一、以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建（论文文献综述）
耿思宇[1]（2019）在《GPAT基因组学研究及GPAT19在植物防卫中的作用》文中研究说明甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）是催化三酰甘油合成和酰基脂质代谢的关键酶,与植物体内脂质的合成和代谢密切相关。在拟南芥中,AtGPATs在萼片、花瓣、果实角质层合成中起着重要作用,并且与胼胝质和花粉发育有关。油菜作为重要的油料作物,BnGPATs的功能却鲜有研究。本文首次对甘蓝型油菜GPATs家族进行了全方位基因组学研究,并利用RNA干扰技术对AtGPAT6的同源基因BnGPAT19的功能进行了初步研究。主要研究结果如下:1.甘蓝型油菜基因组中,共有32个BnGPAT基因,且这32个BnGPAT基因分别定位于叶绿体、内质网、细胞质、质膜和高尔基体上。2.通过对甘蓝型油菜中AtGPAT6同源基因的时空表达分析,发现BnGPAT19主要在植株叶片中表达,主要表达时期为授粉2周。且抗型植株中BnGPAT19表达量高于易感型植株。3.对转pCaMGPAT19-RNAi载体的转基因植株进行qRT-PCR分析发现,与野生型植株相比,RNAi转基因植株中BnGPAT19基因的表达量均有不同程度降低,抑制范围在25.37%-85.55%。4.在植株生长的全生育期内,相比于野生型植株,RNAi转基因植株明显处于劣势,具体体现在:种子萌发晚且萌发率低、生长发育延迟、叶片虫害严重、花器官发育受阻、结实率低、种子皱缩、千粒重降低,种皮颜色加深、花粉粒畸形。5.通过对野生型植株和RNAi转基因植株离体叶片渗透性实验及抗核盘菌实验研究发现:降低BnGPAT19基因在油菜转基因植株中的表达水平,会导致转基因植株叶片渗透性增加、对菌核病防卫能力降低。且在RNAi转基因植株中,与角质合成以及菌核病防卫相关的CER1、MAH1、PTP1基因的表达量也都降低了。
刘芳[2]（2019）在《转录因子GT和GATA对于甘蓝型油菜BnaFAD2基因启动子的作用分析》文中进行了进一步梳理脂肪酸去饱和酶2基因（FAD2）是控制油菜中油酸含量的重要基因,通过研究GATA和GT转录因子与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子的互作关系及其转录调控机制,为高油酸油菜育种提供分子理论基础。本研究通过缺失启动子片段及生物信息学分析,预测BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子区潜在顺式作用元件;从PlantTFDB转录因子数据库中筛选候选转录因子,通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测转录因子的表达规律,并与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5表达规律对比,进一步筛选候选转录因子;利用酵母单杂交验证转录因子与启动子序列的互作情况;将转录因子与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子序列共转入拟南芥,通过Western blot检测报告基因GFP的蛋白表达情况,分析转录因子对于启动子功能的影响。主要研究结果如下:（1）BnaFAD2.C5启动子-1020-319bp区域主要启动基因在甘蓝型油菜根部表达;-1020-581bp区域主要控制基因在茎组织中表达;-581-319bp区域主要调控该基因在叶片中的表达;-1257-1020bp区域主要控制基因在花中的表达;启动子-319-1bp区域是控制种子中基因表达的关键区域。通过分别施加不同浓度的乙酰水杨酸和茉莉酸,发现两种植物生长调节剂对于基因表达有促进作用,说明BnaFAD2.C5基因启动子上存在乙酰水杨酸和茉莉酸的应答元件,结合生物信息学分析发现这两个应答元件分别位于-1150-1141bp和-39-35bp。（2）本文发现BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子具有约680 bp的同源区对于基因表达量有着重大贡献,将BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子高度同源区分为4个区域,进行缺失分析,发现BnaFAD2.A5启动子区域的-226-314bp和BnaFAD2.C5启动子区域的-228-312 bp区域是调控二者在种子中表达的关键启动子区域。通过PlantCARE网站预测分析,发现这两个区域存在共同的调控元件GATA和GT,通过缺失GATA和GT两个顺式作用元件及突变GATA和GT两个顺式作用元件的方法,发现二者在调控基因表达水平上发挥重要作用。（3）通过PlantTFDB网站分析,获得31个甘蓝型油菜GATA转录因子核酸序列和6个甘蓝型油菜GT转录因子核酸序列,采用荧光定量PCR技术分析,发现GATA家族基因中Bna010243与BnaFAD2.A5的表达模式最为相似,Bna006754、Bna015605、Bna026124与BnaFAD2.C5表达模式较为接近,GT家族基因中Bna013749与BnaFAD2.A5的表达模式最为接近,Bna010915与BnaFAD2.C5表达模式最为接近。（4）以甘蓝型油菜湘油15基因组和cDNA基因组序列为模板,克隆GATA家族和GT家族基因,分别为Bna006754（903 bp,301aa）、Bna010243-1（594 bp,198aa）、Bna010243-2（567 bp,189aa）、Bna015605（963 bp,321aa）、Bna026124-1（546 bp,182aa）、Bna026124-2（582 bp,194aa）、Bna010915（681 bp,227aa）和Bna013749（1 239 bp,413aa）。GATA家族蛋白均具有保守的单个18个残基的锌指结构（CX2CX18CX2C）。GT家族蛋白具有3个α-螺旋构成Trihelix结构。（5）通过酵母单杂交技术,分析转录因子与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子在酵母中的互作关系,发现发现GATA家族的转录因子Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2可以与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子相互作用;发现GT家族的转录因子Bna010915和Bna013749均可以与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子发生互作。（6）通过分析转录因子与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子上GATA元件和GT元件在模式植物拟南芥中的互作关系,当GATA家族转录因子与含有GATA元件的启动子片段共转化拟南芥时,GFP蛋白含量明显高于无转录因子时,当敲除GATA元件时,GFP蛋白含量无明显变化;当GT家族转录因子与含有GT元件的启动子片段共转化拟南芥时,GFP蛋白含量有明显变化,当敲除GT元件时,GFP蛋白含量无明显变化。结果表明GATA家族的转录因子Bna010243-1、Bna026124-1和Bna026124-2可以与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子中GATA元件相互作用,增强基因的表达水平。GT家族的转录因子Bna010915可以与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子中的GT元件发生互作,正向调节基因表达;Bna013749通过与BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子中的GT元件发生互作,负向调节基因表达。
徐平丽,唐桂英,毕玉平,柳展基,单雷[3]（2018）在《花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析》文中研究说明FAD2(Δ12 fatty acid desaturase,Δ12FAD或FAD2)是催化油酸在脂肪酸碳链Δ12位脱氢生成亚油酸的关键酶。在花生中,FAD2酶活性下降或失活可提高籽粒中油酸的相对含量,改善花生籽粒及制品的品质和氧化稳定性。通过将种子特异性表达Lectin启动子和Ca MV35S启动子驱动的倒位重复Ah FAD2基因RNAi干扰结构转入花生,获得了以丰花1号（FH1）和花育23（HY23）为受体、携带上述2种转化结构、稳定遗传的花生转基因纯合体株系,转基因花生主要农艺性状与非转基因对照基本一致。实时荧光定量分析发现,各转基因株系发育种子中Ah FAD2基因的转录水平普遍下调。气相色谱法进一步测定了部分转基因后代株系种子的脂肪酸含量及组成,籽粒中油酸含量分别平均提高了15.09%（HY23为受体）、36.40%（FH1为受体）,相应地,亚油酸含量平均下降了16.19%、29.81%,油亚比平均增加了38.02%、98.10%。各转基因株系的油酸含量显着提高;且在以FH1为受体的转基因株系后代籽粒以及种子特异性启动子驱动的转化结构中,RNAi的抑制效果更明显。通过RNAi技术抑制花生FAD2基因的表达,可以有效提高花生籽粒油酸含量。该技术体系可以为花生品质育种提供借鉴。
韦云婷[4]（2018）在《甘蓝型油菜转录因子FUSCA3的功能分析》文中认为油菜作为我国重要的粮油作物,大幅度提高菜籽油产量以增加食用油的自给率,是国家的重大需求。目前植物的种子中油脂形成的分子生物学机制及其代谢调控机理已经有了初步研究,转录因子因其有多个靶基因而成为新的研究热点,而FUSCA3（FUS3）转录因子调控油脂合成的作用方式和调控机理仍不明了。本研究从“湘油15”中克隆到BnaFUS3基因并分析其功能,主要研究结果如下:（1）从“湘油15”中克隆到BnaFUS3基因的两个拷贝BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3的CDS区序列,分别长为927bp、948bp,编码309、315个氨基酸,两拷贝的氨基酸序列变异多发生在C端。BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3属于含B3结构域的蛋白家族,是具有亲水性蛋白,无跨膜区,均是膜外蛋白。系统进化树分析,BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3两者都是BraFUS3和AtFUS3的同源基因。（2）荧光定量PCR分析,BnaA2.FUS3在根、茎、叶、角果皮中均有表达,在种子中相对稳定表达,但在角果皮25d达到峰值;BnaA6.FUS3在种子中稳定高表达,在35d为峰值;两者在角果皮中表达量均呈“M”形趋势。分析脂肪酸积累规律与BnaFUS3表达关系,发现授粉30d后,BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3表达迅速升高,此时各脂肪酸也进入快速增长期;授粉后45d-50d时,两拷贝表达量变化较小,脂肪酸积累亦进入缓慢增长期,并趋于平稳。表明BnaFUS3在甘蓝型油菜的胚胎形成和发育中具有重要影响,对脂肪酸的合成和油脂积累起到重要作用。（3）非生物逆境胁迫分析,6-BA、干旱和高温（40℃）胁迫条件下,能够诱导和促进BnaFUS3基因的表达,其中6-BA对BnaA6.FUS3的诱导大于BnaA2.FUS3,干旱对BnaA2.FUS3的诱导作用大于BnaA6.FUS3;盐胁迫,低温（4℃）环境下,抑制BnaFUS3的表达,其中短时间内盐胁迫对BnaA6.FUS3的抑制大于BnaA2.FUS3,低温处理对BnaA2.FUS3的抑制大于BnaA6.FUS3;ABA和水渍对BnaFUS3的表达影响波动较大。（4）BnaFUS3转化拟南芥分析,BnaFUS3促进油酸的积累,抑制软脂酸、亚油酸和亚麻酸的积累;其中BnaA2.FUS3促进油酸的积累作用大于BnaA6.FUS3,对抑制亚油酸积累作用亦大于BnaA6.FUS3;两者对硬脂酸和花生烯酸影响不大。（5）BnaFUS3基因转化甘蓝型油菜,通过组织培养获得阳性再生苗。
武玉花[5]（2012）在《甘蓝型油菜KCS基因家族表达及功能分析》文中进行了进一步梳理KCS基因家族编码β-酮脂酰CoA合成酶，催化超长链脂肪酸延伸过程的缩合反应，是超长链脂肪酸合成的限速酶。通过克隆KCS基因，可阐明KCS基因在超长链脂肪酸及蜡质合成中的功能，为油菜脂肪酸改良提供新的基因源。本研究采用同源序列法分离了高芥酸油菜品种中油821、零芥酸野生种诸葛菜和荠菜，含芥酸野生种野芥、白芥和菘蓝中的FAE1基因序列。5个野生种的FAE1基因序列与甘蓝型油菜中油821的FAE1基因同源性高于85%。在酵母中异源表达野生种的FAE1基因，各FAE1基因都可正常表达，转化诸葛菜和荠菜FAE1基因的酵母不能合成超长链脂肪酸，而转化野芥、白芥和菘蓝的FAE1基因的酵母都有微量长链脂肪酸的合成。实验结果表明诸葛菜和芥菜的低芥酸性状源于FAE1基因编码产物的失活。无论是高芥酸物种还是零芥酸物种，其FAE1基因的核苷酸序列高度保守。FAE1基因是芥酸合成的限速酶，通过定向抑制FAE1基因的功能，有望将高芥酸油菜品种改良为低芥酸油菜品种。选用FAE1基因的全长序列构建FAE1基因的RNAi载体。将FAE1基因编码区以头对头的方式构建到种子特异性Napin启动子的下游，反向重复的FAE1序列用组蛋白H2A内含子间隔。采用农杆菌介导法将构建的FAE1RNAi载体转化到高芥酸甘蓝型油菜品种中油821中，获得81株转化苗，其中有51株阳性苗。用气相色谱法分析转化株T1代混合种子的脂肪酸组成，受体品种中油821的芥酸含量为43.35%，转基因植株的芥酸含量与野生型相比有不同程度的降低，21株芥酸含量低于35%，2个转化株芥酸含量在10-20%之间。用近红外光谱仪分析转基因植株T2代种子，多数株系的芥酸含量与高芥酸油菜无明显差异，只有1个株系的后代其芥酸性状符合1:3的分离比，低芥酸植株的芥酸含量最低达到2%的水平。结果表明，通过RNAi技术介导FAE1基因沉默可以有效的降低转基因植株中的芥酸含量，但不能降至零芥酸水平。低芥酸转基因植株具有明显的非预期效应，表现出种子皱缩、形状不规则、种皮没有光泽而且难以正常生长等。在前期基因组步移及RACE实验的基础上，克隆了BnKCS1、BnKCS3、BnKCS4、BnKCS5、BnKCS6、BnKCS8、BnKCS9、BnKCS10、BnKCS11、BnKCS12、BnKCS13、BnKCS15、BnKCS16、BnKCS17、BnKCS19、BnKCS20和BnKCS21共17个基因的编码序列。对分离的BnKCS基因成员进行亲缘关系分析，从甘蓝型油菜中分离的BnKCS基因成员可分为6个亚类。FAE1基因与KCS基因家族其他成员间的序列同源性在45.6%-63.1%之间，BnKCS4、BnKCS8、BnKCS9、BnKCS16和BnKCS17基因与FAE1基因属于同一亚类，它们与FAE1基因的序列一致性均大于60%。BnKCS基因的表达谱分析表明，种子中表达的基因有9个，包括BnKCS1、BnKCS4、BnKCS5、BnKCS6、BnKCS9、BnKCS10、BnKCS11、BnKCS19和BnKCS20，这些基因与FAE1基因的同源性均大于50%。推测用FAE1基因的全长序列构建FAE1RNAi载体，不仅抑制FAE1基因的表达，还会协同抑制其他同源基因的表达，从而产生非预期效应。需在充分的分析KCS基因家族的基因序列的基础上，利用FAE1基因的特异性序列构建RNAi载体或MicroRNAi载体，达到特异性抑制FAE1基因表达的目的。用KCS基因家族的保守结构域FAE1-CUT1-RPPA检索甘蓝型油菜的全基因组序列，检索到了40条KCS基因序列。但未在甘蓝型油菜中检索KCS3、KCS7、KCS8、KCS11、KCS12、KCS16和KCS21基因的同源序列。而在本研究中，我们通过同源序列法从甘蓝型油菜中分离到了BnKCS3、BnKCS8、BnKCS11、BnKCS12、BnKCS16和BnKCS21基因。推测，甘蓝型油菜中KCS基因家族可能至少有46个成员。用实时荧光的方法分析甘蓝型油菜中BnKCS基因在根、茎、叶、花蕾、柱头、花粉、30d荚果皮、40d荚果皮、30d种子和40d种子中的表达量。各BnKCS基因在甘蓝型油菜不同组织或器官中具有不同的表达模式，暗示各个基因在不同的组织或器官行使功能。所分析的18个BnKCS基因都在油菜花器官中表达，10个BnKCS基因在茎中表达，13个基因在叶中表达，9个基因在种子中有表达，8个基因在角果皮中表达。BnKCS2、BnKCS7、BnKCS8、BnKCS9和BnKCS215个基因在花器官中特异表达，其中BnKCS2和BnKCS9只在花粉中特异性表达，BnKCS21仅在花瓣中特异表达。将克隆的17个BnKCS基因构建到酵母表达载体pYES2/NTA中半乳糖诱导启动子的下游，在酵母中进行异源表达分析。15个BnKCS基因在酵母中正常表达并翻译蛋白，BnKCS3和BnKCS4受密码子偏好的影响在酵母中没有表达产物。分析酵母脂肪酸组成发现，只有转BnKCS1基因和FAE1基因的酵母中有超长链脂肪酸的合成，其它转基因酵母均没有新的超长链脂肪酸合成。结果表明这些BnKCS基因不能利用酵母中的脂肪酸作为催化底物。在后续研究中需要在酵母体外添加超长链脂肪酸做底物，进一步研究BnKCS基因的功能。为了揭示KCS基因与蜡质合成的相关性，鉴定出了7个有突变体纯系的拟南芥kcs突变体，包括kcs4、kcs7、kcs9、kcs11、kcs13、kcs16和kcs17。基因表达谱分析显示，突变体中的靶标基因因T-DNA的插入而沉默。用扫描电镜扫描拟南芥突变体及野生型角果和茎表面的蜡质晶体密度，突变体与野生型相比，茎和角果表面的蜡质晶体密度没有明显变化。通过GC-MS分析kcs突变体角果、茎和叶的表面蜡质组成。发现除kcs4突变体外，其余的kcs突变体茎、角果和叶的部分蜡质组分与野生型相比有显着降低，且链长不一，既有酰基还原途径的产物，如初级醇，也有脱羰基途径的产物如烷烃、醛和29酮。kcs突变体没有出现出蜡质严重缺失的性状，也没出现某一链长的超长链脂肪酸衍生物过度积累或某一蜡质组分完全缺失的情况。表明本研究中的KCS7、KCS8、KCS9、KCS11、KCS13、KCS16和KCS17基因的催化功能与其他KCS基因相互重叠，催化产物不是某一特定链长的超长链脂肪酸，而且催化产物既参与酰基还原途径也参与脱羰基途径的代谢。
李丹[6]（2011）在《中国白菜型油菜低芥酸基因源的发掘及其FAE1基因研究》文中提出芥酸是22碳的超长链脂肪酸,不易被人体消化吸收,营养价值低,因此,低芥酸被视为衡量菜籽油品质的重要指标。研究表明,FAE1基因是控制芥酸合成的关键基因,该基因已在拟南芥、甘蓝型和芥菜型油菜等植物中克隆,并在甘蓝型油菜中进行了表达分析,称芥酸含量差异主要有编码区序列的变异所导致,但在白菜型油菜中的系统研究尚未见报道。我国是白菜型油菜发源地之一,蕴含丰富的优异资源,利用我国白菜型油菜的多样性和丰富性,发掘新低芥酸基因源,并对白菜型油菜的FAE1基因进行研究,对丰富油菜低芥酸基因源的遗传基础,促进我国油菜品种品质改良的自主创新能力具有重要意义。本研究对不同来源的白菜型油菜芥酸含量及其分布进行检测分析,并对FAE1基因及其启动子进行克隆及表达分析,主要结论如下:1.通过气相色谱分析,140份白菜型油菜芥酸含量主要分布在30 %40 %之间,占47.14 %。通过半粒法,对我国出现芥酸含量分离的品种“三界菜籽”进行分离纯化,发现了芥酸含量小于1%的个体。2.对24份芥酸含量从0 %55 %的白菜型油菜FAE1基因进行克隆测序,共得到26个SNP位点,未发现与芥酸含量相关的SNP位点。26个SNPs导致13个氨基酸变化,氨基酸的变异与芥酸含量无相关性,与SNP变异结果一致,发现并证明白菜型低芥酸并非FAE1基因序列变异所导致。氨基酸比对分析表明,我国低芥酸品种三界菜籽与我国白菜型油菜品种表现出明显的亲缘关系,而与国外低芥酸品种HJa系列的亲缘关系较远,同时,白菜型油菜、甘蓝、甘蓝型油菜三者亲缘关系较远,进一步说明异源四倍体低芥酸基因并非来自亲本中的AA基因组,而是进化过程中突变而来。3.基于白菜型低芥酸并非FAE1基因序列变异所导致的研究结果,对高、低芥酸品种进行FAE1基因的表达分析,发现转录水平明显不同,高芥酸品种在授粉后25天达到表达峰值,低芥酸品种则在20天后达到峰值,但表达量仅为高芥酸品种的18.7%。4.以pF/p712R为引物扩增出南华灵宫大菜籽FAE1启动子前一部分为680 bp,HJA96337、三界菜籽为637 bp,以p987F/p为引物扩增出南华灵宫大菜籽、HJA96337、三界菜籽的FAE1启动子后一部分均为448 bp。国内外低芥酸品种FAE1基因启动子间仅3个碱基差异,高、低芥酸品种间共19个SNPs和43个碱基的缺失,SNPs和缺失均造成了启动子中重要模序的改变和缺失,包括一个启动子活性增强因子TGACG模序（GCN4基序）,一个种子特异表达元件G-box和一个RNA聚合酶II的识别位点TATA-box的缺失。
于洪涛,唐月异,王秀贞,李贵杰,王传堂[7]（2011）在《根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建》文中指出针对根结线虫16D10基因和花生Δ12脂肪酸脱氢酶（FAD2）基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列。以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体。经SalⅠ和KpnⅠ双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体。此载体可用以培育抗根结线虫病和高油酸花生新品种。
田保明[8]（2010）在《基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响》文中指出芥酸是十字花科特有一种22碳超长链脂肪酸,广泛存在于十字花科芸薹属植物种子中。芥酸本身不仅不易被人体消化吸收、营养价值低,而且它在脂肪酸所占比例较大也直接制约其它有益的脂肪酸的含量。因此,低芥酸已成为国际上食用油的重要品质标准和遗传改良的重要目标。油菜中芥酸合成是在脂肪酸延长酶（FAE1）及其它酶的协同下,催化油酰-CoA以丙二酰辅酶A为碳源经过两个相继的缩合反应,先行合成C20：1△11,随后一步生成芥酸（C22：1△13）。其中,由FAE1基因编码的β-酮酯酰-CoA合酶催化第一步（缩合）反应,是芥酸合成中的关键酶。本实验依据依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择fae 1 （GenBanK:AY577313）基因的1147-440区间的序列（498bp）分别以反向和正向的形式插入到含有种子特异性表达的启动子和终止子的载体中,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入一个来源于豌豆rbcS-3C intron（83bp）片段,然后通过转基因技术将正、反向重复序列整合到植物的基因组中,这样由反向重复序列转录形成的mRNA就会经互补配对导致发卡状RNA （hpRNA）的形成,由此形成的dsRNA诱导发生RNAi,进而诱发内源fael转录的mRNA发生降解。经农杆菌介导转化甘蓝型油菜Y015,获得19株阳性植株。半定量RT-PCR检测FAE1基因表达,fael基因的沉默效果均十分明显,FAE1表达下调62-98%。从T1、T3两代之间FAE1的沉默效应可以看出,RNAi介导的FAE1基因沉默效应可以在两代之间稳定遗传。进一步的脂肪酸检测分析,芥酸含量只相当于对照芥酸含量的0.5-41.62%,减少58.38-95.50%；C20脂肪酸也有了明显的降低趋势,减少51.19-89.51%,芥酸含量的降低与FAE1酶的抑制成明显的一致关系。与此同时,转基因植株的油酸、亚油酸等脂肪酸含量比对照相应均有显着增加,油酸含量增加11.44-36.23%、亚油酸含量增加54.90-104.62%、亚麻酸含量增加87.23-119.02%,芥酸含量的降低与油酸、亚油酸含量的升高成明显的负相关关系。软脂酸、硬脂酸含量较对照变化不大。
范正琪[9]（2010）在《麻疯树pepc1基因的克隆及其调控烟草蛋白质和油脂合成的作用分析》文中研究说明麻疯树主要分布于热带和亚热带地区,在我国栽培或半野生于热带地区和干热河谷地区。麻疯树种子种仁中含有丰富的油脂成分,因此它很有可能成为未来替代化石能源的具有巨大开发潜力的木本油料树种之一。但适宜麻疯树种植的土地面积十分有限,麻疯树种仁含油量的提高可提高麻疯树单位面积产油量,可以缓解在有限适宜土地上发展麻疯树生物柴油的矛盾。通过基因工程技术导入调控油脂合成的基因是提高麻疯树种子含油率,培育高油新品种的有效方法之一。近年来研究发现磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）参与了植物种子油脂合成的调控,因此通过反义抑制技术控制麻疯树pepc基因的表达,可能是提高麻疯树种子含油量的有效途径。本研究以麻疯树未成熟种子为材料,采用RT-PCR和RACE法从中克隆了麻疯树pepc基因的一个家族成员pepc1,采用生物信息学分析了其氨基酸序列,构建pepc1基因的正义和反义表达载体,将它们导入烟草,通过转基因烟草的实时荧光定量PCR、PEPC酶活性测定、蛋白质、脂肪酸含量变化,研究pepc1基因在转录水平、翻译水平对烟草脂肪酸合成的影响,通过pepc1基因在麻疯树不同组织、种子发育不同阶段的表达模式研究pepc1基因在麻疯树中的转录水平表达情况,鉴定麻疯树pepc1基因对油脂合成的调控作用,为定向遗传改良提高麻疯树种子油含量建立技术体系和提供科学依据。主要研究结果如下：（1）通过RT-PCR法克隆了麻疯树vepc基因的cDNA片段,在此基础上又通过5’RACE法克隆了pepc基因的5’端,该cDNA全长3124bp,其中开放阅读框（ORF）长为2898bp,编码了965个氨基酸。（2）通过对麻疯树PEPCase蛋白的生物信息学分析表明,该蛋白的分子量为110.6kD,该蛋白酸性氨基酸占总氨基酸的14.6%,碱性氨基酸占总氨基酸的13.5%,理论等电点6.18,稳定系数为46.5,单条肽链属于不稳定蛋白。二级结构主要以无规卷曲为主,间或α螺旋和β直链。麻疯树PEPCase蛋白是亲水性的,无跨膜区及信号肽。本研究克隆的pepc基因编码的蛋白属于基因家族中的PEPC1,基因为pepc1。与蓖麻的氨基酸同源性最高,在系统进化树中也与蓖麻先聚合,它与烟草的同源性也很高。通过NCBI的保守功能域（CDD）搜索,发现在11～965aa之间是一个典型的大Ppc结构域,搜索蛋白质的活性位点,发现46个功能位点,分为7种模式。麻疯树PEPC1的结构特征与大部分PEPC的结构类似,功能位点略有差异。（3）利用克隆获得的麻疯树管家基因actin作为参照。对麻疯树pepc1基因进行了时空表达模式研究,发现在开花到果实成熟过程中,在前4个阶段pepc1基因的表达量是增加的,在后5个阶段表达量明显下降,在叶中表达量不太高。（4）根据植物表达载体pCAMBIA2300-35S、pBI121的多克隆位点特征和麻疯树pepc1基因序列特征,分别构建了pepc1基因的正义表达载体pCAMBIA-KSpepc和反义表达载体pBI-BXpepc。采用农杆菌介导法将正义、反义pepc1基因转化烟草,经卡那霉素筛选、PCR和PCR-Southern鉴定,结果获得了3株转正义pepc1基因的烟草和10株转反义pepc1基因的烟草。在对转麻疯树pepc1基因烟草的实时荧光定量PCR结果中发现,转正义pepc1基因的烟草,烟草内源pepc基因表达量变化不大,外源pepc1增加。10株转反义pepc1基因的烟草,有7株烟草内源pepc基因和外源pepc1基因都降低。（5）通过对转基因烟草叶片PEPCase酶活性、蛋白质含量、总脂及脂肪酸含量等指标的测定,结果表明转正义pepc1基因的3株PEPCase酶活性、蛋白质含量均比野生型对照高,这3株植株中有1株总脂含量较对照高,其余两株较对照低。转反义pepc1基因的10株植株有9株酶活性比对照低,这9株中有5株其蛋白质含量比对照低,其中4株的总脂含量比对照高。转基因烟草的脂肪酸组份发生了一定的变化,但各成分含量主次变化不大。通过对蛋白质/总脂比率与野生型对照相比较,最终获得2株转正义pepc1基因和4株转反义pepc1基因的烟草与预期结果一致,其外源的麻疯树pepc1基因参与了油脂合成的调控。
赵福永,高震,严寒,田志宏[10]（2009）在《野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析》文中研究指明根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列（AY 888037）设计了PCR扩增引物,以野芥总DNA为模板进行扩增得到了特异扩增条带。测序结果表明,该片段长1651 bp,序列分析表明其氨基酸编码区为551575 bp,不含内含子序列,共编码506个氨基酸。该基因序列已提交GenBank,登录号为FJ870905。BLASTn分析结果表明,野芥中fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性为76%98%;BLASTp分析结果表明,野芥中的FAE1与油菜中FAE1存在32个位点差异,其中部分差异可能导致了芥酸含量的不同。
二、以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建（论文提纲范文）
（1）GPAT基因组学研究及GPAT19在植物防卫中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 基因组学概况 |
| 1.2 基因组学研究的分支 |
| 1.2.1 结构基因组学 |
| 1.2.2 功能基因组学 |
| 1.2.3 比较基因组学 |
| 1.3 基因组学研究的工具 |
| 1.3.1 DNA分子标记技术 |
| 1.3.2 测序技术 |
| 1.3.3 基因芯片 |
| 1.3.4 转基因技术 |
| 1.3.5 基因编辑技术 |
| 1.3.6 RNAi技术 |
| 1.4 油菜概述 |
| 1.5 甘蓝型油菜基因组学研究进展 |
| 1.6 植物中的甘油-3-磷酸酰基转移酶 |
| 1.6.1 甘油-3-磷酸酰基转移酶简介 |
| 1.6.2 甘油-3-磷酸酰基转移酶的亚细胞定位 |
| 1.6.3 甘油-3-磷酸酰基转移酶对植物细胞脂质的影响 |
| 1.6.4 甘油-3-磷酸酰基转移酶在植物生长发育中的作用 |
| 1.7 本研究的目的意义及研究内容 |
| 1.7.1 本实验的研究目的意义 |
| 1.7.2 本实验的研究内容 |
| 第二章 甘蓝型油菜BnGPATs基因组学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 数据库及分析软件 |
| 2.1.3 引物设计及合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甘蓝型油菜BnGPATs基因家族鉴定 |
| 2.2.2 甘蓝型油菜BnGPATs基因结构及系统发育分析 |
| 2.2.3 甘蓝型油菜植株RNA的提取及反转录 |
| 2.2.4 甘蓝型油菜BnGPAT19/21 的相对表达量 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 甘蓝型油菜BnGPATs基因的鉴定及定位 |
| 2.3.2 甘蓝型油菜BnGPATs基因系统发育分析 |
| 2.3.3 BnGPAT19/21 特异性表达分析 |
| 2.3.4 RNAi转基因植株中BnGPAT19/21 基因表达量分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 油菜GPAT19-RNAi植株的获得 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 转化菌株及质粒 |
| 3.1.3 主要试剂及常用仪器 |
| 3.1.4 引物设计及合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 pCaMGPAT19-RNAi质粒的转化及提取方法 |
| 3.2.2 pCaMGPAT19-RNAi载体通过花粉介导转化法转入甘蓝型油菜7B基因中 |
| 3.2.3 油菜植株DNA的提取及RNAi转基因植株的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 花粉介导法转化后植株的结实情况 |
| 3.3.2 油菜RNAi转基因植株鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BnGPAT19 在植物生长发育中的作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 主要试剂及常用仪器 |
| 4.1.3 引物设计及合成 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BnGPAT19 的生物信息学分析 |
| 4.2.2 RNAi植株的种子萌发 |
| 4.2.3 花粉碘-碘化钾染色方法 |
| 4.2.4 油菜植株RNA的提取及反转录 |
| 4.2.5 测定BnGPAT19 基因的相对表达量 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 BnGPAT19 蛋白的结构特征分析 |
| 4.3.1.1 BnGPAT19 蛋白的理化性质分析 |
| 4.3.1.2 BnGPAT19 蛋白的保守结构域及跨膜结构分析 |
| 4.3.1.3 BnGPAT19 蛋白的高级结构分析 |
| 4.3.2 BnGPAT19 对种子萌发的影响 |
| 4.3.3 BnGPAT19 对植株生长发育的影响 |
| 4.3.4 转基因植株中BnGPAT19 基因相对表达量与千粒重的相关性 |
| 4.3.5 BnGPAT19 对植株花粉育性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BnGPAT19 在植物防卫中的作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试材料 |
| 5.1.2 主要试剂及常用仪器 |
| 5.1.3 引物设计及合成 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1叶片渗透性实验 |
| 5.2.1.1 离体叶片甲苯胺蓝染色 |
| 5.2.1.2 离体叶片失水率测定 |
| 5.2.1.3 叶绿素浸提率测定 |
| 5.2.2 离体叶片抗菌核病实验 |
| 5.2.3 接种和未接种核盘菌离体叶片细胞结构观察 |
| 5.2.4 相关基因表达量测定 |
| 5.2.4.1 油菜植株RNA的提取 |
| 5.2.4.2 将提取的RNA反转录成cDNA |
| 5.2.4.3 用相对定量RT-PCR(qRT-PCR)检测基因表达量 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 RNAi植株的叶片渗透性结果 |
| 5.3.1.1 GPAT19-RNAi植株离体叶片甲苯胺蓝着色面积较大 |
| 5.3.1.2 GPAT19-RNAi植株叶片同时间段下失水率较大 |
| 5.3.1.3 GPAT19-RNAi植株叶片叶绿素浸提率较大 |
| 5.3.2 离体叶片抗核盘菌实验结果 |
| 5.3.3 离体叶片透射电镜观察实验结果 |
| 5.3.4 抗病相关基因的表达量测定 |
| 5.4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历及联系方式 |
（2）转录因子GT和GATA对于甘蓝型油菜BnaFAD2基因启动子的作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 高油酸育种意义 |
| 1.1 油酸的作用 |
| 1.2 油酸形成的遗传规律 |
| 2 油酸形成的相关基因的研究进展 |
| 2.1 植物DGAT基因的研究进展 |
| 2.2 植物PDAT基因研究进展 |
| 2.3 植物LPAAT基因研究进展 |
| 2.4 植物SAD基因研究进展 |
| 2.5 植物FAE基因研究进展 |
| 2.6 植物FATA和FATB基因研究进展 |
| 2.7 植物FAD2基因研究进展 |
| 2.8 植物FAD3基因研究进展 |
| 3 油酸形成过程中相关转录因子研究进展 |
| 4 研究目的、意义及技术路线 |
| 4.1 研究目的及意义 |
| 4.2 技术路线 |
| 第二章 BnaFAD2.C5启动子不同区域控制其在不同组织、不同时期的表达 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 生物信息学分析 |
| 1.4 GUS组织化学分析 |
| 1.4.1 GUS染色液配制 |
| 1.4.2 脱色液的配制 |
| 1.4.3 GUS染色分析 |
| 1.5 植物生长调节剂调控启动子的不同区域 |
| 1.6 不同组织中GFP蛋白丰度分析 |
| 1.6.1 植物蛋白提取 |
| 1.6.2 western bloting检测蛋白丰度 |
| 1.6.2.1 制胶及蛋白样品处理 |
| 1.6.2.2 电泳 |
| 1.6.2.3 转膜 |
| 1.6.2.4 封闭 |
| 1.6.2.5 一抗孵育 |
| 1.6.2.6 二抗孵育 |
| 1.6.2.7 蛋白检测 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 BnaFAD2.C5启动子不同区域调控基因在不同组织的表达 |
| 2.2 植物生长调节剂影响BnaFAD2.C5启动子功能 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 调控BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5基因高表达的关键启动子区域及元件分析 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子序列分析 |
| 1.4 BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子同源区的缺失分析 |
| 1.4.1 克隆不同长度的缺失片段 |
| 1.4.2 构建缺失载体 |
| 1.5 构建GT和GATA元件的突变载体 |
| 1.5.1 克隆GT和GATA元件突变体 |
| 1.5.2 构建GT和GATA元件突变体载体 |
| 1.6 转化农杆菌 |
| 1.6.1 质粒准备 |
| 1.6.2 农杆菌感受态的制备 |
| 1.6.3 转化农杆菌 |
| 1.7 转化拟南芥 |
| 1.7.1 拟南芥的培养 |
| 1.7.2 拟南芥转化 |
| 1.7.3 转化子筛选 |
| 1.7.3.1 所用试剂的配制及筛选步骤 |
| 1.7.3.2 阳性苗的分子生物学鉴定 |
| 1.8 Western blotting检测蛋白丰度 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子序列同源比对分析结果 |
| 2.2 BnaFAD2.A5/C5启动子序列缺失分析结果 |
| 2.3 验证-226~-314 bp和-228 ~-312bp分别是BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5启动子的主要调控序列 |
| 2.4 GATA 和GT元件对于BnaFAD2.A5和BnaFAD2.C5的作用分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 GATA和GT家族的表达模式分析及主要基因的克隆 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 油菜种子RNA提取 |
| 1.4 基因组的去除 |
| 1.5 cDNA第一链的合成 |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.7 转录因子GATA和GT基因家族克隆 |
| 1.7.1 GATA和GT基因家族的高保真性扩增 |
| 1.7.2 目的片段转化大肠杆菌 |
| 1.8 GATA家族和GT家族转录因子蛋白进化树分析 |
| 1.9 GATA家族和GT家族转录因子的基序分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 GATA和GT家族基因序列分析 |
| 2.2 GATA家族和GT家族克隆结果 |
| 2.3 GATA和GT家族蛋白序列信息分析结果 |
| 2.4 GATA家族和GT家族蛋白基序分析 |
| 2.5 GATA家族和GT家族蛋白进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GATA和GT家族基因表达分析 |
| 3.2 GATA和GT家族蛋白结构分析 |
| 4 小结 |
| 第五章 GATA和GT家族对于BnFAD2的作用的研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌种与载体 |
| 1.1.2 生化试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 酵母单杂交实验 |
| 1.3.1 pHIS2 载体的构建 |
| 1.3.2 pGADT7载体的构建 |
| 1.3.3 转化酵母 |
| 1.3.4 最适3-AT浓度的选择 |
| 1.3.5 酵母单杂交功能验证 |
| 1.4 GATA和GT植物表达载体构建 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pHIS2-和pGADT7-相应载体的构建 |
| 2.2 最适3-AT浓度的选择 |
| 2.3 酵母单杂交实验 |
| 2.4 转化拟南芥检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 主要结论及下一步工作计划 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 1 培养基配方 |
| 2 western blot所用试剂 |
| 3 总RNA提取 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实时荧光定量PCR引物设计 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 稳定遗传的转基因株系获得 |
| 1.4.2 Ah FAD2基因在转基因后代的转录水平分析 |
| 1.4.3 转基因花生株系主要农艺性状调查 |
| 1.4.4 气相色谱法 (Gas chromatography, GC) 检测转基因花生籽粒脂肪酸组成及含量 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Ah FAD2基因在转基因花生种子中的转录水平分析 |
| 2.2 转基因花生主要农艺性状调查 |
| 2.3 气相色谱法 (GC) 分析转基因花生株系籽粒脂肪酸组成 |
| 3 讨论 |
| 3.1 RNAi有效抑制转基因花生种子中FAD2基因的表达 |
| 3.2 转基因花生籽粒的O/L比不同程度提高 |
（4）甘蓝型油菜转录因子FUSCA3的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文章综述 |
| 1.1 油菜生产现状 |
| 1.2 油菜育种现状 |
| 1.2.1 传统育种 |
| 1.2.2 诱变育种 |
| 1.2.3 生物技术育种 |
| 1.3 植物转录因子 |
| 1.3.1 转录因子与植物生长发育和抗性 |
| 1.3.2 转录因子与油脂合成 |
| 1.4 FUS3研究进展 |
| 1.5 研究目的、意义和内容 |
| 1.5.1 研究目的及意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第2章 甘蓝型油菜FUS3基因的克隆和生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BnaFUS3基因CDS序列的克隆 |
| 2.2.2 BnaFUS3基因序列分析 |
| 2.2.3 BnaFUS3氨基酸序列分析 |
| 2.2.4 FUS3蛋白聚类分析 |
| 2.2.5 BnaFUS3蛋白的理化性质分析 |
| 2.2.6 BnaFUS3蛋白二级结构分析 |
| 第3章 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的表达及其与脂肪酸组分关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 荧光定量引物的筛选 |
| 3.2.2 荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线 |
| 3.2.3 BnaFUS3基因相对表达分析 |
| 3.2.4 甘蓝型油菜脂肪酸组分与BnaFUS3相关分析 |
| 第4章 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的非生物逆境胁迫表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 第5章 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的植物表达载体构建和拟南芥转化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 植物表达载体PBnaFUS3的构建 |
| 5.2.2 农杆菌转化检测 |
| 5.2.3 拟南芥转基因苗的检测 |
| 5.2.4 转基因拟南芥种子脂肪酸组分分析 |
| 第6章 BnaFUS3基因转化甘蓝型油菜 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 再生苗的获得 |
| 6.2.2 转基因油菜检测 |
| 第7章 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.1.1 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的生物信息学分析 |
| 7.1.2 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的时空表达及其与脂肪酸的关系 |
| 7.1.3 甘蓝型油菜BnaFUS3基因的非生物逆境胁迫 |
| 7.1.4 BnaFUS3基因转化拟南芥及与脂肪酸关系 |
| 7.1.5 BnaFUS3基因转化甘蓝型油菜再生苗的获得 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 创新点 |
| 7.4 下一步研究工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）甘蓝型油菜KCS基因家族表达及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 脂肪酸分类及功能 |
| 1.1.1 脂肪酸的分类 |
| 1.1.2 脂肪酸的功能 |
| 1.2 饱和脂肪酸的延伸过程 |
| 1.2.1 中长链脂肪酸延伸 |
| 1.2.2 超长链脂肪酸延伸 |
| 1.3 蜡质的合成 |
| 1.3.1 酰基还原途径 |
| 1.3.2 脱羰基途径 |
| 1.4 调控超长链脂肪酸合成的基因工程研究 |
| 1.5 本研究的主要内容和目的意义 |
| 1.5.1 本研究的主要内容 |
| 1.5.2 本研究的创新点 |
| 第二章 FAE1基因克隆及RNAi技术介导FAE1基因沉默研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 长链脂肪酸含量分析 |
| 2.2.2 FAE1的扩增及比对分析 |
| 2.2.3 FAE1的酵母表达分析 |
| 2.2.4 遗传转化载体构建 |
| 2.2.5 油菜的遗传转化 |
| 2.2.6 转基因植株脂肪酸分析 |
| 2.2.7 转基因植株的非预期效应 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 FAE1基因序列保守功能相异 |
| 2.3.2 介导FAE1基因沉默会诱发非预期效应 |
| 第三章 KCS基因家族其他成员的克隆及功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 KCS基因成员克隆 |
| 3.2.2 KCS基因家族的进化分析 |
| 3.2.3 KCS基因在油菜不同组织中的表达谱 |
| 3.2.4 KCS基因在酵母中异源表达 |
| 3.2.5 酵母脂肪酸分析 |
| 3.2.6 拟南芥KCS突变体的鉴定 |
| 3.2.7 拟南芥突变体表达分析 |
| 3.2.8 拟南芥突变体蜡质晶体结构扫描分析 |
| 3.2.9 拟南芥突变体蜡质组成分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 甘蓝型油菜中KCS基因家族的成员数 |
| 3.3.2 FAE1基因与其他KCS基因的同源性 |
| 3.3.3 用酵母研究BnKCS基因的功能 |
| 3.3.4 部分KCS基因功能冗余 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 甘蓝型油菜中KCS基因家族的成员数至少为46个 |
| 4.2 选用FAE1基因特异性序列作为RNAi抑制靶标，培育低芥酸品种 |
| 4.3 KCS基因的功能相互重叠 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）中国白菜型油菜低芥酸基因源的发掘及其FAE1基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 芥酸及其生物合成 |
| 1.1.1 芥酸简介 |
| 1.1.2 芥酸的生物合成途径 |
| 1.2 油菜低芥酸基因源发现与育种利用 |
| 1.2.1 甘蓝型油菜低芥酸基因源的发现与育种利用 |
| 1.2.2 芥菜型油菜低芥酸基因源的发现与育种利用 |
| 1.2.3 白菜型油菜低芥酸基因源的发现与育种利用 |
| 1.3 芥酸的遗传规律 |
| 1.3.1 甘蓝型油菜中芥酸遗传规律 |
| 1.3.2 芥菜型油菜中芥酸遗传规律 |
| 1.3.3 白菜型油菜中芥酸遗传规律 |
| 1.4 影响芥酸含量因素 |
| 1.5 芥酸合成关键基因的克隆及分析 |
| 1.5.1 芥酸合成关键基因FAE1 基因 |
| 1.5.2 FAE1 基因克隆 |
| 1.5.3 FAE1 基因启动子克隆 |
| 1.5.4 FAE1 基因表达分析及蛋白活性分析 |
| 1.6 FAE1 基因研究的问题与展望 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 白菜型油菜种子脂肪酸分析及低芥酸基因源的挖掘 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.3 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同品种白菜型油菜芥酸含量变异 |
| 2.3.2 我国低芥酸基因源的筛选与分离鉴定 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 不同芥酸含量白菜型油菜FAE1 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 24 份白菜型油菜FAE1 基因扩增产物检测 |
| 3.3.2 24 份白菜型油菜FAE1 基因的SNPs |
| 3.3.3 24 份白菜型油菜FAE1 基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.4 白菜型油菜与甘蓝及甘蓝型油菜FAE1 基因氨基酸序列分析 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 不同芥酸含量白菜型油菜FAE1 基因的表达分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RNA 的提取及标准曲线 |
| 4.3.2 不同时期高、低芥酸品种表达水平分析 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 不同芥酸含量白菜型油菜FAE1 基因启动子克隆 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 FAE1 基因启动子克隆 |
| 5.3.2 FAE1 基因启动子的序列比对结果及结构功能分析 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、材料 |
| 1.2 根结线虫16D10基因和花生FAD2基因RNAi结构序列的设计 |
| 1.3 RNA干扰载体的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNAi结构目的序列的获得 |
| 2.2 RNAi载体的获得 |
| 3 讨论 |
（8）基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物脂肪酸的生物合成途径 |
| 1.1 脂肪酸的种类 |
| 1.2 植物脂肪酸生物合成途径 |
| 2 芥酸的生物合成与遗传 |
| 2.1 芥酸的作用 |
| 2.2 芥酸含量的遗传 |
| 2.3 芥酸的生物合成 |
| 3 芥酸的生物合成与基因调控 |
| 3.1 脂肪酸延长基因(FAE1) |
| 3.2 芥酸生物合成的基因工程 |
| 3.2.1 低芥酸油菜的基因工程 |
| 3.2.2 高芥酸油菜的基因工程 |
| 4 RNAI研究背景及其应用 |
| 4.1 RNAi的发现 |
| 4.2 RNAi的产生机制 |
| 4.3 RNAi在植物中的应用 |
| 4.3.1 RNAi在植物功能基因组研究中的应用 |
| 4.3.2 RNAi在植物品质改良中的应用 |
| 4.3.3 降低作物中有害物质的含量 |
| 4.3.4 RNAi在提高植物抗病性的应用 |
| 5 研究的目的意义、原理、主要内容和技术路线 |
| 5.1. 研究的目的、意义 |
| 5.2 技术原理 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 甘蓝型油菜FAE1 RNAI表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备与生产厂家 |
| 1.2 质粒与菌株 |
| 1.3 分子生物学试剂及Kit |
| 1.4 生化试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 1.6 PCR引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 油菜总DNA提取 |
| 2.2 pUC19.RBi、pCAMBIA1301、pUC19.RBi1质粒DNA的提取 |
| 2.3 组成fae1 RNA干扰体5个片段的序列来源、结构设计 |
| 2.3.1 启动子 |
| 2.3.2 干扰体茎体(Stem)部分 |
| 2.3.3 环体(Loop) |
| 2.3.4 终止子caMV3'UTR(polyA signal) |
| 2.4 组成fae1 RNA干扰体5个片段的克隆 |
| 2.4.1 Napin pro、fae1-1、fae1-2三个片段的PCR扩增 |
| 2.4.2 rbcs-3C intron片段扩增 |
| 2.4.3 caMV 3' UTR片段扩增 |
| 2.5 PCR产物检测 |
| 2.6 PCR产物的胶回收纯化 |
| 2.7 PCR产物胶回收片段与T-载体的连接 |
| 2.8 连接产物的细菌转化 |
| 2.9 筛选后PCR鉴定 |
| 2.10 重组质粒测序 |
| 2.11 fae1 RNAi克隆载体构建 |
| 2.11.1 中间载体pUC19.BNp、pUC19.3C的构建 |
| 2.11.2 pUC19.BNp质粒的建立 |
| 2.11.3 pUC19.3C质粒的建立 |
| 2.11.4 油菜fae1 RNAi体各片段的组装 |
| 2.12 fae1 RNAi植物表达载体的构建 |
| 2.13 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.14 pCAMBIA3301-fae1i向农杆菌的导入 |
| 2.15 以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 fae1 RNAi载体5个组成片段的克隆及序列测定结果 |
| 3.2 fae1 RNAi干扰载体的测序验证 |
| 3.3 fae1 RNAi载体的构建结果 |
| 3.3.1 fae1-1.3C.fae1-2重组体的鉴定 |
| 3.3.2 Pro.BNp.CaMV 3' UTR重组体的鉴定 |
| 3.4 油菜fae1 RNAi载体的鉴定 |
| 3.5 油菜fae1 RNAi植物表达载体的鉴定 |
| 3.6 以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转录形成mRNA发卡结构,形成dsRNA诱导产生RNAi |
| 4.2 关于对fae1-1、fae1-2两个干扰片段的克隆途径 |
| 4.3 关于fae1 RNA干扰体启动子的选择 |
| 4.4 构建hpRNA高效表达载体是RNAi技术应用的关键 |
| 第三章 根癌农杆菌介导FAE1 RNAI转化甘蓝型油菜 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 供试材料 |
| 1.1.3 菌株及质粒 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 酶 |
| 1.1.7 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 初始材料的获得 |
| 1.2.2 培养条件 |
| 1.2.3 苗龄对油菜子叶柄分化的影响实验 |
| 1.2.4 PPT选择剂浓度的确定 |
| 1.2.5 油菜的遗传转化 |
| 1.2.6 抗性植株的检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PPT选择剂浓度的确定 |
| 2.2 延迟筛选时间对子叶柄遗传转化的影响 |
| 2.3 不同基因型对转化频率的影响 |
| 2.4 fae1 RNAi转基因油菜GUS组织化学染色检测 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 关于影响农杆菌介导油菜子叶柄遗传转化的因素探讨 |
| 3.2 试管苗移栽成活是植物组织培养的一个重要环节 |
| 第四章 RNAI对FAE1的基因沉默效果及芥酸合成的影响分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要仪器设备与生产厂家 |
| 1.3 菌株和载体 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 1.4.1 DNA和质粒提取及电泳检测的相关试剂 |
| 1.4.2 Southern blot相关试剂 |
| 1.4.3 RNA的提取半定量RT-PCR相关试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因组DNA质量及浓度检测 |
| 2.1.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜叶片基因组DNA |
| 2.1.2 油菜叶片总DNA定量分析 |
| 2.2 PCR检测转基因油菜 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 PCR体系的建立 |
| 2.3 Southern blot |
| 2.3.1 酶切和凝胶电泳 |
| 2.3.2 标记探针的制备 |
| 2.3.3 转膜 |
| 2.3.4 杂交 |
| 2.3.5 洗膜、信号检测 |
| 2.4 基因表达半定量RT-PCR分析 |
| 2.4.1 油菜幼嫩种子RNA的提取 |
| 2.4.2 普通琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜幼嫩种子总RNA的质量 |
| 2.4.3 RNA样品中残留的DNA的消化 |
| 2.4.4 普通琼脂糖凝胶电泳鉴定DNaseI消化后油菜幼嫩种子总RNA |
| 2.4.5 紫外分光光度计测定DNase I消化后总RNA的质量与浓度 |
| 2.4.6 基因表达分析 |
| 2.5 转基因植株的遗传 |
| 2.6 脂肪酸组成的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗性植株PCR扩增电泳检测 |
| 3.2 Southern Blot结果分析 |
| 3.2.1 DNA限制性内切酶酶切效果检验 |
| 3.2.2 探针的制备 |
| 3.2.3 Southern Blot分析 |
| 3.3 FAE1基因的表达分析 |
| 3.3.1 RNA的提取 |
| 3.3.2 PCR模板量的确定和指数增长期的确定 |
| 3.3.3 fae1基因在幼嫩种子中的表达分析 |
| 3.4 脂肪酸组成分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 报告基因的选择 |
| 4.2 关于GUS检测与PCR扩增检测结果存在出入的因素探讨 |
| 4.3 关于RNAi对fae1基因沉默效果及对芥酸形成的影响分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 博士研究生期间发表的论文 |
| 附录2 DNA MARKER和载体图谱 |
| 附录3 植物表达载体PCAMBIA3301-FAE1I质粒图谱 |
| 附录4 FAE1 RNA干扰体构建流程图 |
| 附录5 NAPIN基因启动子测序彩图 |
| 附录6 油菜转化体系流程及成苗图片 |
（9）麻疯树pepc1基因的克隆及其调控烟草蛋白质和油脂合成的作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的和意义 |
| 1.1.3 项目来源和经费支持 |
| 1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2.1 麻疯树研究现状 |
| 1.2.2 植物脂类及脂肪酸基因调控研究进展 |
| 1.2.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)研究进展 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 麻疯树pepc1基因全长cDNA克隆、序列分析及表达模式研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 麻疯树种子pepc1基因全长cDNA克隆 |
| 2.2.2 麻疯树PEPC1蛋白的生物信息学分析 |
| 2.2.3 麻疯树PEPC1基因的时空表达模式 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 麻疯树pepc1基因的正、反义植物表达载体构建及在烟草中的转录表达 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 麻疯树pepc1基因正义表达载体的构建及对农杆菌的转化 |
| 3.2.2 麻疯树pepc1基因反义表达载体的构建及对农杆菌的转化 |
| 3.2.3 烟草转基因植株的获得及分子鉴定 |
| 3.2.4 转基因烟草外源、内源目的基因的转录表达 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 麻疯树pepc1基因在烟草中的表达对蛋白质及脂肪酸合成的调控 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转麻疯树pepc1基因烟草中PEPC酶活性的变化 |
| 4.2.2 转麻疯树pepc1基因烟草中总蛋白含量的变化 |
| 4.2.3 转麻疯树pepc1基因烟草中脂肪酸含量的变化 |
| 4.2.4 转基因烟草中蛋白质/总脂含量比率 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论和讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 RT-PCR和5'RACE扩增pepc1基因片段和全长 |
| 5.2.2 麻疯树PEPC1的保守序列及反义基因序列片段的选取 |
| 5.2.3 麻疯树PEPC1功能位点修饰与功能域 |
| 5.2.4 麻疯树pepc1基因在麻疯树不同组织、种子不同发育阶段的表达 |
| 5.2.5 麻疯树pepc1的表达对转基因烟草油脂代谢的调控 |
| 5.2.6 麻疯树pepc1在转基因烟草中的表达对脂肪酸组分的影响 |
| 5.2.7 转基因植物中的转基因沉默现象 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（10）野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 PCR引物设计与合成 |
| 1.3 PCR扩增程序与反应体系 |
| 1.4 fae1基因的克隆与测序 |
| 1.5 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 fae1基因的PCR扩增 |
| 2.2 fae1基因的克隆与重组子鉴定 |
| 2.3 测序结果分析 |
| 2.3.1 fae1基因结构基因序列的分析比较 |
| 2.3.2 FAE1结构蛋白氨基酸序列比较分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 fae1基因核苷酸序列对于野芥分类归属的意义 |
| 3.2 fae1基因的遗传与利用 |
四、以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建（论文参考文献）
- [1]GPAT基因组学研究及GPAT19在植物防卫中的作用[D]. 耿思宇. 山西大学, 2019(01)
- [2]转录因子GT和GATA对于甘蓝型油菜BnaFAD2基因启动子的作用分析[D]. 刘芳. 湖南农业大学, 2019(01)
- [3]花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析[J]. 徐平丽,唐桂英,毕玉平,柳展基,单雷. 生物工程学报, 2018(09)
- [4]甘蓝型油菜转录因子FUSCA3的功能分析[D]. 韦云婷. 湖南农业大学, 2018(09)
- [5]甘蓝型油菜KCS基因家族表达及功能分析[D]. 武玉花. 中国农业科学院, 2012(10)
- [6]中国白菜型油菜低芥酸基因源的发掘及其FAE1基因研究[D]. 李丹. 中国农业科学院, 2011(10)
- [7]根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建[J]. 于洪涛,唐月异,王秀贞,李贵杰,王传堂. 花生学报, 2011(01)
- [8]基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响[D]. 田保明. 华中农业大学, 2010(06)
- [9]麻疯树pepc1基因的克隆及其调控烟草蛋白质和油脂合成的作用分析[D]. 范正琪. 中国林业科学研究院, 2010(03)
- [10]野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析[J]. 赵福永,高震,严寒,田志宏. 华北农学报, 2009(05)