一、利用体细胞核移植技术生产转基因牛（论文文献综述）
姚顺[1]（2020）在《利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎》文中提出CRISPR/Cas9是划时代的第三代基因编辑技术。IGF2基因编码胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）,该生长因子是一种促进细胞分裂的多肽,参与生长发育,影响骨骼肌质量和脂肪沉积。IGF2基因具有高度的保守性,其内含子3上的阻遏物锌指蛋白6（Zinc finger bed domain containing,ZBED6）结合位点被破坏,会引起骨骼肌中IGF2的表达量上调,进而影响肌肉生长和脂肪沉积。西门塔尔为肉、乳兼用型牛种,它的产肉性能及泌乳性能与纯种奶牛相当。IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除对IGF2表达量影响的相关研究多集中于小鼠和猪,牛上鲜有报道,需要开展相关研究,故此,本研究拟用CRISPR/Cas9技术对牛IGF2基因进行编辑并制备基因编辑胚胎,以期探究牛IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除IGF2表达量变化情况,为生产高产肉牛奠定理论基础和制备肉牛育种新材料。本研究主要结果如下:1.利用CRISPR Design软件对牛IGF2第三内含子中抑制因子ZBED6结合位点及其附近序列设计5个单一导向RNA（Single-guide RNA,sg RNA）并成功构建对应的PX458-sg RNA基因打靶载体。随后,在细胞水平借助T7E1酶切结合T-A克隆检测的方法验证编辑效率,其中sg RNA1效率最高,约为40%。2.通过流式细胞分选结合无限稀释手段,成功获得10株西门塔尔IGF2中ZBED6结合位点完全敲除的细胞系,其中1株为纯合突变。3.在小鼠C2C12细胞中利用荧光素酶试验和荧光定量PCR在牛成纤维细胞上分析突变对IGF2表达的影响,结果显示IGF2非编码区突变可增强IGF2启动子3活性,在转录水平提高IGF2表达。4.运用体细胞核移植技术获得34枚42号纯合突变细胞系克隆胚胎并利用T-A克隆检测了9枚克隆胚胎ZBED6结合位点敲除情况,结果获得100%的敲除效率。随后,经PCR鉴定,42号细胞系及其制备的克隆胚胎均无载体骨架残留,无外源基因引入,具生物安全性,可用于胚胎移植。综上所述,本试验构建的CRISPR/Cas9系统可有效编辑牛肌肉生长相关基因IGF2并提高其表达水平,此外,本试验还借助体细胞核移植技术获得了可用于胚胎移植的牛IGF2基因编辑胚胎。本试验结果为高产肉牛的分子育种奠定了基础。
李昊[2]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中指出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
王明[3]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中研究表明外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
高元鹏[4]（2017）在《应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛》文中进行了进一步梳理结核病是一种由结核分枝杆菌感染造成的人畜共患病,全球范围内潜在感染人口多达20亿,其中约5-10%的携带者会出现临床症状,每年可造成约150万死亡病例。牛结核病由牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）感染造成,同时可经由直接接触患病动物或未消毒的乳肉制品引起人类患病。由于野生宿主广泛存在、畜牧产品交易全球化和高效疫苗缺失,M.bovis感染造成的牛结核病至今在非洲、拉丁美洲和亚洲等地区依然未能被有效控制,对人类健康和农业发展造成严重影响。研究者普遍认为宿主对结核分枝杆菌感染的抵抗力与多种遗传因素相关,其中多项研究表明NRAMP1基因在机体中的表达水平与结核杆菌的抵抗力间存在依赖关系。本研究的前期工作同样证明了提高NRAMP1基因的表达量可以有效增强宿主细胞的抗结核能力。因而,本研究旨在通过转基因方法提高NRAMP1基因的表达量,培育出抗结核的转基因牛新品种。作为当前广泛使用的转基因动物生产工具,CRISPR/Cas9系统已被应用于小鼠、猪、山羊及猴等物种。同时,多种针对于Cas9蛋白本身的突变及相应的转基因策略已经被提出以减少目前最广泛关注的脱靶效应问题,并取得了瞩目成绩。然而关于哺乳动物基因组上外源功能基因插入的报道非常有限,而验证这些打靶策略在转基因牛生产上的可行性,同样具有重要的应用价值。本研究首次应用单个Cas9缺口酶（Cas9n）来诱导功能基因插入并生产出了基因组范围内脱靶效应减弱的转基因牛。进一步的体外与体内攻菌实验表明NRAMP1基因可以通过增加表达量激活巨噬细胞凋亡通路,限制胞内M.bovis的增殖进而提高转基因牛的结核病抗性。本研究主要内容如下:1.在牛基因组上选择了25号染色体上FSCN1基因和ACTB基因间区域作为打靶基因座。应用CRISPR/Cas9设计软件ZiFiT与Cas-OFFinder,初步筛选出全基因组范围内潜在脱靶位点最少的sgRNA序列。构建基因打靶载体,在BFFs上应用Surveyor错配核酸酶检测野生型Cas9核酸酶在各基因打靶位点的切割效率。进一步设计供体载体,比较野生型Cas9核酸酶、成对Cas9切口酶、单一Cas9切口酶等不同打靶策略在相应打靶位点的切割效率与外源基因整合效率。2.应用没有核酸酶活性的dCas9在BFFs上进行ChIP-seq实验,鉴定各打靶位点对应的dCas9:sgRNA复合物在牛基因组上的主要识别与结合位点。通过分析CRISPR/Cas9系统在牛基因组上的主要结合特点与影响因素,获取了各打靶位点对应的潜在脱靶位点信息,建立了转基因牛生产中脱靶效应的评估标准。3.构建针对45号位点的Cas9核酸酶与Cas9切口酶基因打靶载体及对应供体载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro-1/2,共转染牛胎儿成纤维细胞后应用嘌呤霉素筛选出外源基因稳定整合的克隆。通过junction PCR、Sanger测序、Southern blot和绝对定量鉴定出NRAMP1基因定点整合的阳性克隆。进一步以阳性细胞为供核细胞,进行体细胞核移植与胚胎移植操作,最终获得了11头NRAMP1转基因奶牛。4.针对转基因牛进行体外结核分枝杆菌攻菌实验,Western blot、流式细胞术凋亡检测和CFU计数结果表明攻菌后NRAMP1基因可以通过增加表达量激活巨噬细胞凋亡通路,限制胞内M.bovis的增殖。进一步对NRAMP1转基因牛进行体内攻菌实验,IFN-γ释放水平检测和酶联免疫斑点实验证明NRAMP1转基因牛可以有效抵抗结核分枝杆菌感染,具备增强的抗结核能力。综上所述,本研究应用单一Cas9切口酶技术介导NRAMP1基因精准插入,并成功获得11头转基因牛;首次在BFFs上进行dCas9 Ch IP-seq实验,并在BFFs与转基因牛个体水平证明了应用单一Cas9切口酶进行基因打靶可在基因组范围内减少脱靶效应;进一步通过体外与体内攻菌实验证明了NRAMP1转基因牛具有增强的抗结核感染能力,为抗病转基因育种提供了宝贵材料。
刘新峰[5]（2016）在《基于fat—1转基因牛的自身安全评价》文中研究表明n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）与人类的健康密切相关,但人体自身不能合成n-3 PUFAs。自1997年,Spychalla等在线虫中获得了一个脂肪酸脱氢酶基因fat-1,多种富含n-3 PUFAs的fat-1转基因动物相继被研制成功,使这些转基因动物的产品为人类提供必需的n-3 PUFAs成为了可能。随着fat-1转基因家畜的大量出生,涉及转基因家畜的生物安全成为了人类倍受关注的问题,其中转基因家畜自身健康是生物安全检测的一项重要内容。截止目前,转基因家畜自身健康和安全的评价虽已开展了一些研究,但多局限于动物健康的某个方面,系统而全面评价转基因家畜自身健康的研究还未见报道。本研究利用体细胞核移植技术最终获得了3头成活的fat-1转基因牛,高通量测序技术鉴定了其中一头转基因牛的fat-1因整合在16号染色体的15726078bp处。通过对3头fat-1转基因牛在血液生化水平、基因漂移、自身基因表达变化、血浆蛋白表达变化及肠道菌群变化结果的系统分析,发现fat-1基因的转入对转基因牛的脂类代谢、免疫、心血管系统、抗应激等方面均表现出调节作用。实验结果对于建立转基因家畜,特别是转基因大家畜的自身安全评价体系,为获得健康、安全的转基因家畜的相关研究提供了有价值的参考资料。主要研究结果如下：1.fat-1转基因牛的生产及常规分析通过转基因及体细胞核移植技术（SCNT）获得了9头犊牛,6头犊牛被鉴定为fat-1转基因阳性牛,脂肪酸检测证实了fat-1基因的转入可以提升牛体内n-3PUFAs的含量,降低n-6 PUFAs的含量。血液生化水平检测,发现fat-1基因的转入显着降低了犊牛ALT及成年牛AST、GLU、TC和LDL-C的水平。常规PCR检测转基因牛肠道粪便、圈舍中土壤及其周围200 m各方位土壤微生物,均未发现有fat-1基因的存在。2.fat-1转基因牛整合位点分析应用高通量测序技术对fat-1转基因牛（FD006）进行了外源基因整合位点分析,结果表明fat-1基因整合在牛16号染色体的15726078bp处,且为单拷贝,根据测序获得的插入位点及其附近reads的结果分析,显示FD006为杂合子转基因牛,PCR的验证结果证实了fat-1基因确实插入了牛16号染色体的15726078 bp处,而且确实为杂合子转基因牛。本研究为转基因牛的整合位点分析、外源基因定点整合以及稳定表达等研究提供了技术路线与理论依据。3.fat-1转基因牛基因表达变化研究为分析fat-1基因的转入对牛基因表达的影响,提取fat-1转基因牛和野生型牛血液的总RNA,进行基因表达谱芯片检测。结果表明,有2042个基因表达存在显着差异,其中797个基因在fat-1转基因牛中是上调表达的,其余1245个基因则下调表达。基于2042个差异基因进行GO富集分析,发现90个GO Terms被显着富集,这些GO Terms主要与机体的脂类代谢、细胞行为、免疫及神经系统发育密切相关,其中8个GO Terms中包含了36个发生显着变化的脂类代谢关键基因。KEG G富集分析进一步获得了与脂类代谢,特别是与多不饱和脂肪酸的代谢密切相关的“PPAR signaling pathway”代谢通路。应用Real-time PCR对芯片检测获得的16个脂类代谢关键基因进行验证,证实了芯片获得的结果是可信的。综合以上结果,发现fat-1基因的转入引起了牛自身基因表达水平的变化,这些变化的基因在机体的脂类代谢、免疫、神经发育等生物学通路表现出调节作用。4.fat-1转基因牛血浆蛋白组学研究利用2D-双向电泳及质谱检测技术对fat-1转基因牛血浆蛋白组学进行了分析。结果表明,共有15个血浆差异蛋白被鉴定；对这15个差异蛋白及其互作蛋白的GO和KEGG富集分析,发现这些蛋白主要参与了机体的脂类代谢、免疫、应激、神经发育和血液凝固等生物学通路的调节；在18个重要的脂类代谢生物学通路中,有12个通路都富集到了APOA1,表明fat-1基因参与对脂类代谢的调控可能与APOA1有密切关系；血浆APOA1检测发现,转基因牛血浆中APOA1含量显着高于野生型牛,其表达水平与LDL-C高度负相关（r==一0.90）,与HDL-C/TC比值存在显着正相关（r=0.69）。综合以上结果,与野生型牛比较发现,fat-1基因的转入使牛血浆中的一些蛋白表达发生了变化,并发现fat-1基因可能会介导APOA1的表达参与转基因牛脂类代谢的调控。5.fat-1转基因牛肠道微生物菌群的研究采用高通量测序技术,分别对3头fat-1转基因牛和3头野生型牛的直肠粪便进行了基于16s rDNA V4可变区肠道菌群多样性及组成的比较分析。结果显示,转基因牛和野生型牛共获得9714个OTUs的分类,转基因牛的OTUs分类（8907个）明显少于野生型牛（9488个）；物种多样性指数分析发现,转基因牛的Chao和Shannon指数均显着低于野生型牛（p<0.05）。进一步的分析发现,fat-1基因的转入也改变了牛肠道菌群的组成和表达丰度。其中物种注释丰度比较发现,转基因牛与野生型牛间有3个门（广古菌门、变形菌门、螺旋体门）,9个属（紫单胞菌属、拟杆菌属、甲烷短杆菌、密螺旋体属、梭菌属、毛螺菌属、罗氏菌属、消化球菌属、丁酸弧菌属）存在物种丰度差异（p<0-05）。结合肠道菌群的组成、物种丰度比较结果及血糖、血脂生化检测结果,发现Dorea、 Roseburia、Succinivibrio和Alistipes与血糖、血脂的变化存在一定的相关性。此外,也发现与应激有关的Odoribacte r菌属在转基因牛肠道中显着降低。综合本研究结果表明,fat-1基因的转入改变了牛肠道菌群的多样性、群落组成及表达丰度,发生变化的菌属主要与宿主的糖、脂代谢以及机体的抗应激有关,推测fat-1基因的转入可能会通过改变牛肠道菌群的组成或表达丰度参与机体脂类代谢调控的潜在机制。
吕洋[6]（2016）在《正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析》文中认为机体维持正常的生理机能和健康,需要控制体内代谢平衡。一些重要的转录因子可以直接或间接的影响营养和代谢链,如胆固醇、脂质、葡萄糖和胰岛素等可以快速改变基因表达的程序,从而维持代谢平衡。microRNAs（miRNAs）可以调控动物多种生理生化活动,在基因表达的转录水平或转录后水平表现为重要的调控分子,miRNAs可能也参与调控体细胞克隆动物和转基因克隆动物的表观遗传。利用Solexa测序技术,分别检测并分析2头体内受精（in vivo fertilization,Ferti）牛、2头克隆牛（somatic cell nuclear transfer,SCNT）和2头转fat-1基因牛（transgenic, TG）的成纤维细胞中的miRNA表达谱,共建立了6个miRNAs文库。利用Mireap软件,分析miRNA的表达差异,探讨成纤维细胞中miRNAs的表达规律,并预测了差异miRNAs调控的靶基因。通过基因GO （Gene ontology）数据库富集分析和全基因组及代谢途径数据库（KEGG）通路分析,研究了这些靶基因参与的生物学通路,初步揭示了体内受精、克隆和转基因来源的牛中的miRNA表达和靶向基因之间的关系。结果表明：1.运用miRNAs测序技术,共检测了367个已知miRNAs,其中83个、19个和23个已知miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,14个已知miRNAs在三者中共同表达；新发现了178个数据库未公布的miRNAs,其中17个、1个和4个新的候选miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,1个新的候选miRNA在三者中共同表达。2.通过筛选体内受精、克隆和转fat-1基因牛成纤维细胞中的差异表达miRNA,发现成纤维细胞中存在一系列上调和下调的miRNA。通过Real time RT-PCR方法检测、验证和比较体内受精、克隆和转基因组三组中表达量前10个miRNA的差异,同时对表达量高的2个新的候选miRNA进行荧光定量PCR验证,并预测部分高表达的候选miRNA结构。GO富集分析和KEGG通路分析显示,差异表达miRNA对应靶基因显着富集的通路主要在代谢通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路、嘌呤代谢通路、泛素介导的蛋白水解通路、嘧啶代谢通路和细胞周期通路等7个生物学通路。3.通过生物信息学软件预测FGF10、LPL和ATGL可能作为bta-miR-21的靶基因,荧光定量PCR验证后发现,与克隆牛和转基因牛成纤维细胞相比,FGF10和ATGL的mRNA在体内受精牛成纤维细胞中表达显着降低,而bta-miR-21在体内受精牛成纤维细胞中表达显着升高,初步认为bta-miR-21与FGF10和ATGL的表达存在负调控的关系。4.microRNA的功能鉴定。利用在体外水平过表达或敲减bta-miR-21,检测靶基因的表达变化,进一步证明bta-miR-21与FGF10和ATGL的靶向关系,bta-miR-21可能通过调控FGF10和ATGL的表达发挥作用。结论：1.本研究建立了遗传背景一致,不同来源胚胎（体内受精、克隆和转fat-1基因牛）成纤维细胞的miRNA文库,获得了可能影响克隆、转基因克隆后代发育的miRNA信息,为深入揭示克隆与转基因克隆胚胎发育异常的机制提供了重要参考。2.本研究发现bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在体内受精、克隆和转fat-1基因牛胎儿成纤维细胞中具有调控作用,推测bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL可能是克隆与转基因克隆胚胎发育调控的重要靶标。
吴海波[7]（2015）在《TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究》文中研究表明结核病是一种由结核分支杆菌在人与动物或者人与人之间传播引起的人畜共患病。牛结核病在全世界范围内传播严重的影响了人类健康和农业发展,特别是在亚洲和非洲的一些发展中国家,由于没有有效的政策和方案来消除或控制,结核病的危害尤其严重。因此控制和抵御结核菌传播的研究变的紧迫和重要。有文献报道小鼠SP110基因可以控制结核杆菌的生长并且诱导感染细胞凋亡,本研究的前期工作也确认SP110基因可以增强牛巨噬细胞的抗结核菌功能。因此本研究旨在通过TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因组上定点插入SP110基因,生产具有抵抗结核杆菌侵染功能的转基因牛。基因组编程酶TALEN能够在精确位点对基因组进行切割,因此被广泛用于基因功能研究以及转基因动物的生产。在过去的两年中,TALEN介导的基因敲除已有大量文献报道,但是基因敲入成功的例子却非常少;TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物并生产转基因动物,但是尚未见有TALEN介导基因敲入的转基因牛报道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在牛基因组上进行基因敲入,并生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。通过体外攻菌证明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖,结核杆菌侵染的转基因细胞会启动凋亡途径而不是坏死途径;通过体内攻菌以及细菌传染试验证明转基因牛可以有效的抵御结核杆菌的侵染。本研究的主要内容如下所示:1.针对牛28号染色体的表面活化蛋白A1（SFTPA1）和甲硫氨酸腺苷基转移酶I A（MAT1A）的基因间序列设计3对特异性的TALENs。使用荧光素酶单链退火实验在人的293-FT细胞中对TALENs的切割活性进行的了初步鉴定。随后用Surveyor酶切实验在牛的胎儿成纤维细胞中进行了进一步检测,以DNA切割后发生非同源末端连接修复的比率来表征TALENs的切割活性,结果表明所设计的三对TALENs中,第二对TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一个点突变（第450位天冬氨酸突变为丙氨酸）,该点突变可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影响TALEN二聚化以及DNA序列的识别,从而构建TALE核酸切口酶系统。DNA体外切割试验证明了该系统可以在预期的位点造成单链断裂,并具有将DNA修复途径限定为同源重组的能力。3.获得SP110定点打靶的阳性细胞克隆。通过junction PCR及Southern blot实验确认为定点打靶并且筛选出单等位基因打靶的细胞。以此细胞为核供体,通过体细胞核移植生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。4.对转基因牛的巨噬细胞进行体外攻菌试验,结果表明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖。利用流式细胞术分析攻菌后巨噬细胞的凋亡率和坏死率,发现结核杆菌侵染的普通巨噬细胞会启动坏死途径,而转基因牛巨噬细胞则会启动凋亡途径;使用支气管点滴法进行体内攻菌试验,尸检发现转基因牛脏器的病理得分以及荷菌数均明显低于普通牛;通过将转基因牛与结核病牛在密闭环境下共同饲养的方法进行模拟传染试验,皮试检测、伽马干扰素释放水平检测以及酶联免疫斑点检测均证明转基因牛具有拮抗结核菌的功能,尸检发现转基因牛脏器的病理得分显着低于普通牛。5.针对肌成束同源蛋白1（FSCN1）和肌动蛋白（ACTB）的基因间序列设计并构建3对TALENs并获得针对F-A位点打靶的单克隆细胞。通过序列相似性比对,在牛基因组上分别找了8个靶向M-S位点和F-A位点TALE切口酶的潜在脱靶位点并进行脱靶效应分析。在22株F-A位点打靶细胞和19株F-A位点打靶细胞中发现一株细胞克隆存在脱靶效应。说明TALE切口酶虽然可以在牛基因组上任意位点进行基因操作,但仍有可能会对细胞造成不可预知的损伤,因此在基因敲入前需要注意寻找可以容纳外源基因的“安全港湾”。本研究首次利用TALE切口酶对牛基因组进行基因敲入,并生产出具有抗结核病功能的转基因牛。研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义,同时为动物抗病育种提供新思路。
孟庆勇,刘春城,王萌,张阔,戴蕴平,郭英,费菁,李宁[8]（2014）在《牛规模化转基因技术体系构建轨迹和展望》文中研究说明随着生命科学研究的不断发展和产业应用需求的扩大,转基因技术从探索生命科学基本规律的重要技术手段之一,正在向生命产业应用的相关领域扩展,其中包括大的家养动物转基因技术产业化应用的探索。论文综述了转基因技术在牛育种上的应用与发展,结合转基因牛在国际上的发展历史,着重介绍了中国在牛的转基因技术体系构建方面的历程和成果。通过引进、整合和创新,将现代动物生物技术融合在一起,建立了安全、高效及规模化的牛规模化转基因技术体系,进而实现了在牛的生产和繁育实践中更为广泛的应用。通过转基因技术对牛进行选育是为了增强抗病能力、改善乳品质、提高乳肉的产量、质量以及作为高效的生物活体反应器生产功能蛋白。目前,中国牛的规模化转基因技术体系基本构建完成,更多深入的工作将集中在目的基因表达量调控和导入的基因安全性控制等方面。所以未来的牛转基因育种工作以"安全、高效、规模化"为主导,围绕组织特异启动子,优化密码子,调整基因修饰,定点插入基因以及去除筛选标记等工作展开。奶牛的抗病高产是其畜牧产业发展的重要方向,同时作为大型哺乳动物,是动物机体生产活性功能蛋白的重要反应器之一。因此,完善和发展牛转基因动物技术,建立完善的牛规模化转基因技术体系是未来的重要发展方向。
王丙萍[9]（2014）在《靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究》文中研究指明FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。FGF5基因突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长,从而使毛发的长度增加。本研究拟靶除内蒙古白绒山羊的FGF5基因,利用核移植方法创造高产绒量山羊。以我区的白绒山羊为对象,建立胎儿皮肤成纤维细胞系；设计pLOX-EGFP-FGF5、 RNAi-FGF5、TALEN-FGF5,三种FGF5基因靶除载体；分别将三种敲除载体用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选阳性细胞并扩繁；以其为核供体构建转基因山羊重构胚并移植到同步发情的受体羊输卵管内,制造转基因克隆山羊并鉴定。1.根据已经公布的牛和山羊的FGF5基因序列设计引物克隆内蒙古白绒山羊的FGF5基因,发现FGF5基因具有三个外显子和两个内含子,cDNA长度为924bp。根据基因序列设计并构建合成3种靶除绒山羊FGF5基因的载体,分别为基因打靶载体pLOX-EGFP-FGF5,RNA干扰载体RNAi-FGF5-1#和RNAi-FGF5-2#,以及TALEN载体TN000201、TN000202、TN000204。测序及酶切鉴定结果表明载体构建正确并可用。2.采用组织块种植法分离培养了9个绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞系；通过G418敏感度实验,确定了各个细胞系的最佳G418筛选浓度,并选择对G418抗性较好的两个细胞系goat6#和goat9#作为筛选转基因阳性细胞的细胞系；分别应用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法将3种载体转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,最终筛选出3种转基因阳性细胞系。3.以筛选鉴定得到3种转基因阳性细胞系为核供体,分别构建转基因克隆胚胎。应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植46只受体山羊,妊娠4只,妊娠率为8.7%。1只羔羊存活4天后死亡,2只羔羊出生后几分钟死亡,目前健康存活羔羊1只。应用RNA干扰技术沉默FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植143只受体山羊,妊娠24只,妊娠率为16.78%,但胎儿均发生流产。应用TALEN技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植62只受体山羊,经B超检测发现有5只受体羊怀孕,妊娠率为8.06%。4.应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆羔羊经PCR鉴定,检测出编号为083的羔羊发生了FGF5基因的双敲除,目前健康状况良好。其余三只羔羊为非转基因的克隆羊。在应用RNA干扰技术沉默FGF5基因中,通过实时荧光定量PCR对流产胎儿进行鉴定,结果表明这些胎儿FGF5基因的表达量均发生了明显的降低。应用TALEN技术靶除FGF5基因的转基因克隆羔羊,经PCR产物测序鉴定,结果表明4只新生羔羊FGF5基因的靶标区域均缺失了两个碱基,造成了FGF5基因的移码突变。
赵敬贤[10]（2014）在《FABP4转基因牛的生物学评价》文中提出牛肉脂肪含量是肉质风味的重要指标,我国牛肉消费以含有一定量脂肪的红肉为嗜好主流,因此急需培育出肉质好、产量高的优质肉牛品种。转基因技术是肉牛改良的重要手段之一,肌内脂肪是影响肉质的一个非常重要的因素,FABP4基因能影响肌内脂肪含量,促进脂肪沉积。本研究对获取的转基因牛进行生物学评价,包括对转基因阳性、基因拷贝数、基因表达水平、蛋白表达水平进行检测,旨在为转基因优良新品种的进一步研究提供理论依据。本研究所得结果如下；1、对通过真核表达载体的构建、细胞转染、体细胞核移植、胚胎移植等技术手段成功获得的3头克隆牛进行PCR检测发现均为转基因阳性；经血液、尿液生化分析,表明转基因个体身体状况良好,脂肪代谢水平有所增强。2、利用Southern blot方法检测了3头转基因个体外源FABP4基因的拷贝数,结果表明3头转基因牛的外源基因均为单拷贝插入。3、对于整合位点及侧翼序列的检测,1号转基因牛外源基因整合位点在13号染色体,侧翼序列大小为736bp；2号个体外源基因整合位点在24号染色体,侧翼序列大小为494bp；3号个体外源基因整合位点在10号染色体,侧翼序列大小为771bp。4、在外源FABP4基因表达水平检测中,1号个体外源FABP4基因在除肺外的组织均有表达,脂肪组织、背最长肌表达量较高；3号个体外源基因的表达水平高于2号；2、3号个体外源基因的表达随月龄变化均呈现先上升后下降趋势,两个体间变化存在差异。5、在内源FABP4基因表达水平检测中,外源基因抑制了内源基因的表达,2、3号个体内源FABP4基因表达水平随月龄变化有恢复正常水平的趋势。6、通过对转基因个体外源与内源FABP4基因相对表达量的叠加显示,转基因个体FABP4基因整体表达水平较野生型大幅提升。7、蛋白表达的检测结果与基因表达检测结果基本一致,1号个体除肺外的组织均检测到外源FABP4蛋白的表达,其中背最长肌表达量最高,3号个体蛋白表达水平高于2号个体。
二、利用体细胞核移植技术生产转基因牛（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用体细胞核移植技术生产转基因牛（论文提纲范文）
（1）利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 西门塔尔牛简介 |
| 1.2 基因编辑发展及安全管理 |
| 1.2.1 基因编辑发展概述 |
| 1.2.2 牛基因编辑概述 |
| 1.2.3 基因编辑产品的安全管理 |
| 1.3 骨骼肌的发育 |
| 1.3.1 骨骼肌形成及发育过程 |
| 1.3.2 骨骼肌发育的分子机理 |
| 1.4 IGF2基因在遗传育种中的研究进展 |
| 1.4.1 IGF2基本概况 |
| 1.4.2 IGF2表达调控方式 |
| 1.4.3 IGF2对克隆效率的影响 |
| 1.4.4 IGF2与家畜家禽生产性状的关系 |
| 1.4.5 IGF2基因编辑研究成果 |
| 1.5 试验目的及意义 |
| 第二章 西门塔尔IGF2突变的阳性细胞筛选及验证 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 试验结果与分析 |
| 2.2.1 牛IGF2 基因编辑位点筛选及sg RNA设计 |
| 2.2.2 牛IGF2基因编辑载体构建 |
| 2.2.3 牛IGF2基因编辑载体细胞转染及效率检测 |
| 2.2.4 西门塔尔IGF2基因纯合突变的阳性细胞筛选 |
| 2.2.5 ZBED6 结合位点敲除对IGF2 表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 西门塔尔IGF2突变克隆胚胎的制备 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验步骤 |
| 3.2 试验结果与分析 |
| 3.2.1 克隆胚胎制备和鉴定 |
| 3.2.2 质粒骨架残留鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（2）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（4）应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 转基因动物生产研究进展 |
| 1.1 转基因动物生产的发展历程 |
| 1.2 基因编辑技术研究进展 |
| 1.2.1 基因编辑技术机理 |
| 1.2.2 锌指核酸酶 |
| 1.2.3 TALE核酸酶 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9 |
| 1.3 转基因动物生产的应用 |
| 1.3.1 提高动物生产性能 |
| 1.3.2 在生物医学上的应用 |
| 1.3.3 提高动物抗病能力 |
| 第二章 CRISPR/Cas9系统及转基因动物生产 |
| 2.1 CRISPR系统概述 |
| 2.1.1 CRISPR系统的发现历程 |
| 2.1.2 CRISPR系统的分类 |
| 2.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9系统的结构 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9对靶位点的识别与切割 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9的打靶精准性 |
| 2.3 CRISPR/Cas9在动物转基因上的应用 |
| 2.3.1 NHEJ介导的基因敲除 |
| 2.3.2 HDR介导的基因定点整合 |
| 2.3.3 转录调控基因表达 |
| 实验研究 |
| 第三章 CRISPR/Cas9打靶位点的筛选及活性检测 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 打靶基因座的选择 |
| 3.2.2 打靶位点的软件预测与筛选 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9真核表达载体构建 |
| 3.2.4 CRISPR/Cas9打靶位点的切割效率检测 |
| 3.2.5 CRISPR/Cas9打靶策略选择与活性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 打靶基因座的选择 |
| 3.3.2 打靶位点的软件预测与筛选 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9真核表达载体构建 |
| 3.3.4 CRISPR/Cas9打靶位点的切割效率检测 |
| 3.3.5 不同打靶策略下Cas9系统活性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛胎儿成纤维细胞中sgRNA-dCas9结合位点的鉴定 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 dCas9真核表达载体构建 |
| 4.2.2 dCas9-sgRNA在BFFs基因组的结合位点鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 dCas9真核表达载体构建 |
| 4.3.2 dCas9-sgRNA在BFFs基因组的结合位点鉴定 |
| 4.3.3 主要结合位点的特点分析 |
| 4.3.4 主要结合位点的实际脱靶效应验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 NRAMP1精准插入的重组细胞筛选及转基因牛生产 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 牛NRAMP1基因功能验证 |
| 5.2.2 同源重组供体载体构建 |
| 5.2.3 细胞筛选及鉴定 |
| 5.2.4 体细胞核移植生产转基因牛 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 牛NRAMP1基因的功能验证 |
| 5.3.2 同源重组供体载体构建 |
| 5.3.3 阳性克隆鉴定 |
| 5.3.4 体细胞核移植生产转基因牛 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转NRAMP1克隆牛的功能验证 |
| 6.1 材料和试剂 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 NRAMP1转基因牛精准打靶验证 |
| 6.2.2 NRAMP1转基因牛的抗结核能力验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 NRAMP1转基因牛精准打靶验证 |
| 6.3.2 NRAMP1转基因牛的抗结核能力验证 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新之处与进一步研究课题 |
| 创新之处 |
| 进一步研究课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）基于fat—1转基因牛的自身安全评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 fat-1转基因动物及生物安全评价研究进展 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸研究进展 |
| 1.1.1 n-3多不饱和脂肪酸的主要来源和发现 |
| 1.1.2 n-3多不饱和脂肪酸对心血管疾病的作用 |
| 1.1.3 n-3多不饱和脂肪酸的抗癌作用 |
| 1.1.4 n-3多不饱和脂肪酸对炎症和免疫反应的作用 |
| 1.1.5 n-3多不饱和脂肪酸对神经系统的作用 |
| 1.1.6 n-3多不饱和脂肪酸对动物生殖的作用 |
| 1.2 fat-1转基因研究进展 |
| 1.2.1 fat-1基因简介 |
| 1.2.2 fat-1转基因在小鼠中的研究 |
| 1.2.3 fat-1基因在家畜中的研究 |
| 1.2.3.1 fat-1转基因猪的研究 |
| 1.2.3.2 fat-1转基因牛的研究 |
| 1.2.3.3 fat-1转基因羊的研究 |
| 1.3 转基因动物生物安全评价 |
| 1.3.1 环境安全评价 |
| 1.3.1.1 基因水平漂移对环境的影响 |
| 1.3.1.2 动物逃逸对环境的影响 |
| 1.3.1.3 所谓的木马基因效应 |
| 1.3.2 动物健康评价 |
| 1.3.2.1 表型评价 |
| 1.3.2.2 非表型评价 |
| 1.3.2.3 转基因的非预期性效应 |
| 1.3.3 食品安全评价 |
| 1.3.3.1 转基因食品的安全性疑虑 |
| 1.3.3.2 转基因动物食品安全评价 |
| 1.3.3.3 转基因动物食品安全评价的主要原则 |
| 1.4 动物福利问题 |
| 第二章 fat-1转基因牛的生产及常规分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 fat-1转基因牛外源基因整合位点分析 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 fat-1转基因牛基因表达变化研究 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 fat-1转基因牛血浆蛋白组学研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 fat-1转基因牛肠道微生物菌群研究 |
| 引言 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间主要学术成果 |
（6）正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 克隆与转基因克隆动物研究进展 |
| 1.1.1 动物克隆技术 |
| 1.1.2 动物转基因(TRANSGENIC)技术 |
| 1.2 克隆与转基因克隆动物研究中遇到的问题 |
| 1.2.1 克隆效率低 |
| 1.2.2 胎盘肥大且功能异常 |
| 1.2.3 克隆相关基因的异常表达 |
| 1.2.4 转基因克隆动物存在的问题 |
| 1.3 克隆与转基因动物机理研究进展 |
| 1.4 MIRNA在动物发育调控中的作用 |
| 1.4.1 在动物正常发育中的作用 |
| 1.4.2 在克隆动物中的研究情况 |
| 1.4.3 在转基因动物研究中的情况 |
| 第二章 体内受精牛、克隆牛与转FAT-1基因牛的成纤维细胞中差异MIRNA的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BTA-MIR-21和候选靶基因在体内受精、克隆和转FAT-1基因牛成纤维细胞表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BTA-MIR-21与FGF10、ATGL靶向关系的验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 转基因动物研究进展 |
| 1.1 转基因动物的发展史 |
| 1.2 转基因动物的应用 |
| 1.2.1 转基因动物在理论研究上的应用 |
| 1.2.2 转基因动物在医学上的应用 |
| 1.2.3 转基因动物在农业上的应用 |
| 1.3 基因打靶技术的研究进展 |
| 1.3.1 转座子 |
| 1.3.2 锌指核酸酶 |
| 1.3.3 TALEN |
| 1.3.4 RGEN（CRISPR/Cas RNA-Guided Nuclease）系统 |
| 第二章 TALEN在动物遗传修饰中的应用 |
| 2.1 TALEN的发明 |
| 2.2 TALEN的设计与构建 |
| 2.2.1 TALEN的设计 |
| 2.2.2 TALEN表达载体的构建方法 |
| 2.3 TALEN与ZFN和RGEN的特点比较 |
| 2.3.1 切割成功率和切割效率 |
| 2.3.2 DNA序列识别特异性 |
| 2.3.3 细胞毒性 |
| 2.4 TALEN介导的基因修饰的应用 |
| 2.4.1 在细胞水平上的应用 |
| 2.4.2 在模式动物上的应用 |
| 2.4.3 在家畜上的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 TALEN真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 TALEN真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 TALEN在 293-FT细胞中的切割活性分析 |
| 3.2.3 TALEN在BFFs细胞中的切割活性分析 |
| 3.2.4 TALE切.酶的构建及活性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TALEN真核表达载体的构建 |
| 3.3.2 TALEN在 293-FT细胞中的切割活性分析 |
| 3.3.3 TALEN在BFFs细胞中的切割活性分析 |
| 3.3.4 TALE核酸切.酶活性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 SP110定点打靶细胞筛选及转基因牛生产 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 MSR1启动子活性验证 |
| 4.2.2 小鼠SP110基因功能验证 |
| 4.2.3 打靶载体构建 |
| 4.2.4 细胞筛选及验证 |
| 4.2.5 体细胞核移植生产转基因牛 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MSR1启动子活性验证 |
| 4.3.2 SP110基因功能验证 |
| 4.3.3 打靶载体构建 |
| 4.3.4 细胞筛选及验证 |
| 4.3.5 体细胞核移植生产转基因牛 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 转基因牛抗结核菌验证 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Junction PCR |
| 5.2.2 Genome walking |
| 5.2.3 Southern blot |
| 5.2.4 Western Blot |
| 5.2.5 Real Time RT-PCR |
| 5.2.6 细胞CFU计数 |
| 5.2.7 流式细胞术分析凋亡率 |
| 5.2.8 病理学评分系统 |
| 5.2.9 器官CFU计数 |
| 5.2.10 结核菌传染实验 |
| 5.2.11 结核菌素皮肤试验 |
| 5.2.12 IFN-γ释放水平检测 |
| 5.2.13 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） |
| 5.2.14 苏木精-伊红染色（HE染色） |
| 5.2.15 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Junction PCR验证阳性细胞 |
| 5.3.2 Genome walking验证阳性细胞 |
| 5.3.3 Southern Blot筛选单等位基因打靶克隆 |
| 5.3.4 Western Blot验证SP110基因的表达 |
| 5.3.5 外周血单核细胞诱导分化为巨噬细胞 |
| 5.3.6 Real-Time RT PCR检测临近基因表达水平 |
| 5.3.7 细胞水平上攻菌后CFU计数 |
| 5.3.8 流式细胞术分析细胞死亡方式 |
| 5.3.9 体内攻菌后的病理评分 |
| 5.3.10 体内攻菌后的器官CFU计数 |
| 5.3.11 传染实验中的结核菌素皮试检测 |
| 5.3.12 传染实验中的IFN-γ释放水平 |
| 5.3.13 酶联免疫斑点检测产生IFN-γ反应的细胞数 |
| 5.3.14 传染实验后的病理学评分 |
| 5.3.15 传染实验后的病理切片检测 |
| 5.3.16 SP110转基因牛子代分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 TALE核酸切.酶应用评估 |
| 6.1 材料和试剂 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 针对F-A位点TALEN表达载体的构建 |
| 6.2.2 BFF细胞中检测F-A位点TALENs的切割活性 |
| 6.2.3 转基因克隆胚构建以及体细胞核移植 |
| 6.2.4 Real-Time PCR检测F-A位点临近基因的表达水平 |
| 6.2.5 TALEN的脱靶效应分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 TALEN在F-A位点打靶 |
| 6.3.2 TALEN的脱靶效应分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）牛规模化转基因技术体系构建轨迹和展望（论文提纲范文）
| 1 动物转基因和转基因牛发展历程 |
| 2 牛规模化转基因技术体系构建 |
| 2.1 转基因技术的一般方法 |
| 2.2 牛规模化转基因技术体系构建 |
| 2.2.1“安全”的转基因牛生产 |
| 2.2.2“高效”和“规模化”的转基因牛生产 |
| 2.2.2. 1 牛的体细胞克隆技术 |
| 2.2.2. 2 细胞同步化的改进 |
| 2.2.2. 3 建立不同供体细胞系 |
| 2.2.2.4建立锌指核酸酶及Cas9基因编辑技术系统 |
| 2.2.2. 5 人工受精等常规繁育及再克隆技术相结合是实现“规模化”的重要途径 |
| 3 问题与展望 |
（9）靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 动物转基因技术的研究历史及进展 |
| 1.1.1 动物转基因技术研究的初级阶段 |
| 1.1.2 动物转基因技术研究的初级应用阶段 |
| 1.1.3 动物转基因技术研究的飞速发展阶段 |
| 1.2 转基因动物的制备方法及其进展 |
| 1.2.1 传统制备转基因动物的主要方法 |
| 1.2.2 新型发展的高效转基因方法 |
| 1.3 动物转基因技术的应用 |
| 1.3.1 动物转基因技术在基础医学研究领域的应用 |
| 1.3.2 生物反应器 |
| 1.3.3 动物转基因技术在农业生产中的应用 |
| 1.3.4 动物转基因技术存在的问题 |
| 1.4 FGF5在皮肤毛囊中的作用及其研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 靶除绒山羊FGF5基因载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.1.3 载体及菌种 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶除绒山羊FGF5基因打靶载体的构建 |
| 2.2.2 靶除绒山羊FGF5基因RNA干扰载体的构建 |
| 2.2.3 靶除绒山羊FGF5基因TALEN载体的构建 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 靶除绒山羊FGF5基因打靶载体的构建 |
| 2.3.2 靶除绒山羊FGF5基因RNA干扰载体的构建 |
| 2.3.3 靶除绒山羊FGF5基因TALEN载体的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 3 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.2.2 生长曲线的测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 4 绒山羊鞭除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.2.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.2.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 5 靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 试剂及耗材 |
| 5.1.3 主要试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 山羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.2.2 供体细胞的准备 |
| 5.2.3 受体卵母细胞的准备 |
| 5.2.4 核移植构建重构胚 |
| 5.2.5 重构胚的融合 |
| 5.2.6 融和胚的激活和发育 |
| 5.2.7 胚胎移植 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 山羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.3.2 转基因克隆胚构建中融合条件的摸索 |
| 5.3.3 转基因克隆胚的构建及移植 |
| 5.3.4 应用基因打靶技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.3.5 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.3.6 应用TALEN技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.4 讨论 |
| 6 靶除FGF5基因克隆绒山羊的鉴定 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验设备 |
| 6.1.2 试剂及耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 基因组DNA水平上的鉴定 |
| 6.2.2 RNA水平上的鉴定 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.3.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.3.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（10）FABP4转基因牛的生物学评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 转基因动物的研究进展 |
| 1.2.1 转基因动物的应用 |
| 1.2.2 转基因动物的安全问题 |
| 1.3 体细胞核移植技术的研究进展 |
| 1.3.1 体细胞核移植技术与转基因技术的结合 |
| 1.3.2 影响体细胞核移植的因素 |
| 1.4 FABP4基因功能及研究进展 |
| 1.4.1 FABP4基因的生物学功能 |
| 1.4.2 FABP4基因的研究进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第二章 FABP4转基因牛的阳性鉴定及生化指标检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试验所需试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 组织、血液总RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 血液生化分析 |
| 2.2.4 尿液生化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 个体阳性检测 |
| 2.3.2 转基因个体身体成分检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 影响细胞转染的因素 |
| 2.4.2 绿色荧光蛋白在转基因动物上的应用 |
| 2.4.3 转基因动物安全性的分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 FABP4转基因牛外源基因拷贝数及整合位点的测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试验所需试剂的配制 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 Southern blot杂交 |
| 3.2.3 TAIL-PCR检测整合位点 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Southern blot的鉴定结果 |
| 3.3.2 整合位点检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Southernblot技术的研究进展 |
| 3.4.2 外源基因拷贝数对转基因动物的影响 |
| 3.4.3 TAIL-PCR技术的研究进展 |
| 3.4.4 整合位点对转基因动物的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 转基因牛FABP4基因及蛋白的表达水平检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物及样品采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验所需试剂的配置 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 荧光定量PCR试验 |
| 4.2.2 Western blot检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转基因牛与野生型牛外源FABP4基因的表达水平 |
| 4.3.2 转基因牛外源FABP4基因的相对表达水平变化 |
| 4.3.3 转基因与野生型牛内源FABP4基因及整体FABP4基因表达水平变化 |
| 4.3.4 转基因牛FABP4基因的蛋白表达水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、利用体细胞核移植技术生产转基因牛（论文参考文献）
- [1]利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎[D]. 姚顺. 广西大学, 2020(02)
- [2]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [3]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [4]应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛[D]. 高元鹏. 西北农林科技大学, 2017(10)
- [5]基于fat—1转基因牛的自身安全评价[D]. 刘新峰. 内蒙古大学, 2016(08)
- [6]正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析[D]. 吕洋. 内蒙古大学, 2016(08)
- [7]TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究[D]. 吴海波. 西北农林科技大学, 2015(01)
- [8]牛规模化转基因技术体系构建轨迹和展望[J]. 孟庆勇,刘春城,王萌,张阔,戴蕴平,郭英,费菁,李宁. 中国农业科学, 2014(21)
- [9]靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究[D]. 王丙萍. 内蒙古农业大学, 2014(01)
- [10]FABP4转基因牛的生物学评价[D]. 赵敬贤. 中国农业科学院, 2014(11)