的结构分析Ss-ast-1的c DNA序列是从Wormbase Parasite上得到,其中编码区为1905bp,编码634个氨基酸。通过分析可知,前32个氨基酸为信号肽,氨基酸序列比对发现虾青素金属蛋白酶Ss-AST-1具有保守的功能结构域,比如Zine-binding、Met-turn、EGF-like domain等,同时对Ss-AST-1进行三维同源建模分析。预测的Ss-ast-1启动子的全长为468 bp,具有多种真核生物保守的启动子调控元件。（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属的转录水平和定位分析通过转录组分析发现,该基因在粪类圆线虫的各个发育阶段均有表达,在i L3期的表达水平最高。通过显微注射,可以得到荧光虫卵,该蛋白虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达。（4）原核表达粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白体外原核表达并从包涵体中纯化Ss-AST-1,纯化的蛋白一部分用于酶活性实验,一部分用于制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究首次对粪类圆线虫Ss-ast-1的基因结构和功能进行了初步研究,证明Ss-ast-1在虫卵中表达,并具有良好的免疫原性,为之后开发疫苗和新的检测手段提供了一定的理论基础。
乔一丹[4]（2020）在《耐伊维菌素捻转血矛线虫耐药性相关蛋白的分离与鉴定》文中研究指明寄生性线虫在全球范围内广泛流行,尤其是其中的捻转血矛线虫,为严重危害反刍动物的寄生性线虫之一。尽管使用驱虫药能较好地控制此类线虫,但虫体的耐药性问题却越来越不容忽视。对于虫体的耐药性问题,限于研究方法,目前仍十分缺乏系统的耐药性现状和耐药机理方面的资料。鉴于此,本研究拟以耐伊维菌素捻转血矛线虫作研究对象,在获得虫体和虫卵蛋白的基础上,对其中所含蛋白质进行Shot-gun LC MS/MS分析,以发现与耐药性相关的蛋白,具体结果如下:（1）捻转血矛线虫虫卵裂解方法的筛选先以糖盐水漂浮法获取捻转血矛线虫虫卵,再分别以酶解法、反复冻融法、强酸强碱液法以及酶解与反复冻融结合法裂解虫卵,然后在镜下观察虫卵结构和计数未裂解虫卵数,并以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证裂解效果。最终确定当1mL虫卵悬液中加入2mL几丁质酶溶液作用45min,再将虫卵悬液放入液氮中冻存30min,然后取出于50℃水浴6h,反复3次,虫卵裂解效果最好,裂解率为93%。（2）捻转血矛线虫虫体裂解方法的筛选对捻转血矛线虫三期幼虫,分别以液氮研磨法、反复冻融法、脱鞘后液氮研磨法以及脱鞘后反复冻融法裂解幼虫虫体,结果显示脱鞘后液氮研磨法为幼虫破碎的最佳方法,虫体裂解效果明显,裂解率为1 00%。（3）捻转血矛线虫虫卵与幼虫蛋白质Shotgun LC MS/MS分析由捻转血矛线虫虫卵和幼虫蛋白质Shotgun LC MS/MS分析得知,共鉴定得到蛋白质528个,其中捻转血矛线虫耐药株幼虫特有蛋白16个、敏感株幼虫特有蛋白2个和虫卵特有蛋白192个,敏感株虫卵与敏感株幼虫共同蛋白质为4个,敏感株虫卵、敏感株幼虫和耐药株幼虫共同蛋白有30个。这些蛋白主要参与虫体的蛋白水解、代谢、转录、离子输运、电子转运、分子结合、蛋白质折叠和信号转导等过程。同时,还发现4种蛋白质-肽酶C2域蛋白质、组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]和肌动蛋白与虫体的耐药性相关。（4）捻转血矛线虫体蛋白质的Western-blot分析根据Western-blot结果显示,捻转血矛线虫虫体蛋白出现特异性条带,大小在14-120KDa之间,证实了不同虫株、不同阶段虫体体内蛋白存在差异,且部分蛋白具有良好的反应性,并能够被绵羊血清所识别。上述结果的取得为捻转血矛线虫的发育、感染、免疫逃避、疫苗抗原和药物靶点的筛选及耐药机制等的研究提供了重要基础信息,也使阐明耐药性的分子背景,进而揭示耐药性产生机制更进了一步。
徐佳[5]（2020）在《旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究》文中认为旋毛虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病,在全球范围内广泛分布,对公共卫生安全造成巨大威胁。研究旋毛虫侵入相关蛋白与宿主互作机制,对于筛选抗旋毛虫药物和研制疫苗具有重要指导意义。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteases,ASPs）是多种寄生性蠕虫的毒力因子,在虫体侵入宿主、发育、免疫逃避中具有重要的作用。然而,ASPs在旋毛虫侵入宿主过程中所发挥的功能尚不明确。本研究选取了旋毛虫中两种具有天冬氨酸蛋白酶结构域的虫体蛋白（TsASP1和TsASP2）,克隆表达获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2;分析了 2种旋毛虫蛋白的生物学特性及酶活性;将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠,分析2种蛋白抗旋毛虫感染的免疫保护作用;应用RNAi技术研究2种蛋白在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）中的功能。本研究结果有助于阐明旋毛虫ASPs的生物学特性及在虫体侵入宿主IECs中的作用,可为研制相应的抗旋毛虫疫苗及药物提供理论基础。材料与方法1.寄生虫、实验动物、细胞系旋毛虫（ISS534）在本实验室经小鼠传代保存;BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心;小鼠IECs从胎鼠中分离获得;小鼠成肌细胞（C2C12）系本实验室保存。所有动物实验经郑州大学实验动物伦理委员会同意。2.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达和特性分析根据旋毛虫的全基因组信息选定两种天冬氨酸蛋白酶（TsASP1和TsASP2）,通过软件及在线工具对两个蛋白进行生物信息学分析。应用RT-PCR从旋毛虫肌幼虫中扩增出TsASP1/TsASP2基因,借助不同表达载体（pQE-80L和pMAL-c2x）原核表达并纯化获得带有His标签和MBP标签的重组蛋白,利用含His标签的重组蛋白免疫小鼠后获得多克隆血清。通过RT-PCR、Real-time PCR、Western-blot及免疫荧光对TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育时期的基因转录、蛋白表达水平及定位情况进行分析。3.rTsASP1和rTsASP2的酶活鉴定及免疫保护作用分析以血红蛋白及特异性荧光肽段为底物,检测rTsASP1及rTsASP2的蛋白水解活性。通过SDS-PAGE进一步分析具有蛋白水解活性的rTsASP2对其他天然蛋白（血清白蛋白、IgG、IgM、纤维蛋白原及胶原IV）的水解情况;分析rTsASP2抗血清和pepstatin A对rTsASP2水解活性的抑制情况;分析rTsASP2水解特异性底物的酶动力学及其在不同温度、pH及抑制剂环境下的酶催化特征。将rTsASP1及rTsASP2经皮下免疫小鼠,并设置PBS、MBP及佐剂对照组。应用ELISA对免疫后小鼠血清抗体（IgG、IgG1、IgG2a）、肠道IgA、脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）细胞的细胞因子IFN-γ和IL-4进行检测。在免疫程序结束后对小鼠进行旋毛虫攻击感染,感染后6天和35天分别计算成虫和肌幼虫虫荷及雌虫生殖力,分析免疫后小鼠产生的免疫保护类型及免疫保护效率。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的建立设计特异性TsASP1 siRNA、TsASP2 siRNA、Control siRNA,经电穿孔导入旋毛虫肌幼虫体内。通过显微镜观察带有荧光标记的siRNA导入虫体的情况。通过对RNAi作用后各组虫体中TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达水平的检测,分析RNAi基因沉默效果。以TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA互为对照,确定RNAi作用的靶特异性,建立RNAi沉默TsASP1和TsASP2的方法。5.RNAi沉默TsASP1和TsASP2基因的虫体对入侵IECs的影响通过Far-western blot、ELISA、激光共聚焦分析rTsASP1和rTsASP2与IECs间的相互结合作用;分析RNAi作用后虫体中TsASP1和TsASP2与IECs间结合效率的变化情况。建立体外虫体侵入IECs单层细胞模型,分析两种蛋白及相应抗血清对虫体侵入IECs的影响;检测RNAi作用后虫体对IECs单层细胞的侵入效率和损伤的变化情况,确定两种蛋白在虫体侵入IECs中的功能。将不同siRNA及PBS处理过的虫体经口感染小鼠:对各组小鼠的十二指肠切片进行PAS和HE染色,观察虫体侵入宿主后引起肠道病理变化;对回收的6 d成虫和35 d肌幼虫虫荷及6 d雌成虫生殖力进行分析;对不同虫期的虫体长度进行观察并测量;通过扫描电镜观察6 d成虫虫体表面形态。分析RNAi对虫体发育的影响及TsASP1和TsASP2在虫体侵入宿主过程中发挥的功能。6.统计学分析应用SPSS19.0软件对实验数据进行处理,采用的方法主要有单因素方差分析、卡方检验、线性回归等。P<0.05即为数据统计学差异。结果1.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达及鉴定生物信息学分析表明,TsASP1和TsASP2都有信号肽、无跨膜区,属于天冬氨酸蛋白酶超家族,且具有双叶型的肽链折叠结构。TsASP2具有天冬氨酸蛋白酶经典活性位点序列Asp-Thr（Ser）-Gly,位于双叶活化中心,而TsASP1的活性位点与经典序列有一些不同。通过克隆及表达成功获得重组蛋白。rTsASP1的分子量为43 kDa（His标签）、86 kDa（MBP 标签）;rTsASP2 的分子量为 42.9 kDa（His 标签）、85.9 kDa（MBP 标签）,与预测一致。TsASP1和TsASP2基因在肌幼虫（ML）、感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）和新生幼虫（NBL）阶段均有转录,其中IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低。两种蛋白在ML、IIL、AW及ML的排泄分泌抗原（ES）中被相应抗血清所识别,但在NBL中不能被识别。免疫荧光结果表明:TsASP1主要位于虫体的肌肉细胞、杆状体、雌成虫子宫内胚胎周围;TsASP2主要位于ML和IIL虫体的肌肉细胞、中肠和后肠、雌成虫子宫内胚胎周围。2.TsASP1和TsASP2的酶活性分析及免疫保护作用蛋白水解活性检测表明,rTsASP 1不能水解血红蛋白（Hemoglobin,Hb）,rTsASP2能在酸性条件下水解人、鼠和牛Hb,但不水解鸡Hb。rTsASP2水解小鼠Hb的最佳pH值为2.5,水解人和牛Hb最佳pH值为4.5,且水解鼠Hb的效率高于人和牛Hb。rTsASP2亦能水解胶原IV和人IgM。以特异性肽段为底物,测得rTsASP2在pH 2.0至6.0间均有活性,在pH 3.0、温度37℃时相对酶活最高。Pepstatin A可显着抑制rTsASP2酶活。此外,Cu2+、Fe2+可抑制酶活,Mg2+则对酶活有增强作用。通过米氏方程确定 rTsASP2 酶反应动力学:Vmax＝16.68±0.3465 nM/min,Km＝2.254±0.1878 nM。将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠:血清中特异性IgG水平显着增高,IgG1的表达水平高于IgG2a;肠道中总IgA及特异性IgA水平增高,表明蛋白免疫后诱导宿主产生了肠道粘膜免疫;脾脏和MLN细胞产生的IFN-γ和IL-4水平均升高,表明宿主产生了 Th1/Th2混合型免疫作用。免疫后对小鼠攻击感染300条旋毛虫:TsASP1和TsASP2免疫组的6 d成虫虫荷减虫率分别为49.79%（P<0.05）和54.18%（P<0.05）;TsASP1和TsASP2免疫组的35 d肌幼虫虫荷减虫率分别为50.55%（P<0.05）和54.59%（P<0.05）,表明免疫小鼠后对旋毛虫感染产生了免疫保护作用。3.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的成功建立荧光显微镜观察结果表明,siRNA成功被导入虫体。不同siRNA或PBS处理组的虫体在培养1 d或7d后死亡率无显着差异（P<0.05）,表明电转siRNA对虫体死亡率无影响。TsASP1或TsASP2 siRNA处理虫体1d后,即产生有效沉默效果,在第5 d效果最为显着:TsASP1转录水平和蛋白表达水平分别降低66.52%（P<0.05）、63.60%（P<0.05）;TsASP2转录水平和蛋白表达水平分别降低58.69%（P<0.05）、64.86%（P<0.05）。Control siRNA处理对TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达无明显影响。特异性分析显示TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA具有靶特异性。以上结果表明本研究通过RNAi对TsASP1及TsASP2沉默成功。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2对虫体发育及侵入IECs的影响分析TsASP1 siRNA处理组的虫体天冬氨酸蛋白酶活性为对照组的93.1%（P>0.05）;TsASP2 siRNA处理组为对照组的43.3%（P<0.05）。该结果证明TsASP2对虫体天冬氨酸蛋白酶活性有贡献,而TsASP1无天冬氨酸蛋白酶活性。rTsASP1和rTsASP2都能够结合IECs蛋白,且具有剂量依赖性。两种蛋白与IECs结合位置存在差异:rTsASP1结合在IECs的细胞质中;rTsASP2结合在IECs的细胞膜及部分胞质中。同时,两种蛋白免疫血清可以检测到虫体可溶蛋白中天然TsASP1和TsASP2与IECs存在结合,但经RNAi沉默后,这种结合能力显着降低。体外侵入实验显示:rTsASP1与rTsASP2均可促进虫体侵入IECs单层细胞;对应的免疫血清可抑制虫体侵入IECs细胞单层。RNAi作用后,虫体对IECs的侵入率显着降低:其中TsASP1 siRNA组侵入率降低29.45%（P<0.05）;TsASP2 siRNA组侵入率降低35.22%（P<0.05）。分析体外侵入实验后IECs细胞单层损伤情况,TsASP1 siRNA和TsASP2 siRNA处理组细胞损伤数量分别降低42.92%（P<0.05）和66.24%（P<0.05）。上述结果揭示两种蛋白在虫体侵入IECs单层细胞中发挥重要功能。Control siRNA组小鼠肠道切片呈现小肠上皮细胞水肿、结构损伤、杯状细胞增多等病理变化,而TsASP1和TsASP2基因沉默组病理变化不明显,且6 d成虫、35 d肌幼虫虫荷及NBL产出量较对照组均显着下降;TsASP1 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少16.37%（P<0.05）和11.92%（P<0.05）;TsASP2 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少20.46%（P<0.05）和24.65%（P<0.05）。扫描电镜显示Control siRNA组的6 d成虫表皮较为光滑,TsASP1和TsASP2基因沉默组的6 d成虫表皮出现一定的皱褶。以上结果表明这两种蛋白在虫体侵入宿主及虫体发育过程中发挥重要功能。结论1.通过原核表达系统成功获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2。TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育虫期均有转录,在IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低且未检测到这2种蛋白的表达。前者主要定位于虫体切片的肌细胞、杆状体、雌虫子宫内胚胎周围,而后者主要定位于肌细胞、中肠和后肠、雌虫子宫内胚胎周围。2.rTsASP2具有天冬氨酸蛋白酶活性,rTsASP1无酶活性。两种蛋白免疫小鼠后均可诱导Th1/Th2混合型免疫反应和抗旋毛虫感染的免疫保护作用,其中rTsASP2产生的免疫保护效果相对更好。3.TsASP1和TsASP2均能结合IECs并促进虫体侵入IECs;RNAi沉默后,虫体中TsASP1和TsASP2表达量显着降低,虫体对宿主IECs的侵入和虫体发育受到抑制。4.TsASP1和TsASP2均是旋毛虫侵入宿主相关蛋白,且两种蛋白均可作为抗旋毛虫疫苗的候选抗原分子。
陆明敏[6]（2018）在《捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响》文中进行了进一步梳理捻转血矛线虫是寄生于小反刍动物皱胃,以吸食宿主血液为生的寄生性胃肠道线虫。感染捻转血矛线虫可引起严重贫血、腹泻、脱水甚至是宿主的死亡。近期的研究表明寄生性胃肠道线虫可通过产生排泄分泌物（ESP）释放免疫抑制因子与宿主免疫细胞或免疫调节分子相互作用,抑制或逃避宿主的免疫应答从而保证其存活。T细胞和单核细胞均为参与宿主机体免疫应答的核心细胞,因此针对捻转血矛线虫ESP中一些对T细胞和单核细胞功能抑制分子的研究有助于揭示其调节宿主免疫反应及产生免疫逃避的具体机制。同时鉴定出的抑制分子可作为候选疫苗抗原,用于临床治疗与研究,为控制捻转血矛线虫病提供新的方法。为此,我们进行了以下研究:1捻转血矛线虫半乳糖凝集素C端与N端糖结合域与山羊PBMC结合位点的鉴定及其功能研究在之前的研究中,我们发现捻转血矛线虫半乳糖凝集素（Hco-gal-m/f）的C端和N端糖结合域（CRD）具有不同的糖结合能力。然而,在宿主与寄生虫相互作用中,Hco-gal-m/f的不同CRD是否具有不同的免疫调节功能依然未知。在本章研究中,我们发现Hco-gal-m/f的N端CRD（MNh）和C端CRD（MCh）可通过不同的受体与山羊外周血单个核细胞（PBMC）结合:跨膜蛋白63A（TMEM63A）是MNh的结合受体,而跨膜蛋白147（TMEM147）是MCh的结合受体。此外,重组C端CRD（rMCh）具有更强抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,而重组N端CRD（rMNh）在抑制PBMC分泌一氧化氮方面具有更强的生物学效应。另外,rMNh可以抑制干扰素-γ（IFN-y）的转录,但rMCh不能。以上结果有助于增强我们对寄生性线虫半乳糖凝集素及半乳糖凝集素家族生物学多样性的了解,并有助于阐明寄生虫的免疫逃避机制。2捻转血矛线虫ESP中与山羊T细胞结合蛋白的鉴定及其对T细胞功能的影响通过免疫共沉淀及质谱分析,共筛选出114种捻转血矛线虫排泄分泌蛋白及15种T细胞受体蛋白。结合GO注释及KEGG分析,对ESP参与的T细胞的调节功能进行进一步研究,发现在体外ESP能显着抑制T淋巴细胞的活力与增殖,诱导了 FasL介导的、Caspase 8及Caspase 9参与的T细胞内源性以及外源性细胞凋亡,并且通过下调细胞周期蛋白E和D及细胞周期蛋白激酶CDK4/6和CDK2的转录阻滞T细胞G1期向S期的转化。此外,ELISA检测结果显示ESP能够抑制T细胞分泌IL-2、IL-4及IFN-y,促进T细胞分泌IL-10、IL-17以及TGF-β1。以上发现为我们寻找捻转血矛线虫ESP中T细胞功能抑制分子提供了线索,同时进一步揭示了捻转血矛线虫调节宿主T细胞免疫应答的机制。3捻转血矛线虫ESP中与山羊单核细胞结合蛋白的鉴定及其对单核细胞功能的影响通过免疫共沉淀及质谱分析,共鉴定出108种能与单核细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白及33种单核细胞受体蛋白。为了进一步研究ESP对山羊单核细胞调节功能,在体外使用ESP刺激单核细胞,我们发现捻转血矛线虫ESP对单核细胞的凋亡及MHC-I类分子的表达没有显着影响,但是却能抑制单核细胞分泌一氧化氮,降低其吞噬能力,并减少其MHC-II分子的表达。此外,ELISA检测结果显示ESP能够抑制单核细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-12及-TNF-a,促进其分泌IL-10,但对IL-8的分泌没有显着影响。以上发现为我们寻找捻转血矛线虫ESP中单核细胞功能抑制分子提供了线索,同时进一步阐明了捻转血矛线虫调节宿主单核细胞免疫应答的机制。4捻转血矛线虫Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM基因的克隆表达及其对T细胞功能的影响我们选取了与T细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白:水解酶结构包含蛋白（Hc-ABHD）、糖苷水解酶蛋白（Hc-GHD）及粘附调节因子（Hc-ADRM）。分别对捻转血矛线虫Hc-ABHD基因、Hc-GHD基因及Hc-ADRM基因进行克隆表达,并获取了重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM。Western Blot分析显示3个重组蛋白均能被感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。荧光定量检测显示Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM在捻转血矛线虫的不同发育时期均有表达,Hc-ABHD以及Hc-ADRM在雄虫中表达水平最高,而Hc-GHD在三期幼虫中表达水平最高。同时,免疫共定位结果显示天然Hc-ABHD蛋白、Hc-GHD蛋白及Hc-ADRM蛋白在捻转血矛线虫成虫内均有分布。间接免疫荧测定显示rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM均能在体外与山羊T淋巴细胞结合。通过细胞功能实验,我们发现重组蛋白rHc-ABHD及rHc-ADRM均能降低T淋巴细胞的活力,可通过提高Caspase 8、Caspase 9及Caspase 3的转录诱导T淋巴细胞内源性及外源性凋亡。与此同时,重组蛋白rHc-ABHD及rHc-ADRM均能抑制T细胞增殖,rHc-ABHD可通过下调CCNE1、CCND1及CDK4/6基因的转录阻滞T细胞G1期向S期转换,而rHc-ADRM可通过下调CCNE1和CDK2基因的转录引起T细胞G1期向S期转换的阻滞。此外,重组蛋白rHc-GHD可上调T细胞的活力,促进T细胞增殖,并可通过上调CDK4/6和CDK2基因的转录促进T细胞G1期向S期转换。ELISA测定结果显示,重组蛋白rHc-ABHD刺激可抑制T细胞分泌IL-4、TGF-β1及IFN-γ,并促进IL-10的分泌;重组蛋白rHc-GHD可促进细胞因子IL-2、IL-4以及IFN-γ的分泌;重组蛋白rHc-ADRM可抑制细胞因子IL-4、IL-10及IFN-γ的分泌。结果表明,三个捻转血矛线虫重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM在不同程度上参与了宿主T细胞的免疫调节,并且T细胞功能抑制分子Hc-ABHD和Hc-ADRM可作为候选疫苗抗原,用于进一步的临床研究。5捻转血矛线虫Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD基因的克隆表达及其对单核细胞功能的影响我们选取了与单核细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白:Ras结构域包含蛋白（Hc-Rab33）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域包含蛋白（Hc-Mak1）以及液泡ATP酶（Hc-ATPD）。分别对捻转血矛线虫Hc-Rab33基因、Hc-Mak1基因及Hc-ATPD基因进行克隆表达,并获取了重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD。Western Blot结果显示rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD均能被感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。荧光定量分析显示Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD在捻转血矛线虫的不同发育时期均有表达,Hc-Rab33和Hc-ATPD在雌性成虫中表达水平最高,而Hc-Mak1在虫卵中表达水平最高。另外,免疫共定位结果显示天然Hc-Rab33、Hc-Mak 1及Hc-ATPD蛋白在捻转血矛线虫成虫内均有分布。间接免疫荧测定显示rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD均能在体外与山羊单核细胞结合。此外,我们发现rHc-Rab33能显着降低单核细胞分泌一氧化氮（NO）的水平,抑制其吞噬能力,并减少其MHC-Ⅱ类分子的表达;重组蛋白rHc-Mak1能够诱导单核细胞的凋亡;而rHc-ATPD可抑制单核细胞内NO的产生。ELISA测定结果显示,重组蛋白rHc-Rab33可抑制单核细胞分泌IL-12和TNF-α,并促进IL-10和TGF-β1分泌;重组蛋白Hc-Mak1可抑制细胞因子IL-6、IL-10以及TGF-β1分泌;而重组蛋白rHc-ATPD可促进单核细胞分泌IL-6,并抑制IL-10的分泌。以上研究结果表明,三个捻转血矛线虫重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD参与了宿主单核细胞的免疫调节,并且作为单核细胞功能抑制分子的Hc-Rab33可作为候选疫苗抗原,用于下一步研究。6捻转血矛线虫水解酶蛋白（Hc-ABHD）、粘附调节因子（Hc-ADRM）及Ras结构域包含蛋白（Hc-Rab33）抗血清免疫保护性研究我们制备了重组蛋白rHc-ABHD、rHc-ADRM及rHc-Rab33的高免山羊血清,进行免疫保护性研究。共设置5组试验组,每组5只山羊,分别为不感染并注射健康山羊血清的空白对照组、感染并注射健康山羊血清的攻虫对照组、感染并注射抗rHc-ABHD血清的实验A组、感染并注射抗rHc-ADRM血清的实验B组、感染并注射抗rHc-Rab33血清的实验C组。在攻虫前第6天和第3天分别对各试验组注射相应血清,于第0天时各攻虫试验组内山羊经口感染8000条捻转血矛线虫三期幼虫（L3）。于攻虫后的第22、24、26、28、30、32、34天采集粪便,虫卵计数。于攻虫后的第0、7、14、21、28、35天采集试验羊抗凝血与非抗凝血,抗凝血用于山羊血常规指标测定,非抗凝血用于分离血清,并检测血清中IgG1、IgA、IgE抗体及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β1、IFN-γ、TNF-α的含量。攻虫后第35天剖杀试验羊,挑取皱胃成虫,统计荷虫数。结果显示,与攻虫对照组相比,抗rHc-ABHD血清试验组虫卵排出量减少了 50.1%,荷虫数减少66.7%;抗rHc-ADRM血清试验组虫卵排出量减少了 3 7.2%,荷虫数减少44.4%;抗rHc-Rab33血清试验组虫卵排出量减少32.1%。同时,在攻虫第35天,注射抗rHc-ABHD血清试验组及抗rHc-ADRM血清试验组与攻虫对照组相比,嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞比例显着下降,更趋向空白对照组,嗜碱性粒细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积未见显着性变化。在攻虫第35天,与攻虫对照组相比,抗rHc-ABHD血清试验组、抗rHc-ADRM血清试验组及抗rHc-Rab33血清试验组血清内IgG1、IgA、IgE抗体含量未见显着性变化。此外,在攻虫第35天,抗rHc-ABHD血清试验组内IL-2、IL-4分泌水平显着高于攻虫对照组,抗rHc-ADRM血清试验组内IL-4分泌水平显着高于攻虫对照组,抗rHc-Rab33血清试验组与攻虫对照组相比未见显着性变化。以上结果显示注射抗rHc-ABHD山羊血清及抗rHc-ADRM山羊血清具有一定的抗捻转血矛线虫感染效果。
冯陈晨[7]（2017）在《斯氏副柔线虫转录组学和蛋白质组学研究及免疫相关基因鉴定》文中研究表明斯氏副柔线虫是一种寄生于反刍动物真胃的吸血性线虫,骆驼是其最适宜宿主。大量感染斯氏副柔线虫后,可导致骆驼拉稀、贫血甚至死亡,严重危害骆驼健康。在国内外,有关斯氏副柔线虫的基础理论研究,生前诊断和免疫防治研究均未见报道。本研究对骆驼斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫分别进行转录组和蛋白质组学研究,并利用荧光定量PCR方法验证转录组分析结果,同时整合分析两组学数据,揭示不同发育阶段斯氏副柔线虫生物学特征,以探明不同发育阶段虫体在mRNA和蛋白水平上的差异,发掘免疫相关分泌性基因和蛋白,最终筛选了3个斯氏副柔线虫特有分泌基因进行重组表达和免疫原性鉴定;并利用重组抗原建立了斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,为该病的免疫防治研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.通过对斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫的转绿组测序,共获得超过10GB的有效数据量,拼接组装、优化处理数据后得到54102个Unigenes,其中33816个Unigenes为差异表达基因,32006个Unigenes具有功能注释。基因时序表达中描绘出4个阶段虫体的表达模式特征,虫卵阶段主要富集在蛋白质合成功能上;第三期幼虫阶段中幼虫发育和自身免疫保护等功能基因表达明显;雄虫主要富集在精子形成和能量代谢等功能;而雌虫主要富集在参与受精和激活精子进入等功能。qPCR检测了 12个各阶段高富集基因,结果有11个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。比较转录组学研究中,对成对比较的差异表达基因进行统计,G0功能分类和KEGG代谢通路分析,推断出虫卵与第三期幼虫、第三期幼虫与成虫（coFemale/Male）、雌虫与雄虫的转录模式改变特征。预测了 1975个候选斯氏副柔线虫免疫相关分泌性基因,鉴定出多种重要的功能性分泌抗原基因。2.通过对斯氏副柔线虫第三期幼虫、雌虫和雄虫的蛋白质组学研究,共鉴定到2072个蛋白质,其中有2009（97.0%）个蛋白具有功能注释。对成虫和第三期幼虫、雌虫和雄虫比较的差异蛋白进行分析,结果表明成虫和幼虫的差异蛋白显着富集在幼虫发育、生长正调控和成虫寿命调控等功能分类中;主要参与核糖体,氧化磷酸化和丙酮酸盐代谢等通路。雌虫和雄虫的差异蛋白显着富集在生殖相关的功能分类中;主要参与细胞骨架调节、PPAR信号通路和血管平滑肌收缩等通路。筛选出197个分泌性蛋白,并对其表达情况进行了分析。3.对两组学数据中的差异基因/蛋白进行数量、表达量和功能分类比较关联分析,结果发现差异基因和差异蛋白的数量、表达量、功能分类和代谢通路调控在两组学水平上有较高的一致性。4.结合两组学预测的分泌性基因/蛋白数据,筛选出9个重要的分泌性基因作为斯氏副柔线虫免疫相关抗原的候选基因进行了克隆测序分析,并成功构建了BL21（pETSTPK）、BL21（pETCPI）和 BL21（pETCPR）三个重组表达系统。WB 检测发现重组蛋白rSTPK、rCPI和rCPR能够与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中的抗体发生特异性结合反应,具有较高的特异性和较好的免疫原性。5.以重组蛋白rSTPK、rCPI和rCPR作为抗原,成功建立了斯氏副柔线虫重组抗原rSTPK、rCPI和rCPR的iELISA诊断方法。利用建立的三个重组抗原iELISA诊断方法对81份已知阳性血清和9份已知阴性血清进行检测,发现三个重组抗原的特异性均为100%;重组抗原rSTPK、rCPI和rCPR的敏感性分别为97.5%、98.8%和96.3%,且均具有良好的重复性。通过对140份田间骆驼血清进行iELISA检测,发现建立的三个重组抗原iELISA检测方法在阳性检出率上无显着差异（P>0.05）,均可用于斯氏副柔线虫病的血清学诊断。
谢跃[8]（2016）在《大熊猫西氏贝蛔虫基因组及发育转录组测序分析研究》文中研究指明野生动物是我们珍贵的自然资源,保护野生动物是我们的共同责任。大熊猫（diiluropoddamelaaoleucaa）作为我国的国宝和野生动物保护的旗舰物种,是全球公认最濒危的物种之一。西氏贝蛔虫（Bay,lisascarisschroederi）是大熊猫体内最为常见的一种肠道寄生虫,对野生和圈养大熊猫危害严重。遗憾的是,由于基础研究的滞后,目前对于该蛔虫的致病机制、生长发育调控、寄生适应性、遗传与进化、宿主互作及免疫逃避等仍知之甚少。本研究欲通过对西氏贝蛔虫基因组及发育转录组的测序分析研究,从分子水平揭示大熊猫西氏贝蛔虫的相关科学问题,从而为当前大熊猫蛔虫病的防控提供新的研究思路及理论指导,丰富和完善大熊猫保护生物学的内容。借助第二代测序平台,本研究完成了西氏贝蛔虫全基因组草图的绘制及组分的注释,解析了西氏贝蛔虫四个重要发育时期,即虫卵期、虫卵感染期（L2）及肠道幼虫期（L5）和雌性成虫期的基因表达动态谱;通过比较基因组学,系统地分析了西氏贝蛔虫与猪蛔虫、犬弓蛔虫及其它相关线虫的基因组特征,并重构了系统发育树,确认了西氏贝蛔虫及蛔目在整个线虫纲中的进化地位;然后借助西氏贝蛔虫基因组、转录组数据,利用成熟的分泌蛋白预测流程预测了西氏贝蛔虫寄生阶段特有的分泌蛋白组,并从中鉴定得到了大量高表达且可用于疫苗和免疫诊断抗原的分子候选;最后,本研究还首次试验验证了我们在基因组、转录组及分泌组分析中所得候选疫苗分子——无机焦磷酸酶的疫苗潜在性价值。主要结果如下:1、西氏贝蛔虫基因组草图大小约为249Mb（Megabase,Mb）,测序深度为124 ×,Conti gs N50 为 135kb（kilobase,kb）,Scaffolds N50 为 666kb,最长 Scaffold 为 3900kb。整个基因组GC含量为37.7%,真核生物核心基因（core eukaryotic genes,CEG）注释率为95%。2、西氏贝蛔虫基因组重复序列约～7.6MMb),占整个基因组的3.1%,包含串联重复（tandem repeats）、散在分布重复序列（Interspersed repeats）和一些未被注释到的重复序列;整个基因组编码18,360个蛋白基因、552个tRNA、155个microRNA及其它小 RNAs,如小核 RNA（small nuclear RNA,snRNA）、信号识别颗粒 RNA（RNA component of signal-recognition particle,SRP）和核仁小 RN A（Small nucleolar RNAs,snoRNA）等。基因结构分析表明,西氏贝蛔虫无论在外显子还在内含子长度分布上,均与猪蛔虫和犬弓蛔虫的高度一致。基因结构域、基因本体论（Gene ontology,GO）及KEGG通路等注释发现,西氏贝蛔虫的基因集主要代表了一些激酶、磷酸酶、受体、转运体及离子通道等,与报道的猪蛔虫和犬弓蛔虫类似。3、西氏贝蛔虫虫卵期、虫卵感染期（L2）及肠道幼虫期（L5）和雌性成虫期的发育转录组表达动态谱揭示,在18,360个基因中,至少在一个发育时期表达的基因有13,755个,占全部基因数的74.92%;共表达基因有1],186个,占全部表达基因的81.32%;特异表达基因有2,569个,占全部表达基因的18.68%。高表达基因功能注释发现,虫卵期的表达主要涉及一些与细胞分裂、内环境酸碱平衡调节、解毒及抗菌免疫等相关的生物学过程,虫卵L2期的表达主要涉及一些与蛋白质表达调控、核糖体蛋白质合成与转运、动力蛋白合成、细胞信号感知与传导以及能量储备等相关生物学过程,肠道L5期的表达主要涉及一些与脱皮相关的胶原蛋白和皮层蛋白合成及抗菌免疫等生物学过程,雌性成虫期的表达主要涉及一些与生殖及外环境免疫防御等相关的生物学过程。4、比较基因组学揭示,西氏贝蛔虫与猪蛔虫和犬弓蛔虫享有高的基因组基因共线性和类似的家族进化等特征,从基因组层面反应了三个物种较近的亲缘关系。借助单拷贝直系同源基因所构建的系统发育树（ML）以及化石和分子证据所提供的时间点,我们证实西氏贝蛔虫与猪蛔虫亲缘关系最近,与犬弓蛔虫亲缘关系次之;在整个线虫纲内,蛔目（Ascaridida）物种与旋尾目（Spirurida）物种亲缘关系最近,与杆形目物种关系次之,与线粒体基因组分析结果完全一致;在分化时间上,首次揭示西氏贝蛔虫与猪蛔虫的分化时间约为25Myr,蛔目物种与旋尾目物种的分化时间约为236Myr,蛔目和旋尾目与杆形目的分化时间约为363Myr。5、西氏贝蛔虫分泌组包含1,639个分泌/排泄蛋白（execretory/secretory proteins,ESPs）,其中西氏贝蛔虫寄生阶段特异性高表达的ESPs有59个。为方便后续体内和体外试验验证,这些蛋白基因候选被进一步做限制长度,最终得到10个基因长度小于],500bp的西氏贝蛔虫特异的疫苗和诊断候选抗原,主要代表了天蚕素（CecropinP2）、抗菌肽（ASABF-β）、假定蛋白（Hypothetical protein）、运甲状腺素样蛋白（Transthyretin-]ike protein）和几丁质结合围食膜因子A结构域蛋白（Chitin binding Peritrophin-Adomain protein）等,它们是理想的疫苗及免疫诊断抗原分子候选。6、试验鉴定和描述了西氏贝蛔虫分泌组源疫苗候选选分子——无机焦磷酸酶（Bsc-PYP-1）。该分子隶属可溶性无机焦磷酸酶I家族（PPase family l）,其内源形式主要分布于西氏贝蛔虫雌性成虫的体壁、肠上皮、卵巢及子宫等组织和器官;同时,Bsc-PYP-1同系物蛋白也存在于人蛔虫、猪蛔虫及犬弓蛔虫体内。动物保护性试验揭示,原核表达的重组蛋白Bsc-PYP-1（rBsc-PYP-1）经弗氏完全佐剂（FCA）乳化后,皮下接种小鼠,可诱导产生Th2型免疫反应,小鼠保护率高达69.02-71.15%,存活率达80%。试验表明rBsc-PYP-1可以用作大熊猫西氏贝蛔虫病的预防性疫苗候选,并证实我们生物信息学筛选所得分泌组及其疫苗及免疫诊断抗原分子数据真实、可行。
李爽[9]（2016）在《旋毛虫表皮胶原蛋白rol-6在秀丽隐杆线虫体内的表达》文中进行了进一步梳理旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）表皮胶原蛋白构成的表皮不仅能够维持虫体的形态和运动,还能够抵抗宿主的防御系统,保护虫体免受外界伤害。随着人类对马铃薯金线虫、苍白球胞囊线虫、血吸虫等寄生虫的表皮胶原蛋白进行研究,证明了此类蛋白会引起宿主在免疫过程中最强烈的反应,是宿主免疫系统攻击的最重要抗原。T.spiralis表皮胶原蛋白在虫体刚刚蜕皮后,合成速度很快,且每一阶段的组分与结构各不相同,但是在虫体免疫应答的功能上与其他线虫的表皮胶原蛋白相似,都会引起宿主强烈的免疫反应。近年来,人们对表皮胶原蛋白的研究主要集中在马铃薯金线虫以及血吸虫,而对T.spiralis表皮胶原蛋白rol-6的研究极少,所以利用秀丽隐杆线虫（Caenorkabditis elegans,C.elegans）表达rol-6蛋白可以为筛选旋毛虫疫苗候选抗原奠定基础。本文根据NCBI中rol-6（XM003379120.）编码序列设计引物,提取T.spiralis总RNA,反转为cDNA作为模板并进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD19-T载体之后转入克隆感受态DH5α,经过PCR和Bam H1/Sal I双酶切鉴定后进行测序。结果显示克隆的序列由1023个核苷酸组成,编码340个氨基酸。利用生物信息学软件对序列结构进行分析,结果表明rol-6不仅具备表皮胶原蛋白Gly-X-Y的结构,而且具有潜在的抗原表位。本实验将rol-6编码序列克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒pGEX-rol,经PCR和双酶切鉴定后转入大肠杆菌Tans（DE3）中,以IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE电泳结果显示蛋白分子量约为61KD,其中载体中的GST标签蛋白约为26 KD,rol-6蛋白约为35 KD,结果与预期相符。利用电洗脱方法纯化重组蛋白并将其免疫小鼠制备多克隆抗体,经western blot检测,成功获得鼠抗rol-6血清。为了进一步表达rol-6的活性蛋白,实验中采用PCR方法从C.elegans基因组DNA中扩增sqt-1 5’端侧翼序列（5’-FSsqt-1）作为启动子,将5’-FSsqt-1、rol-6编码序列克隆至含有绿色荧光蛋白GFP的启动子验证载体pPD95.77,构建重组质粒pPD-FSsqt-rol-GFP,通过显微注射技术,将质粒注射到C.elegans生殖腺内并培养57 d。结果显示,启动子5’-FSsqt-1能够启动rol-6与GFP融合蛋白在C.elegans体内瞬时表达。T.spiralis与C.elegans都属于线虫,具有一定的亲缘关系,T.spiralis抗原rol-6能够在C.elegans体内表达,其选择性剪接、糖基化修饰以及构象折叠就会更加接近天然抗原,从而使抗原活性增强,且表达过程方便简单,为研制T.spiralis疫苗提供便利。
曲自刚[10]（2016）在《旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选》文中提出旋毛虫病是由旋毛虫感染引起,是一种再度肆虐流行的疾病,旋毛虫肌幼虫入侵宿主且形成适应厌氧环境的包囊,这可能是旋毛虫的正选择基因以及旋毛虫基因组与其余线虫基因组中存在差异基因而导致。正选择基因在进化中具有非同义替代率高于同义替代率的特性,可通过已存在的基因随意突变而改变基因功能,从而使寄生虫适应宿主环境,此外旋毛虫基因组与其余基因组存在差异也可能是旋毛虫适应宿主环境的另外一种机制,因此本研究分析了旋毛虫与不同的蠕虫物种之间的部分差异基因和正选择基因。半胱氨酸蛋白酶是寄生性蠕虫的重要毒力因子,可能作为一潜在抗蠕虫药物靶标和疫苗候选抗原。旋毛虫通过机械作用、酶水解来入侵宿主肌纤维,半胱氨酸蛋白酶是否在入侵中具有作用,仍属未知。组织蛋白酶F属于半胱氨酸蛋白酶家族,旋毛虫组织蛋白酶F在NCBI中初步筛选显示在旋毛虫中是多基因家族,其生物学特性未知,因此我们对旋毛虫组织蛋白酶F家族基因进行研究。本研究以旋毛虫基因组与马来丝虫、猪鞭虫、锡兰钩口线虫和秀丽隐杆线虫基因组作为对照,采用CODEML软件鉴定旋毛虫的正选择基因,结果显示鉴定出986个正选择基因,旋毛虫正选择基因可解释其对宿主厌氧环境的适应性,鉴定的正选择基因对于药物和疫苗研发具有潜在作用;采用blastn进行差异基因组研究,将旋毛虫与人类、锡兰沟口线虫、广州管圆线虫、罗阿线虫、猪蛔虫、美洲板口线虫、马来丝虫、彭亨氏线虫、犬弓首蛔虫、秀丽小杆线虫、秀丽隐杆线虫、鼠鞭虫、犬恶心丝虫、猪鞭虫、捻转血矛线虫、人鞭虫、棘球蚴、曼氏血吸虫中的半胱氨酸蛋白酶家族进行比较,结果显示组织蛋白酶F、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、肠道特异性半胱氨酸蛋白酶、二肽基肽酶在不同物种之间存在差异。成功克隆了TsCF1、TsCF2、TsCF3基因,TsCF1、TsCF2、TsCF3基因片段分别编码366 aa、496 aa和365 aa。将去除信号肽基因与pET30a表达载体连接得到重组质粒随后进行原核表达,表达获得的重组蛋白分别大小为TsCF1重组蛋白大小为45.00 kDa,TsCF2重组蛋白大小为58.29 kDa,TsCF3重组蛋白大小为43.94 kDa。将纯化的rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3免疫家兔后,获高免血清。免疫印迹实验显示TsCF1、TsCF2和TsCF3在旋毛虫肌幼虫粗抗原、排泄分泌抗原以及成虫粗抗原中均存在;免疫组化显示TsCF1定位于表皮和杆状体、TsCF2定位于生殖原基、TsCF3定位于后肠、表皮和杆状体中。抗体阻断实验显示与对照组相比,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠35天后,肌幼虫减虫率分别为54.38%、23%和48%,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠5天后TsCF1、TsCF2和TsCF3组与对照组相比成虫减虫率分别为62.5%、50.6%和55.67%,显示TsCF1、TsCF2和TsCF3对虫体生存具有显着作用,推测TsCF家族蛋白具有胚胎致死性;采用TsCF1、TsCF2、TsCF3和TsCF1、TsCF2、TsCF3混合蛋白进行免疫,在最后一次免疫后2周进行攻虫实验,与对照组相比,上述各组的减虫率分别为23.24%、21.28%、23.29%和51.72%。将rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3复性后,采用针对组织蛋白酶F的特异性底物Z-Phe-Arg-AMC研究重组TsCF1和TsCF2在pH为5.5时的酶活性实验和抑制实验,显示rTsCF1的Km为0.5091μM,Vmax为6.12 RFU/sμM,E64可强有效抑制rTsCF1活性,其IC50为135.50±16.90 nM;rTsCF2的Km为2.016μM,最大速度Vmax值为5.72 RFU/sμM,E64也可强有效抑制rTsCF2活性,其IC50值为112.50±6.16 nM;rTsCF3无酶活性。通过虚拟对接实验研究了TsCF1、TsCF2、TsCF3与E64和K11777之间的相互作用,将旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族进行虚拟对接,获得组织蛋白酶F家族与cystatin家族之间的最适结合构象,显示cystatin家族可与组织蛋白酶F家族之间进行结合,这部分解释了cystatin家族和组织蛋白酶F家族之间的抑制作用。将旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物库进行对接和虚拟筛选,每个组织蛋白酶F均获得200种化合物。采用SPRi技术对TsCF1进行筛选,结果显示TsCF1与头孢地尼、呋塞米、酮洛芬、地拉罗司、舒洛芬、曲尼斯特、坎地沙坦、缬沙坦、替米考星、盐酸倍他洛尔、阿奇霉素、盐酸奎宁二水合物、阿奇霉素二水合物可特异性结合,推测上述化合物可作为体内实验和体外实验筛选的候选药物来治疗旋毛虫病。基于上述结果表明,旋毛虫组织蛋白酶F可作为治疗旋毛虫病的潜在药物靶标。
二、秀丽纤杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、秀丽纤杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用（论文提纲范文）
（1）Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫与捻转血矛线虫病 |
| 1 捻转血矛线虫 |
| 1.1 形态特征 |
| 1.2 生活史 |
| 2 捻转血矛线虫病 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 症状与危害 |
| 2.3 诊断 |
| 2.4 预防与控制 |
| 3 本章小结 |
| 第二章 寄生性线虫与宿主相互作用 |
| 1 寄生性线虫的致病性 |
| 1.1 病理损伤 |
| 1.2 营养掠夺 |
| 1.3 免疫调节与免疫逃避 |
| 2 宿主对GINs感染的应答 |
| 2.1 固有免疫应答 |
| 2.2 获得性免疫应答 |
| 2.3 免疫应答的结果 |
| 3 本章小结 |
| 第三章 胃肠道寄生线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1 丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 2 GINs中主要的SPIs |
| 2.1 Serpin型 SPIs |
| 2.2 Kazal型 SPIs |
| 2.3 Kunitz型 SPIs |
| 2.4 α-巨球蛋白 |
| 2.5 TIL型 SPIs |
| 3 SPIs在 GINs中的功能 |
| 3.1 调控自身丝氨酸蛋白酶活性 |
| 3.2 调控宿主丝氨酸蛋白酶 |
| 4 本章小结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 捻转血矛线虫Hc-spi-i8 基因生物学特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-spi-i8 基因的扩增及序列分析 |
| 2.2 Hc-SPI-I8 的生物信息学分析 |
| 2.3 Hc-SPI-I8在293T细胞中的定位 |
| 2.4 原核表达与多克隆抗体制备 |
| 2.5 Hc-SPI-I8 的表达特性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-SPI-I8A具有抗凝血功能 |
| 2.2 Hc-SPI-I8A抗凝血功能是TIL依赖的 |
| 2.3 Hc-SPI-I8A互作蛋白的筛选与验证 |
| 2.4 OaTSP1CP参与了绵羊血液凝固抑制过程 |
| 2.5 OaTSP1CP及内源性途径关键凝血因子的CDS扩增 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 Hc-SPI-I8 抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-SPI-I8与Oa RACK1/Oa MKRN1 间的互作验证 |
| 2.2 RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守 |
| 2.3 Hc-SPI-I8和MKRN1 通过RACK1 影响NF-κB活性 |
| 2.4 Hc-SPI-I8和MKRN1 能影响RACK1 泛素化 |
| 2.5 RACK1 泛素化影响其功能 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附录 Ⅱ 引物序列 |
| 附录 Ⅲ 绵羊成纤维细胞OAR-L1 高效转染方法的探索 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光质粒表达鉴定 |
| 2.2 PEI、Lipo2000和CF2 转染OAR-L1 细胞的效果比较 |
| 2.3 慢病毒侵染OAR-L1 细胞的效果 |
| 2.4 储存条件和时间对慢病毒侵染效果的影响 |
| 2.5 不同方式包装慢病毒共侵染效果比较 |
| 2.6 融合Oa RACK1 对慢病毒共侵染OAR-L1 细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（2）捻转血矛线虫转录组和蛋白组学分析及耐IVM候选基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1.1 病原及其生活史 |
| 1.1.2 流行状况及分布 |
| 1.1.3 临床症状与诊断 |
| 1.1.4 治疗及防控措施 |
| 1.2 线虫耐药性研究进展 |
| 1.2.1 伊维菌素简介 |
| 1.2.2 耐药发生机制 |
| 1.2.3 耐药性检测方法 |
| 1.3 组学在寄生虫学研究中的应用 |
| 1.3.1 转录组学研究 |
| 1.3.2 蛋白组学研究 |
| 1.4 RNAi技术在寄生虫学研究中的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 研究一 捻转血矛线虫分离株耐药性检测 |
| 2.1 幼虫发育实验 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.2 幼虫移行抑制实验 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.3 幼虫运动行为检测 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 研究二 伊维菌素作用前后捻转血矛线虫分离株比较转录组学研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验虫株 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 测序样本收集 |
| 3.2.2 测序样本总RNA提取和质量检测 |
| 3.2.3 文库构建 |
| 3.2.4 测序数据质量评估 |
| 3.2.5 差异表达基因筛选 |
| 3.2.6 差异表达基因GO和KEGG富集分析 |
| 3.2.7 荧光定量PCR对RNA-seq的验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 测序结果统计评估 |
| 3.3.2 Reads污染检测结果 |
| 3.3.3 基因表达水平分析及样品间相关性检测结果 |
| 3.3.4 主成分分析结果 |
| 3.3.5 差异基因筛选结果 |
| 3.3.6 qPCR对转录组测序结果的验证 |
| 3.3.7 差异表达基因GO分析 |
| 3.3.8 差异表达基因KEGG分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 4 研究三 伊维菌素作用前后捻转血矛线虫分离株蛋白组学研究及分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验虫株 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 测序样本收集 |
| 4.2.2 样品总蛋白提取及浓度测定 |
| 4.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.2.4 蛋白酶酶解及iTRAQ标记 |
| 4.2.5 反相色谱分离及LC-MS/MS分析 |
| 4.2.6 差异表达蛋白筛选和GO、KEGG富集分析 |
| 4.2.7 蛋白质组学与转录组学关联分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 蛋白浓度测定结果 |
| 4.3.2 SDS-PAGE结果 |
| 4.3.3 主成分分析结果 |
| 4.3.4 差异表达蛋白筛选结果 |
| 4.3.5 差异表达蛋白的GO分析 |
| 4.3.6 差异表达蛋白的KEGG富集和蛋白互作网络分析 |
| 4.3.7 蛋白组学与转录组学关联分析结果 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 5 研究四 捻转血矛线虫耐IVM候选基因的功能探究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验虫株 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 捻转血矛线虫RNAi方法的建立 |
| 5.2.2 捻转血矛线虫RNAi后的运动行为检测 |
| 5.2.3 捻转血矛线虫RNAi后的移行抑制试验 |
| 5.2.4 幼虫饲喂抑制实验 |
| 5.2.5 捻转血矛线虫TRINITY_DN30265_c0_g1_i5_1等候选基因的研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 捻转血矛线虫siRNA浸泡方法的可行性分析结果 |
| 5.3.2 捻转血矛线虫RNAi后的运动行为检测结果 |
| 5.3.3 捻转血矛线虫RNAi后的移行抑制实验结果 |
| 5.3.4 幼虫饲喂抑制实验 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 讨论 |
| 5.4.2 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 粪类圆线虫简介 |
| 1.1.1 粪类圆线虫概述 |
| 1.1.2 粪类圆线虫的生活史 |
| 1.1.3 粪类圆线虫的流行病学 |
| 1.1.4 粪类圆线虫病的临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 粪类圆线虫病的诊断方法和治疗措施 |
| 1.2 .虾青素金属蛋白酶 |
| 1.2.1 金属蛋白酶概述 |
| 1.2.2 虾青素金属蛋白酶概述 |
| 1.2.3 虾青素金属蛋白酶研究进展 |
| 1.3 显微注射在寄生虫基因功能研究中的应用 |
| 2.研究目的与意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物以及实验用菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验溶液的配制 |
| 3.2.1 抗生素和培养基的制备 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要溶液 |
| 3.2.4 Western blot缓冲液 |
| 3.2.5 线虫收集用缓冲液 |
| 3.2.6 ELISA试验相关溶液 |
| 3.2.7 镍柱亲和纯化缓冲液 |
| 3.2.8 酶活实验缓冲液 |
| 3.2.9 其它缓冲液 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 粪类圆线虫的保存和各阶段虫体的收集及感染方法 |
| 3.3.2 引物的设计与合成 |
| 3.3.3 粪类圆线虫DNA的提取 |
| 3.3.4 粪类圆线虫RNA的提取 |
| 3.3.5 反转录获得粪类圆线虫cDNA的提取 |
| 3.3.6 粪类圆线虫Ss-ast-1的生物信息学分析 |
| 3.3.7 粪类圆线虫Ss-ast-1全长和截短型原核表达质粒的构建 |
| 3.3.7.1 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p ET-42b-no GST载体) |
| 3.3.7.2 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.3 Ss-ast-1 截短基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.4 PCR产物的凝胶检测 |
| 3.3.7.5 PCR产物的凝胶纯化回收 |
| 3.3.7.6 目的DNA连接p ET-42b-no GST与 p E-SUMO载体 |
| 3.3.7.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.3.7.8 连接产物的转化 |
| 3.3.7.9 菌液PCR鉴定 |
| 3.3.8 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的小量表达 |
| 3.3.9 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 3.3.10 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的大量表达 |
| 3.3.11 包涵体的溶解 |
| 3.3.12 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的纯化 |
| 3.3.13 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的复性 |
| 3.3.14 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的Western-Blot分析 |
| 3.3.15 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.16 ELISA测定多抗血清效价 |
| 3.3.17 粪类圆线虫全虫蛋白的提取 |
| 3.3.18 Western blot多克隆抗体的特异性 |
| 3.3.19 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的酶活性实验 |
| 3.3.20 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 3.3.21 粪类圆线虫的转基因实验 |
| 3.3.22 粪类圆线虫转基因后代的观察 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 选定研究基因 |
| 4.1.1 从转录组数据中筛选锌依赖性金属蛋白酶的基因 |
| 4.1.2 构建进化树选定粪类圆线虫靶基因 |
| 4.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的生物信息学分析 |
| 4.2.1 粪类圆线虫Ss-ast-1蛋白的氨基酸进化树 |
| 4.2.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的氨基酸比对分析 |
| 4.2.3 粪类圆线虫Ss-AST-1抗原性和亲水性分析 |
| 4.2.4 粪类圆线虫Ss-ast-1 基因的DNA结构分析 |
| 4.2.5 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的三维结构分析 |
| 4.3 粪类圆线虫Ss-ast-1基因在各个时期的转录水平分析 |
| 4.4 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白信号肽位置分析 |
| 4.5 原核表达质粒的构建和鉴定 |
| 4.5.1 全长蛋白原核表达质粒Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc的构建 |
| 4.5.2 全长原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-qc的构建 |
| 4.5.3 Ss-AST-1 截短型原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-jd的构建 |
| 4.6 粪类圆线虫全长和截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.1 以Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.1.1 Ss-AST-1 的诱导表达(Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc) |
| 4.6.1.2 不同浓度IPTG对全长Ss-AST-1 蛋白表达的影响 |
| 4.6.1.3 全长Ss-AST-1蛋白在包涵体和上清中的表达情况 |
| 4.6.2 .以Ss-AST-1-p E-SUMO-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.3 截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.4 蛋白的纯化 |
| 4.6.5 蛋白的复性 |
| 4.6.6 复性蛋白的Western blot分析 |
| 4.7 酶谱法检测酶活性 |
| 4.8 多克隆抗体的制备 |
| 4.8.1 ELISA测定抗血清效价 |
| 4.8.2 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.9 粪类圆线虫Ss-ast-1的基因定位 |
| 4.9.1 粪类圆线虫Ss-ast-1基因启动子序列分析 |
| 4.9.2 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 4.9.3 粪类圆线虫Ss-ast-1在虫卵中的表达模式 |
| 5.讨论 |
| 5.1 粪类圆线虫Ss-AST-1的一级结构和三维结构分析 |
| 5.2 粪类圆线虫Ss-AST-1的原核蛋白的表达和纯化 |
| 5.3 粪类圆线虫Ss-AST-1的酶活性的分析 |
| 5.4 粪类圆线虫Ss-ast-1的转录水平的分析 |
| 5.5 粪类圆线虫Ss-AST-1的定位分析 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（4）耐伊维菌素捻转血矛线虫耐药性相关蛋白的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 家畜线虫病概述 |
| 1.2 捻转血矛线虫概述 |
| 1.2.1 捻转血矛线虫简介 |
| 1.2.2 捻转血矛线虫的形态 |
| 1.2.3 捻转血矛线虫的生活史 |
| 1.2.4 捻转血矛线虫流行病学概况 |
| 1.2.5 捻转血矛线虫的防控现状 |
| 1.3 捻转血矛线虫的检测相关研究 |
| 1.4 捻转血矛线虫耐药性相关研究 |
| 1.5 几丁质酶 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 研究一 捻转血矛线虫虫卵裂解方法研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 虫卵裂解法优化结果 |
| 2.2.2 捻转血矛线虫虫卵蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 2.3.1 讨论 |
| 2.3.2 小结 |
| 3 研究二 捻转血矛线虫三期幼虫裂解方法的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 捻转血矛线虫三期幼虫裂解方法筛选结果 |
| 3.2.2 捻转血矛线虫三期幼虫虫体蛋白的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 讨论 |
| 3.3.2 小结 |
| 4 研究三 捻转血矛线虫蛋白质的Shotgun LC MS/MS分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 质谱数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 质谱数据 |
| 4.2.2 蛋白质鉴定结果 |
| 4.2.3 共同蛋白鉴定结果 |
| 4.2.4 差异蛋白鉴定结果 |
| 4.2.5 GO功能注释结果 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 5 研究四捻转血矛线虫虫体蛋白的Western-blot分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 捻转血矛线虫虫体蛋白质的Western-blot结果 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 5.3.1 讨论 |
| 5.3.2 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 旋毛虫TsASP1和TsASP2的鉴定及免疫保护作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验所用的主要仪器 |
| 1.2 实验购买的主要试剂 |
| 1.3 实验主要的试剂配置 |
| 1.4 生物信息学及序列比对分析 |
| 1.5 实验动物和虫株 |
| 1.6 不同虫期旋毛虫的收集 |
| 1.7 旋毛虫虫体可溶蛋白和ES蛋白的制备 |
| 1.8 TsASP1/TsASP2重组表达质粒构建 |
| 1.9 TsASP1/TsASP2重组质粒的原核表达 |
| 1.10 免疫血清的制备 |
| 1.11 ELISA检测方法 |
| 1.12 TsASP1/TsASP2在不同虫期的转录水平鉴定 |
| 1.13 western blot分析 |
| 1.14 石蜡切片的制备 |
| 1.15 TsASP1/TsASP2在虫体上的定位分析 |
| 1.16 酶活性检测 |
| 1.17 旋毛虫不同虫期天冬氨酸蛋白酶活性分析 |
| 1.18 rTsASP1/rTsASP2免疫保护研究 |
| 1.19 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsASP1和TsASP2的生物信息学分析 |
| 2.2 重组蛋白的原核表达 |
| 2.3 TsASP1和TsASP2在各虫期的转录和表达水平 |
| 2.4 rTsASP1酶活鉴定 |
| 2.5 rTsASP2酶活鉴定 |
| 2.6 rTsASP1和rTsASP2免疫后产生的体液免疫应答 |
| 2.7 肠液IgA表达水平的检测 |
| 2.8 细胞因子水平的检测 |
| 2.9 rTsASP1和rTsASP2免疫后产生的免疫保护作用分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 旋毛虫天冬氨酸蛋白酶基因选择和序列分析 |
| 3.2 重组蛋白的表达和特征分析 |
| 3.3 天冬氨酸蛋白酶活性分析 |
| 3.4 免疫保护 |
| 4 小结 |
| 第二部分 RNAi技术分析TsASP1和TsASP2在旋毛虫侵入宿主小肠细胞中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1主要的仪器和试剂 |
| 1.2 siRNA的合成 |
| 1.3 电穿孔法导入siRNA |
| 1.4 电穿孔法siRNA引起虫体的死亡率和导入率 |
| 1.5 RNAi沉默效果分析 |
| 1.6 RNAi作用对虫体天冬氨酸蛋白酶活性及虫体蜕皮率的影响 |
| 1.7 TsASP1/TsASP2与小肠上皮细胞的结合及RNAi对其相互结合的影响 |
| 1.8 旋毛虫体外侵入实验及RNAi对虫体侵入IEC的影响 |
| 1.9 RNAi处理虫体感染小鼠后对肠道病理反应的影响 |
| 1.10 RNAi作用对虫体发育、侵入宿主能力和成虫生殖力的影响 |
| 1.11 扫描电镜观察虫体变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 siRNA导入旋毛虫虫体及对虫体死亡率的影响 |
| 2.2 RNAi对TsASP1/TsASP2 mRNA转录和蛋白表达的影响 |
| 2.3 RNAi对虫体可溶蛋白酶活性的影响 |
| 2.4 RNAi对蜕皮的影响 |
| 2.5 RNAi对TsASP1/TsASP2与IECs结合的影响 |
| 2.6 RNAi沉默TsASP1/TsASP2对虫体侵入IECs功能的影响 |
| 2.7 不同siRNA处理组虫体感染小鼠后对杯状细胞表达的影响 |
| 2.8 小肠组织HE染色 |
| 2.9 RNAi沉默TsASP1/TsASP2对虫体发育的影响 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 RNAi实验设计 |
| 3.2 RNAi对TsASP1及TsASP2沉默效果分析 |
| 3.3 RNAi沉默TsASP1和TsASP2基因对虫体发育的影响 |
| 3.4 RNAi作用对虫体侵入IECs的影响 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 天冬氨酸蛋白酶在寄生虫中的研究进展 |
| 1 天冬氨酸蛋白酶主要类型 |
| 1.1 胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶 |
| 1.2 逆转录天冬氨酸蛋白酶 |
| 2 天冬氨酸蛋白酶的结构 |
| 3 天冬氨酸蛋白酶底物肽段 |
| 4 天冬氨酸蛋白酶在寄生虫中的研究 |
| 4.1 秀丽隐杆线虫 |
| 4.2 盘尾丝虫 |
| 4.3 钩虫 |
| 4.4 血吸虫 |
| 4.5 肝吸虫 |
| 4.6 捻转血矛线虫 |
| 4.7 粪类圆线虫 |
| 4.8 斯氏线虫 |
| 4.9 疟原虫 |
| 4.10 弓形虫 |
| 4.11 阴道毛滴虫 |
| 4.12 利什曼原虫 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病 |
| 1 捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 生活史 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 致病作用、病理变化及临床症状 |
| 2.2 捻转血矛线虫病的诊断 |
| 2.3 捻转血矛线虫病的防治 |
| 2.4 捻转血矛线虫的抗药性 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 寄生性胃肠道线虫感染与免疫研究 |
| 1 寄生性胃肠道线虫病概述 |
| 2 寄生性胃肠道线虫感染与宿主免疫应答 |
| 2.1 机体检测 |
| 2.2 信号转导 |
| 2.3 机体免疫诱导 |
| 2.4 免疫排斥 |
| 2.5 机体修复 |
| 3 捻转血矛线虫感染与宿主免疫应答 |
| 3.1 三期幼虫、四期幼虫与宿主免疫应答 |
| 3.2 捻转血矛线虫成虫与宿主免疫应答 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 反刍动物胃肠道线虫免疫调节分子研究进展 |
| 1 反刍动物胃肠道线虫概述 |
| 2 胃肠道线虫调节分子 |
| 2.1 半乳糖凝集素 |
| 2.2 蛋白酶抑制剂 |
| 2.3 补体系统抑制分子 |
| 2.4 巨噬细胞迁移抑制因子 |
| 2.5 其他免疫调节性分子 |
| 3 免疫调节分子用于疫苗研究 |
| 3.1 捻转血矛线虫 |
| 3.2 背带线虫 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 捻转血矛线虫半乳糖凝集素C端与N端糖结合域与山羊PBMC结合位点的鉴定及功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pET-32a-MNh及pET-32a-MCh双酶切鉴定 |
| 2.2 重组蛋白rMNh及rMCh的纯化 |
| 2.3 rMNh及rMCh与山羊PBMC结合 |
| 2.4 MNh及MCh在山羊PBMC上受体鉴定 |
| 2.5 rMCh与rMNh对细胞增殖的作用 |
| 2.6 rMCh与rMNh对山羊PBMC一氧化氮分泌的影响 |
| 2.7 rMCh与rMNh对山羊PBMC凋亡作用 |
| 2.8 rMCh与rMNh对山羊PBMC细胞因子转录的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 捻转血矛线虫ESP中与山羊T细胞结合蛋白的鉴定及其对T细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫ESP的获取与多克隆抗体的制备 |
| 2.2 山羊T细胞的磁珠分选 |
| 2.3 捻转血矛线虫ESP与山羊T细胞的结合 |
| 2.4 捻转血矛线虫ESP与山羊T细胞体外免疫共沉淀的SDS-PAGE和Western Blot分析 |
| 2.5 LC-MS/MS鉴定与分析 |
| 2.6 GO注释与KEGG分析 |
| 2.7 ESP对T细胞活力影响 |
| 2.8 ESP对T细胞凋亡的影响 |
| 2.9 ESP对T细胞增殖的影响 |
| 2.10 ESP对T细胞周期的影响 |
| 2.11 ESP对T细胞主要分型的影响 |
| 2.12 ESP对T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 捻转血矛线虫ESP中与山羊单核细胞结合蛋白的鉴定及其对单核细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊单核细胞磁珠分选 |
| 2.2 捻转血矛线虫ESP与山羊单核细胞的结合 |
| 2.3 捻转血矛线虫ESP与山羊单核细胞体外免疫共沉淀的SDS-PAGE和Western Blot分析 |
| 2.4 LC-MS/MS鉴定与分析 |
| 2.5 GO注释与KEGG分析 |
| 2.6 ESP对单核细胞分泌一氧化氮水平影响 |
| 2.7 ESP对单核细胞吞噬能力影响 |
| 2.8 ESP对单核细胞MHC分子表达影响 |
| 2.9 ESP对单核细胞凋亡影响 |
| 2.10 ESP对单核细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 捻转血矛线虫Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM基因的克隆表达及其对T细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pET28a-HcABHD、pET-32a-HcGHD及pET-32a-HcADRM的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM的Western blot分析 |
| 2.5 捻转血矛线虫不同发育阶段Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM转录水平的变化 |
| 2.6 Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM的组织定位 |
| 2.7 重组蛋白Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM与山羊T细胞结合 |
| 2.8 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞活力影响 |
| 2.9 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞凋亡及相关信号通路的影响 |
| 2.10 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞增殖的影响 |
| 2.11 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞周期及相关通路的影响 |
| 2.12 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 捻转血矛线虫Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD基因的克隆表达及其对单核细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pET28a-HcRab33、pET28a-HcMak1及pET28a-HcATPD的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白rHc-Rb33、rHc-Mak1及rHc-ATPD的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD的Western blot分析 |
| 2.5 捻转血矛线虫不同发育阶段Hc-Rb33、Hc-Mak1及Hc-ATPD转录水平的变化 |
| 2.6 Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD的组织定位 |
| 2.7 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD与山羊单核细胞结合 |
| 2.8 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞NO分泌水平的影响 |
| 2.9 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞吞噬能力的影响 |
| 2.10 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞内MHC-11分子表达水平的影响 |
| 2.11 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞凋亡的影响 |
| 2.12 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对细胞因子分泌水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 捻转血矛线虫水解酶包含蛋白(Hc-ABHD)、粘附调节因子(Hc-ADRM)和Ras结构域包含蛋白(Hc-Rab33)抗血清免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 虫卵排出情况 |
| 2.2 成虫减少率 |
| 2.3 血常规检测 |
| 2.4 血清抗体检测 |
| 2.5 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（7）斯氏副柔线虫转录组学和蛋白质组学研究及免疫相关基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 斯氏副柔线虫概论 |
| 1.1.1 斯氏副柔线虫的分类 |
| 1.1.2 斯氏副柔线虫生物学特性 |
| 1.1.3 斯氏副柔线不同发育阶段形态学特征 |
| 1.1.4 斯氏副柔线虫病的流行病学 |
| 1.1.5 斯氏副柔线虫病对我国骆驼养殖业的影响 |
| 1.1.6 斯氏副柔线虫病的致病作用 |
| 1.1.7 斯氏副柔线虫病的诊断和防治现状 |
| 1.2 转录组学研究及其在寄生虫学研究中的应用 |
| 1.2.1 转录组学和RNA-Seq技术概述 |
| 1.2.2 转录组测序在寄生虫研究中的应用 |
| 1.3 蛋白质组学研究及在寄生虫学研究中的应用 |
| 1.3.1 蛋白质组学概述 |
| 1.3.2 蛋白质组学研究技术 |
| 1.3.3 蛋白质组学研究在寄生虫研究中的应用 |
| 1.4 寄生虫与宿主的相互作用 |
| 1.4.1 宿主对寄生虫的免疫调节 |
| 1.4.2 寄生虫的免疫逃避 |
| 1.5 寄生虫免疫相关分泌性抗原研究进展 |
| 1.5.1 寄生虫排泄分泌蛋白相关研究 |
| 1.5.2 寄生虫保护性抗原研究 |
| 1.5.3 寄生虫的免疫诊断抗原研究 |
| 1.6 本研究选题的目的与意义 |
| 2 研究一 不同发育阶段斯氏副柔线虫转录组测序分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫和成虫的收集 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斯氏副柔线虫第三期幼虫和成虫分子生物学鉴定 |
| 2.2.2 Total RNA提取及质量检测 |
| 2.2.3 cDNA文库构建及RNA-Seq测序分析 |
| 2.2.4 序列拼接及测序数据质量评估 |
| 2.2.5 测序数据De novo组装及组装效率评估 |
| 2.2.6 斯氏副柔线虫转录组数据生物信息学分析 |
| 2.2.7 虫卵、第三期幼虫、雄虫和雌虫时序基因表达分析 |
| 2.2.8 不同发育阶段斯氏副柔线虫的比较转录组学分析 |
| 2.2.9 斯氏副柔线虫免疫相关分泌性基因预测 |
| 2.2.10 荧光定量PCR鉴定转录组测序 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 第三期幼虫和成虫的分子生物学鉴定 |
| 2.3.2 Total RNA质量检测结果 |
| 2.3.3 测序数据初步结果与文库质量检测 |
| 2.3.4 De novo组装与组装效率评估结果 |
| 2.3.5 Unigenes在4个样本中表达特征概述 |
| 2.3.6 Unigenes功能注释 |
| 2.3.7 虫卵、第三期幼虫、雄虫和雌虫的时序基因分析结果 |
| 2.3.8 差异表达基因筛选 |
| 2.3.9 不同发育阶段斯氏副柔线虫差异表达基因功能分析 |
| 2.3.10 斯氏副柔线虫免疫相关基因 |
| 2.3.11 荧光定量PCR鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 研究二 斯氏副柔线虫第三期幼虫和成虫蛋白质组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 斯氏副柔线虫第三期幼虫和成虫的收集 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 iTRAQ实验原理 |
| 3.2.2 蛋白质的提取及还原烷基化的处理 |
| 3.2.3 Bradford定量及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.2.4 蛋白质酶解及iTRAQ标记 |
| 3.2.5 质谱分析 |
| 3.2.6 蛋白质数据分析 |
| 3.2.7 蛋白质定量及差异蛋白筛选 |
| 3.2.8 数据生物信息学相关分析 |
| 3.2.9 分泌蛋白筛选 |
| 3.2.10 转录组学和蛋白质组学数据比较关联分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 样本蛋白质浓度和SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.3.2 蛋白质鉴定分析 |
| 3.3.3 蛋白质功能注释 |
| 3.3.4 差异蛋白筛选 |
| 3.3.5 差异蛋白功能富集分析 |
| 3.3.6 分泌蛋白的筛选 |
| 3.3.7 转录组学和蛋白质组学数据比较关联分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 研究三 免疫相关基因PJ_STPK、PJ_CPI和PJ_CPR的原核表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 虫体样本 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要实验设备 |
| 4.1.5 主要溶液及配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫相关基因的两组学研究分析 |
| 4.2.2 Pj_STPK、Pj_CPI和Pj_CPR基因生物信息学分析 |
| 4.2.3 Total RNA提取与反转录 |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 Pj_STPK、Pj_CPI和Pj_CPR基因特异性PCR扩增 |
| 4.2.6 目的基因编码区PCR扩增及产物回收 |
| 4.2.7 Pj_STPK,Pj_CPI和Pj_CPR基因的克隆测序 |
| 4.2.8 Pj_STPK,Pj_CPI和Pj_CPR基因的表达载体构建与鉴定 |
| 4.2.9 重组表达菌的表达鉴定 |
| 4.2.10 重组表达菌的表达条件优化 |
| 4.2.11 重组蛋白表达形式的鉴定 |
| 4.2.12 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.13 Western-blot检测重组蛋白 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 免疫相关基因在两组学联合分析 |
| 4.3.2 Pj_STPK,Pj_CPI和Pj_CPR基因生物信息学分析结果 |
| 4.3.3 Pj_STPK,Pj_CPI和Pj_CPR基因特异性PCR结果 |
| 4.3.4 目的基因PCR扩增 |
| 4.3.5 重组克隆菌的鉴定结果 |
| 4.3.6 重组表达菌的鉴定结果 |
| 4.3.7 重组表达菌基因测序与分析 |
| 4.3.8 重组表达菌的表达条件优化 |
| 4.3.9 重组蛋白表达形式检测 |
| 4.3.10 重组蛋白的纯化结果 |
| 4.3.11 重组蛋白WB检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 研究四 斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验血清 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 rSTPK,rCPI和rCPR重组蛋白iELISA操作方法 |
| 5.2.2 iELISA反应条件的优化 |
| 5.2.3 判定点(cut-off value)的确定 |
| 5.2.4 重复性实验 |
| 5.2.5 敏感性实验 |
| 5.2.6 特异性实验 |
| 5.2.7 田间实验 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 iELISA反应条件优化结果 |
| 5.3.2 判定点确定结果 |
| 5.3.3 重复性分析结果 |
| 5.3.4 敏感性分析结果 |
| 5.3.5 特异性分析 |
| 5.3.6 田间实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 全文结论 |
| 7 创新点 |
| 8 进一步研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（8）大熊猫西氏贝蛔虫基因组及发育转录组测序分析研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 大熊猫西氏贝蛔虫病概述 |
| 1.1 西氏贝蛔虫生物学 |
| 1.1.1 分类与形态 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.4 致病与临床症状 |
| 1.1.5 诊治及存在的问题 |
| 1.2 西氏贝蛔虫分子生物学 |
| 1.2.1 疫苗分子研究 |
| 1.2.2 遗传进化研究 |
| 1.2.2.1 西氏贝蛔虫与同属其它蛔虫的系统进化关系 |
| 1.2.2.2 西氏贝蛔虫种群遗传关系 |
| 1.3 问题与展望 |
| 第二章 寄生虫基因组研究进展 |
| 2.1 寄生虫基因组组成及特点 |
| 2.2 寄生虫基因组测序现状 |
| 2.3 寄生虫基因组测序技术及分析方法 |
| 2.3.1 测序技术 |
| 2.3.2 序列分析 |
| 2.4 寄生性线虫基因组研究进展 |
| 2.4.1 植物寄生性线虫基因组学研究 |
| 2.4.2 动物寄生性线虫基因组学研究 |
| 2.4.3 寄生性线虫基因组研究价值 |
| 2.5 西氏贝蛔虫(四川株)基因组及发育转录组测序 |
| 2.6 本研究目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 西氏贝蛔虫基因组测序、拼接、注释及特征分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 虫体 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 文库制备与测序 |
| 3.2.2 数据质量评估与过滤 |
| 3.2.3 基因组拼接与质量评估 |
| 3.2.4 基因组注释 |
| 3.2.4.1 重复序列注释 |
| 3.2.4.2 RNA注释 |
| 3.2.4.3 编码蛋白基因注释 |
| 3.2.4.4 基因功能及通路注释 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 虫株鉴定 |
| 3.3.2 测序与数据质量评估 |
| 3.3.3 拼接与拼接质量评估 |
| 3.3.4 重复序列注释 |
| 3.3.5 非编码RNA注释 |
| 3.3.6 基因结构注释与特征分析 |
| 3.3.7 基因功能及通路注释 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 西氏贝蛔虫发育转录组分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 寄生虫样品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转录组测序 |
| 4.2.2 原始数据处理 |
| 4.2.3 饱和度分析 |
| 4.2.4 序列组装 |
| 4.2.5 基因表达量分析 |
| 4.2.6 差异表达分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 总RNA提取 |
| 4.3.2 RNA-Seq原始数据质量评估与过滤 |
| 4.3.3 饱和度分析 |
| 4.3.4 转录组de novo组装 |
| 4.3.5 有参基因组组装 |
| 4.3.6 基因表达量计算 |
| 4.3.7 差异表达基因及功能注释 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 西氏贝蛔虫比较基因组学分析 |
| 5.1 方法 |
| 5.1.1 基因组大小 |
| 5.1.2 基因组GC含量比较 |
| 5.1.3 共线性分析 |
| 5.1.4 同源基因比较分析 |
| 5.1.5 蛋白家族聚类与比较 |
| 5.1.6 线虫系统发育及分化时间 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 基因组大小评估 |
| 5.2.2 基因组GC含量比较分析 |
| 5.2.3 共线性分析 |
| 5.2.4 同源基因比较分析 |
| 5.2.5 基因家族比较 |
| 5.2.6 线虫系统发育及分化时间 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 西氏贝蛔虫分泌组及潜在疫苗和诊断抗原分子鉴定分析 |
| 6.1 方法 |
| 6.1.1 ESPs的预测与注释 |
| 6.1.2 潜在疫苗和诊断抗原分子筛选鉴定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 西氏贝蛔虫分泌组蛋白 |
| 6.2.2 分泌组蛋白的功能注释 |
| 6.2.3 分泌组蛋白的GO聚类和富集分析 |
| 6.2.4 分泌组蛋白的KAAS富集分析 |
| 6.2.5 潜在疫苗和诊断抗原分子鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 西氏贝蛔虫无机焦磷酸酶(PPase)疫苗潜在性鉴定分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 寄生虫 |
| 7.1.2 实验动物 |
| 7.1.3 试剂 |
| 7.1.4 引物合成与测序 |
| 7.1.5 菌株和质粒 |
| 7.1.6 常用缓冲溶液和培养基的配制 |
| 7.1.7 仪器设备 |
| 7.1.8 生物信息数据库及分析软件 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 RNA提取及Bsc-PYP-1基因扩增 |
| 7.2.2 DNA序列分析 |
| 7.2.3 重组蛋白rBsc-PYP-1的表达与纯化 |
| 7.2.4 免疫血清的制备 |
| 7.2.5 免疫印迹 |
| 7.2.6 内源性Bsc-PYP-1在雌性成虫虫体中的免疫定位 |
| 7.2.7 免疫保护性试验 |
| 7.2.8 ELISA检测抗体 |
| 7.2.9 脾细胞的培养与细胞因子的测定 |
| 7.2.10 数据分析 |
| 7.2.11 序列登陆 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bsc-PYP-1基因的克隆与鉴定 |
| 7.3.2 重组rBsc-PYP-1蛋白的表达、纯化与生化特征分析 |
| 7.3.3 西氏贝蛔虫内源性Bsc-PYP-1抗原及其同系物的鉴定 |
| 7.3.4 西氏贝蛔虫内源性Bsc-PYP-1在雌性成体中的定位 |
| 7.3.5 rBsc-PYP-1与不同动物免疫血清的反应原性 |
| 7.3.6 西氏贝蛔虫rBsc-PYP-1抗的疫苗免疫保护效果 |
| 7.3.7 体液免疫 |
| 7.3.8 细胞免疫 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 8.1 总体结论 |
| 8.2 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（9）旋毛虫表皮胶原蛋白rol-6在秀丽隐杆线虫体内的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫保护性抗原的分类 |
| 1.2 表皮胶原蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 表皮胶原蛋白的概述 |
| 1.2.2 表皮胶原蛋白的生物合成 |
| 1.2.3 表皮胶原蛋白的组成 |
| 1.2.4 表皮胶原蛋白的结构特征 |
| 1.2.5 旋毛虫表皮胶原蛋白的功能 |
| 1.3 秀丽隐杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用 |
| 1.3.1 秀丽隐杆线虫简介 |
| 1.3.2 秀丽隐杆线虫作为表达系统的优势 |
| 1.3.3 利用秀丽隐杆线虫表达盘尾丝状线虫蛋白 |
| 1.3.4 利用秀丽隐杆线虫表达人的马来布鲁丝虫alt相关抗原 |
| 1.3.5 利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫种和实验动物 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 主要软件及网络资源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 旋毛虫rol-6 基因的克隆和序列分析 |
| 2.2.2 重组表达质粒pGEX-rol的构建 |
| 2.2.3 pGEX-rol（DE3）的诱导表达及条件优化 |
| 2.2.4 重组蛋白纯化与Western Blot检测 |
| 2.2.5 重组蛋白多抗制备 |
| 2.2.6 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序列的克隆 |
| 2.2.7 重组表达质粒pPD-FSsqt-GFP的构建 |
| 2.2.8 重组表达质粒pPD-rol-GFP的构建 |
| 2.2.9 重组表达质粒pPD-FSsqt-rol-GFP的构建 |
| 2.2.10 秀丽隐杆线虫的显微注射及荧光观察 |
| 2.2.11 秀丽隐杆线虫表达的rol-6 蛋白Western Blot检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 旋毛虫rol-6 基因克隆结果 |
| 3.1.1 rol-6 编码序列扩增结果 |
| 3.1.2 重组克隆质粒pMD-rol的鉴定 |
| 3.1.3 rol-6 基因分析结果 |
| 3.2 重组表达质粒pGEX-rol的鉴定 |
| 3.3 诱导表达结果 |
| 3.3.1 pGEX-rol重组蛋白的表达鉴定 |
| 3.3.2 诱导pGEX-rol（DE3）时间的优化 |
| 3.3.3 诱导pGEX-rol（DE3）IPTG浓度的优化 |
| 3.3.4 诱导pGEX-rol（DE3）温度的优化 |
| 3.3.5 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.3.6 重组蛋白Western Blot检测结果 |
| 3.3.7 重组蛋白多克隆抗体的效价 |
| 3.3.8 多克隆抗体Western Blot检测 |
| 3.4 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序列的克隆 |
| 3.4.1 sqt-1 的 5'端侧翼序列的扩增 |
| 3.4.2 重组克隆质粒pMD-FSsqt的鉴定 |
| 3.4.3 sqt-1 的 5'端侧翼序列分析结果 |
| 3.5 重组表达质粒pPD-FSsqt-GFP的构建 |
| 3.6 重组表达质粒pPD-rol-GFP |
| 3.7 重组表达质粒pPD-FSsqt-rol-GFP的鉴定 |
| 3.8 秀丽隐杆线虫显微注射后的荧光观察 |
| 3.9 秀丽隐杆线虫表达的rol-6 蛋白Western Blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 旋毛虫rol-6 基因的克隆和序列分析 |
| 4.2 旋毛虫rol-6 基因的原核表达及多抗制备 |
| 4.3 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序克隆与启动活性的验证 |
| 4.4 旋毛虫rol-6 基因在秀丽隐杆线虫体内的表达 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病概述 |
| 1.2 旋毛虫的功能蛋白 |
| 1.2.1 排泄分泌产物 |
| 1.2.2 尚未揭示功能的蛋白 |
| 1.2.3 具有确定功能的旋毛虫的蛋白 |
| 1.3 寄生性蠕虫药物靶标研究进展 |
| 1.3.1 抗蠕虫药物研发的三个阶段 |
| 1.3.2 基于机理的新型抗寄生虫药物研发流程 |
| 1.3.3 已经获得成功的基于蛋白靶标筛选的抗寄生虫药物的例子 |
| 1.3.4 体外培养系统和药物筛选 |
| 1.3.5 高通量抗蠕虫药物筛选前景和挑战 |
| 第二章 旋毛虫正选择基因、旋毛虫与相关物种半胱氨酸蛋白酶差异基因及组织蛋白酶F进化研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 旋毛虫正选择基因研究材料与方法 |
| 2.1.2 旋毛虫与人类宿主及蠕虫半胱氨酸蛋白酶差异基因研究 |
| 2.1.3 组织蛋白酶F中的结构组成材料与方法 |
| 2.1.4 蠕虫组织蛋白酶F系统进化分析材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 旋毛虫正选择基因研究结果 |
| 2.2.2 旋毛虫与人类宿主及蠕虫半胱氨酸蛋白酶家族差异基因研究 |
| 2.2.3 组织蛋白酶F中的结构组成结果 |
| 2.2.4 蠕虫组织蛋白酶F系统进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 旋毛虫组织蛋白酶F家族蛋白特征研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 虫种和抗原 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 载体与菌株 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要软件和仪器 |
| 3.1.6 实验中所使用的引物 |
| 3.1.7 TsCF1、TsCF2和TsCF3表达载体构建 |
| 3.1.8 重组蛋白的原核表达以及纯化 |
| 3.1.9 TsCF1、TsCF2和TsCF3的分子对接研究 |
| 3.1.10 兔抗TsCF1、TsCF2和TsCF3重组蛋白高免血清制备和WesternBlotting反应 |
| 3.1.11 免疫定位 |
| 3.1.12 酶活性实验和抑制实验 |
| 3.1.13 抗体阻断实验 |
| 3.1.14 重组蛋白免疫保护性实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 旋毛虫TsCF1、TsCF2和TsCF3基因片段扩增 |
| 3.2.2 pET30a-TsCF1、pET30a-TsCF2和pET-30a-TsCF3重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 原核表达产物纯化 |
| 3.2.4 TsCF1、TsCF2和TsCF3蛋白分子建模 |
| 3.2.5 免疫印迹实验 |
| 3.2.6 免疫定位实验 |
| 3.2.7 酶活性实验和抑制实验 |
| 3.2.8 抗体阻断实验结果 |
| 3.2.9 免疫保护实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作及旋毛虫组织蛋白酶F的虚拟筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作 |
| 4.1.2 旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物之间虚拟筛选 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作 |
| 4.2.2 旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢物库分子对接和虚拟筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 组织蛋白酶F实际药物筛选 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验仪器和样品 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 芯片准备及SPR实时动力学分析 |
| 5.2 实验数据与结果 |
| 5.2.1 阴阳性对照信号图 |
| 5.2.2 FDA小分子样品与组织蛋白酶F样品的相互作用 |
| 5.2.3 FDA小分子样品与组织蛋白酶F1样品浓度梯度结合情况实例 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、秀丽纤杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用（论文参考文献）
- [1]Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究[D]. 吴飞. 浙江大学, 2021
- [2]捻转血矛线虫转录组和蛋白组学分析及耐IVM候选基因功能研究[D]. 刘阳. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [3]粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析[D]. 单嘉男. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]耐伊维菌素捻转血矛线虫耐药性相关蛋白的分离与鉴定[D]. 乔一丹. 内蒙古农业大学, 2020
- [5]旋毛虫天冬氨酸蛋白酶生物学特性鉴定及其在虫体侵入宿主肠上皮细胞中作用的研究[D]. 徐佳. 郑州大学, 2020(02)
- [6]捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响[D]. 陆明敏. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]斯氏副柔线虫转录组学和蛋白质组学研究及免疫相关基因鉴定[D]. 冯陈晨. 内蒙古农业大学, 2017(11)
- [8]大熊猫西氏贝蛔虫基因组及发育转录组测序分析研究[D]. 谢跃. 四川农业大学, 2016(12)
- [9]旋毛虫表皮胶原蛋白rol-6在秀丽隐杆线虫体内的表达[D]. 李爽. 东北农业大学, 2016(02)
- [10]旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选[D]. 曲自刚. 中国农业科学院, 2016(01)