一、Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺（论文文献综述）
夏媛媛[1]（2019）在《亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究》文中研究表明腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）能够催化腈在常温中性条件下与水化合形成酰胺,是替代高温强酸催化工艺实现酰胺类大宗化学品绿色制造的关键酶种。常见NHase是含?和?亚基的金属酶,酶的成熟遵循亚基自身交换机制。但酶的热稳定性和有机溶剂耐受性较差,难以满足工业化生产对酶学性质的应用要求。因此,亟需发掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依据新发现的领鞭毛虫（Monosiga brevicollis）单肽链腈水合酶的蛋白结构特点,对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668）腈水合酶进行亚基融合重构,大幅提高腈水合酶的热稳定性和产物耐受性;又研究了来源于P.putida 5B和玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶亚基融合突变体的活化机理,揭示了调控蛋白对于融合型腈水合酶的激活机制。主要研究结果如下:（1）对P.putida 5B来源的腈水合酶PpNHase进行亚基融合重构,获得了活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis单链腈水合酶的蛋白结构特点,采用亚基融合策略对PpNHase进行改造,获得了两种活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。其中共表达调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BA）P14K的比酶活比PpNHase提高了54%,而融合了调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BAP14K）的比酶活较PpNHase提高了39%,两者在50°C的半衰期分别为PpNHase的2.8倍和2倍,对烟酰胺的产物耐受性也较PpNHase有一定的提高。（2）基于半理性改造,进一步提高腈水合酶的稳定性。以NHase-（BA）P14K为出发蛋白,通过结合点突变扫描程序和分子动力学模拟手段,建立了一个高效的小型突变库,并从中筛选出三个酶活和稳定性均提高的突变体B-M150C、B-T173Y和B-S189E,其催化效率较出发蛋白提高了1.1倍、1.5倍和2.2倍,在50°C的半衰期分别较出发蛋白提高了32%、7%及107%。（3）解析了融合型腈水合酶的成熟活化机理。通过优化表达策略,获得了来源于P.putida 5B和R.rhodochrous J1的腈水合酶调控蛋白P14K及NhlE。在此基础上对腈水合酶激活机制进行了探究。用单独的调控蛋白在体外与同源的不含钴的融合型腈水合酶进行混合后,获得了活化的成熟酶;此外,用调控蛋白激活不同来源的腈水合酶,也可以实现部分激活。本结果表明,调控蛋白起着类似金属伴随子的作用,协助输送钴离子到腈水合酶中;另外,调控蛋白不仅可以激活同源腈水合酶,也能激活异源腈水合酶,但对于自身来源的腈水合酶有着更高的激活效率。（4）成功表达M.brevicollis来源的单链腈水合酶Mb NHase。以大肠杆菌作为表达宿主对Mb NHase进行了可溶性表达,并测定了其比酶活为88.4 U·mg-1。根据调控蛋白可以激活异源腈水合酶的结论,构建了MbNHase与两种调控蛋白P14K、NhlE共表达的质粒,表达纯化后酶活测定发现,比酶活分别为220.2 U·mg-1和127.0 U·mg-1,是MbNHase的2.5和1.4倍。结果表明,两种细菌来源的调控蛋白可以协助真核来源的天然融合型腈水合酶提高活性。
刘义[2]（2014）在《恶臭假单胞菌中腈水合酶钴离子摄取机制和热稳定性改造研究》文中研究指明腈水合酶（Nitrile hydratase,简写NHase, EC4.2.1.84）是一种能够催化腈类化合物水合生成相应酰胺的金属酶。目前国际上已经广泛应用第三代工业用菌玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous J1实现酰胺类物质的工业生产。此法具有选择性好，回收率高，副产物少，反应可在常温常压下进行，省去了产品提浓和丙烯腈回收等步骤的优势，使生产工艺过程得到简化。我国利用腈水合酶生产丙烯酰胺的生物技术虽然起步较晚，但发展很快。腈水合酶的广泛应用推动了其基础研究的发展。本研究室长期从事腈水合酶机理的研究，前期发现R. rhodochrous J1来源的腈水合酶金属离子摄取机理是一种称为“亚基自身交换”的新型蛋白质翻译后修饰体系。尽管如此，这种新型的蛋白质翻译后修饰体系是否具有普遍性还需要进一步探讨。然而，腈水合酶不稳定的酶学性质限制了体外研究酶分子翻译后修饰的机制，因此，提高其稳定性对进一步系统探讨酶催化的分子机制以及广泛应用于工业生产具有重要的意义。本论文以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668中腈水合酶为研究对象，系统探讨了其Co离子摄取机理，并对酶分子进行了热稳定性改造研究，主要结果如下：（1）利用N端原则在大肠杆菌中成功表达了P. putida腈水合酶调控蛋白P14K。P14K对腈水合酶的功能性表达是必要的，但在大肠杆菌中很难表达。利用N端原则，将P14K的N端的第二位Lys突变成Ala、截断N端前16个氨基酸后使新的N端第二位氨基酸是Gly、在N端融合strep标签，都能实现P14K在大肠杆菌中成功表达。此外，通过在P14K的N端融合pelB信号肽也可以提高P14K的稳定性。（2）P. putida菌中腈水合酶（α亚基àβ亚基à调控蛋白）的Co离子摄取机制遵循亚基自身交换机制。首先分离了调控蛋白复合物，发现该复合物是由P14K与腈水合酶自身α亚基形成的蛋白质三聚体α（P14K）2。设计表达了含有两种不同分子量α亚基（α和HisT7-α）的腈水合酶（HisT7-α）2β2和调控蛋白α（P14K）2，把纯化的不含Co离子的（HisT7-α）2β2与含Co离子的α（P14K）2混合4小时后发现，原来的腈水合酶（HisT7-α）2β2变成了α2β2，说明这个过程中两者的α亚基相互发生了交换。由此证明了P. putida菌中腈水合酶的Co离子摄取机制是遵循亚基自身交换机制的。本实验不仅说明新型蛋白质翻译后修饰亚基自身交换机制存在于P. putida腈水合酶中，结合本实验室以前的研究结果也说明亚基自身交换机制具有一定的普遍性。（3）P14K上C端Leu85-Ala144（C-domain）高度柔性带正电的结构特征在腈水合酶Co离子摄取的过程中具有重要作用。分子动力学模拟显示C-domain具有高度柔性的结构特征。突变该结构域氨基酸序列上保守的并与结构柔性相关的Gly86，发现腈水合酶只保留了野生酶10%的酶活。说明C-domain高度柔性的结构特征对于腈水合酶的激活有重要的作用。突变C-domain上的带正电的氨基酸为中性氨基酸导致腈水合酶失活，说明C-domain带正电的特征也同样对于腈水合酶的激活有重要的作用。同时发现这些突变体的Co离子含量很低。另外，量子化学计算结果显示腈水合酶摄取Co离子时需要克服203kcal×mol-1的能垒，结合上述实验结果和分析，我们认为C-domain高度柔性带正电的结构特征恰好就是为了克服这个能垒而辅助α亚基摄取Co离子的。（4）在腈水合酶β亚基N端融合自组装肽ELK16（SAP-NHase-2）能诱导腈水合酶形成活性包涵体。在腈水合酶β亚基C端融合ELK16（SAP-NHase-10）或是融合自组装肽EAK16（SAP-NHase-1）虽都不能诱导腈水合酶形成活性包涵体，但能提高腈水合酶的稳定性，其中SAP-NHase-1, SAP-NHase-2和SAP-NHase-10的热稳定性较原始酶分别提高了45%,30%和50%。
金利群[3]（2013）在《生物催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸的研究》文中研究表明近年来,生物催化水解腈化合物制备羧酸和酰胺引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。腈酶转化法具有反应条件温和、无污染及立体选择性好等优点,已成了诸多企业化学工艺替代的首选。2-氯烟酸由于其特殊的生物活性,作为中间体已在农药、医药和精细化学品合成中得到广泛的应用。本课题的目标是通过腈水合酶和酰胺酶双酶水解途径,发展生物催化技术在2-氯烟酸合成中的应用;利用基因工程方法构建的重组大肠杆菌分别表达单一腈水合酶和酰胺酶,研究两重组菌分别催化2-氯-3-氰基吡啶和2-氯烟酰胺为相应2-氯烟酰胺和2-氯烟酸的反应规律;建立两重组菌耦合催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸的工艺,并研究双酶共表达菌株催化制备2-氯烟酸的反应特性。论文首先根据NCBI数据库中报道的编码腈水合酶的序列设计引物,以红平红球菌Rhodococcus erythropolis ZJB-09149 基因组 DNA为模板克隆了腈水合酶基因,分析结果表明该腈水合酶αα亚基全长624 bp,编码208个氨基酸,预测分子量为22.9 KDa;β亚基全长639 bp,编码213个氨基酸,预测分子量为23.4 KDa;比对结果显示该腈水合酶氨基酸序列与NCBI中报道的Rhodococcus erythropolis SK121（ZP04388498.1）的同源性为100%;选用共表达载体pCDFduet-1,构建了含腈水合酶基因的表达质粒pCDFduet-1-NHα-NHβ并转化到大肠杆菌中,通过筛选获得表达腈水合酶的重组菌E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ,并成功检测到了腈水合酶的活性。为提高腈水合酶的催化活性,论文通过单因素实验对E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ表达腈水合酶的诱导条件进行了优化。当菌浓OD600为1.0左右时加入诱导剂IPTG浓度0.4～0.6 mM较为合适,诱导时添加Fe2+与否对产酶有较大影响;最适诱导温度为25℃,诱导时间为10～14 h,在优化条件下测得腈水合酶的活力为730 U/l,比未优化前提高了 6倍。研究了转化pH值和温度、底物浓度以及菌体密度等因素对腈水合酶催化2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酰胺的影响。结果表明,转化的最适pH为7.5,最适温度为35℃,受底物溶解度的影响较小,一次添加量可达6 mol/l,高浓度的底物和产物对水解反应有一定的抑制作用,在上述条件下,添加5 gWCW/l的菌体量,转化30 min后,2-氯烟酰胺的产率达100%。为解决酰胺酶活力不高的问题,从野生型和基因工程型菌株中筛选重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI用于催化水解2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸。对该重组菌进行诱导表达,发现诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等对酶活影响较大;通过响应面设计进一步对酰胺酶的诱导条件进行了优化,得到最佳条件为:IPTG浓度0.38 mM、诱导时间8.6 h和诱导温度22.4℃,经优化,酰胺酶活力达500.3 U/l。优化结果与实际试验结果吻合较好。分离纯化获得了电泳纯的酰胺酶,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,最适pH为7.5,最适温度为45-50℃,该酰胺酶的热稳定性好,在40和45℃下半衰期分别达16和6 h,圆二色谱分析计算得到酰胺酶的熔点温度为62.5℃;底物特异性研究表明,该酰胺酶底物作用谱广,对芳香族和部分杂环族酰胺具有较高的水解能力。通过同源建模及分子对接技术,证实酰胺酶对不同底物之间催化能力的差异主要受通道氨基酸和底物之间的相互作用影响;研究重组酰胺酶催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸的转化过程,发现当催化剂浓度为10 g WCW/l,底物浓度为60 mM,于40 ℃,pH 7.5条件下进行转化具有最高的催化效率;通过分批流加底物的操作方法,流加底物浓度到150 mM时,产率仍可达到100%;确定了E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI静息细胞具有良好的催化稳定性,当重复使用10批次后,仍保留有50%以上的酶活。论文还研究了腈水合酶产生菌E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ 和酰胺酶产生菌E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI耦合催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸反应的特性,考察了双菌质量比、底物浓度、温度和转速等对双菌反应体系的影响。结果表明,底物浓度对双菌催化反应有一定的抑制,2-氯-3-氰基吡啶浓度大于60 mM时,产物产率明显降低;当转化pH为7.5,温度为40 ℃,摇床转速200 rpm,E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ 与E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI静息细胞湿重比为1:2的情况下,有最高的转化效率。研究同步控制和两步控制双菌耦合制备2-氯烟酸的过程,发现同步控制双酶双菌耦合催化60 mM的2-氯-3-氰基吡啶,转化40 min后,产率即达到100%;若两步控制双酶双菌耦合催化,则上述底物浓度被完全水解的反应时间将不少于90 min。论文最后构建了共表达腈水合酶和酰胺酶的重组菌 E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHa-NHβ/pET-28b（+）-AMI,初步优化了该重组菌的产酶条件:当菌体浓度OD600为0.6时,加入IPTG 0.4mM,24℃下诱导10 h,总酶活为28.1 U/gWCW;当2-氯-3-氰基吡啶底物浓度为10 mM,转化温度为40℃,转化50 min后,产率可达100%。
黄伟波[4]（2011）在《一株腈水合酶产生菌发酵过程的控制及其酶学性质的研究》文中认为来源于微生物的腈水合酶（Nitrile hydratase,NHase,EC4.2.1.84）是工业生产丙烯酰胺（Acrylamide,AM）的重要生物催化剂。它催化丙烯腈（Acrylonitrile,AN）转化为AM的反应,条件温和、产率高、副产物少。随着AM的需求量不断增大,在NHase产生菌方面的研究已成为一个热点,国内外的学者在NHase产生菌的分离筛选、发酵条件优化和酶学性质等方面做了大量工作,并取得了可喜的成果。本实验通过摇瓶发酵条件的优化,初步确定了NHase摇瓶培养的最佳条件。结果表明:当培养基初始pH为7.5,葡萄糖浓度为20g/L,尿素浓度为7g/L,谷氨酸钠浓度为1g/L,促进剂浓度为1mL/L(Co2+终浓度为0.00248g/L)时,发酵得到的NHase酶活达到967.14U/mL。对诺卡氏菌（Nocardia sp.）发酵产NHase过程中菌体生长、pH变化以及葡萄糖消耗对NHase合成的影响进行了分析。根据NHase在发酵过程中的合成特性优化了在2L发酵罐中Nocardia sp.产高酶活NHase的发酵工艺条件。结果表明,在分批补糖工艺中,控制发酵液pH为6.5,使发酵液的葡萄糖浓度维持在1.5g/L～6g/L,发酵结束时,发酵液酶活达到2814.3U/mL,是优化前的8.7倍。对菌体进行超声波破壁过程中,初步探索到了最优的破壁条件为超声功率160W,工作5s,间隙5s,总时间30min,该条件下NHase比酶活达到一个最优值。利用硫酸铵沉淀技术,对从Nocardia sp.中提取出的NHase进行初步分离纯化。在经过硫酸铵沉淀后,酶的纯化倍数到达1.25倍,酶活收率达到48.1%。经过初步纯化后的酶液最适反应pH为7.0,最适反应温度为30℃。
张锦丽,王敏,钟莉萍,李晓丹[5]（2010）在《Rhodococcus ruber TCCC28001产丙烯腈水合酶过程调节及转化条件研究》文中提出对分离自土样中的产腈水合酶的菌株Rhodococcus sp.TCCC28001进行16S rDNA序列测定及系统发育分析,可鉴定为Rhodococcus ruber。通过对其培养过程中pH的调控,尿素的加入时间的研究,使Rhodococcus ruber TCCC28001培养72 h后丙烯腈水合酶比活力达到4628 U/mL,比调控前提高了441%。考察了底物对腈水合酶活性及丙烯腈转化的影响,底物浓度≤20%对腈水合酶活性无抑制作用,丙烯腈转化率达100%,表明Rhodococcus ruber TCCC28001对底物有较强的耐受性。
张云天[6]（2008）在《利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究》文中研究表明丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化学产品,相对传统的固定化细胞批式反应工艺而言,游离细胞膜生物反应器工艺具有工艺简单,成本低,菌体利用率高,无污染等优点。本文前期探讨了高效腈水合酶产生菌Rhodococcus sp.HUST-2培养条件的优化,然后设计和应用了一种新的游离细胞膜生物反应器的工艺,来取代传统的生产工艺,期待实现工业化应用。首先,通过研究菌体发酵过程中产酶的规律,提出了调节pH值,补加葡萄糖和诱导剂的菌体优化培养方案。使发酵液腈水合酶的活力提高到4000U/mL以上,比酶活达到224.7U/mg（DCW）左右,大大高于现有工业生产中的酶活。然后,通过对膜材料的截留性能、膜通量、膜抗污染性能和膜抗溶胀性能等方面性能评价,选择聚砜中空纤维超滤膜作为膜组件的膜材料。并采用反应器和中空纤维膜组件串联的膜生物反应器形式,它具有操作方便,结构简单合理,易于清洗等优点。还从水力学的角度对膜组件工作状态建立了数学模型和优化设计,这对工业化过程中膜组件的设计有重要的指导意义。最后在膜生物反应器工艺平台上开发设计了单级非稳态工艺和单级拟稳态工艺两种工艺过程,并进行了可行性研究。实验结果表明:这两种工艺过程各有特点,在生产效率和菌体利用率等方面都优于现有的固定化细胞生产方式。在单级非稳态工艺过程中,根据对产品浓度要求不同的情况。开发和验证了三个不同反应批次单级非稳态工艺过程。生产效率均在0.02mol/L/min以上,6批次反应菌体利用率最高为0.7 gAM/mg。从生产效率和菌体利用率来看,应用单级非稳态过程的膜生物反应器比现有的固定化细胞催化生产方式更有优势。该工艺过程路线简洁,操作简单应该是日后丙烯酰胺小型工业化生产理想的选择。在单级拟稳态工艺过程中,从反应温度和菌体加入方式两个方面对单级拟稳态工艺过程进行了优化设计。结果发现单级拟稳态工艺过程在20℃下操作,菌体悬液以滴加的方式进入反应体系,会使生产效率和菌体利用率有较大程度的提高。最后还进行了单级拟稳态工艺的生产应用,整个生产过程持续了20小时,反应速率稳定,产品浓度为313.1g/L。该工艺过程很适合丙烯酰胺大型工业化生产的要求。
王超,张根林,李春,吴丽[7]（2007）在《Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺》文中研究说明通过研究发酵过程中溶氧、生物量、腈水合酶活力以及残糖的变化规律和搅拌速度、通气量、接种量及诱导剂对产腈水合酶的影响,确立了5L发酵罐中Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺参数。结果表明,发酵过程中溶氧控制在30%以上有利于菌体快速生长和腈水合酶的合成。在pH7.2,温度30℃的发酵条件下,适宜的腈水合酶合成工艺条件为:接种量10%,通气量1.0vvm,搅拌速度采用由初始的200r/min调至500r/min的变速调控方式,同时于48h补加产酶诱导剂,发酵液腈水合酶的最高酶活力达到了9500U/mL,是摇瓶培养时最高酶活力8208U/mL的1.2倍,且比未进行工艺优化时最大产酶期缩短了20～24h,其最佳产酶期为52～60h。
朱婷婷[8]（2007）在《一株腈水合酶产生菌株的选育和发酵条件的优化》文中指出丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化工产品,主要用于生产聚丙烯酰胺及其衍生物。聚丙烯酰胺可用作水处理絮凝剂、纸张增强剂、钻井防卡剂、纤维处理剂、粘合剂等。近年来,随着国内三次采油技术的广泛应用,聚丙烯酰胺的需求量日益增长,因而作为其单体的丙烯酰胺也是供不应求,市场前景非常乐观。由于微生物法生产丙烯酰胺与化学法相比具有高效性、高选择性、反应条件温和、成本低和环境污染小等优点,多年来一直为研究的热点之一。腈水合酶作为生物催化法生产丙烯酰胺的催化剂,能催化丙烯腈生成丙烯酰胺。选育出高活力腈水合酶产生菌株是整个生物法生产的关键。本文对菌株的选育以及发酵条件的优化作了深入的研究,主要研究成果如下:从化工废水处理厂的活性污泥中分离筛选获得1株高活力腈水合酶产生菌株T5,腈水合酶活力为415.1U。通过物理诱变剂紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯对菌株T5进行复合诱变处理,选育出菌株HUST-1,酶活达到688.3U。通过对菌株HUST-1的生理生化特征及16S rDNA序列分析,初步将菌株HUST-1归属为Rhodococcus sp.,命名为Rhodococcus sp. HUST-1。对HUST-1发酵产生腈水合酶的温度、pH等条件进行了研究,发现Co2+、酪氨酸对腈水合酶有明显的诱导激活作用,对菌株HUST-1的发酵培养基进行了优化,确定菌株HUST-1的最适发酵培养基（g/L）为:葡萄糖20,酵母粉10,MgSO4.7H2O 0.5 ,K2HPO4 0.5,KH2PO4 0.5,酪氨酸0.2,CoCl2.6H2O 0.08mmol/L, pH 7.0。接种种龄为36～48h的菌株在此培养基中28℃,200r/min的条件下振荡培养96h,酶活达1012.7U,比优化前提高了47.1%。另对发酵过程的pH进行调控使之保持在7.0左右,发酵过程中通过补加葡萄糖、诱导剂,酶活可以达到1500.4U,比调控前的酶活提高了48.2%。
赵霞[9]（2006）在《一株腈水合酶产生菌发酵条件的优化控制及其酶学性质研究》文中提出丙烯酰胺是一种重要的有机化工原料,主要用于合成聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺作为絮凝剂、增稠剂、增强剂等,广泛应用于造纸、煤炭、地质、冶金、纺织、化工、食品等许多经济领域,尤其是在石油工业中聚丙烯酰胺的应用更为突出。丙烯酰胺是以丙烯腈为原料水合而成,从20世纪50年代至今,生产工艺先后经历了硫酸水合、铜系催化的化学水合两个阶段,而微生物酶催化是第三代最新技术,其具有高选择性、高活性和高收率的特点。腈水合酶是微生物法生产丙烯酰胺中起关键作用的生物催化剂,能在常温常压下实现丙烯腈向丙烯酰胺的转化。因此本文对产腈水合酶菌株Rhodococcus sp. SHZ-1的发酵优化控制及以游离细胞液为催化剂对其进行了腈水合酶学性质的研究,取得了以下进展:1.对SHZ-1菌株的生长特征、生理生化等特性进行了研究。分别利用形态学和生理生化方法对其进行鉴定,结果表明该菌属于红球菌。2.对Rhodococcus sp. SHZ-1菌株的发酵条件进行优化控制。通过腈水合酶生产菌Rhodococcus sp. SHZ-1菌株的发酵过程研究,阐明了发酵液pH、葡萄糖含量以及细胞浓度变化与酶活之间的关系。确定了腈水合酶高活力表达的过程,在发酵过程中调节pH以及补加葡萄糖-Co2+,使酶活达到5226U/mL,是对照工艺（1196.23 U/mL）的4.7倍。在确定了pH调控和葡萄糖-Co2+耦合补加工艺的基础上,通过向培养基中加入诱导剂、表面活性剂等进一步优化了产酶过程。酶活最高达7009.18U/mL,比优化初始酶活力（5226U/mL）提高了34.12%。3.研究了温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶活性的影响。结果表明,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。温度30℃,反应体系在pH中性范围酶活达到最高。该酶对于底物丙烯腈有很强的耐受性,丙烯腈浓度为7.2%时,酶活最高;但是产物丙烯酰胺浓度过高,达到40%时就会严重抑制酶的活性。
赵霞,王纯利,娄恺[10]（2006）在《腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究》文中研究说明通过腈水合酶生产菌Rhodococcus sp.SHZ-1菌株的发酵过程研究,阐明了发酵液pH、葡萄糖含量以及细胞浓度变化与酶活之间的关系。在发酵过程中调节pH以及补加葡萄糖,使酶活从2 294 U/mL增加到5 226 U/mL,提高了1.28倍。腈水合酶的酶学性质研究表明,温度30℃,反应体系在pH中性范围酶活达到最高。该酶对于底物有很强的耐受性,丙烯腈浓度为7.2%时,酶活最高;产物丙烯酰胺浓度过高,则会严重抑制酶的活性。
二、Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺（论文提纲范文）
（1）亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类化合物 |
| 1.1.1 腈类化合物的作用 |
| 1.1.2 腈类的微生物转化 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶 |
| 1.2.2 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.3 腈水合酶的来源及基因结构 |
| 1.3 翻译后修饰 |
| 1.3.1 亚基自身交换 |
| 1.3.2 金属伴随子 |
| 1.4 腈水合酶的工业应用 |
| 1.5 腈水合酶的改造 |
| 1.5.1 腈水合酶生产存在的问题 |
| 1.5.2 大肠杆菌的异源表达 |
| 1.5.3 腈水合酶稳定性改造策略 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 第二章 亚基融合型腈水合酶的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 |
| 2.2.5 基因操作 |
| 2.2.6 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 钴含量测定 |
| 2.2.9 最适pH测定 |
| 2.2.10 热稳定性测定 |
| 2.2.11 产物耐受性测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 融合型腈水合酶的构建及表达 |
| 2.3.2 融合型腈水合酶的表征 |
| 2.3.3 调控蛋白融合位置的影响 |
| 2.3.4 融合型腈水合酶的理化性质测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 融合型腈水合酶的热稳定性改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株质粒 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 |
| 3.2.4 基因操作 |
| 3.2.5 蛋白表达及纯化 |
| 3.2.6 酶活及动力学参数测定 |
| 3.2.7 动力学及热力学稳定性测定 |
| 3.2.8 同源建模 |
| 3.2.9 计算模拟 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模 |
| 3.3.2 融合型腈水合酶突变体库的构建 |
| 3.3.3 突变体的筛选 |
| 3.3.4 正向突变体的酶学表征 |
| 3.3.5 正向突变体的结构分析 |
| 3.3.6 正向突变体分子间相互作用探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与载体 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 蛋白表达与纯化 |
| 4.2.4 腈水合酶的体外激活 |
| 4.2.5 紫外-可见光扫描 |
| 4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化状态测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 融合型腈水合酶的体外激活 |
| 4.3.2 腈水合酶的紫外—可见光光谱扫描 |
| 4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻译后修饰分析 |
| 4.3.4 融合型腈水合酶成熟机理 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 调控蛋白的金属伴随子功能探究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与载体 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 质粒构建 |
| 5.2.4 蛋白表达与纯化 |
| 5.2.5 酶活与动力学参数测定 |
| 5.2.6 钴离子的光谱扫描及含量测定 |
| 5.2.7 钴离子与调控蛋白的结合 |
| 5.2.8 测定调控蛋白与腈水合酶的结合 |
| 5.2.9 从头建模及分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 调控蛋白对融合型腈水合酶活性的影响 |
| 5.3.2 单独调控蛋白的获取 |
| 5.3.3 单独调控蛋白的表征 |
| 5.3.4 单独调控蛋白对融合型腈水合酶的体外激活 |
| 5.3.5 异源调控蛋白对融合型腈水合酶的体内激活 |
| 5.3.6 钴离子与调控蛋白体外结合的分析 |
| 5.3.7 调控蛋白与脱辅基酶的结合分析 |
| 5.3.8 调控蛋白模型的建立及动力学分析 |
| 5.3.9 调控蛋白钴离子结合位点的分析 |
| 5.3.10 金属伴随子激活模型 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 天然融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与载体 |
| 6.2.2 培养条件 |
| 6.2.3 基因合成及密码子优化 |
| 6.2.4 包涵体的检测 |
| 6.2.5 蛋白表达与纯化 |
| 6.2.6 酶活及热稳定性测定 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的异源表达 |
| 6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表达优化 |
| 6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及热稳定性 |
| 6.3.4 异源调控蛋白对M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 ：作者在攻读博士期间发表的论文 |
（2）恶臭假单胞菌中腈水合酶钴离子摄取机制和热稳定性改造研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈水合酶概述 |
| 1.1.1 腈水合酶简介 |
| 1.1.2 腈水合酶的热稳定性和区域选择性 |
| 1.1.3 腈水合酶的结构与分类 |
| 1.2 腈水合酶的结构与功能 |
| 1.2.1 腈水合酶的晶体结构 |
| 1.2.2 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.3 腈水合酶金属离子摄取机理研究进展 |
| 1.3 腈水合酶的工业应用 |
| 1.4 酶的热稳定性改造 |
| 1.4.1 非理性设计酶稳定性改造 |
| 1.4.2 理性设计酶稳定性改造 |
| 1.4.3 生物信息学软件在酶学中的应用 |
| 1.5 本课题的研究背景、意义和主要研究内容 |
| 第二章 腈水合酶调控蛋白 P14K 在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验菌株与载体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 DNA 操作 |
| 2.2.7 全质粒 PCR 方法定点突变 |
| 2.2.8 表达载体构建 |
| 2.2.9 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 |
| 2.2.10 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 |
| 2.2.11 分子模拟分析方法 |
| 2.2.12 实验分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 恶臭假单胞菌中腈水合酶全基因 ABP 的克隆 |
| 2.3.2 利用 N 端原则在 E. coli 中成功表达调控蛋白 P14K |
| 2.3.3 调控蛋白 P14K 大量稳定的表达 |
| 2.3.4 分子内氢键的形成影响 P14K 蛋白质的稳定性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 腈水合酶钴离子摄取机制的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验菌株与载体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 实验相关溶液配制 |
| 3.2.5 实验仪器 |
| 3.2.6 DNA 操作 |
| 3.2.7 表达载体的构建 |
| 3.2.8 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 |
| 3.2.9 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 |
| 3.2.10 实验分析方法 |
| 3.2.11 进化树的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 调控蛋白复合体α(strep-P14K)2分离与鉴定 |
| 3.3.2 恶臭假单胞菌中腈水合酶遵循亚基自身交换机制 |
| 3.3.3 α(P14K)2是亚基自身交换分子伴侣也是金属伴随子 |
| 3.3.4 不同α亚基-β亚基顺序对腈水合酶酶活的影响 |
| 3.3.5 基因型 ABP 与 BAP 型腈水合酶的分子进化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 腈水合酶调控蛋白 P14K 上 C 端结构域结构与功能的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验菌株与载体 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 实验相关溶液配制 |
| 4.2.5 实验仪器 |
| 4.2.6 DNA 操作 |
| 4.2.7 表达载体构建 |
| 4.2.8 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 |
| 4.2.9 腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 |
| 4.2.10 分子模拟分析方法 |
| 4.2.11 实验分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 P14K 分子动力学模拟 |
| 4.3.2 P14K 上 C-domain 截断实验 |
| 4.3.3 C-domain 高度柔性的作用 |
| 4.3.4 C-domain 区域正电荷氨基酸的作用 |
| 4.3.5 C-domain 的柔性和正电性可能与 Co 离子的摄取有关 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 自组装肽提高腈水合酶热稳定性的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验菌株与载体 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 实验相关溶液配制 |
| 5.2.5 实验仪器 |
| 5.2.6 DNA 操作 |
| 5.2.7 CloneEZ 快速构建质粒 |
| 5.2.8 表达载体构建 |
| 5.2.9 腈水合酶的诱导表达 |
| 5.2.10 腈水合酶的纯化 |
| 5.2.11 实验分析方法 |
| 5.2.12 分子模拟 Foldit 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 腈水合酶最适自组装肽融合的筛选 |
| 5.3.2 融合 ELK16 能使腈水合酶形成活性包涵体 |
| 5.3.3 ELK16 比其它 SAP 可能更具优势 |
| 5.3.4 分别融合 EAK16/ELK16 对腈水合酶稳定性的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）生物催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 2-氯烟酸的概述 |
| 1.1.1 2-氯烟酸的用途 |
| 1.1.2 2-氯烟酸的合成工艺 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源 |
| 1.2.2 腈水合酶的结构和催化性质 |
| 1.2.3 腈水合酶的基因克隆 |
| 1.3 酰胺酶 |
| 1.3.1 酰胺酶的来源 |
| 1.3.2 酰胺酶的分类 |
| 1.3.3 酰胺酶的结构及催化机理 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 腈水合酶基因的克隆及表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒及培养基 |
| 2.2.2 工具酶及试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 野生型菌株培养与选择 |
| 2.2.5 分析方法 |
| 2.2.6 腈水合酶基因的克隆 |
| 2.2.7 质粒提取与转化 |
| 2.2.8 腈水合酶基因的表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 产腈水合酶菌株的选择 |
| 2.3.2 腈水合酶基因的克隆 |
| 2.3.3 腈水合酶基因的表达 |
| 2.3.4 酶活测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 腈水合酶的诱导条件优化及其催化2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酰胺 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和培养基 |
| 3.2.2 菌体培养及酶活分析 |
| 3.2.3 腈水合酶的诱导表达条件优化 |
| 3.2.4 重组腈水合酶催化2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酰胺 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 产腈水合酶诱导条件的优化 |
| 3.3.2 转化pH对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.3 转化温度对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.4 金属离子对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.5 底物浓度对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.6 产物浓度对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.7 催化剂用量对2-氯烟酰胺合成的影响 |
| 3.3.8 腈水合酶酶促反应动力学 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 产酰胺酶菌株培养条件的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 产酰胺酶菌株的培养 |
| 4.2.3 分析与检测 |
| 4.2.4 产酰胺酶菌株培养条件的研究 |
| 4.2.5 响应面实验设计 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 酰胺酶酶源的选择 |
| 4.3.2 产酰胺酶菌株培养条件的研究 |
| 4.3.3 响应面法优化酰胺酶的诱导表达条件 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组酰胺酶的酶学特性及其催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和试剂 |
| 5.2.2 酰胺酶的分离纯化 |
| 5.2.3 分析方法 |
| 5.2.4 酰胺酶酶学性质的研究 |
| 5.2.5 重组酰胺酶催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 酰胺酶的分离纯化 |
| 5.3.2 酰胺酶酶学性质的研究 |
| 5.3.3 同源建模及分子对接 |
| 5.3.4 底物浓度对2-氯烟酸制备的影响 |
| 5.3.5 E.coli BL21 (DE3)/pET-28b(+)-AMI静息细胞的重复使用批次 |
| 5.3.6 酶促反应动力学 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 双酶耦合催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 菌株、培养基及培养方法 |
| 6.2.2 分析方法 |
| 6.2.3 双酶双菌耦合同步控制反应的研究 |
| 6.2.4 双酶双菌耦合分步控制反应的研究 |
| 6.2.5 共表达腈水合酶和酰胺酶重组菌的构建及其催化制备2-氯烟酸 |
| 6.3 结果和讨论 |
| 6.3.1 双酶双菌耦合催化制备2-氯烟酸的反应机理 |
| 6.3.2 转化pH对双菌耦合催化反应的影响 |
| 6.3.3 双菌质量比对耦合催化反应的影响 |
| 6.3.4 反应温度对双菌耦合催化反应的影响 |
| 6.3.5 反应转速对双菌耦合催化反应的影响 |
| 6.3.6 底物浓度对双菌耦合催化反应的影响 |
| 6.3.7 双酶双菌耦合催化制备2-氯烟酸的反应进程 |
| 6.3.8 腈水合酶和酰胺酶共表达的SDS-PAGE图 |
| 6.3.9 诱导剂浓度对双酶共表达活力的影响 |
| 6.3.10 诱导温度对双酶共表达活力的影响 |
| 6.3.11 诱导时间对双酶共表达活力的影响 |
| 6.3.12 转化温度对一菌双酶耦合催化的影响 |
| 6.3.13 转化pH对一菌双酶耦合催化的影响 |
| 6.3.14 一菌双酶催化制备2-氯烟酸的反应进程 |
| 6.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 攻读博士期间发表论文与申请专利 |
| 致谢 |
（4）一株腈水合酶产生菌发酵过程的控制及其酶学性质的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 AM 概述 |
| 1.1.1 AM 的性质 |
| 1.1.2 AM 的用途 |
| 1.2 AM 生产技术 |
| 1.2.1 硫酸水合法 |
| 1.2.2 铜催化水合法 |
| 1.2.3 微生物转化法 |
| 1.3 微生物法生产技术 |
| 1.3.1 微生物法生产AM 发展历史 |
| 1.3.2 微生物法生产AM 的工艺过程 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 NHase 摇瓶发酵工艺条件的优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 培养方法 |
| 2.3.2 NHase 活性测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 初始pH 对NHase 酶活的影响 |
| 2.4.2 初始葡萄糖浓度对NHase 酶活的影响 |
| 2.4.3 初始尿素浓度对NHase 酶活的影响 |
| 2.4.4 初始谷氨酸钠浓度对NHase 酶活的影响 |
| 2.4.5 初始促进剂浓度对NHase 酶活的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 2L 自控式发酵罐补料分批发酵工艺的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌种和培养基 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 培养方法 |
| 3.3.2 菌体浓度测定 |
| 3.3.3 氨基氮浓度测定 |
| 3.3.4 葡萄糖浓度测定 |
| 3.3.5 NHase 活性测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 分批发酵工艺 |
| 3.4.2 pH 调控工艺 |
| 3.4.3 补糖分批发酵工艺 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 NHase 的初步分离及其酶学性质的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌种和培养基 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 培养方法 |
| 4.3.2 菌体的超声破碎 |
| 4.3.3 硫酸铵沉淀酶蛋白 |
| 4.3.4 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 |
| 4.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.6 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 |
| 4.3.7 pH 对NHase 酶活及稳定性的影响 |
| 4.3.8 温度对NHase 酶活及稳定性的影响 |
| 4.3.9 NHase 活性测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 超声破壁最适时间的选择 |
| 4.4.2 硫酸铵沉淀蛋白结果分析 |
| 4.4.3 硫酸铵分级沉淀蛋白结果分析 |
| 4.4.4 pH 对NHase 酶活及稳定性的影响 |
| 4.4.5 温度对NHase 酶活及稳定性的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 论文总结 |
| 5.1 论文研究总体结论 |
| 5.2 论文创新 |
| 5.3 论文后续工作与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表论文（着）及科研情况 |
（5）Rhodococcus ruber TCCC28001产丙烯腈水合酶过程调节及转化条件研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 |
| 1.4 |
| 1.5 |
| 1.6 |
| 1.6.1腈水合酶产生菌生长过程曲线的测定 |
| 1.6.2产酶过程中 |
| 1.6.3尿素添加时间的选择 |
| 1.6.4尿素浓度的确定 |
| 1.7 丙烯酰胺转化条件的研究 |
| 1.7.1腈水合酶产生菌对丙烯酰胺的耐受性 |
| 1.7.2反应温度对丙烯酰胺产率的影响 |
| 1.7.3反应介质 |
| 1.7.4底物浓度对丙烯酰胺产率的影响 |
| 1.8 |
| 1.9 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 Rhodococcus ruber CGMCC3090的培养过程曲线 |
| 2.3 Rhodococcus ruber CGMCC3090产酶条件的优化 |
| 2.3.1调控pH对腈水合酶活性的影响 |
| 2.3.2尿素添加时间的选择 |
| 2.3.3尿素浓度的确定 |
| 2.4 丙烯腈转化条件的研究 |
| 2.4.1 RhodococcusruberCGMCC 30901对产物丙烯酰胺的耐受性 |
| 2.4.2反应温度对丙烯酰胺产率的影响 |
| 2.4.3反应介质pH对丙烯酰胺产率的影响 |
| 3 结论 |
（6）利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙烯酰胺概述 |
| 1.1.1 丙烯酰胺的物化性质 |
| 1.1.2 丙烯酰胺的用途及其市场前景 |
| 1.2 生物法生产丙烯酰胺的历程 |
| 1.2.1 硫酸水合法 |
| 1.2.2 铜催化水合法 |
| 1.2.3 腈水合酶生物转化法 |
| 1.3 腈水合酶研究简介 |
| 1.3.1 腈水合酶的种类和分布 |
| 1.3.2 腈水合酶的结构特点 |
| 1.3.3 腈水合酶的反应机理 |
| 1.4 传统微生物法工艺过程 |
| 1.4.1 细胞的固定化 |
| 1.4.2 固定化细胞批式反应工艺流程 |
| 1.4.3 传统微生物法中需要解决的问题 |
| 1.5 膜生物反应器技术的研究进展 |
| 1.5.1 生物反应-分离耦合技术 |
| 1.5.2 膜生物反应器 |
| 1.5.3 游离细胞膜生物器工艺的优点 |
| 1.6 课题背景 |
| 1.6.1 课题来源 |
| 1.6.2 本课题的研究目的与意义 |
| 1.6.3 本课题的主要研究内容 |
| 第2章 菌体发酵条件的优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌种和培养基 |
| 2.2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.3 细菌和酶活测定方法 |
| 2.3 菌体的发酵过程 |
| 2.3.1 菌落的形态特征 |
| 2.3.2 发酵过程中pH 的变化规律 |
| 2.3.3 发酵过程酶活变化的一般规律 |
| 2.4 菌体培养过程的优化 |
| 2.4.1 培养过程中pH 值的优化调控 |
| 2.4.2 培养过程中葡萄糖浓度的调控 |
| 2.4.3 培养过程中诱导剂的调控 |
| 2.4.4 菌体培养的优化调控方案 |
| 2.5 菌种的保存与活化 |
| 2.5.1 菌种的保存 |
| 2.5.2 菌种的活化 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 膜组件的优化设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 膜组件的选择 |
| 3.2.2 膜组件性能评价方法 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 膜组件性能评价 |
| 3.3.2 膜组件性能总结 |
| 3.4 膜组件工作的水力学模型 |
| 3.4.1 建立水力学模型的意义 |
| 3.4.2 建立水力学模型 |
| 3.5 膜组件与反应器的耦合方式 |
| 3.5.1 串联式膜生物反应器 |
| 3.5.2 内置式膜生物反应器 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 膜生物反应器工艺的设计和应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 单级非稳态工艺过程 |
| 4.3.1 单级非稳态工艺过程的设计 |
| 4.3.2 单级非稳态工艺过程的应用 |
| 4.3.3 单级非稳态工艺过程的总结 |
| 4.4 单级拟稳态工艺过程 |
| 4.4.1 单级拟稳态工艺过程的设计 |
| 4.4.2 单级拟稳态工艺参数的影响 |
| 4.4.3 单级拟稳态工艺过程的应用 |
| 4.4.4 单级拟稳态工艺过程的总结 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌 种 |
| 1.2 培养基 |
| 1.2.1 斜面培养基 (g /L) |
| 1.2.2 发酵培养基 (g/L) |
| 1.2.3 菌体浓度 |
| 1.3 丙烯腈和丙烯酰胺浓度的测定[5] |
| 1.4 腈水合酶活力的测定[5, 6] |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 发酵过程中各主要指标和腈水合酶的动态变化规律 |
| 2.2 接种量对产酶的影响 |
| 2.3 搅拌转速对产酶的影响 |
| 2.4 通气量对产酶的影响 |
| 2.5 诱导剂对产酶的影响 |
| 3 结 论 |
（8）一株腈水合酶产生菌株的选育和发酵条件的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙烯酰胺概述 |
| 1.1.1 丙烯酰胺的物化性质 |
| 1.1.2 丙烯酰胺的用途及其市场前景 |
| 1.2 生物法生产丙烯酰胺的历程 |
| 1.2.1 硫酸水合法 |
| 1.2.2 铜催化水合法 |
| 1.2.3 腈水合酶生物转化法 |
| 1.3 腈水合酶研究简介 |
| 1.3.1 腈水合酶的种类和分布 |
| 1.3.2 腈水合酶的结构特点 |
| 1.3.3 腈水合酶的反应机理 |
| 1.4 课题背景 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 本课题的研究目的与意义 |
| 1.4.3 本课题的主要研究内容 |
| 第2章 一株腈水合酶高产菌的选育 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 诱变技术概述 |
| 2.2.1 诱变技术的发展 |
| 2.2.2 诱变剂简介 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 菌种与培养基 |
| 2.3.2 腈水合酶产生菌的分离筛选 |
| 2.3.3 菌体发酵 |
| 2.3.4 丙烯酰胺的分析方法 |
| 2.3.5 诱变处理 |
| 2.3.6 最适诱变剂量的选择 |
| 2.3.7 突变菌株的筛选 |
| 2.3.8 突变株的遗传稳定性试验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 腈水合酶产生菌的分离筛选 |
| 2.4.2 诱变条件的选择 |
| 2.4.3 诱变对菌落形态的影响 |
| 2.4.4 突变株的初筛 |
| 2.4.5 突变株的复筛 |
| 2.4.6 突变株的遗传稳定性试验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 菌株HUST-1 的生理生化和分子生物学鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种与培养基 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 菌体细胞生长量测定 |
| 3.2.4 细胞形态特征的观察 |
| 3.2.5 菌落的形态观察 |
| 3.2.6 菌株生理生化指标的测定 |
| 3.2.7 165 rDNA 基因的序列分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 菌株HUST-1 不同时期细胞的形态特征 |
| 3.3.2 菌落的形态特征 |
| 3.3.3 菌株HUST-1 的生理生化性质 |
| 3.3.4 菌株HUST-1 的碳源利用 |
| 3.3.5 HUST-1 的165 rDNA 序列测定结果 |
| 3.3.6 菌株HUST-1 的OD460 和菌体干重的标准曲线 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 菌体发酵条件的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种与培养基 |
| 4.2.2 发酵条件的确定 |
| 4.2.3 腈水合酶的诱导 |
| 4.2.4 发酵过程各个条件的调控 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 碳源对酶形成的影响 |
| 4.3.2 氮源对酶形成的影响 |
| 4.3.3 最适碳、氮源浓度的确定 |
| 4.3.4 培养条件的优化 |
| 4.3.5 腈水合酶的诱导 |
| 4.3.6 发酵过程各个条件的调控 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）一株腈水合酶产生菌发酵条件的优化控制及其酶学性质研究（论文提纲范文）
| 独创性声明 |
| 学位论文版权使用授权书 |
| 摘 要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丙烯酰胺 |
| 1.2 酶 |
| 1.3 腈水合酶 |
| 1.4 腈水合酶基因工程的研究 |
| 1.5 微生物法制备丙烯酰胺的工艺研究 |
| 第二章 Rhodococcus sp.SHZ-1 菌的特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 第三章 腈水合酶产生菌发酵条件的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 测定方法 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 第四章 腈水合酶酶学性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 测定方法 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.5 结果与分析 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 Rhodococcus sp. SHZ-1 菌株的特性研究 |
| 5.2 Rhodococcus sp. SHZ-1 菌株发酵条件优化 |
| 5.3 腈水合酶酶学性质的研究 |
| 5.4 粗提酶蛋白分析结果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 培养方法 |
| 1.4.1 种子培养 |
| 1.4.2 摇瓶培养 |
| 1.5 细胞生长量的测定 |
| 1.6 酶反应及酶活的计算 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 发酵条件的优化结果 |
| 2.1.1 pH对Rhodococcus sp. SHZ-1菌体浓度及腈水合酶酶活的影响 |
| 2.1.2 补加葡萄糖工艺 |
| 2.2 酶学性质 |
| 2.2.1 pH对腈水合酶酶活及稳定性的影响 |
| 2.2.2 温度对酶活及其稳定性的影响 |
| 2.2.3 底物丙烯腈对酶活的影响 |
| 2.2.4 产物丙烯酰胺的浓度对酶的影响 |
四、Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺（论文参考文献）
- [1]亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究[D]. 夏媛媛. 江南大学, 2019(12)
- [2]恶臭假单胞菌中腈水合酶钴离子摄取机制和热稳定性改造研究[D]. 刘义. 江南大学, 2014(12)
- [3]生物催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸的研究[D]. 金利群. 浙江工业大学, 2013(01)
- [4]一株腈水合酶产生菌发酵过程的控制及其酶学性质的研究[D]. 黄伟波. 江西师范大学, 2011(04)
- [5]Rhodococcus ruber TCCC28001产丙烯腈水合酶过程调节及转化条件研究[J]. 张锦丽,王敏,钟莉萍,李晓丹. 山东农业大学学报(自然科学版), 2010(01)
- [6]利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究[D]. 张云天. 哈尔滨理工大学, 2008(04)
- [7]Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺[J]. 王超,张根林,李春,吴丽. 食品与发酵工业, 2007(07)
- [8]一株腈水合酶产生菌株的选育和发酵条件的优化[D]. 朱婷婷. 哈尔滨理工大学, 2007(01)
- [9]一株腈水合酶产生菌发酵条件的优化控制及其酶学性质研究[D]. 赵霞. 新疆农业大学, 2006(02)
- [10]腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究[J]. 赵霞,王纯利,娄恺. 新疆农业大学学报, 2006(01)