一、改进的大鼠原位肝移植术与相关手术技巧（论文文献综述）
朱宏伟[1]（2021）在《SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律》文中进行了进一步梳理[目 的]构建SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,探索肝移植缺血再灌注损伤后不同时间节点大鼠粪便菌群的变化规律,分析肝移植缺血再灌注损伤引起粪便菌群改变的可能机制,进而为将来从肠道菌群的角度对肝移植缺血再灌注损伤进行干预与治疗时提供指导。[方法]采用自体原位肝移植的方法构建大鼠肝脏的缺血再灌注损伤动物模型,其中模型组（M组）根据术后取材时间节点不同又分为M1、M4、M7、M10、M14、M21、M28七个组,并建立假手术组（S组）进行对照。术前分别对以上8组（n=5）大鼠进行血液、粪便标本的搜集。假手术组（S组）在术后第1天进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集,模型组（M组）分别对应于术后第1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集。大鼠血液进行ALT、AST、TBIL、WBC、NEUT、LYM指标的检测,从血液学角度对肝脏损伤、胆汁淤积及全身炎症情况进行评估与分级。制作并观察肝脏、回盲部肠管病理切片,从病理学角度了解肝脏组织、肠管黏膜的损伤情况。采用高通量基因测序对大鼠新鲜粪便进行检测,了解AOLT缺血再灌注损伤后粪便菌群谱的变化规律。[结 果]1、本次研究采用自体原位肝移植的方法构建肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,建模成功率100%。在肝移植缺血再灌注损伤术后第1天,ALT、AST、TBIL指标均较假手术组明显升高,差异皆具有明显统计学意义（P<0.05）。肝脏组织病理图片显示,M1组肝脏组织呈现出较重损伤,Suzuki’ s评分3分,以上结果均证实AOLT动物模型能反映出肝脏的IRI情况,是研究肝移植IRI的理想动物模型。2、AST、ALT、TBIL与肝脏组织病理在AOLT缺血再灌注损伤术后的变化规律基本保持一致。其中,模型组M1中的AST、ALT、TBIL在术后第1天分别为 776.20±298.79、241.00±66.21 和 2.90±2.00,它们显着高于假手术组（S）及其余各模型组,与各组间比较均存在明显差异（P<0.05）,其余各模型组与假手术组（S）之间未见明显差异。由各组AST、ALT、TBIL的变化趋势图和肝脏组织的病理图片可以看出SD大鼠在经历AOLT缺血再灌注后,术后早期（第1天）肝组织损伤、胆汁淤积最为明显,进行到术后中期时肝脏的损伤明显减轻,至术后晚期（第28天）已经完全恢复至术前正常水平。3、通过对大鼠血液WBC、NEUT、LYM指标进行检测以及回盲部肠管组织病理切片的观察,我们发现AOLT缺血再灌注损伤也可导致肠管组织的损伤与炎症反应的产生,且两者的变化平行发生。各模型组中WBC、NEUT、LYMD的值均显着高于假手术组（S）,且与假手术组（S）比较的P值均小于0.05。其中由各指标的变化趋势和回盲部肠管组织病理图片可以看出炎症反应及肠道黏膜损伤在肝移植术后早期即可发生,但程度较轻;在移植术后中期（第4-14天）呈现出先增加后逐渐递减的趋势,以第7-14d炎性反应及肠道黏膜损伤表现得尤其显着;至术后晚期（第28天）观察结束时炎性指标仍略高于术前正常水平,肠道黏膜呈现轻度损伤,但均较术后中期明显好转。4、SD大鼠正常情况下粪便内菌群在门的水平上以拟杆菌门和厚壁菌门为主,且它们的比值约为1。在属的水平层面,正常大鼠粪便菌群丰度占比排名前五（丰度均>1%）的菌群依次为:乳杆菌属（Lactobacillus）、普氏菌属（Prevotella）、颤螺菌属（Oscillospira）、疣微菌科瘤胃球菌属（RuminococcaceaeRuminococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）。在经历肝移植IRI后,大鼠粪便内菌群呈现出明显规律性的变化。在门的水平上,厚壁菌门在术后早期（第1天）明显增加,而术后中期（第4天）开始逐渐减少,至术后晚期时（第28天）又开始出现出现增加趋势,而拟杆菌门在此时则完全表现出与厚壁菌门截然相反的变化趋势。在属的层面上,肝移植缺血再灌注术后早期（第1天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属、拟杆菌属、Blautia的丰度在总菌群中的比例显着增加,普氏菌属、颤螺菌属则明显减低。粪便菌群Alpha多样性分析显示此时菌群的多样性降低。术后中期（第4天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属开始逐渐降低,普氏菌属、颤螺菌属开始增加,拟杆菌属和Blautia在此期间则先后呈现先增后减的变化趋势,菌群的多样性也开始逐渐增加。至术后晚期（第28天）观察结束时疣微菌科瘤胃球菌属、颤螺菌属、拟杆菌属及Blautia基本恢复至术前水平,普氏菌属在总菌群中的比重仍高于乳杆菌属,但它们之间的差距在进一步缩小,呈现出向术前趋于一致的变化趋势,菌群的多样性仍高于术前水平。[结论]1、SD大鼠自体原位肝移植IRI模型是研究肝移植IRI的理想模型。2、自体原位肝移植IRI可引起粪便内菌群发生变化,且该变化具有明显的规律性。3、大鼠肝脏的IRI在AOLT术后早期表现得最为严重,但恢复也较为迅速。术后中、后期主要表现为AOLT缺血再灌注损伤继发的炎症及肠道管损伤,AOLT缺血再灌注损伤后大鼠粪便菌群的变化与肠道损伤及全身炎症具有一定的相关性。
蓝海斌[2]（2020）在《逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究》文中提出目的本研究分为两个部分:一、通过建立大鼠同种异体原位肝移植模型,观察经下腔静脉逆灌注法对肝移植氧化应激分子和炎症因子影响的变化;二、通过回顾性研究本中心肝移植手术患者术前及术后手术相关指标,观察临床原位肝移植术中采用经下腔静脉逆灌注法对DCD供肝移植肝术后氧化应激损伤的影响。方法第一部分:将130只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为七组:对照组、1小时经门静脉正灌注（IPR）组、2小时IPR组、6小时IPR组、1小时经下腔静脉逆灌注（RETR）组、2小时RETR组、6小时RETR组,对照组参照供肝手术方式,IPR组和RETR组均实行同种异体原位肝移植术,其中IPR组采用经门静脉正灌注法,RETR组采用经下腔静脉逆灌注法。对照组于取肝前留取血清检测,测肿瘤坏死因子α（TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）,留取肝脏组织检测SOD和MDA;门静脉组和逆灌注组于灌注后1小时、2小时和6小时留取血清检测TNF-α和HMGB1,留取肝脏组织检测超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）。第二部分:收集我中心2018年1月到2019年9月行肝移植术患者48例,根据手术方式的不同,可分为IPR组23例和RETR组25例。观察在不同手术方式下两组病人术前年龄、性别、MELD评分,以及术后1天、2天、3天、5天和7天血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、凝血酶原时间（PT）、谷氨酰转肽酶（GGT）、血清白蛋白（ALB）和总胆红素（TB）的恢复情况,并检测临床供肝灌注前和灌注后供肝组织中SOD和MDA的含量。结果第一部分:IPR组SOD水平显着低于RETR组（F=16.581,P=0.001）,术后各个时间点SOD水平也要显着低于RETR组（P<0.05）,IPR组术后MDA水平显着高于RETR组（F=13.884,P=0.002）,术后各个时间点MDA水平也要显着高于RETR组（P<0.05）;IPR组TNF-α水平显着高于RETR组（F=12.88,P=0.002）,术后各个时间点TNF-α水平显着高于RETR组（P<0.05）;IPR组HMGB1水平显着高于RETR组（F=30.246,P=0.000）,两组之间存在交互效应,术后1小时、2小时HMGB1水平显着高于RETR组（P<0.05）,术后6小时两组无明显差异（P>0.05）,最大值在IPR组术后2小时处,最小值位于RETR组术后6小时处。第二部分:在ALT、TB和AST水平上,IPR组显着高于RETR组（P<0.05）,在术后各个时间的对比上,ALT和TB水平IPR组均要显着高于RETR组（P<0.05）,AST水平除术后第1天,两组无显着差异（P>0.05）,其余时间IPR组均要显着高于RETR组（P<0.05）。在ALB、GGT和PT水平上,两组均无显着差异（P>0.05）,在术后各个时间点的对比上,两组均无显着差异（P>0.05）。在SOD和MDA水平上,IPR组和RETR组在手术前SOD和MDA水平的对比上无显着差异（P>0.05）,IPR组SOD灌注后水平显着的低于RETR组（P<0.05）,IPR组MDA灌注后水平显着的高于RETR组（P<0.05）。结论1、经下腔静脉逆灌注法能使移植术后氧化应激分子和炎症因子的水平相对的减少。2、经下腔静脉逆灌注法能减轻DCD来源移植肝术后早期氧化应激损伤。
田全发[3]（2020）在《双重动脉血供模型的建立及对大鼠肝再生线粒体能量代谢的影响》文中指出目的:1.建立一种稳定、成功率高的显微镜下大鼠68%肝切除+肝双重动脉血供（liver dual arterial blood supply,LDABS）的动物模型。2.在动物模型基础上,分离肝脏线粒体,阐述肝双重动脉血供对肝脏线粒体能量代谢的影响。方法:1.纳入研究大鼠76只,分为训练组（40只）、造模组（36只）。训练组模拟手术操作,优化围手术期管理;模型组行显微镜下制备大鼠68%肝切除（肝左叶和中叶）+肝双重动脉血供手术,术后观察大鼠一般情况,计算造模成功率和1w存活率。2.将雄性、清洁级108只SD大鼠随机分三组,即假手术组（Sham operation group,SO组）、68%肝切除组（partial hepatectomy,PH组）、68%肝切除结合双重动脉血供组（PH+LDABS组,简称LDABS组）。每组动物模型术后按照时间点0、12、24、72、120和168h取材;通过提取肝脏线粒体,测线粒体膜电位、呼吸链酶浓度以及ATP酶分析来探索LDABS线粒体能量代谢的影响。结果:1.通过训练组模拟操作,渡过学习曲线。造模组手术时间为65.3±6.56min,血管吻合时间11.1±2.53min。术中无明显副损伤,出血量0.6±0.21m L。术后24h造模成功率100%（36/36）,术后1w造模成功率88.9%（32/36）;造模成功大鼠术后状态良好。2.（1）与SO组相比,PH组肝脏组织线粒体膜电位在术后12h升高,在1-3天有所降低,但均无显着差异;与PH组相比,LDABS组肝脏组织线粒体膜电位在处理后第3天膜电位有所上升,但无显着差异。（2）与PH组相比,LDABS组在术后12-168h线粒体呼吸链酶I水平均有所升高,其中12h和72h具有显着性差异（p<0.05）,LDABS组在术后12-72h线粒体呼吸链酶Ⅱ、Ⅲ水平均有所升高,但无显着差异。（3）与PH组相比,LDABS组Ca2+Mg2+-ATP酶含量水平在术后0-120h变化不明显,无显着差异;术后168h明显低于PH组,有显着差异;与SO组相比,LDABS组在术后24h Ca2+Mg2+-ATP酶水平升高明显,有显着差异;与SO组相比,PH组在术后0h Ca2+Mg2+-ATP酶含量水平明显低于SO组。在Na+K+-ATP酶含量水平方面,LDABS组术后12h达到峰值,此后在各个时间段含量减少;与PH组相比,LDABS组在术后0h明显升高,具有明显差异。结论:1.显微镜下制备大鼠68%肝切除+LDABS模型操作较为复杂,但通过一定时间显微技能训练后,该模型成功率高、可重复性强,为进一步研究其在肝再生,急性肝功能衰竭和肝移植等中应用奠定基础。2.LDABS通过线粒体呼吸链酶I在肝再生中发挥重要作用;LDABS有一定的代偿肝损伤能量代谢的功能,可在更早的阶段通过能量代谢促使肝细胞再生,且使肝再生所需的能量代谢的峰值提前。
张黎[4]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中认为第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
吴凤东[5]（2019）在《DCD巴马小型猪肝脏常温机械灌注下劈离肝脏移植的实验研究》文中指出目的肝脏移植是治疗各种终末期肝病的根治性方法,近年来供肝短缺日益明显,劈离肝脏移植（Split liver transplantation,SLT）可将一个肝脏劈分给两个受者,提高了供肝利用率。体外劈离一般是在冷保存条件下进行,其缺陷是延长了冷缺血时间,增加了术后血管和胆管并发症及移植物功能不全的发生率。体内肝脏劈离缩短了缺血时间,但只能在循环稳定的脑死亡捐献（Donation after brain death,DBD）患者进行。目前心脏死亡器官捐献（Donation after circulatory death,DCD）肝脏所占比率越来越大,如果能够对DCD肝脏进行劈离肝移植则会进一步扩大供体来源。DCD患者的循环状况不适合体内劈离,体外劈离又会给经历较长时间热缺血损伤的DCD肝脏带来额外损伤。常温机械灌注（Normothermic machine perfusion,NMP）能够通过连续提供氧气、营养物质,维持细胞的生理机能及代谢,修复肝脏损伤。本研究拟构建简单、稳定、实用的NMP灌注保存系统,并探讨NMP对DCD猪肝SLT的保护作用。方法1.巴马小型猪肝脏解剖学研究:结合文献并通过对5只巴马小型猪腹部和肝脏进行解剖研究,观察肝脏各叶的大小,观察肝动脉、门静脉、胆道和肝静脉的解剖分布走行以及肝脏劈离面的选择,为肝脏劈离手术提供解剖学基础。2.猪原位无转流劈离肝移植的研究:选用健康巴马小型猪20只,分别按文献方法获取供肝和原位无转流肝脏移植（预实验组）,以及改进方法获取供肝和原位无转流肝脏移植（实验组）,比较两组术中血流动力学指标、术后生化、术后并发症和生存率,掌握猪原位无转流肝脏移植手术技巧及验证模型的稳定性;选用健康巴马小型猪10只分为供体组和受体组,按前面所述实验组方法获取供肝,供肝在冷保存过程中沿肝中裂劈离,注意保护门静脉右中叶支和右外侧叶胆管,以右半肝为移植物行原位无转流劈离肝移植,观察术中情况、术后化验、术后并发症和生存率,掌握劈离肝移植手术技巧。3.常温机械灌注DCD巴马小型猪劈离肝脏移植研究:选用健康巴马小型猪10只,随机选取5只作为灌注采血用,其余5只在供肝获取时建立功能性热缺血30分钟和无循环热缺血10分钟DCD模型,进行DCD肝脏体外NMP,观察NMP过程中门静脉和肝动脉灌注压、灌注液流量和胆汁分泌量变化,检测胆汁中碳酸氢盐和胆汁PH值,测量灌注液乳酸及ALT、AST变化,评估肝脏活力并改进灌注液组成、灌注通路设计和灌注模式;DCD猪肝脏常温机械灌注下劈离肝移植研究:巴马小型猪30只,其中10只作为采血用,其余20只分为供体组和受体组,每组10只。供体组均建立功能性热缺血30分钟和无循环热缺血10分钟DCD模型,受体组随机分为冷保存DCD肝脏劈离移植组（冷保存5小时）和NMP保存DCD肝脏劈离移植组（冷保存2小时后NMP 3小时）,每组5只,分别进行右半肝供肝原位无转流肝脏移植,比较两组术中血流动力学指标、术后生化、术后并发症和生存率。结果1.巴马小型猪肝脏解剖与人有一定区别,其固定韧带薄弱,肝动脉分支多,门静脉右中叶支起于门静脉左干起始段。胆管有多种变异,尾状叶和右外侧叶胆管绕行汇入左肝管约占2/3。下腔静脉与尾状叶间难以解剖分离,左半肝移植需重建替代下腔静脉的血管。肝中裂平面左右肝之间的交通支较少,在此平面进行劈离可将肝脏分为左右侧体积相近的两个半肝。2.采用改进方法获取供肝和原位无转流肝脏移植,有利于无肝期血液动力学稳定,术后出血、低体温发生率显着降低,预实验组7天存活率20%,实验组7天存活率80%。冷保存肝脏劈离过程中无门静脉右中叶支的损伤,无肝脏断面搭桥重建肝静脉,与全肝移植实验组对比,劈离肝移植术后ALT、AST均显着增高,生存率稍低（80%对60%）。3.通过在门静脉灌注通路添加压力缓冲装置,保证了灌注期间灌注压力的可控性,采用20分钟内逐渐升温升压的NMP灌注模式,DCD肝脏在体外灌注期间,血液动力学稳定,灌注液乳酸由灌注初期6.04±0.54mmol/L下降到结束时1.96±0.294mmol/L,NMP期间分泌胆汁逐渐增加,NMP结束前胆汁PH和碳酸氢盐浓度分别为7.59±0.04和32.98±1.04 mmol/L。与冷保存DCD肝脏劈离移植组比较,NMP保存DCD肝脏劈离移植组开放后循环更加稳定,其术后在3天生存率为60%,差异有显着意义。结论巴马小型猪有其特殊的解剖学特点,右半肝供肝移植宜选择肝中裂为劈离面,劈离时需注意防止损伤门静脉右中叶支和右外侧叶胆管;采用改进方法获取供肝和原位无转流肝脏移植的实验模型稳定,但是与全肝移植对比劈离肝移植仍然会对动物恢复造成显着的影响;在门静脉灌注通路增加压力缓冲装置可使灌注血液动力学更稳定,在灌注早期采用逐渐升温升压的NMP灌注模式,在NMP灌注后期进行肝脏劈离,可以修复肝脏并减少灌注机械性损伤。NMP期间通过对灌注液乳酸和分泌胆汁的检测,可以进行肝脏活力的评估。通过对比静止冷保存和NMP条件下DCD猪肝劈离肝移植,证明了NMP保存对DCD猪劈离肝移植的保护作用。
唐波[6]（2018）在《树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究》文中研究表明第一部分树鼩原位肝移植模型的建立[目的]首次尝试用树鼩建立同种异体原位肝移植动物模型,为肝移植的临床及科学研究提供一种新型的,与人类基因型及免疫系统同源性更高,且更为经济实用的肝移植动物模型。[方法]在Kamada报道的“二袖套”法肝移植模型基础上加以改进,通过对总共60只树鼩进行随机分组为供体组和受体组进行同种异体原位肝移植实验,观察手术成功率,术后树鼩存活率,并行肝脏组织病理学检查,建立稳定的树鼩原位肝移植模型。[结果]定型手术成功率为90.00%（27/30）,树鼩24h存活率为76.67%（23/30）,3 天存活率为 60.00%（18/30）,1 周存活率为 30.00%（9/30）,最长存活时间为11天。3例手术失败原因为:肝上下腔静脉吻合口出血,麻醉过深,气胸死亡各1例。24h内死亡4例,其中1例因吻合口出血,1例吻合口血栓形成,2例死亡原因不明。术后存活超24h死亡23例,原因分别为急性排斥反应15例,占65.22%,其它为:胆道梗阻1例,腹腔感染2例,肝叶坏死1例,不明原因4例。[结论]1树鼩原位肝移植模型建立的难度及操作复杂性比大鼠肝移植更大,综合影响因素更多。合理的围手术期处理及娴熟的显微镜操作是影响肝原位移植模型手术成功的关键。2树鼩肝移植模型成功建立为本研究的创新点,目前未见报道,首次成功用树鼩建立了同种异体原位肝移植模型,作为一种新型动物肝移植模型的建立——改良“二袖套”法在树鼩原位肝移植模型的建立,模型稳定可靠,为今后将树鼩原位肝移植模型运用于肝移植的临床及基础研究奠定了基础。第二部分树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因表达和迁移的体外实验研究[目的]研究雷帕霉素对树鼩外周血淋巴细胞趋化因子CXCL12（SDF-1）趋化功能及其受体CXCR4表达的影响,为移植排斥体内研究提供实验依据。[方法]实验分组:Rapacymin药物组、DMSO对照组和空白组。采用MTS细胞增殖实验,观察雷帕霉素对树鼩淋巴细胞存活及状态的影响;用细胞迁移运动实验检测雷帕霉素对人源性重组CXCL12所诱导树鼩淋巴细胞迁移能力的影响:使用Real-time PCR法检测雷帕霉素对树鼩淋巴细胞CXCR4基因的表达情况。[结果]雷帕霉素对树鼩淋巴细胞活力无显着影响,但对树鼩的淋巴细胞的迁移有抑制作用。同时雷帕霉素可下调树鼩淋巴细胞的CXCR4基因表达。[结论]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达水平可影响淋巴细胞迁移,为树鼩肝移植急性排斥反应体内实验研究提供依据。第三部分树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究[目的]在肝移植模型建立的基础上加用免疫抑制剂及趋化因子受体阻止剂对趋化因子及其受体的作用进行实验研究。通过表达的差异性,阐明肝移植急性排斥中趋化因子/趋化因子受体（CXCL12/CXCR4）轴调控淋巴细胞迁移发挥的作用和机理等系列问题。为肝移植急性排斥反应发生机制提供重要依据,同时为临床有效的治疗和控制急性排斥反应,促进移植物存活提供实验数据和理论支持。[方法]1树鼩肝移植急性排斥反应模型建立,方法同第一部分。2实验分组;（1）对照组,A组（n=25）:正常树鼩作为对照;（2）排斥组,B组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植组;（3）AMD3100组,C组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植静脉注射AMD3100,1mg/kg/day;（4）雷帕霉素（Rapacymin,RAPA）抑制组,D组（n=25）。术后1、3、5、7d随机处死5只,收集血液、肝脏、脾脏标本。留下5只观察生存期,绘制生存曲线。3 实验室常规指标测定:收集各组肝移植术后1d,3d,5d,7d的血清,使用血液全自动生化分析仪测定TP,ALT,AST,TB水平。4流式细胞仪检测淋巴细胞CXCR4:分别在肝移植术后1d,3d,5d,7d,收集脾脏淋巴细胞,进行分离、培养,流式细胞检测。5移植物组织形态及病理学检测:免疫组织化学染色（IHC）检测并分析CXCL12的表达情况。肝组织HE染色病理学检查,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。6酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中CXCL12（SDF-1）蛋白量。7组织蛋白印迹（Western blot）分析与检测各组移植肝的CXCR4蛋白表达情况。[结果]1 C、D组树鼩移植后中位生存时间明显长于B组,差异有显着意义（P<0.05）,各组与 A 组比较,（P<0.05）。2树鼩肝移植术后实验室常规检查指标:对比各组树鼩肝移植术后1d,3d,5d,7d的相关指标。血清TP同时间点各组之间相比较,B、C、D组明显低于A组,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D,TP开始下降,但三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。B组呈持续性下降,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,开始恢复,呈上升趋势,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。D组3d后,TP上升略高于C组,但两组统计无差异（P>0.05）。B组,C组,D组术后血清TB,ALT,AST,急剧上升,与A组在1d,3d,5d,7d同期比较,明显高于A组,差异有显着性（P<0.05）。B组持续性升高,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,肝功能开始恢复,略有上升趋势,但较平缓,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。3外周脾淋巴细胞流式细胞检测:术后1d、3d,B、C、D组间脾脏淋巴CXCR4表达无明显差异（p>0.05）,与A组有显着性差异（P<0.05）。术后5d、7d各时间点,C、D组明显低于B组,差异有显着性（P<0.05）。4移植肝脏形态学检测:采用Banff分级对移植肝脏AR的程度进行分级,A组术后各时间点,移植肝脏组织结构正常;B、C、D组1d肝小叶结构基本完好,肝细胞基本无变性、坏死,汇管区仅有少许炎性细胞浸润,未发生排斥;B组移植术后Id排斥不明确,在术后第3、5、7 d分别发生了轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）排斥;C、D组术后3天到10天内,有少数发生了轻度AR。B组与C,D组同期比较排斥反应更为严重（P<0.05）。B组,术后3d可有明确的急性排斥反应发生。5免疫组化检测肝脏CXCL12表达:术后第7d B组CXCL12在肝脏细胞表达最高,C组、D组肝细胞CXCL12表达少,C组、D组与B组比较有显着性差异（P<0.05）。A组正常组织也有较少量的CXCL12表达,但与B组、C组、D组比较有显着性差异（P<0.05）。6酶联免疫吸附法检测树鼩外周血浆中CXCL12蛋白的表达:肝移植后`d,B组,C组,D组血清CXCL12表达相互比较均无明显差异（P>0.05）,与A组相比有显着差异（P<0.01）。移植术后3d,B组血清中CXCL12快速上升,与术前`d的表达水平相比较,有显着差别（P<0.05）,并随时间上调。C组、D组表达水平在术后5d,7d天上升缓慢,与B组同时间点比较表达水平低（P<0.05）。CXCL12蛋白的表达变化与RAI呈正相关,相关系数（r）为0.880。7 Western蛋白印迹分析检测:术后第1d各组树鼩移植肝内CXCR4蛋白表达无明显差异（P>0.05）。而术后第3d、5d、7d各时段A组、C组、D组树鼩淋巴细胞表达CXCR4蛋白明显低于B组（P<0.05）。C组、D组术后CXCR4蛋白表达高于A组（P<0.05）,而C组、D组两组之间第3d、5d、7d 比较CXCR4蛋白表达差异不明显（P>0.05）。[结论]1树鼩与人同源性较好,可用人的相关试剂应用在树鼩实验研究上,本实验研究结果的可靠性,进一步证实树鼩肝移植模型可应用于肝移植的系列实验研究中,并具有物种的优越性和价值。2树鼩肝移植模型急性排斥反应研究证实,正常肝组织有CXCL12表达,急性排斥时,可与CXCR4协同发生淋巴细胞、炎性细胞迁移至移植物,引起移植肝功能不全或受损。3趋化因子受体抑制剂AMD3100可阻断CXCL12/CXCR4轴在肝移植排斥中的作用,抑制T淋巴细胞向移植物浸润,减轻急性排斥反应。4雷帕霉素可抑制CXCL12人重组蛋白诱导的树鼩淋巴细胞迁移。其相关可能的机制为:雷帕霉素可下调CXCL12的激活与表达,并影响CXCR4受体的表达,以调控CXCL12/CXCR4信号通路所介导的淋巴细胞的运动能力,发挥其免疫抑制作用。5肝移植后CXCL12/CXCR4的表达水平与急性排斥反应的程度密切相关,表达水平与排斥反应强度有关,可评估免疫排斥反应状态。6 CXCL12血清中持续高表达可较敏感地预示肝移植急性排斥发生。检测血清CXCL12表达可作为一种无创的、敏感的早期诊断肝移植急性排斥反应的方法,为临床监测和诊断提供参考依据。并且可通过CXCL12的表达水平在一定程度上预测排斥反应的严重程度和判断抗排斥反应的治疗效果。
武睿超[7]（2018）在《CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究》文中认为第一部分大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析[目的]探讨大鼠DCD供体原位肝移植模型稳定建立的技巧及其经验总结。[方法]通过改良Kamada“二袖套”法,对三组（A组热缺血0min40对,B组热缺血10min40对,C组热缺血20min40对）SD大鼠施行原位肝移植,术后记录分析大鼠24h,72h,7天生存率和死亡原因。[结果]术后24h生存率A组92.5%,B组90.0%,C组92.5%;术后72h生存率A组 90.0%,B 组 80.0%,C 组 77.5%;术后 7 天生存率 A 组 85.0%,B 组 70.0%,C组57.5%。3组术后24h和术后72h生存率差异均无显着性（p>0.05）。但3组术后7天生存率不全相同（p<0.05）。7天生存率C组比A组显着降低（p=<0.0167）。术后24h内死亡原因多为手术操作不足,术后胆漏、缺血性肝衰竭多在24h-72h死亡,手术3天-7天死亡原因多为胆道并发症,且随着热缺血时间的延长,胆道并发症的发生率增高。[结论]建立了稳定的大鼠DCD原位肝移植模型。大鼠DCD原位肝移植模型的稳定建立关键在于保护肝脏和胆道功能,难点在于肝上下腔静脉的吻合和缩短无肝期。第二部分热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMKⅡ、肝细胞凋亡及线粒体凋亡的关系[目的]研究在大鼠DCD原位肝移植中,供肝不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMK Ⅱ和肝细胞凋亡、线粒体凋亡的关系[方法]建立大鼠DCD肝移植模型,A组（热缺血Omin）、B组（热缺血1Omin）、C组（热缺血20min）,三组分别于肝移植术后1d、3d、7d随机处死6只大鼠,取肝细胞流式细胞技术AnnexinV-FITC/PI标记测肝细胞凋亡率和JC-10标记测肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaM mRNA、CaMK Ⅱ γmRNA定量,Western blot测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]术后3天,7天,肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比C组较A组、B组升高,（P<0.05）。B组较A组高（P<0.05）。三组术后同一时间点细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死率C组较B组和A组高,B组较A组高（p<0.05）。CaM、CaMKⅡγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显着性,术后3天、7天C组高于B组和A组（P<0.05）,而B组高于A组（P<0.05）。[结论]在大鼠DCD原位肝移植中,随着供肝经历热缺血时间的延长,术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡逐渐增加,肝细胞质CytC、AIF表达量,肝组织CaM、CaMKⅡ表达量逐渐上调。提示CaM、CaMKⅡ与大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡相关,并在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡途径的细胞凋亡中起着十分关键的作用。第三部分CaMK Ⅱ表达在大鼠DCD肝移植术后细胞和线粒体凋亡中的初步研究[目的]探究CaMK Ⅱ在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡中的作用。[方法]通过建立热缺血10min的大鼠DCD原位肝移植模型,注射靶向CaMK Ⅱγ基因、CaMKⅡγ-shRNA慢病毒转染,上调和下调模型肝细胞CaMKⅡ表达量。1B组（生理盐水空白组）,2B组（CaMK Ⅱγ过表达空载体组）,3B组（CaMK Ⅱγ过表达组）,4B组（CaMK Ⅱγ干扰表达空载体组）,5B组（CaMK Ⅱγ干扰表达组）,于术后1天、3天、7天、30天随机处死3只大鼠,流式细胞技术测肝细胞凋亡率和肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaMmRNA、CaMK ⅡγmRNA定量,Western blot检测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]五组术后同一时间点肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死细胞率3B组明显高于1B和2B组（P<0.05）,5B组明显低于1B组和4B组（P<0.05）,而1B、2B、4B差异无显着性（P>0.05）。CaM、CaMK Ⅱγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显着性,术后3天、7天、30天3B组明显高于1B和2B组（P<0.05）,5B组明显低于1B组和4B组（P<0.05）,而1B、2B、4B差异无显着性（P>0.05）。[结论]大鼠DCD原位肝移植术后自大鼠阴茎背静脉注入慢病毒进行转染,此方法简单、安全、有效。在大鼠DCD原位肝移植中,上调肝细胞CaMKⅡγ表达量后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率升高。反之,干扰下调肝细胞CaMKⅡ表达后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率降低。反应了CaMKⅡ参与大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡及细胞凋亡过程的调控。由此推断,在DCD肝移植术后,若能特异性阻断CaMK Ⅱ信号通路,则可达到减少肝细胞凋亡的目的。
黄兆宇,武睿超,冉江华,刘均汉[8]（2018）在《大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析》文中提出目的建立稳定的大鼠心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death,DCD）供肝原位肝移植模型,分析移植后24 h内大鼠死亡原因并探索相应的改进措施。方法所有供肝获取前经历供体心脏停跳10 min,采用改良Kamada的"二袖套"吻合法完成大鼠DCD供肝原位肝移植手术,记录各个手术阶段所用时间及术后大鼠的死亡情况。结果在40 d内完成大鼠DCD供肝原位肝移植手术100例,供体手术时间为（20±5）min,受体手术时间为（55±5）min,无肝期为（20±3）min。移植术后受体一般情况可。术中死亡9例,其中术中大出血4例、麻醉意外1例、无肝期过长1例、套管置入失败1例、空气栓塞2例;术后12 h内死亡22例,其中术后肠道坏死6例、术后吻合口渗血6例、术后肺水肿3例、术中失血量过多4例、术后血管栓塞2例、不明原因死亡1例;1224 h死亡19例,其中术后肠道坏死9例、术后吻合口渗血3例、术后肺水肿2例、术中失血量过多1例、术后血管栓塞1例、不明原因死亡3例。结论导致大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因很多,其中术后肠道坏死、术中及术后出血、术后肺水肿及术后血管栓塞是主要的致死因素。针对术后死亡原因采取相应的预防及改进措施能大大提高大鼠术后存活率,从而建立稳定的大鼠DCD供肝原位肝移植模型。
范林[9]（2017）在《低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制》文中研究指明第一部分大鼠原位肝移植模型手术改进目的:建立大鼠原位肝移植（Rat orthotopic liver transplantation,ROLT）模型对供肝质量的评价与研究至关重要。传统的显微缝合重建管道方法耗时较长,且对吻合技术要求过高,不利于推广。Kamada二袖套法及其改良法的出现使该模型简化并趋于稳定。笔者基于此方法,针对手术中潜在危险因素和细节问题的处理进行了探讨,并且对整个ROLT术中影响大鼠术后生存率的危险因素进行分析,对肝上下腔静脉吻合（suprahepatic inferior vena cava,SHVC）技术进行改进,以期获得稳定的大鼠术后生存率。方法:雄性SPF级SD大鼠180只,体重250±20 g。实验分为三组,第一组:ROLT模型学习阶段（60只）;第二组:ROLT模型稳定阶段（60只）;第三组:ROLT模型改良阶段（60只）。在受体手术过程中,记录各个部分操作用时,包括:无肝期,肝上下腔静脉、门静脉、肝下下腔静脉及胆管的重建时间等,同时记录手术成功率。术后每天观察受体的一般状况,对术中及术后死亡的大鼠及时进行尸检。统计并比较移植术后1天及7天生存率。结果:本研究共实施大鼠原位肝移植手术90例。三个阶段无肝期相比较,第二阶段比第一阶段缩短40%,第三阶段比第一阶段缩短64%。三个阶段肝移植术后24小时存活率分别为:20%（6/30）;86.7%（26/30）;100%（30/30）。三个阶段大鼠肝移植术后一周存活率分别为 10%（3/30）,60%（18/30）及 93%（28/30）。结论:ROLT术后生存率的提升须注意对术中各细节的处理。无肝期过程中,需快速、熟练地完成SHVC的吻合。尤其是缩短无肝期可提高手术安全性,而缩短无肝期决定于手术熟练度,技术稳定性,特别是针对大鼠无肝期内环境和血液动力学改变采取有效的处理措施,可有效减少术中危险因素,提高围手术期和术后生存率,并为进一步实验奠定坚实的基础。第二部分大鼠低温携氧机械灌注系统的建立及其参数探讨目的:本研究通过比较并评估低温携氧机械灌注（Hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE）过程中不同压力参数下肝脏质量的变化,建立一种稳定、安全、有效的HOPE系统,实现对肝脏的精细化灌注,以达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床研究提供思路,从而达到扩大供肝来源的目的。方法:雄性SPF级SD大鼠（220±10g）30只,根据不同的门静脉灌注压力分随机分为 5 组（n=6）,A 组:OmmHg,B 组:2mmHg,C 组:4mmHg,D 组:6mmHg及E组:8mmHg。肝脏获取后经离体冷保存（A组）或HOPE（B组、C组、D组及E组）干预3小时后,观察并记录各组肝脏湿重变化,检测灌注液中ALT、AST及LDH的含量与肝组织中MDA、糖原、乳酸盐含量以评估肝脏质量。结果:随着肝脏门静脉灌注压力的升高,各组肝脏湿重均有不同程度增加,D组及E组增加最为明显,最高达40%。同时,灌注液中ALT、AST、LDH,肝脏组织中的MDA及乳酸盐的含量随着门静脉灌注压力的升高逐渐增加,而C组肝脏中糖原含量最低,E组含量最高。结论:严格调控HOPE期间的灌注参数,将灌注压力控制在4mmHg以内,能够保证肝脏充分灌注的同时尽可能地降低灌注性损伤,从而达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床应用提供理论依据。第三部分大鼠脂肪供肝模型的建立目的:本研究旨在建立一种稳定的大鼠脂肪供肝模型,模拟人体发病机制,为优化边缘供肝的研究奠定基础。方法:成年SPF级SD大鼠90只,雄性,体重220±10g。随机选取10只大鼠经过适应性喂养一周后取材,检测指标作为正常对照。其余80只分为两组,A组:高脂饮食组（High-fat diet,HFD）（n=40）,采取60%高脂饮食（60%脂肪,20.6%碳水化合物,19.4%蛋白。其中脂质部分包含90%猪油及10%大豆油）饲养;B组:普通饮食组（Standard chow diet,SCD）（n=40）,采用普通低脂饮食饲养,饮食诱导持续8周。造模期间观察大鼠生命体征及一般情况,每周检测其组织学及血清学变化情况。结果:与SCD组相比,HFD组血清中ALT和AST水平均无统计学差异。HFD组血清TG水平在第1、2周上升较快,达到正常值的两倍以上,在随后的第3-8周内逐渐降至正常值。HFD组血糖、胰岛素及肝组织脂质含量与SCD组比较有明显统计学差异（P<0.05,P<0.05和P<0.01）。各组脂肪肝中MDA含量无明显差异（P>0.05）。随着造模时间延长,肝脏脂肪变性程度逐渐加重,第1-3周以小泡型脂肪变性为主,第4-8周则以大泡型脂肪变性为主。结论:选择不同造模时间来诱导实验所需程度的大鼠肝脏脂肪变性,本组脂肪供肝的模型验证了该配方的有效性及稳定性,并为进一步实验提供可靠稳定的大鼠脂肪供肝模型。第四部分低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其机制目的:器官供需严重失衡,脂肪供肝质量的优化可提高使用率,有益于扩大供体器官的来源。本研究拟分析静态冷保存（Static Cold storage,SCS）与低温携氧机械灌注（Hypothemic oxygenated machine perfusion,HOPE）对脂肪肝的作用,进一步探讨 HOPE对于脂肪供肝的质量优化作用及其潜在机制。方法:成年SPF级SD大鼠44只,雄性,体重220±10g,采用普通饲料（A组）或60%高脂饲料（B-D组）进行饲养。分为4组:A组（11只）:非脂肪变性肝脏获取后,置于UW液（0-4℃）中保存45分钟（修肝）后移植。B组（11只）:脂肪变性肝脏获取后在0-4℃的保存液中4小时后移植。C组（11只）:脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE以及1小时CS后移植。D组（11只）:脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE+1小时CS（灌注液中增加脱脂药）后移植。通过记录肝脏灌注过程中的参数,Western blot 检测肝脏组织中 KLF-2、eNOS、ICAM-1、HMGB1、TLR4、PRDX6、Caspase-3、PP2A、PPY、GRP78、CHOP 与 ATF-6 蛋白表达水平,Tunel 检测各组中肝细胞凋亡情况,试剂盒检测肝脏组织中ATP与肝糖原含量,比较各组移植术后生存率,综合评价肝脏质量。结果:比较门静脉开放1min后各组肝脏复灌情况,结果显示A组脂肪供肝复灌效果最佳,B组效果最差;与B组相比,C组与D组微循环相关蛋白KLF2及eNOS表达明显升高,同时D组表达最高,且差别有统计学意义（P<0.05）,而ICAM-1蛋白水平明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）;HMGB1与TLR4在C组与D组的表达水平明显下降,B组中表达量最高,而PRDX6在B组中明显降低,三者差别均有统计学意义（P<0.05）,表明经HOPE与DF干预之后的脂肪供肝炎症损伤明显减轻,抗氧化损伤能力明显增强;C组与D组内质网应激相关蛋白PPY、GRP78、CHOP、ATF-6表达较B组呈下降趋势,其中D组表达最低,反之C组与D组中PP2A表达升高,B组表达最低,三者差异有统计学意义（P<0.05）,同时Tunel结果证实:与B组相比,C组与D组肝细胞凋亡得到明显抑制。移植术后24小时肝脏组织中ATP与糖原含量结果显示,B组中ATP含量较低,而C与D组中ATP含量明显升高,反之,肝糖原含量在B组中较高,三者差异有统计学差异（P<0.05）;比较各组移植术后生存曲线发现,C组与D组移植术后生存率较B组明显升高。结论:低温携氧机械灌注通过改善脂肪供肝微循环,抑制内质网应激,稳定线粒体功能促进ATP合成,清除炎症因子等减轻缺血再灌注损伤,从而提高移植术后受者生存率,为临床应用HOPE提供了理论依据。脱脂药在低温状态下无法促进脂肪供肝的脂质分解,但可以进一步改善微循环、抑制炎症因子的释放等,从而优化肝脏质量。为脂肪肝应用于移植提供理论依据。
黄戎娟,刘洋,张聪[10]（2016）在《建立大鼠原位肝移植模型的手术技巧》文中进行了进一步梳理目的采用"二袖套法"建立稳定的大鼠原位肝移植模型,为临床试验提供依据,并探讨手术技巧。方法在Kamada的"二袖套法"基础上进一步改进,供体经腹主动脉行肝脏冷灌注,用缝合法吻合肝上下腔静脉,用袖套法吻合门静脉与肝下腔静脉,胆道采用支架法重建。对200只SD大鼠进行原位肝移植,记录各项操作时间以及术后存活率、并发症情况,专人对数据统计分析。结果共对200只大鼠采用改良的"二袖套法"行原位肝移植。手术成功率为90.00%（180/200）。部分大鼠死亡原因包括出血、肝下腔静脉血栓、肝上下腔静脉回流不畅、袖套扭转、脱落、胆瘘、胆道梗阻、肝功能衰竭以及肝脓肿。结论能熟练进行显微外科操作,并且手术精确是缩短操作过程以及减少术后并发症发生的前提。而受体大鼠的术后存活情况又与无肝期时间密切相关。
二、改进的大鼠原位肝移植术与相关手术技巧（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改进的大鼠原位肝移植术与相关手术技巧（论文提纲范文）
（1）SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道微生物与肝病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 建立大鼠肝移植模型并探究逆灌注法对移植术后炎症因子和氧化应激分子影响的观察 |
| 一、大鼠肝移植模型的建立 |
| 二、经下腔静脉逆灌注法对移植术后炎症因子和氧化应激分子影响的观察 |
| 三、材料与方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 经下腔静脉逆灌注法对DCD来源供肝术后早期氧化应激损伤的影响 |
| 一、资料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 综述 |
| 参考文献 |
| 附录B 中英文对照缩略词表 |
| 附录C 个人简历及研究生发表文章 |
| 致谢 |
（3）双重动脉血供模型的建立及对大鼠肝再生线粒体能量代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 肝脏双重动脉血供动物模型的建立 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| References |
| 第二部分 双重动脉血供对大鼠肝细胞再生线粒体能量代谢的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| References |
| 文献综述 肝脏双重动脉血供的基础与临床研究进展 |
| References |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 内蒙古医科大学硕士学位论文评阅意见书 |
（4）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）DCD巴马小型猪肝脏常温机械灌注下劈离肝脏移植的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、巴马小型猪肝脏解剖学研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 麻醉及静脉动脉通路建立 |
| 1.1.3 手术方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 巴马小型猪肝脏大体解剖 |
| 1.2.2 巴马小型猪肝脏各叶重量及比率 |
| 1.2.3 巴马小型猪肝脏血管和胆道 |
| 1.3 讨论 |
| 二、巴马小型猪经典非转流肝脏移植研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 麻醉及静脉动脉通路建立 |
| 2.1.3 肝脏获取及修整 |
| 2.1.3.1 预实验组供肝获取及修整 |
| 2.1.3.2 实验组供肝获取及修整 |
| 2.1.4 受体手术 |
| 2.1.5 术后治疗方案 |
| 2.1.6 观察指标 |
| 2.1.7 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 移植术后基本情况 |
| 2.2.2 术中血流动力学及体温改变 |
| 2.2.3 实验组术后肝功能改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 猪肝脏移植的困难 |
| 2.3.2 猪肝脏移植血液的准备及无肝期处理 |
| 2.3.3 猪肝脏移植供肝获取和移植技术的改进 |
| 2.3.4 猪肝脏移植的体温维持和术后管理 |
| 2.4 小结 |
| 三、巴马小型猪经典非转流劈离肝脏移植研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物及分组 |
| 3.1.2 手术方法 |
| 3.1.2.1 麻醉和供肝获取方法 |
| 3.1.2.2 供肝劈离及修整 |
| 3.1.2.3 受体肝脏劈离式移植手术(右半肝) |
| 3.1.3 术后治疗方案 |
| 3.1.4 观察指标 |
| 3.1.4.1 手术基本情况 |
| 3.1.4.2 受体术后监测指标 |
| 3.1.5 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 移植术后基本情况 |
| 3.2.2 术后肝功能情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 劈离肝移植左、右半肝移植物的选择 |
| 3.3.2 血管和胆道的劈离 |
| 3.3.3 劈离肝移植的管理和并发症的防治 |
| 3.4 小结 |
| 四、巴马小型猪DCD肝脏常温机械灌注研究 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 常温机械灌注装置的主要设备及材料 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 DCD供肝获取 |
| 4.1.5 常温机械灌注灌注液配方 |
| 4.1.6 常温机械灌注管路运行及检测 |
| 4.1.7 灌注过程中标本收集 |
| 4.1.8 统计方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 灌注过程中血液动力学情况 |
| 4.2.2 常温灌注过程中灌注液酶学、乳酸,胆汁情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 DCD肝脏模型的建立 |
| 4.3.2 NMP灌注液成分 |
| 4.3.3 氧气浓度 |
| 4.3.4 灌注模式(灌注压力和灌注温度) |
| 4.4 不足 |
| 五、DCD巴马小型猪肝脏常温机械灌注下劈肝脏移植的研究 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验动物及分组 |
| 5.1.2 手术方法 |
| 5.1.2.1 冷保存组手术方法 |
| 5.1.2.2 NMP组手术方法 |
| 5.1.3 术后治疗方案 |
| 5.1.4 观察指标 |
| 5.1.4.1 手术基本情况 |
| 5.1.4.2 受体术后监测指标 |
| 5.1.5 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 移植术后基本情况 |
| 5.2.2 生化检验情况 |
| 5.2.3 组织学改变 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 DCD肝脏在常温机械灌注下劈离的优势 |
| 5.3.2 DCD肝脏在常温机械灌注下劈离的时机 |
| 5.3.3 常温机械灌注下劈离需要注意情况 |
| 5.3.4 NMP对DCD劈离肝移植的保护作用 |
| 5.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肝脏机械灌注保存进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 树鼩原位肝移植模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因迁移和表达的体外实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMK Ⅱ、肝细胞凋亡及线粒体凋亡的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMK Ⅱ表达在大鼠DCD肝移植术后细胞和线粒体凋亡中的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 手术方法 |
| 1.3.1 术前准备 |
| 1.3.2 供体手术 |
| 1.3.3 受体手术 |
| 1.3.4 术后处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 术中大鼠死亡的主要原因及改进措施 |
| 3.1.1 术中出血 |
| 3.1.2 麻醉意外 |
| 3.1.3 缩短无肝期、减少套管失败导致的出血及空气栓塞 |
| 3.2 术后24 h内主要死亡原因及改进措施 |
| 3.2.1 肠道坏死 |
| 3.2.2 肺水肿 |
| 3.2.3 血管栓塞 |
（9）低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型手术改进 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第二部分 大鼠低温携氧机械灌注系统的建立及其参数探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第三部分 大鼠脂肪供肝模型的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第四部分 低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
四、改进的大鼠原位肝移植术与相关手术技巧（论文参考文献）
- [1]SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律[D]. 朱宏伟. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究[D]. 蓝海斌. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [3]双重动脉血供模型的建立及对大鼠肝再生线粒体能量代谢的影响[D]. 田全发. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [4]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [5]DCD巴马小型猪肝脏常温机械灌注下劈离肝脏移植的实验研究[D]. 吴凤东. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究[D]. 唐波. 昆明医科大学, 2018(05)
- [7]CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究[D]. 武睿超. 昆明医科大学, 2018(01)
- [8]大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析[J]. 黄兆宇,武睿超,冉江华,刘均汉. 中国普外基础与临床杂志, 2018(03)
- [9]低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制[D]. 范林. 武汉大学, 2017(06)
- [10]建立大鼠原位肝移植模型的手术技巧[J]. 黄戎娟,刘洋,张聪. 肝脏, 2016(04)