一、伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建（论文文献综述）
顾阳[1]（2020）在《PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析》文中进行了进一步梳理猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）又称为奥耶斯基病（Aujeszky’s disease,AD）,是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种烈性传染病,育肥期猪呈现体温升高、呼吸道感染症状;哺乳期幼仔感染后通常具有较高致死率;怀孕母猪表现繁殖障碍、流产、死胎、木乃伊胎等。PRV宿主广泛,但猪是已知的唯一自然宿主,也是引起其他动物感染的重要排毒者和疫源,给整个养猪业带来巨大损失。近年来,我国很多地区经过经典疫苗株免疫接种的猪场再次出现猪伪狂犬病疫情,经初步研究发现其为PRV变异毒株感染导致,并且病料样本g E阳性率较高。我国之前大部分猪场使用的是敲除g E基因的Bartha-K61等疫苗,这表明传统的经典疫苗已不能对当前PRV感染提供有效保护,因而找出当前流行毒株的变异程度及野毒的感染情况是当务之急。由于常规的血清学检测方法无法区分疫苗免疫接种动物和野毒感染动物,已知g E基因是野毒感染的标志基因;g H基因是PRV内高度保守和病毒复制所必须的基因,因此根据Gen Bank中猪伪狂犬病毒（PRV）g H、g E基因序列,设计合成2对特异性引物,通过对退火温度等条件进行优化,建立了鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法。特异性分析表明,从强毒株基因组中扩增出2条大小为429bp和355bp的特异性片段,从弱毒株基因组中仅扩增出1条大小为355bp的特异性片段,而扩增猪圆环病毒2型和猪细小病毒基因组结果均为阴性。敏感性分析表明所建立的鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法的最低有效检测量为1×102 TCID50/0.1ml。对采自河南省郑州、许昌、濮阳、焦作、洛阳等地市以及山西省文水、河北邯郸的348份PRV疑似病料组织样品进行双重PCR检测,检测病原只需3 h～4 h。该方法具有较高的特异性、敏感性及可重复性,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染,为PRV野毒的筛查以及PRV的快速检测提供技术支持。从河南、山西和河北收集的5份疑似PRV病料组织匀浆液,经无菌处理后接种于ST细胞,提取每一代收获的细胞病毒液DNA,PCR扩增、电泳,结果均为阳性。将培养至第7代的细胞病毒液接种于6周龄小鼠,攻毒48 h后小鼠开始出现死亡,62 h时全部死亡,而对照组小鼠168 h后仍无发病和死亡现象。表明所获得的5株分离株为PRV强毒株,将其命名为XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2。以XC株为例,进行理化特性试验,结果表明其具有PRV理化特性。XC株在ST细胞上的一步生长曲线结果显示,感染ST细胞后第4-12 h时XC株病毒效价逐渐增长,第36 h达到最高峰(TCID50/m L为10 7.49),之后病毒效价开始降低。这与PRV在ST细胞上的生长动力规律相吻合。本试验成功分离5株PRV野毒株,为PRV的分离鉴定及控制猪伪狂犬病的流行提供了理论依据。参照Gen Bank中发表的g B和g D基因序列,使用引物设计软件设计2对引物,对实验室分离的5个PRV流行株（XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2）的g B和g D基因进行PCR扩增、克隆、测序及其核苷酸与氨基酸序列分析。结果显示,分离出来的5株流行株虽然来自不同地区,但核苷酸和氨基酸的同源性均较高,对比国内早些年流行株Ea、Fa、SC等,本试验的5个分离毒株g B基因的氨基酸序列,共出现5处共同突变,此5处位点都与国内近年流行毒株的氨基酸保持一致;国内与国外毒株比对发现20多处突变。推导g D基因氨基酸序列发现,相对于国内早年流行株,在278位处国外毒株（除Becker和NIA3外）和国内近些年流行变异株出现了氨基酸位点缺失;相对于国外毒株（除Becker和NIA3外）,包括5个分离毒株在内的国内毒株共发生了8处位点共同突变。研究结果表明5个分离毒株与国外流行毒株由于地理隔离的存在差异较大,不同地区PRV毒株的感染和流行情况并不相同;5个分离毒株与2011年之前国内流行毒株亲缘关系较远,表明2011年以来我国PRV流行毒株发生了变异,可以推断出我国在2011年之后可能是由于出现了PRV变异毒株而导致不同地区PR疫情的发生;遗传进化树结果表明,这些分离的毒株与之前的经典毒株如Bartha-K61等亲缘关系较远,这也解释了为何我国近年各地已经免疫的猪场还是有PRV感染发生。
赵宇[2]（2020）在《PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究》文中研究指明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,即奥耶兹氏病（Aujeszky’s disease）,是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物患病的传染病。猪是PRV主要的天然宿主,感染PRV会导致严重的神经紊乱、呼吸系统疾病和母猪的繁殖障碍,以及新生仔猪的高死亡率。目前对于猪伪狂犬病的防制主要依靠Bartha-K61疫苗,使该病得到有效控制。自2011年以来,中国许多规模化猪场接种Bartha-K61疫苗的猪群出现新一轮的PR疫情,表明Bartha-K61疫苗不能对当前的PRV感染提供完全保护,且新一轮的PR对我国养猪业的危害巨大,因此一种可针对当前PRV流行变异株的有效疫苗急待开发。本试验成功建立了检测PRV野毒株的荧光定量PCR检测方法,特异性结果显示,该方法只能够特异性检测PRV,对其它病原体无反应,表明该方法具有良好的特异性;灵敏度结果显示,PRV的最小检测下线为37.0 copies/μL,表明该方法具有良好的灵敏性;重复性结果显示,不同浓度标准品模板的批内变异系数为0.214～0.873%,批间的变异系数为0.964～1.233%,且批内和批间的变异系数均小于2%,表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有重复性高、稳定性良好的优点。对201 8年6月至2020年1月的56份河南省的临床样品进行检测,结果显示,PRV的阳性率为17.86%（10/56）,表明河南省猪场依旧存在PRV野毒感染。本试验为PRV的早期诊断及其流行病学调查提供了技术保障。将鉴定为PRV阳性的病料接种于ST细胞,成功分离出2株PRV毒株。血清中和试验和靶向PRV gE基因的荧光定量PCR结果显示,本试验分离出的2株PRV毒株为野毒株。对本研究分离的2株PRV野毒株和1份PRV阳性病料进行gE全基因扩增、gE基因序列同源性分析以及遗传进化分析,结果显示,3株PRV野毒株均与国内流行株亲缘关系最近,同属一个分支,说明3株PRV野毒株均为PRV流行株。对PRV流行株在ST细胞上的增殖规律以及致病性进行探究,结果显示,分离株JZ-1-2019在接种ST细胞上第4-24h毒力逐渐上升,第36h达到最高,随后毒力开始降低;动物试验结果显示,分离株JZ-I-2019对小鼠具有致死性,说明流行株ZJ-1-2019为PRV强毒株。本次试验为PRV的检测方法提供技术支持,也为PRV遗传变异情况提供参考依据。本实验室利用同源重组的方法成功构建了 rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株,但传统的同源重组方法效率较低,因此,本试验在rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株的基础上,利用CRISPR/Cas9对外源基因EGFP进行大片段的敲除,获得不带有外源基因EGFP的rPRV NY-gE-/gI-/TK-变异株,随后,我们对该毒株的TCID50、一步生长曲线、理化特性以及稳定性进行探究。结果显示,敲除EGFP后并没有显着影响该毒株的病毒感染力,且该毒株的增长速度略低于亲本毒株;理化特性和遗传稳定性结果显示,该毒株与PRV野毒株的理化特性类似且该毒株具有良好的遗传稳定稳定性;将本实验室保存的rPRVNY-gE-/gI-,rPRV NY-gE-/gl-/TK-病毒液经甲醛灭活后,分别与MONTANIDETM SIA201 VG佐剂和MONTANIDETM GEL PR佐剂混合,制成4种灭活制剂,将4种灭活制剂及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,通过ELISA试验、中和试验及攻毒保护试验,来鉴定4种灭活制剂的免疫原性。结果显示,4种灭活制剂均可以有效刺激小鼠产生特异性抗体,且对PRV野毒的攻击均具有一定的抵抗力,其中,rPRV NY-gE-/gl-/TK--GEL灭活苗的免疫效果较差,其余3组无明显差异,但rPRV NY-gE-/gI-/TK--201灭活苗由于缺少TK基因,因此更加安全。本研究将为猪伪狂犬病毒变异株的防控及净化提供理论基础和科学依据。
苗灵燕[3]（2020）在《红茴香注射液对PRRSV和PRV的抗病毒作用及其初步机制研究》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）和伪狂犬病（pseudorabies virus,PR）分别是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和伪狂犬病病毒（PRV）引起的急性传染性疾病,是我国当前规模化猪场常见的病毒性疾病,严重危害养猪业的发展。红茴香注射液（Honghuixiang Injection,HHXI）是由木兰科八角属植物红毒茴（Illicium lanceolatum A.C.Smith）根皮提取制备而成的无菌水溶液,具有活血化瘀、消肿止痛的功效。临床上常用于治疗腰肌劳损,关节损伤或肌肉韧带拉伤及风湿性疼痛等疾病。本课题评价HHXI对PRRSV和PRV的抗病毒作用,并初步探讨其作用机制。1.红茴香注射液对PRRSV的抗病毒作用以MTT法测定HHXI对非洲绿猴胚胎肾Marc-145细胞增殖的影响。利用PRRSV感染Marc-145细胞模型,通过细胞病变（CPE）观察、MTT法以及流式细胞术,检测HHXI对PRRSV的体外抗病毒作用。结果表明,HHXI不仅能直接杀灭PRRSV、阻断PRRSV吸附Marc-145细胞以及抑制PRRSV在Marc-145细胞中复制,还可降低PRRSV感染Marc-145细胞的凋亡率,呈现显着的抗PRRSV作用,半数有效浓度（EC50）范围为生药浓度0.1-0.571 mg/mL,效果优于阳性对照药利巴韦林。同时,HHXI可显着下调感染Marc-145细胞中PRRSV N基因和蛋白表达水平（P<0.01）,降低PRRSV感染细胞中炎性因子基因表达水平。这些结果显示:HHXI可以通过直接与病毒作用以及干预PRRSV诱导的炎症反应发挥保护细胞的作用。2.红茴香注射液对PRV的抗病毒作用以MTT法测定HHXI对非洲绿猴肾细胞Vero细胞增殖的影响。采用PRV感染Vero细胞模型,通过CPE观察、MTT法以及流式细胞术,评价HHXI对PRV的体外抗病毒作用。结果表明:HHXI不仅能显着直接杀灭PRV、阻断PRV吸附Vero细胞、抑制PRV在Vero细胞中复制,降低PRV感染Vero细胞的坏死率,而且可下调PRV感染Vero细胞中PRV gD基因和蛋白表达水平,呈显着的抗PRV作用,其EC50范围为生药浓度0.1-0.508 mg/mL。同时,鉴于PRV的神经嗜性,采用小鼠神经小胶质BV2细胞模型,研究HHXI对PRV诱导BV2细胞炎症反应的影响。结果表明,HHXI可显着降低PRV感染BV2细胞产生NO,下调IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、COX-2、iNOS和IFN-β等炎性因子基因表达水平,抑制NF-κB、细胞外信号相关激酶（ERK）、p38和c-Jun N-末端激酶（JNK）磷酸化,说明HHXI可以通过NF-κB和MAPKs通路抑制PRV诱导BV2细胞产生的炎症反应,从而起到保护细胞作用。最后,以PRV感染小鼠模型评价HHXI对PRV的体内抗病毒作用。结果显示,HHXI可显着提高PRV感染小鼠的存活率以及延长感染小鼠的生存时间,具有预防和治疗作用,效果优于阿昔洛韦（ACV）。脑组织检测结果显示:HHXI可显着减轻PRV感染小鼠脑组织病理变化,降低脑组织病毒载量,下调脑组织中炎性因子基因表达水平,从小鼠体内的角度证明了 HHXI对PRV具有抗病毒活性的作用。综上所述,HHXI对PRRSV和PRV具有显着的抗病毒作用,其确切机制有待进一步深入研究。
张磊[4]（2019）在《河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定》文中研究说明伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种急性烈性传染病,其宿主范围广泛,可引起多种动物感染,表现发热、脑脊髓炎、呼吸和神经障碍。PRV具有潜伏感染能力。猪伪狂犬病病毒可以以气溶胶形式经过易感猪的口鼻传入,侵入呼吸道,经过神经传导入侵中枢神经系统最终导致神经症状。本研究系统的调查和分析了目前河南省部分地区的PRV野毒感染情况进行,了解流行情况,并且对分离到伪狂犬病病毒进行鉴定做遗传进化分析,以了解伪狂犬病毒的变化情况,对伪狂犬病的预防及控制有重要意义。1.河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查自2011年来,猪伪狂犬病在中国大部分地区暴发,野毒感染情况急剧上升,为了研究河南省猪伪狂犬病的野毒感染情况,了解该病的流行情况,对2018年全年送检共387个猪场的8947份猪血清用gE-ELLISA方法进行检测,并且收集河南农业大学动物疫病检测诊断中心近三年的野毒抗体检测数据,对其进行分析。结果显示,2018年河南地区PRV野毒抗体阳性猪场的比率为86.3%,血清PRV野毒抗体阳性率为41.53%,其中产房仔猪的PRV野毒抗体阳性率最高为65.5%,后备母猪的PRV野毒抗体阳性率最低为21.1%。2016-2018年的血清阳性率分别为47.8%、44.1%和41.53%。可以看出,河南省PRV野毒感染情况非常严重,阳性猪场较多,但是近三年的血清阳性率呈逐年下降趋势。2.猪伪狂犬病病毒流行毒的分离鉴定对2017年10月至2018年12月期间,疑似猪伪狂犬病的病料接种到Vero细胞上进行病毒的分离,在接毒48h即出现细胞变圆、收缩和合胞体的产生等典型的PRV细胞病变。对4株分离毒株做PCR鉴定、中和试验和动物试验等鉴定。检测到4株分离株的TCID50分别为:1 0-6.8/0.1ml、10-7.0/0.1ml、10-71/0.1 ml和10-73/0.1ml,并且所有毒株均能被标准的PRV阳性血清特异性中和,确定分离到的所有毒株均为PRV毒株。3.4株PRV分离毒株的gC、gD和gE基因序列分析根椐GenBank中PRV全基因序列,设计了 gE基因、gC基因和gD 基因的全基因特异性引物,将4株PRV分离株的DNA做为PCR扩增的模板,扩增产物测序。采用DNAStar软件将毒株序列与国内外参考毒株序列进行分析比对,做核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分析,并做氨基酸序列的遗传进化树分析。结果显示,gE基因与参考毒株之间核苷酸和氨基酸的相似性分别为97.7%-1 00%和95.7%-100%,gC基因序列与参考毒株核苷酸和氨基酸的相似性分别为95.9%-100%和93.1%-100%,gD基因的核苷酸和氨基酸的相似性与国外毒株相似性分别为98.8%-99.3%和97.5%-99.8%。4株分离株与HN1201株和JS-2012株等国内毒株亲缘关系最近。
姜子义[5]（2018）在《基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究》文中认为近年来RNA分子领域相关技术突破性进展,mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果,mRNA疫苗将mRNA传递至细胞,表达产生蛋白,从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点:它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。猪伪狂犬病是当今危害养猪业最重要的传染病之一,疫苗免疫仍是防控伪狂犬病的最主要方式。然而2012年起,伪狂犬病毒变异株在全国多地流行,造成了养猪业的巨大经济损失。本研究以囊膜糖蛋白gD其分子和功能特性为基础,创新地研究PRV囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗作为候选疫苗对PRV的防治有着重要的潜在价值。猪伪狂犬病毒XJ株为病毒模板,扩增克隆囊膜糖蛋白gD基因,扩增后的囊膜糖蛋白gD基因构建mRNA克隆载体、真核表达载体,实现体外转录mRNA后再与真核表达载体分别进行免疫原性相关研究。主要研究内容为:1.囊膜糖蛋白gD基因的扩增与质粒构建使用生物学软件Premier5.0、Oligo6.0及BLAST对比并参考本实验相关研究,设计了两对特异性引物,第一对引物分别在5’和3’引入BamHI和XhoI酶切位点,第二对引物分别在5’和3’引入Bam HI、T7启动子和XhoI酶切位点。以Vero细胞培养增殖的PRV-XJ病毒抽提的DNA为模板,扩增两段目的片段后分别连接pMD19-T克隆载体和PVAX真核表达载体,构建的克隆重组载体pMD19-gD和真核表达载体PVAX-gD进行双酶切鉴定,送公司测序鉴定,与预期目的基因序列完全一致。2.囊膜糖蛋白gD基因体外转录,mRNA疫苗及PVAX-gD真核表达载体免疫原性相关研究。pMD19-gD酶切后回收获得线性化含有T7启动子的囊膜糖蛋白gD基因片段,加入体外转录体系后获得mRNA,将囊膜糖蛋白gD基因mRNA和真核表达质粒PVAX-gD转染BHK21细胞,40h后富集细胞进行western blot验证,有明确的特异性条带。将囊膜糖蛋白gD基因mRNA脂质体包被制成mRNA疫苗,mRNA疫苗、PVAX-gD真核表达载体进行动物实验,五组BALB/c小鼠大腿肌肉免疫两次,在首免后的第0、2、4、6、8周眼底静脉丛采血分别进行ELISA抗体检测、病毒中和抗体测定;在首免后第4周采血样ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-γ的,同时进行流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群变化情况。实验数据分析对比可得出,mRNA疫苗和PVAX-gD真核表达载体都可以诱导小鼠产生PRV gD特异性抗体和病毒中和抗体,在二免后,特异性抗体水平和病毒中和抗体效价都有显着提高。实验组CD4+/CD8+细胞占比例提高显着,实验组CD4+比例达到50%,相较于阴性组提高了18%;实验组CD8+比例达到16%,相较于阴性提高了3%以上。在IL-2中,mRNA+保护剂组、PVAX-gD组浓度超过阴性小鼠浓度的1.5倍,mRNA组接近;IFN-γ的浓度mRNA+保护剂组、PVAX-gD组为阴性小鼠的2倍,mRNA组接近阴性小鼠的2倍。攻毒保护试验进一步证明了囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗能够抵御病毒攻击,与DNA疫苗效果持平可以诱导良好的体液免疫与细胞免疫应答。
郑思文[6]（2019）在《猪伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株及表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建》文中研究说明猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）和猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是猪的两种重要传染病,目前在我国流行严重,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。能够区分野毒感染和接种疫苗动物（DIVA）的标记疫苗是目前控制和根除PR的有效策略之一。经典的基因缺失疫苗在防控PR中曾经起了重要作用,但近几年由于变异株的出现,导致免疫失败的现象时有发生。PED的再次流行增加了对相关疫苗的需求,目前多数使用的是弱毒活苗,存在一定的安全隐患。随着PRV活载体疫苗的研究应用,外源基因共同表达成为可能,多联疫苗得到了大家的广泛关注。S基因是PEDV的主要保护性抗原,是疫苗研究的首选靶蛋白。因此,本研究先通过同源重组构建针对PR变异株的rPRV-TX-gE-/TK-双基因缺失株,然后将PEDV的S1基因插入该双基因缺失株构建表达PEDV S1蛋白的重组病毒,为这两种猪病的防控提供疫苗候选株。1.猪伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株的构建利用已构建的带有绿色荧光蛋白EGFP标记的pSKTKRL-GFP转移载体,通过蛋白酶K消化和苯酚抽提法提取了 rPRV-TX-gE-单基因缺失株的总DNA,运用磷酸钙沉淀法,将细胞总DNA和转移载体的量以10:1的比例共转染PK15细胞,待细胞出现80%病变时收获病毒,通过空斑纯化法筛选得到带有报告基因的重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-/GFP。再运用Cre重组酶剔除报告基因,经空斑纯化获得剔除报告基因的双缺失株病毒。纯化病毒TK基因的序列测定显示TK基因缺失并保留一个loxP位点,证明双缺失株病毒构建成功,该病毒命名为rPRV-TX-gE-/TK-。2.猪伪狂犬病病毒rPRV-TX-gE-/TK-的生长特性及免疫效力研究对基因缺失株的生长曲线进行了测定,结果显示,单缺失病毒rPRV-TX-gE-在PK15细胞上的增殖速度与野生株相比较略高;双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-在PK15细胞上的增殖速度与野毒株相比略低,差异不显着。在小鼠上进行LDs0的测定,结果显示,PRV-TX、rPRV-TX-gE-和 rPRV-TX-gE-/TK-对小鼠的 LDs0分别为 3.5×103、3.1×103 和>1×106TCID50。表明在gE基因缺失的基础上进一步缺失TK基因可使病毒的毒力显着降低。分别将双基因缺失株rPRV-TX-gE-/TK-和经典疫苗株Bartha-K61株以104 TCIDso剂量肌肉注射的方式免疫小鼠,分别于7 d、14 d和21 d采血分离血清,利用间接ELISA方法分别检测血清中针对变异毒株PRV-TX和经典毒株PRV-SZ的抗体,rPRV-TX-gE-/TK-免疫组在免疫后14 d和21 d均可检测到针对变异毒株PRV-TX与经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体;Bartha-K61免疫组在免疫后14 d和21 d可检测到针对经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体,而针对变异毒株PRV-TX的特异性抗体较低。免疫后21 d分别以104 TCIDs0剂量变异毒株PRV-TX和经典毒株PRV-SZ攻毒,结果表明,变异毒株PRV-TX攻毒后7 d,rPRV-TX-gE-/TK-和 Bartha K61组的保护率分别为100%和0;经典毒株PRV-SZ攻毒后7 d,rPRV-TX-gE-/TK-和Bartha K61组的保护率分别为20%和70%。变异毒株PRV-TX攻毒后14d,rPRV-TX-gE-/TK-的保护率降为30%,结果表明,rPRV-TX-gE-/TK-双缺失株针对变异毒株的致死性攻击7 d内能够提供完全保护;对经典毒株的攻毒也能起到一定的保护作用。而Bartha-K61株只对经典毒株有较好的保护作用,对目前流行的变异毒株没有保护作用。3.表达PEDV S1基因重组伪狂犬病病毒的构建根据GenBank发表的PEDV基因序列设计引物,扩增PEDV的纤突蛋白S1基因,长度为2376 bp,将其克隆至含有PRV的TK基因上、下游同源臂的转移载体pSKTKRL-GFP中,构建重组PRV转移质粒pSKTKRL-PEDV-S1。采用磷酸钙转染法共转染将重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1与带有荧光标记的双缺失株病毒rPRV-TX-gE-/TK--GFP基因组DNA共转染PK15细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV-TX-gE-/TK--S 1,经PCR、间接免疫荧光试验（IFA）试验和Western-blot鉴定,S1基因已成功插入重组病毒rPRV-TX-gE-/TK--S1的基因组中并得以表达。在小鼠上进行 LD50 的测定,结果显示,Bartha-K61 株的 LD50 为 3.5× 104TCID50,而 rPRV-TX-gE-/TK-和 rPRV-TX-gE-/TK--S1 的 LD50均为>1×106,表明表达 PEDV S1 蛋白的 rPRV-gE-/TK--S1与rPRV-TX-gE-/TK-双基因缺失株的LD50相同。
赵军,黄剑波,朱玲,徐志文[7]（2016）在《伪狂犬病毒表达载体的研究进展》文中提出随着生物工程技术的逐步发展和完善,利用伪狂犬病毒作为载体的相关研究也取得了一定突破,为后续的伪狂犬基因工程疫苗研制奠定了基础。文中以缺失处理相关基因的伪狂犬病毒作为载体,与构建的携带外源基因的质粒在细胞内同源重组的研究现状进行了综述。
林群群[8]（2015）在《猪伪狂犬病毒分离鉴定及宿主天然免疫应答的初步研究》文中指出2013年下半年,福建某免疫猪伪狂犬病毒基因缺失弱毒疫苗（Bartha-K16）的规模化猪场大批妊娠母猪发生流产、新生仔猪共济失调等疑似为猪伪狂犬病的症状,为明确发病原因,本研究采集发病仔猪脑、肝脏和肺脏接种MDCK细胞,通过PCR测序比对及动物回归试验证实所分离到的病毒为猪伪狂犬病病毒,并命名为NP株,用Reed-Muench法测定NP株病毒的组织细胞半数感染量（TCID50）为10-9.13/0.1mL,小鼠和家兔回归试验均出现PRV感染的典型症状。本研究为丰富福建省猪群PRV分子流行病学奠定基础。根据GenBank中已公布的PRVgE、gI及TK基因的全基因序列分别设计3条引物,对PRVNP株的gE、gI、TK基因进行了 PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRVgE、gI、TK基因片段相符。同源性分析显示,PRVNP株gE、gI、TK基因与国内分离的PRV毒株推导氨基酸的同源性范围分别为95.7%-99.8%、89.9%-99.5%、96.9%-99.1%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRVNP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株可能为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学有效的新型PRV疫苗提供科学依据。为了进一步研究宿主对PRV天然免疫机制,本试验以野生（WT）和干扰素受体敲除（IFNR/-）的C57BL/6小鼠为动物模型,通过肌肉注射相同剂量的PRVMin-A株,观察并记录攻毒后两种类型小鼠的临床发病情况,并进行小鼠脑组织和肺组织的石蜡切片HE染色对比,脑组织PRVMin-A株gE基因表达量对比及小鼠生存率对比等试验,结果表明IFNR-/-小鼠发病和死亡时间均比WT小鼠早,脑部和肺部的病变较WT的严重,在IFNR-/-小鼠脑部的PRVgE基因表达量更高,且IFNR-/-小鼠的生存率低于WT小鼠。由此表明:IFNR-/-小鼠由于天然免疫信号通路被阻断,直接降低了其对PRV的抵抗能力,为宿主对PRV的天然免疫应答机制的研究提供了重要的参考。
高晓云[9]（2014）在《猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定与生物学特性研究》文中指出伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。PRV可以感染不同年龄段的猪,主要引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎;哺乳仔猪出现神经症状,衰竭死亡,死亡率几乎高达100%。我国自1947年刘永纯从猫体内分离到PRV以来,已有20多个省市报道发生了该病。在生产实践中,主要依靠疫苗尤其是基因工程缺失疫苗对PR进行防制,从而使该病得到有效控制。但2012年春季以来,在河南、吉林、黑龙江等多地区使用PRV基因缺失苗免疫的猪场出现疑似PR病例,本试验分离并鉴定了 PRV河南流行株,进行了gE、gC全基因测序及相关生物学特性研究,探索了河南分离株NY的免疫原性。采用PCR方法对河南不同地市采集的疑似PRV感染病料进行PCR检测,将PCR检测为阳性的病料接种ST细胞,分离到9株PRV,分别命名为NY、ZK、M5、JY、GY、MZ1、MZ2、LGX、ZM。9株病毒均能在ST细胞上出现较稳定的CPE,且均能扩增出特异性gE基因片段（429bp）,传代至第7代时病毒毒力效价基本稳定在105.6TCID50/0.1mL～109TCID50/0.1mL。9株PRV接种6周龄雌性小鼠,72 h小鼠先后均死亡。以NY株为例进行理化特性试验,结果表明,对分析纯氯仿敏感;对酸、碱、热有较强抵抗力;对胰蛋白酶敏感;对紫外不敏感。经电镜观察,可看到大小均一、近似圆形的病毒粒子,大小约110～150nm,囊膜表面有呈放射状排列的纤突。证实分离的9株病毒均为PRV野毒株。参照GenBank中发表的gE基因序列（AF171937）,使用引物设计软件Primer5.0设计了 1对引物,扩增9株PRV野毒株的gE全基因片段,克隆到克隆载体pMD（?）18-T中,并对其序列进行测定,以及gE基因序列分析及进化分析。结果表明9株分离株之间的核苷酸同源性介于99.9%～100%:9株PRV分离株处于一个相对独立的小分支上,且与近年国内的分离毒株具有较近的亲缘关系;其gE基因推导的氨基酸序列均在48位和494位均插入1个天冬氨酸,均在448位和510位发生氨基酸置换（V448I,G510S）,仅NY株在385位发生氨基酸置换（T→M）,仅ZK株在530位发生氨基酸置换（S→G）。参照GenBank中发表的gC基因序列,使用引物设计软件设计了 1对引物,扩增9株伪狂犬野毒株的gC全基因片段,并对其序列进行测定,以及gC基因推导的氨基酸进行分析。9株PRV分离株之间的核苷酸同源性介于99.9%～100%,且均在第63位氨基酸后连续插入或缺失7个氨基酸（AASTPA）。将猪伪狂犬病毒NY株大量培养后,经0.3%甲醛灭活,加入弗氏佐剂制备PRVNY株灭活油乳剂。用PRVNY株灭活油乳剂、Bartha-K61株商品苗和湖北98株商品苗分别免疫接种6周龄雌性昆明小鼠,28 d后采血分离血清,进行血清中和试验,并用PRVNY株进行攻毒保护试验,结果PRV NY株灭活油乳剂免疫组小鼠中和抗体最高,且小鼠完全被保护,而Bartha-K61株商品苗和湖北98株商品苗免疫小鼠仅部分保护,且中和抗体低,表明PRV NY株与Bartha-K61株和湖北98株存在一定的抗原交叉性,但抗原差异较大。
裴丽华[10]（2014）在《猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立》文中研究说明猪伪狂犬病（porcine Pseudorabies, PR）是由猪疱疹病毒Ⅰ型（pseudorabiesvirus,PRV）引起猪的一种急性传染病。该病已在世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。结合相应的鉴别诊断方法，并采取相应的控制措施是预防该病的有效手段。gE糖蛋白是其主要的毒力因子之一，gE基因的缺失可以使PRV毒力大大降低，但不影响其免疫原性。目前gE基因缺失弱毒株已经在世界各国广泛使用。由于缺失疫苗与野毒株之间在gE基因上的差别，因此，gE基因可以区分疫苗免疫和野毒感染。本研究克隆表达了gE的主要抗原表位区，并将其作为包被抗原，建立了快速检测猪伪狂犬病的血清学诊断方法。根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病毒gE全基因序列，设计合成一对特异性引物，采用PCR技术扩增gE全基因，克隆后进行序列测定，测序正确的质粒命名为PRV-gE。根据gE糖蛋白及原核表达载体pET32a的特点，选取一段抗原性较高的序列用Primer5.0软件设计另一对特异性引物。从重组质粒PRV-gE中扩增gE基因抗原性较高的序列（gE，），将其与原核表达载体pET32a连接，构建表达质粒pET32a-gE，。经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为45ku的蛋白，与预期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中。利用原核表达载体pET32a上带有的His标签对pET32a-gE，重组蛋白进行纯化，纯化蛋白的Western-blotting结果显示，该重组蛋白与PRV阳性血清具有良好的反应原性。表明分子质量约45ku的蛋白即为目的蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，通过系列反应条件的优化，建立了检测PRV抗体的间接ELISA检测方法。优化结果显示，该方法的抗原最佳包被浓度为6.0μg/mL；封闭液为含5%犊牛血清的PBST工作液；阴阳性血清最佳稀释度为1∶40，37℃作用1h；酶标抗体最佳稀释度为1∶200，37℃作用1h；底物显色时间为15min。与IDEXX公司PRV ELISA试剂盒相比，特异性为84%，敏感性为90%，符合率为87%。该方法与CSFV、PRRSV、PPV阳性血清不发生交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均值都小于10%，具有较好的特异性和重复性，为检测PRV提供了一种简便的血清学诊断方法。
二、伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建（论文提纲范文）
（1）PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 1 PRV的病原学 |
| 1.1 PRV的分类地位 |
| 1.2 PRV的病毒粒子结构 |
| 1.3 PRV的理化特性 |
| 1.4 PRV的血凝性和培养特性 |
| 1.5 PRV的病原性及致病机理 |
| 2 PRV的分子生物学特性 |
| 2.1 PRV的基因组特性 |
| 2.2 PRV的主要基因及其功能 |
| 3 猪伪狂犬病毒病的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 解剖学与组织病理学诊断 |
| 3.3 分子病原学诊断 |
| 3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.3.2 环介导恒温扩增技术(LAMP) |
| 3.4 血清学诊断 |
| 3.4.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.4.2 间接免疫荧光法(IFA) |
| 3.4.3 血清中和试验(SNT) |
| 3.4.4 乳胶凝集试验(LAT) |
| 3.4.5 免疫胶体金技术 |
| 3.5 病毒分离 |
| 4 猪伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 传统弱毒疫苗 |
| 4.3 亚单位疫苗 |
| 4.4 核酸疫苗 |
| 4.5 伪狂犬重组活载体疫苗 |
| 4.6 伪狂犬基因缺失苗 |
| 4.6.1 第一代基因缺失苗 |
| 4.6.2 第二代双基因缺失苗 |
| 4.6.3 第二代三基因缺失苗 |
| 5 猪伪狂犬的流行状况 |
| 5.1 猪伪狂犬国外流行状况 |
| 5.2 猪伪狂犬病国内流行状况 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 试验一 鉴别猪伪狂犬病病毒强毒与疫苗弱毒PCR方法的的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株及临床样品 |
| 1.1.2 主要试剂及设备 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病料的研磨与DNA的提取 |
| 1.4 单项PCR扩增 |
| 1.5 DNA纯化回收,连接及转化 |
| 1.5.1 DNA纯化回收 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.5.4 蓝白斑筛选及测序 |
| 1.6 双重PCR扩增 |
| 1.7 双重PCR的特异性试验 |
| 1.8 双重PCR的灵敏度试验 |
| 1.9 双重PCR的重复性试验 |
| 1.10 临床应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 强毒株PCR扩增结果 |
| 2.2 弱毒株PCR扩增结果 |
| 2.3 双重PCR反应条件优化结果 |
| 2.4 双重PCR检测 |
| 2.5 双重PCR的灵敏度试验 |
| 2.6 双重PCR的重复性试验 |
| 2.7 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒强毒株的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、试验动物及临床样品 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 工具酶及试剂 |
| 1.2 病毒的PCR扩增 |
| 1.3 PRV的分离及其gE基因的检测 |
| 1.4 ST细胞中病毒滴度TCID50 的测定 |
| 1.5 接种小鼠试验 |
| 1.6 分离株的理化特性试验 |
| 1.7 一步生长曲线的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 组织病料PRV的 PCR检测结果 |
| 2.2 PRV的细胞培养与CPE的观察结果 |
| 2.3 PRVgE基因检测结果 |
| 2.4 PRV病毒含量测定结果 |
| 2.5 接种小鼠试验结果 |
| 2.6 分离株的理化特性试验结果 |
| 2.7 分离株的一步生长曲线测定结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 PRV分离株gB、gD基因的扩增及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒增殖培养及其DNA的提取 |
| 1.4 PRV gB、gD全基因的PCR扩增、克隆与测序 |
| 1.5 基因的遗传进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRV gB、gD全基因的扩增结果 |
| 2.2 PRV gB、gD全基因重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.3 gB全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.4 gB基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.5 gB基因的遗传进化树分析 |
| 2.6 gD全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.7 gD基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.8 gD基因的遗传进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（2）PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 伪狂犬病 |
| 2 伪狂犬病病毒 |
| 2.1 伪狂犬病病毒的分子生物学 |
| 2.2 伪狂犬病病毒的基因组 |
| 2.3 伪狂犬病病毒的理化特性 |
| 3 猪伪狂犬病病毒常见的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 病理组织学诊断 |
| 3.3 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) |
| 3.4 酶联免疫吸附试验(Hemagglutination-hemagglutination inhibition,ELISA) |
| 3.5 血清中和试验(Serum Neutralization,SN) |
| 4 猪伪狂犬病毒疫苗 |
| 4.1 灭活苗 |
| 4.2 弱毒疫苗 |
| 4.3 基因缺失疫苗 |
| 4.3.1 第一代基因缺失疫苗-单基因缺失疫苗 |
| 4.3.2 第二代基因缺失疫苗-双基因缺失疫苗 |
| 4.3.3 第二代基因缺失疫苗-三基因缺失疫苗 |
| 4.4 亚单位疫苗 |
| 4.5 DNA疫苗 |
| 4.6 猪伪狂犬病病毒重组疫苗 |
| 5 猪伪狂犬病的防控 |
| 6 CISPR/Cas9系统 |
| 6.1 CRISPR/Cas9系统的来源 |
| 6.2 CRISPR/Cas9系统的基因结构与工作机制 |
| 6.3 CRISPR/Cas9的应用 |
| 6.3.1 CRISPR/Cas9在植物中的应用 |
| 6.3.2 CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中的应用 |
| 6.3.3 CRISPR/Cas9在病毒中的应用 |
| 7 本研究的目的和意义 |
| 试验一 猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株及临床样品 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病料的研磨与DNA的提取 |
| 1.4 PRV的PCR扩增 |
| 1.5 DNA纯化回收,连接及转化 |
| 1.5.1 DNA的纯化 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.6 蓝白斑筛选及测序 |
| 1.7 阳性质粒的提取 |
| 1.8 PRV荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 1.8.1 PRV荧光定量PCR最佳反应条件的摸索及标准曲线的建立 |
| 1.8.2 PRV荧光定量PCR的特异性和敏感性分析 |
| 1.8.3 PRV荧光PCR重复性试验 |
| 1.8.4 临床样品检测 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 标准品模板的制备结果 |
| 2.2 PRV荧光定量PCR标准曲线的建立结果 |
| 2.3 荧光定量PCR特异性试验与灵敏性试验结果 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 临床样品PRV的检测 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒的分离及gE基因的遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒的分离培养 |
| 1.4 病毒的纯化 |
| 1.5 病毒在ST细胞上TCID_(50)的测定 |
| 1.6 PRV血清中和试验鉴定 |
| 1.7 病毒荧光定量PCR鉴定 |
| 1.8 PRVgE基因的扩增 |
| 1.8.1 gE全基因的扩增纯化及测序 |
| 1.8.2 序列测定与分析 |
| 1.9 PRV JZ-1-2019株的一步生长曲线的测定 |
| 1.10 PRV JZ-1-2019株动物回归试验 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 PRV的分离纯化结果 |
| 2.2 PRV TCID_(50)的测定结果 |
| 2.3 PRV的血清中和试验结果 |
| 2.4 PRV的荧光定量PCR鉴定结果 |
| 2.5 gE全基因的扩增结果 |
| 2.6 PRV分离株gE基因的序列分析结果 |
| 2.6.1 PRV分离株gE基因的同源性分析结果 |
| 2.6.2 PRV分离株gE全基因推导氨基酸的序列分析 |
| 2.6.3 PRV分离株gE全基因系统发育进化关系分析 |
| 2.7 猪伪狂犬病病毒变异株在ST细胞上的增殖规律 |
| 2.8 猪伪狂犬病病毒变异株致病性结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 PRV流行株三基因缺失变异rPRV NY-gE-/gI-/TK-的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞、菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.1.3 敲除载体的构建技术路线 |
| 1.2 病毒增殖培养 |
| 1.3 待检样品处理与DNA提取 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 TK及EGFP基因的扩增 |
| 1.6 CRISPR/Cas9菌液的复苏、挑斑及质粒的提取 |
| 1.7 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-EGFP及PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK双敲除载体的构建 |
| 1.8 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK及PX459-gRNA1/2- EZ-gRNA3/4-EGFP双敲除载体的构建 |
| 1.9 敲除载体PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK及PX459-gRNA1/2- EZ-gRNA3/4-EGFP的转染 |
| 1.10 接毒 |
| 1.11 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK-的挑斑纯化 |
| 1.12 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-株的的TCID_(50)的测定 |
| 1.13 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-株的一步生长曲线的测定 |
| 1.14 重组病毒rPRV NY-gE-/gI~-/TK~-的理化特性检测 |
| 1.15 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-遗传稳定性的评价 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TK与EGFP基因的扩增结果 |
| 2.2 PX459与EZ载体的提取结果 |
| 2.3 PX459与EZ载体的酶切结果 |
| 2.4 PX459-gRNA1/2-TK、EZ-gRNA3/4-TK、PX459-gRNA1/2-EGFP及EZ-gRNA3/4-EGFP载体的构建结果 |
| 2.5 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-EGFP及PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK双敲除载体菌液PCR检测结果 |
| 2.6 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的拯救结果 |
| 2.7 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的TCID_(50)的测定结果 |
| 2.8 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的—步生长曲线测定结果 |
| 2.9 重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的理化特性检测 |
| 2.10 rPRV NY-gE~-/gl~-/TK~-遗传稳定性的评价结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 基因缺失伪狂犬变异株灭活制剂免疫原性初步探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 疫苗和毒株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂仪器 |
| 1.2 灭活疫苗的制备 |
| 1.2.1 rPRV NY-gE~-/gI~-及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-缺失毒的灭活 |
| 1.2.2 rPRV NY-gE~-/gI~--201、rPRV NY-gE~-/gI~--GEL、rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--201以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--GEL灭活制剂的制备 |
| 1.3 小鼠免疫试验 |
| 1.4 间接ELISA检测 |
| 1.5 血清中和试验 |
| 1.6 攻毒保护试验 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灭活制剂的制备结果 |
| 2.1.1 rPRV NY-gE~-/gI~-及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-缺失毒的灭活 |
| 2.1.2 rPRV INY-gE~-/gI~--201、rPRV NY-gE~-/gI~--GEL、rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--201以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--GEL灭活制剂的制备结果 |
| 2.2 间接ELISA抗体检测结果 |
| 2.3 PRV的血清中和试验结果 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 2.5 荧光定量PCR方法检测攻毒小鼠主要组织中PRV载量 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录：攻读硕士期间发表的论文 |
（3）红茴香注射液对PRRSV和PRV的抗病毒作用及其初步机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 红茴香及红茴香注射液研究进展 |
| 1. 化学成分 |
| 2. 药理作用 |
| 3. 临床应用 |
| 4. 结语 |
| 第二章 PRRSV及中药抗PRRSV活性相关研究进展 |
| 1. PRRSV病原学 |
| 2. 中药体外抗PRRSV作用 |
| 3. 结语 |
| 第三章 伪狂犬病及其防治研究进展 |
| 1. PRV病原学 |
| 2. 伪狂犬病流行病学 |
| 3. 伪狂犬病临床表现和病理变化 |
| 4. 伪狂犬病的诊断 |
| 5. 伪狂犬病的防控 |
| 6. 抗伪狂犬病毒的药物 |
| 7. 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 红茴香注射液抗PRRSV作用及其初步机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 供试药品 |
| 1.4 实验细胞 |
| 1.5 实验病毒 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Marc-145细胞的复苏 |
| 2.2 Marc-145细胞的传代及培养 |
| 2.3 细胞接种与培养 |
| 2.4 PRRSV CH-1R株TCID_(50)测定 |
| 2.5 HHXI对Marc-145细胞毒性测定 |
| 2.6 HHXI对PRRSV的杀灭作用 |
| 2.7 HHXI对PRRSV的阻断作用 |
| 2.8 HHXI对PRRSV的抑制作用 |
| 2.9 流式细胞术(Flow cytometry,FCM) |
| 2.10 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.11 免疫荧光分析(IFA) |
| 2.12 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 2.13 数据分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 PRRSV毒力测定 |
| 3.2 HHXI对Marc-145细胞增殖的影响 |
| 3.3 HHXI对PRRSV的杀灭作用 |
| 3.4 HHXI对PRRSV吸附细胞的阻断作用 |
| 3.5 HHXI对PRRSV增殖的抑制作用 |
| 3.6 HHXI对PRRSV感染Marc-145细胞凋亡和坏死的影响 |
| 3.7 HHXI对感染Marc-145细胞PRRSV N蛋白mRNA表达的影响 |
| 3.8 HHXI对PRRSV感染Marc-145细胞PRRSVN蛋白阳性细胞数的影响 |
| 3.9 HHXI对PRRSV感染Marc-145细胞N蛋白表达的影响 |
| 3.10 HHXI对PRRSV感染Marc-145细胞炎性因子mRNA表达的影响 |
| 4. 分析与讨论 |
| 第三章 红茴香注射液抗PRV作用及其初步机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要 |
| 1.3 供试药品 |
| 1.4 实验细胞 |
| 1.5 实验病毒 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞的复苏、传代及培养 |
| 2.2 细胞接种与培养 |
| 2.3 PRV的TCID50测定 |
| 2.4 HHXI对Vero细胞和BV2细胞增殖的影响 |
| 2.5 HHXI对PRV的杀灭作用 |
| 2.6 HHXI对PRV的阻断作用 |
| 2.7 HHXI对PRV的抑制作用 |
| 2.8 流式细胞术(FCM) |
| 2.9 HHXI对PRV诱导产生的NO的影响 |
| 2.10 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.11 免疫荧光分析(IFA) |
| 2.12 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 2.13 HHXI体内抗PRV作用评价 |
| 2.14 数据分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 PRV对Vero细胞和BV2细胞的毒力 |
| 3.2 HHXI对Vero细胞和BV2细胞增殖的影响 |
| 3.3 HHXI对PRV的杀灭作用 |
| 3.4 HHXI对PRV吸附细胞的阻断作用 |
| 3.5 HHXI对PRV增殖的抑制作用 |
| 3.6 HHXI对PRV感染Vero细胞凋亡和坏死的影响 |
| 3.7 HHXI对PRV gD基因表达的影响 |
| 3.8 HHXI对PRV感染Vero细胞病毒阳性细胞数的影响 |
| 3.9 HHXI对PRV感染Vero细胞病毒蛋白表达的影响 |
| 3.10 HHXI对PRV诱导BV2细胞产生NO的影响 |
| 3.11 HHXI对PRV感染BV2细胞炎性因子mRNA表达的影响 |
| 3.12 HHXI对PRV感染BV2细胞MAPK和NF-κB蛋白表达的影响 |
| 3.13 HHXI对小鼠的毒性反应 |
| 3.14 HHXI体内抗PRV作用 |
| 3.15 HHXI对PRV感染小鼠脑组织病理变化的影响 |
| 3.16 HHXI对PRV感染小鼠脑组织病毒载量的影响 |
| 3.17 HHXI对PRV感染小鼠脑组织中炎性因子mRNA表达的影响 |
| 4. 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基因组 |
| 1.2 病毒的相关蛋白 |
| 1.3 病毒的潜伏感染机制 |
| 2 流行现状 |
| 2.1 国外的流行状况 |
| 2.2 国内的流行状况 |
| 3 主要诊断方法 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 分子诊断 |
| 3.2.1 核酸探针诊断 |
| 3.2.2 常规PCR诊断 |
| 3.2.3 多重PCR诊断 |
| 3.2.4 荧光定量PCR诊断 |
| 3.2.5 环介导等温扩增 |
| 3.3 血清检测 |
| 3.3.1 中和试验 |
| 3.3.2 酶联免疫吸附试验 |
| 3.3.3 乳胶凝集试验 |
| 3.3.4 免疫荧光试验 |
| 4 疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 转因缺失疫苗 |
| 4.4 新型疫苗 |
| 4.4.1 亚单位疫苗 |
| 4.4.2 重组疫苗 |
| 4.4.3 核酸疫苗 |
| 试验一 河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 血清样品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验器材 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 血清处理 |
| 1.2.2 PRV野毒抗体的检测 |
| 1.2.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同地区猪场PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.2 不同年龄段猪群PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.3 不同规模猪场PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.4 近三年PRV野毒抗体阳性率 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒流行毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料和细胞 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要器材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料的采集和处理 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 细胞传代 |
| 1.2.4 病毒分离 |
| 1.2.5 DNA的提取 |
| 1.2.6 PCR鉴定 |
| 1.2.7 病毒TCID_(50)测定 |
| 1.2.8 病毒中和试验 |
| 1.2.9 动物试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 PCR鉴定 |
| 2.3 TCID_(50)的测定 |
| 2.4 病毒中和试验 |
| 2.5 动物试验 |
| 3 讨论 |
| 试验三 4株PRV分离毒株的gC、gD和gE基因序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要器材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计及合成 |
| 1.2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 目的基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 gE、gC和gD基因的PCR扩增 |
| 2.2 gE基因序列分析 |
| 2.2.1 gE基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.2.2 gE基因进化分析 |
| 2.3 gC基因序列分析 |
| 2.3.1 gC基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.3.2 gC基因进化分析 |
| 2.4 gD基因序列分析 |
| 2.4.1 gD基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.4.2 gD基因进化分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（5）基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病研究进展 |
| 1.1 病原及理化特征 |
| 1.2 病毒分子生物学特征 |
| 1.3 病毒复制过程 |
| 1.4 PRV逃逸宿主免疫系统机制 |
| 1.5 囊膜糖蛋白gD的结构与功能 |
| 2 mRNA疫苗 |
| 2.1 mRNA疫苗的分子构成 |
| 2.2 mRNA疫苗的包被 |
| 2.3 mRNA疫苗研究 |
| 2.4 核酸类疫苗免疫应答过程 |
| 3 目的和意义 |
| 第二章 PRV-GD基因mRNA克隆质粒和真核质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 囊膜糖蛋白gD基因扩增 |
| 2.2 mRNA克隆载体的酶切鉴定及测序结果 |
| 2.3 真核表达载体PVAX-gD酶切鉴定及测序结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pMD19-GD克隆载体酶切线性化体外转录,mRNA疫苗及真核表达载体免疫原性相关研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western blot结果分析 |
| 2.2 ELISA检测特异性抗体结果 |
| 2.3 病毒中和抗体检测 |
| 2.4 T淋巴细胞亚群数量分析和ELISA测定细胞因子 |
| 2.5 小鼠攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 mRNA疫苗诱导动物的免疫应答反应 |
| 3.2 mRNA疫苗诱导动物的免疫保护 |
| 3.3 核酸类疫苗免疫途径及作用方式 |
| 3.4 mRNA的体外转录及包被 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）猪伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株及表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: 猪伪狂犬病病毒和疫苗研究进展 |
| 1 病毒特征 |
| 2 病毒基因组特征 |
| 3 PRV毒力相关的蛋白及功能研究 |
| 4 伪狂犬病病毒变异株的研究概况 |
| 5 伪狂犬病疫苗研究进展 |
| 6 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 猪伪狂犬病病毒gE/TK基因双缺失毒株的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 伪狂犬病病毒rPRV-TX-gE~-/TK~-的生长特性及免疫效力研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达PEDV S1基因重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）伪狂犬病毒表达载体的研究进展（论文提纲范文）
| 1??PRV基因组的结构 |
| 2??伪狂犬病毒载体的优势 |
| 2.1??安全性好 |
| 2.2??外源基因容量大 |
| 2.3??生产工艺简单, 原材料来源方便 |
| 2.4??生产成本低 |
| 2.5??宿主范围广 |
| 3??重组伪狂犬病毒的构建 |
| 3.1??构建原理? |
| 3.2??转移载体的构建 |
| 3.3?伪狂犬基因缺失突变株的制备 |
| 3.4??转染方法 |
| 3.5??筛选方法? |
| 3.6??外源基因的表达调控结构? |
| 3.7??构建重组病毒注意事项? |
| 4??国内外伪狂犬病毒表达载体的研究进展 |
| 5??展望 |
（8）猪伪狂犬病毒分离鉴定及宿主天然免疫应答的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PRV特征 |
| 2 PRV的主要糖蛋白及其相关功能 |
| 3 PRV主要酶类 |
| 4 PRV的生物学特性 |
| 4.1 流行病学特点 |
| 4.2 发病机制 |
| 4.3 临床症状及病理变化 |
| 5 诊断方法 |
| 6 天然免疫机制的研究 |
| 6.1 模式识别受体与天然免疫机制简介 |
| 6.2 诱导产生干扰素(IFNs)的核酸感受器 |
| 6.2.1 诱导产生干扰素(IFNs)的RNA感受器 |
| 6.2.2 诱导产生干扰素(IFNs)的DNA感受器 |
| 6.3 介导产生Ⅰ型干扰素(IFN-I)的核心信号通路 |
| 6.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I)诱导的下游免疫调控机制 |
| 6.5 PRV与宿主天然免疫的研究 |
| 7 研究目的和意义 |
| 第二章 PRV NP株的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料采集处理 |
| 1.2 主要试验试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 1.4 试验动物及细胞 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 伪狂犬病病毒NP株核酸提取及目的基因的PCR扩增 |
| 1.6.1 目的基因PCR扩增 |
| 1.6.2 PCR产物回收 |
| 1.7 细胞培养 |
| 1.7.1 细胞传代 |
| 1.7.2 细胞冻存 |
| 1.7.3 细胞复苏 |
| 1.8 病毒的分离 |
| 1.8.1 PRV NP株接种MDCK细胞 |
| 1.8.2 PRV NP株空斑纯化 |
| 1.8.3 PRV NP株TCID_(50)测定 |
| 1.9 PRV NP株感染小鼠试验 |
| 1.10 PRV NP株感染家兔试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离结果 |
| 2.1.1 病毒gE基因的PCR检测结果 |
| 2.2 分离株特性的研究 |
| 2.2.1 病毒在MDCK细胞的增殖 |
| 2.2.2 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.3 动物感染试验 |
| 2.3.1 小鼠感染试验 |
| 2.3.2 家兔感染试验 |
| 3 讨论 |
| 第三章 PRV NP株gE,gI,TK基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试验试剂 |
| 1.1.2 菌种、毒株和质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 病毒基因组的提取、目的基因的扩增与克隆 |
| 1.2.3 目的基因的序列测定与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒gE,gI,TK基因的PCR结果 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 基因序列的测定分析 |
| 2.4 同源性分析结果 |
| 2.4.1 不同毒株PRV gE,g,TK基因核苷酸及氨基酸同源性分析 |
| 2.5 遗传进化树分析 |
| 2.5.1 gE,gI,TK基因的遗传进化树分析 |
| 2.6 gE,gI,TK基因推导的氨基酸序列分析 |
| 2.6.1 gE基因推导的氨基酸序列分析 |
| 2.6.2 gI基因推导的氨基酸序列分析 |
| 2.6.3 TK基因推导的氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 WT及IFNR~(-/-)小鼠对PRV Min-A株天然抵抗力的对比分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.2 毒株、试验动物 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.1.4 试验仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 PRVMin-A株的扩增 |
| 1.2.2 PRV Min-A株TCID_(50)测定 |
| 1.2.3 小鼠细胞因子引物设计 |
| 1.2.4 C57BL/6小鼠试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV Min-A株TCID_(50)测定结果 |
| 2.2 野生型C57BL/6小鼠注射不同浓度的PRV Min-A株病毒液后发病死亡结果统计 |
| 2.3 临床症状对比结果 |
| 2.4 脑和肺组织石蜡切片HE染色结果 |
| 2.5 检测小鼠脑组织中PRV Min-A株gE的表达量 |
| 2.6 小鼠生存率结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（9）猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定与生物学特性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒的病原学 |
| 1.1 PRV的分类地位 |
| 1.2 PRV的形态和理化特性 |
| 1.3 PRV的血凝性 |
| 1.4 PRV的培养特性 |
| 1.5 PRV的病原性 |
| 1.6 PRV对猪的致病性 |
| 2 伪狂犬病毒的流行现状及危害 |
| 3 伪狂犬病毒的分子生物学特性 |
| 3.1 伪狂犬病毒的基因组 |
| 3.2 伪狂犬病毒的蛋白及其功能 |
| 4 PR的免疫预防 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 自然弱毒苗 |
| 4.3 基因缺失疫苗 |
| 4.4 发展中的疫苗 |
| 引言 |
| 试验一 猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 组织病料中PRV DNA的PCR检测 |
| 1.4 病毒的分离与培养 |
| 1.5 PRV gE基因的检测 |
| 1.6 病毒滴度TCID_(50)的测定 |
| 1.7 PRV NY株理化特性研究 |
| 1.8 PRV NY株形态学观察 |
| 1.9 PRV NY株形态学观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 组织病料中PRV DNA的PCR检测结果 |
| 2.2 PRV的细胞培养与细胞病变观察 |
| 2.3 PRV gE基因的PCR扩增结果 |
| 2.4 病毒滴度TCID_(50)结果 |
| 2.5 病毒感染小鼠试验结果 |
| 2.6 PRV NY株理化特性研究结果 |
| 2.7 病毒形态学观察结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病毒河南流行株gE全基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 病毒DNA的提取及gE全基因的扩增 |
| 1.4 PRV gE全基因的克隆和鉴定 |
| 1.5 PRV gE全基因的序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV gE全基因的扩增结果 |
| 2.2 PRV gE全基因重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.3 PRV gE全基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 PRV gE全基因的测序结果 |
| 2.5 PRV分离株gE全基因序列同源性分析 |
| 2.6 PRV分离株gE全基因推导氨基酸的序列分析 |
| 2.7 PRV分离株gE全基因系统发育进化关系分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 猪伪狂犬病毒河南流行株gC全基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 病毒DNA的提取及gC全基因的扩增 |
| 1.4 PRVgC全基因的克隆和鉴定 |
| 1.5 PRVgC全基因的序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV gC全基因的扩增结果 |
| 2.2 PRV gC全基因重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.3 PRV gC全基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 PRV gC全基因的测序结果 |
| 2.5 PRV分离株gC全基因序列同源性分析 |
| 2.6 PRV分离株gC全基因推导氨基酸的序列分析 |
| 2.7 PRV分离株gC全基因系统发育进化关系分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 猪伪狂犬病毒NY株的免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒滴度TCID_(50)测定结果 |
| 2.2 病毒灭活效果检验 |
| 2.3 PRV NY株乳化剂的鉴定 |
| 2.4 PRV NY株攻毒试验结果 |
| 2.5 PRV NY株中和试验结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（10）猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪伪狂犬病的流行新特点 |
| 1.2 病原学及致病机理 |
| 1.2.1 病毒粒子特征 |
| 1.2.2 病毒的理化特性 |
| 1.2.3 病毒的培养及保存 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.3 PRV 基因组 |
| 1.4 PRV 病毒囊膜及主要糖蛋白 |
| 1.4.1 病毒囊膜 |
| 1.4.2 必需糖蛋白 |
| 1.4.3 非必需糖蛋白 |
| 1.5 gE 基因的生物学特性及其在诊断防治中的意义 |
| 1.6 猪伪狂犬病的诊断 |
| 1.6.1 病原学诊断方法 |
| 1.6.2 血清学诊断方法 |
| 1.6.3 强弱毒鉴别诊断 |
| 1.7 猪伪狂犬病的防治 |
| 1.7.1 弱毒疫苗 |
| 1.7.2 灭活疫苗 |
| 1.7.3 基因缺失疫苗 |
| 1.7.4 核酸疫苗 |
| 1.7.5 亚单位疫苗 |
| 1.7.6 重组疫苗 |
| 1.8 本课题研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 抗体 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 病料及血清 |
| 2.1.4 其他相关实验材料 |
| 2.1.5 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳用溶液 |
| 2.1.7 制备感受态细胞和转化主要用液 |
| 2.1.8 原核表达主要用液 |
| 2.1.9 SDS-PAGE 电泳溶液 |
| 2.1.10 Western-blotting 用溶液 |
| 2.1.11 ELISA 用溶液 |
| 2.1.12 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PRV gE 全基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.2 PRV- gE 优势抗原表位的扩增及重组表达质粒的构建 |
| 2.2.3 重组表达质粒 pET32a-gE，的诱导表达及表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.4 重组 pET32a-gE，蛋白间接 ELISA 检测方法的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 PRV-gE 全基因扩增及鉴定 |
| 3.1.2 PRV gE 优势抗原表位的克隆及原核表达 |
| 3.1.3 重组蛋白间接 ELISA 检测方法建立的结果 |
| 3.2 分析 |
| 3.2.1 PRV gE 全基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.2 PRV gE 优势基因的亚克隆及原核表达 |
| 3.2.3 间接 ELISA 方法的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建（论文参考文献）
- [1]PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析[D]. 顾阳. 河南农业大学, 2020(04)
- [2]PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究[D]. 赵宇. 河南农业大学, 2020(06)
- [3]红茴香注射液对PRRSV和PRV的抗病毒作用及其初步机制研究[D]. 苗灵燕. 浙江大学, 2020(01)
- [4]河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定[D]. 张磊. 河南农业大学, 2019(04)
- [5]基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究[D]. 姜子义. 四川农业大学, 2018(02)
- [6]猪伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株及表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建[D]. 郑思文. 扬州大学, 2019(02)
- [7]伪狂犬病毒表达载体的研究进展[J]. 赵军,黄剑波,朱玲,徐志文. 猪业科学, 2016(02)
- [8]猪伪狂犬病毒分离鉴定及宿主天然免疫应答的初步研究[D]. 林群群. 福建农林大学, 2015(05)
- [9]猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定与生物学特性研究[D]. 高晓云. 河南农业大学, 2014(07)
- [10]猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 裴丽华. 河北农业大学, 2014(03)