一、鸡传染性法氏囊病疫苗毒株的生物学特性研究（论文文献综述）
秦颖[1]（2021）在《传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析》文中研究说明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease）又称甘布洛病（Gumboro disease）,是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）引起的鸡的急性、高度接触性、传染性疾病,严重危害养禽业发展。传染性法氏囊病主要感染3-6周龄雏鸡,引起严重的免疫抑制。近年来出现的新型变异株主要变现为法氏囊萎缩,虽不致死,但导致鸡的严重免疫抑制。由于传染性法氏囊病病毒由相对独立的两个节段组成,其不同毒株重组的可能性极高,导致不同毒株之间重组病毒的出现。超强毒株持续流行,变异株以及重组病毒的不断出现对传染性法氏囊病的防控形成了巨大的挑战。本研究分离鉴定了两株传染性法氏囊病病毒,对其进行遗传进化树及氨基酸序列分析,并针对VP2蛋白通过原核表达以及杆状病毒表达两种表达系统分别进行表达,将表达产物粗提纯后免疫SPF鸡,验证其免疫原性,为传染性法氏囊病的防控以及疫苗的研发提供了数据参考。1传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定本研究从临床上发生严重法氏囊萎缩的送检病料中用鸡胚接种分离出两株传染性法氏囊病病毒,该病毒可以在鸡胚上增殖;利用传染性法氏囊病特异性引物对其中一株进行全基因测序,对另一株VP1及VP2基因进行扩增测序,并通过生物信息学软件进行遗传进化树和氨基酸序列分析,结果表明两株分离株一株为新型重组病毒,一株为新型变异株。分离的新型重组病毒VP2基因属于超强毒株分支,而VP1基因属于非超强毒株分支。氨基酸序列分析发现该分离株VP2基因编码的氨基酸具有超强毒株所特有的氨基酸序列,和超强毒株同源性最高（99%-99.4%）,VP1基因编码的氨基酸具有弱毒株所特有的氨基酸序列,和弱毒株同源性最高（99.3%-99.8%）,遗传进化树和氨基酸分析结果表明该分离株为超强毒株和弱毒株的重组病毒。分离的新型变异株和中国分离的新型变异株同属于新型变异株分支,与新型变异株同源性达96.2%-98.2%,氨基酸序列分析该分离株具有新型变异株同源性氨基酸序列。本研究分离的两株传染性法氏囊病病毒为传染性法氏囊病的流行趋势以及防控提供了参考。2不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白传染性法氏囊病病毒的防控主要依赖于疫苗免疫预防,疫苗的研发是传染性法氏囊病防控的基础。本研究采用原核表达系统和杆状病毒表达系统分别表达VP2蛋白,将VP2基因成功克隆到原核表达载体pET-28a以及杆状病毒表达质粒中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2和重组杆状病毒re-Bac-1-GP67-VP2,两种表达系统均成功表达了 VP2蛋白,原核表达系统主要以包涵体形式表达在裂解后的沉淀中,表达量约占蛋白总量的33%,杆状病毒表达系统以可溶性形式分泌到培养上清中,表达量约占总蛋白量的11%,优化表达条件后收集表达的蛋白,表达的蛋白均可与VP2单抗发生反应,具有一定的生物活性,为后续免疫原性试验提供了基础。3两种VP2重组蛋白免疫原性比较将上述重组蛋白大量表达,经粗提纯后混合佐剂制备疫苗,按照免疫程序免疫SPF鸡,免疫后采血测血清抗体效价,并于免疫后21天进行攻毒保护试验,剖检观察法氏囊大体变化,通过病理组织学分析法氏囊病理变变化,测定排毒量和病毒载量。试验结果表明,杆状病毒表达重组蛋白效果明显优于大肠杆菌表达重组蛋白免疫效果,其法氏囊病理损伤程度较低,血清学抗体水平高于原核表达产物免疫的抗体水平,病毒载量和排毒量相较于原核表达产物免疫较低,免疫程序对免疫效果也有明显影响,免疫两次效果优于免疫一次。本研究结果为传染性法氏囊病亚单位疫苗研制提供了数据参考。
黄宇[2]（2021）在《广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究》文中研究指明传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业最重要的免疫抑制病之一。IBDV共有四种主要的致病型（pathotypes）,分别为经典毒株（classical IBDV,c IBDV）、变异株（variant IBDV,vIBDV）、超强毒株（very virulent IBDV,vvIBDV）及新型变异株（novel variant IBDV,nvIBDV）,其中新型变异株为近年来在中国首先新发现的致病型。不同致病型的毒株间存在着致病性与抗原性的差异,给IBD的防控带来困难。因此及时跟踪和了解IBD的流行情况以及毒株的致病型及其特性对于疾病的防控具有十分重要的意义。课题对广西各地2017年-2019年间临床上疑似IBD的病例通过采集病料、接种鸡胚进行IBDV的分离与鉴定,最终成功获得13个IBDV分离株。通过对毒株基因组A节段的vVP2以及B节段的VP1-b基因的扩增及其序列的分析,确定2017年-2019年广西同时存在有vvIBDV（9株）、弱毒株（1株）和nvIBDV（3株）的流行。13个分离株分别属于四种不同的基因型,即基因Ⅱ型（A节段为弱毒株,B节段为超强毒株）、基因Ⅳ型（A节段为超强毒株,B节段为Uniq-B）、基因Ⅹ型（A节段为新型变异株,B节段为Uniq-B）和基因Ⅺ型（A节段为新型变异株,B节段为新型变异株）。首次确定广西存在有nvIBDV（QZ191002和QZ191003）和新型变异重排毒株（novel variant reassortant IBDV,nvrIBDV）（YL190623）的流行,其中nvrIBDV为国内首次发现。课题选取2016年-2019年的nvIBDV毒株QZ191002和QZ191003以及nvrIBDV毒株YL160304和YL190623,利用蚀斑技术进行纯化,然后对毒株的全基因组序列进行测定与分析。结果发现YL160304、YL190623、QZ191002和QZ191003毒株的A节段均与nvIBDV参考株SHG19等的核苷酸同源性最高（94.4%-98.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与SHG19的A节段抗原相关的氨基酸残基的相似性最高（85%-100%）。nvrIBDV毒株YL160304和YL190623的B节段与我国近年来优势流行毒株HLJ-0504（属于vvIBDV）的核苷酸同源性最高（97.6%-97.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与HLJ-0504的B节段关键氨基酸残基的相似性最高（100%）。nvIBDV毒株QZ191002和QZ191003的B节段与参考株SHG19等的核苷酸同源性最高（97.2%-97.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与SHG19的B节段关键氨基酸残基的相似性最高（88%）。课题选取nvIBDV毒株QZ191002及nvrIBDV毒株YL160304分别在三黄鸡上进行了致病性研究。实验选用出壳的三黄鸡商品鸡雏共30只,在隔离条件下饲养至35d龄,自由采食和饮水。每周采鸡的血清,并用ELISA检测试剂盒检测其抗体,待试验鸡的血清抗体水平变成阴性后,随机分成三个组,每组10只鸡。在28d龄分别用毒株QZ191002和YL160304以105.0 TCID50/0.2ml的感染剂量,口服感染A组和B组,C组为不感染对照组。每天记录鸡的表现及死亡情况。在试验结束的时候（35d龄）对各组的鸡只进行称重并采集血清,剖杀所有鸡只及试验期间死亡的鸡只,分别采集脾脏和法氏囊,分别进行IBDV病毒载量的检测,计算囊重比、囊指数及脾脏/体重比。结果表明,nvIBDV毒株QZ191002不引起IBD的典型症状,无死亡,能导致法氏囊严重萎缩,囊指数为0.46;nvrIBDV毒株YL160304可引起IBD的典型症状,死亡率为10%（1/10）,法氏囊萎缩程度更加严重,囊指数为0.35;法氏囊和脾脏的病毒载量的检测结果以及法氏囊组织的病理学观察均表明,nvrIBDV毒株YL160304的致病力显着高于nvIBDV毒株QZ191002。课题研究结果表明,2017年-2019年广西鸡群同时存在有vvIBDV、弱毒株和nvIBDV的流行,并首次发现2016年即开始有nvIBDV和nvrIBDV毒株的流行。其全基因组序列分析也首次揭示了这两类新型变异毒株A、B片段的不同进化关系。三黄鸡的致病性研究结果证明nvrIBDV与nvIBDV所引起的病变特征是囊的萎缩,而且nvrIBDV毒株所引起的囊的萎缩程度要高于nvIBDV。
陈果[3]（2019）在《传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究》文中研究说明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBD可直接造成鸡只发病死亡,更重要的是雏鸡的早期感染将引起严重的长期的免疫抑制,导致继发其他疾病及疫苗应答水平降低。因此,该病对养禽业具有重要的经济学意义。目前,免疫预防是控制该病的主要手段。IBDV根据抗原性和致病性的不同,分为致弱毒株（Attenuated）、经典毒株（Classical）、变异毒株（Variant）和超强毒株（vv IBDV）。由于病毒基因组的突变和毒株间的重组,导致IBDV的流行出现新的特点,给免疫防控带来新的挑战。因此本研究对2012-2015年广西IBDV流行株进行分子流行病学研究,以阐明广西IBDV的流行情况。在此基础上,选取1990-2017年分离自中国的IBDV流行株进行时空动态进化分析,以阐明IBDV在中国的时空进化特点。最后,针对IBDV流行的优势基因型毒株进行了新型疫苗的研究。1.2012-2015年广西IBDV分子流行病学研究本研究在2012年9月-2015年12月间从广西疑似IBD发病鸡群中分离鉴定IBDV分离株29株。对IBDV分离株的v VP2基因、VP1b基因进行基因扩增、序列测定和分析。29株分离株v VP2、VP1b基因序列间均具有较高的相似性（≥89.6%（nt）、≥92.4%（aa））。比较v VP2基因序列,29株分离株中有27株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（≥94.9%（nt）、≥97.5%（aa））高于non-vv IBDV（Variant、classical、attenuated）参考毒株间的相似性（≤94.1%（nt）、≥96.8%（aa））。比较VP1b基因序列,29株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（86.8%-98.2%（nt）、93.7%-99.6%（aa））和non-vv IBDV参考毒株间的相似性（89.4%-99.9（nt）、95.3%-100%（aa））没有显着差异。基于v VP2、VP1b基因序列绘制系统进化树,29株分离株可以分为4个基因型:vv-A/Att-B、vv-A/Uniq-B、Classical-A/Uniq-B和Att-A/Uniq-B。其中以vv-A/Uniq-B为优势基因型占75.9%（22/29）。2.中国IBDV流行株时空进化分析本研究通过Gen Bank数据库查询、查阅文献、结合本研究第1部分获得的29株IBDV分离株v VP2基因序列,构建了一个包含1990-2017年国内255株IBDV v VP2基因序列的数据集。运用贝叶斯法对该数据集进行进化分析。结果显示255株IBDV v VP2基因序列被分为3个大的进化分支。Cluster 1包含217株毒株,为vv IBDV株。Cluster 2包含15株毒株,又细分为2个分支,其中一个分支为variant株,另一个分支为classical株。Cluster3包含23株毒株,为attenuated株。同时,经分析IBDV v VP2基因的碱基替代速率为7.9001×10-4碱基替代/位点/年。基于IBDV v VP2基因序列数据集绘制的种群动态分布图（Bayesian skyline plots）,IBDV种群经历了平缓（1950-1988）、快速增长（1989-1992）、平缓增长（1993-2008）、极速下降（2009-2012）和再平缓（2013-2017）的过程。3.泛素介导的IBDV及IBDV-IBV二联核酸疫苗的研究本研究将泛素基因（Ub）与广西IBDV优势基因型毒株NN1172的VP2、VP1基因以及广西IBV优势基因型毒株GX-YL5的N、S1基因融合获得重组质粒p VAX1-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2-VP1和p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2。重组质粒经PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定。4个重组质粒经体外转染Vero细胞对其m RNA和蛋白表达进行了检测。RT-PCR检测表明4个重组质粒瞬时转染Vero细胞均能够正确表达目的基因的m RNA。间接免疫荧光试验（IFA）表明4个重组质粒能够正确表达目的蛋白。动物试验表明,4个重组质粒免疫组血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、B淋巴细胞数量、抗IBDV抗体水平以及p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组抗IBV抗体水平均高于空载体对照组和PBS对照组。攻毒试验结果表明,p VAX1-Ub-linker-VP2免疫组可以抵御IBDV的攻击,p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组可以同时抵御IBDV和IBV的攻击。4.IBDV B87疫苗株反向遗传学改造及拯救本研究对IBDV B87疫苗株基因组进行分段扩增获得了IBDV全基因组的c DNA克隆。通过多片段融合的方法获得了B87疫苗株基因组A、B节段真核表达质粒,基因组节段的两端分别引入了锤头状核酶结构（Ham Rz）和丁肝病毒核酶结构（Hdv Rz）。随后分别在B87疫苗株基因组A、B节段引入了分子标签Eco R V和Pst I,获得感染性克隆p VAX1-m B87A和p VAX1-m B87B。将重组质粒共转染CEF细胞,经SPF鸡胚传代、RT-PCR、IFA和测序鉴定获得拯救病毒r B87。采用多片段融合的方法,对B87基因组B节段进行了改造,最终获得了5个拯救病毒r B87A-NN1172B、r B87A-NN1172VP1、r B87A-NN1172VP1N、r B87A-NN1172VP1M和r B87A-NN1172VP1C。所有拯救病毒均能使CEF产生CPE、SPF鸡胚死亡。所有拯救病毒感染CEF后,经IFA鉴定均能检测到绿色荧光。体外复制动力学分析表明亲本病毒B87、r B87和r B87A-NN1172VP1C在CEF上的复制曲线相似。r B87A-NN1172VP1在CEF上的平均滴度最高,其次为r B87A-NN1172VP1M。r B87A-NN1172VP1C在CEF上的平均滴度最低。结论:广西IBDV流行株主要通过基因突变、基因重排的方式进化。广西IBDV流行株优势基因型为vv-A/Uniq-B基因型。IBDV种群动态经历了平缓-快速增长-平缓增长-极速下降-平缓的过程。泛素介导的IBDV核酸疫苗可以有效抵抗IBDV的攻击。泛素介导的IBDV-IBV二联多基因核酸疫苗可以同时抵抗IBDV和IBV的攻击。vv IBDV基因组B节段VP1基因能够增强病毒复制能力。
陈春波[4]（2017）在《稳定表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的细胞系的构建及IBDV疑似受体的分离鉴定》文中研究指明传染性法氏囊病是一种高度接触性传染病,引起禽类严重的免疫抑制和法氏囊损伤,它最早于1957在美国甘布罗镇发现,又称甘布罗病。其病原体传染性法氏囊病病毒,属于双RNA病毒科;含有两个血清型,但只有一型对鸡有致病性。该病毒无囊膜,只有一层外壳,表达5种蛋白,即VP1,VP2,VP3,VP4,VP5;其中VP2是主要的宿主保护性抗原,并组成外衣壳。传染性法氏囊病病毒作为双股RNA病毒的一员,与双股RNA病毒科,呼肠孤病毒科的许多成员具有一定的相似性。不少双股RNA病毒的受体得到了鉴定:如轮状病毒受体主要包括唾液酸、整合素家族、热应激同源蛋白70、Toll-like受体、组织血型抗原等,其通过与该病毒的不同蛋白相互作用,从而达到感染不同组织和细胞;呼肠孤病毒利用结合黏附分子A（junctional adhesion molecule A）,Nogo等作为受体,利用GM2多糖,唾液酸等作为辅受体,共同协助病毒与宿主细胞作用,造成病毒感染和复制。传染性法氏囊病病毒经过众多学者的研究。目前已经分离到不少受体:如表面免疫球蛋白M,整合素,膜联蛋白A2,鸡热休克蛋白90等四种受体;但是他们是基于不同的细胞产生的受体,表面免疫球蛋白M是从鸡的B成淋巴细胞系LSCC-BK3中找到的,鸡的Hsp90是从DF-1细胞发现的,整合素是通过验证BALB/c 3T3细胞系得来的,鸡的膜联蛋白A2则是从DF-1细胞的VOPBA实验中捕获到的。从IBDV发现至今已经经历了几十年,从弱毒株到强毒株,从野毒株到细胞适应毒株等等,使得不同毒株对一些相同或者不同的细胞产生了不同的感染能力,可能因此受体也具有了多样性。1.稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的DF-1细胞系的构建本研究首先构建pcDNA-VP2真核表达质粒,然后通过脂质体转染的方法,将其转染进DF-1细胞系,利用细胞分裂过程中染色体的同源重组,将质粒中的传染性法氏囊病病毒的VP2基因重组插入DF-1细胞中,在药物zeocin的筛选下,构建成一个稳定表达VP2蛋白的细胞系。通过一系列研究,最终确定zeocin的工作浓度为25μg/ml为最佳筛选浓度;将细胞系不断培养传代,至60代对所构建的细胞系进行形态学,细胞生长曲线,间接免疫荧光,聚合酶链式反应（PCR）,免疫印迹等各种方法进行了分析鉴定,发现所构建的细胞系生长状态良好,形态保留原有DF-1细胞系梭状特征,只是略肥大;通过检测和比较其生长曲线发现,在抗性药物维持下,细胞生长分化速度低于正常的DF-1细胞和无抗性药物维持的细胞;利用单克隆抗体2H11做间接免疫荧光试验发现传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白在构建的pcDNA-VP2 DF-1细胞系中得到了充分表达;通过提取细胞系中的基因组并进行PCR检测,发现了 VP2目的基因的存在;Western-blot实验证实了 VP2蛋白在细胞系中得到了表达。这一系列实验表明pcDNA-VP2 DF-1细胞系构建成功,其中的目的蛋白VP2得到了稳定表达。这个细胞系为下一步实验提供了重要的实验材料和物质基础。2.传染性法氏囊病病毒在DF-1细胞上受体的分离鉴定通过提取pcDNA-VP2 DF-1细胞系和DF-1细胞系（对照）的细胞膜蛋白与纯化的单克隆抗体2H11及protein A+G agrose相互作用,进行免疫共沉淀,再将沉淀产物进行SDS-PAGE电泳和银染,找出差异蛋白条带;另外,将pcDNA-VP2 DF-1细胞系和DF-1细胞系（对照）进行充分裂解,取裂解蛋白上清与纯化的单克隆抗体2H11及protein A+G agrose相互作用,免疫共沉淀,SDS-PAGE电泳,银染,通过比较切取差异蛋白。将两种方法的差异蛋白合并,进行质谱分析。质谱结果得到近50种差异蛋白,然后将这50种蛋白进行分类,并分析各个蛋白的功能,特别对其能否作为受体参与病毒的感染复制进行了深入分析,最后通过比较筛选,认定HSC70和波形蛋白（vimentin）为疑似受体,这为下一步受体的鉴定和验证奠定了基础。3.HSC70和波形蛋白（vimentin）疑似受体的验证实验及相关分析（1）:利用HSC70的抗体封闭DF-1细胞,然后进行病毒阻断实验,考察疑似受体得到封闭阻断后,对传染性法氏囊病病毒的感染复制的影响。实验过程如下:预先将生长状态良好的DF-1细胞用HSC70抗体孵育,通过抗体中和封闭HSC70疑似受体,然后感染IBDV的细胞适应毒,48小时后通过观察细胞病变,间接免疫荧光实验,荧光定量PCR实验,Western-blot实验,取上清测定TCID50等,通过与阳性对照比较发现,随抗体浓度增加,抑制病毒的效果增强。主要表现为细胞病变减少,细胞中病毒蛋白表达量减少,病毒的基因表达水平下降,病毒滴度同样下降明显。（2）:通过HSC70抑制剂VER-155008作用于DF-1细胞,然后进行病毒感染抑制实验,本实验主要考察热休克蛋白70特异性抑制剂VER-155008对HSC70抑制后,对IBDV的感染复制的影响。实验步骤如下:首先将DF-1细胞用抑制剂孵育6小时,然后加入:IBDV细胞适应毒感染细胞,在24小时,48小时,72小时不同时间段取上清测TCID50及免疫印迹实验,在与阳性对照比较中发现,由于实验组细胞在抑制剂作用后,细胞上HSC70受到大量抑制,导致不同时间段细胞中病毒滴度显着下降,细胞中病毒蛋白的表达也同步降低。（3）:通过波形蛋白（vimentin）抑制剂丙烯酰胺作用于DF-1细胞,然后感染传染性法氏囊病病毒进行病毒抑制实验。实验步骤如上:将DF-1细胞预先用丙烯酰胺孵育2小时,然后加入IBDV细胞适应毒感染细胞,在24小时,48小时,72小时不同时间段取上清测病毒滴度并进行免疫印迹实验。同阳性对照组比较发现,实验组在丙烯酰胺作用后,其病毒复制能力下降明显,细胞中病毒蛋白的表达水平也显着降低。4.HSC70和波形蛋白受体重建实验通过RT-PCR扩增出HSC70及波形蛋白的基因,然后将它们分别克隆进真核表达载体pcDNA3.1空载体,然后再将构建的真核表达质粒pcDNA-HSC70和pcDNA-vimentin转染IBDV非易感细胞MDCK细胞,48小时后,用MOI=5的IBDV感染细胞,7天后,取其上清及细胞裂解液测TCID50,感染正常的DF-1细胞进行间接免疫荧光实验,结果发现TCID50为0,间接免疫荧光为阴性。表面看起来受体重建失败,但经过查阅相关文献发现,HSC70体外表达能产生天然免疫,其介导分泌的I型干扰素具有抗病毒作用;而波形蛋白能形成“笼子”状结构,过表达的蛋白会将病毒隔离包围起来,阻止其进一步进入细胞内。
星东[5]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）与新城疫（Newcastle disease,ND）的防控仍然是国内家禽养殖业面临的两大难题。IBD和ND疫苗在蛋鸡的应用已经取得一定的成效,但是在生产中其免疫效果仍达不到预期效果,而且经常由于苗毒毒力过强造成免疫器官损伤。而ND-IBD二联灭活苗经生产工艺改进,提高了抗原含量,且可以减少免疫次数,能够有效的避免活苗的缺陷。ND-IBD二联灭活苗在商品蛋雏鸡的免疫效果及机体对该疫苗的免疫反应仍然有待进一步的研究。因此,本试验比较了 ND-IBD二联灭活疫苗对1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果,并比较了 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果,同时结合实时荧光定量PCR分析了 ND-IBD二联灭活疫苗免疫后免疫因子mRNA表达量的变化情况。研究结果为ND-IBD二联灭活疫苗在蛋鸡生产上的应用提供了重要依据。具体内容如下:方法:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡360只,随机分成A、B和C三个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为1日龄疫苗免疫组,雏鸡1日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗;C组为7日龄疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期56d,免疫后每7d采血分离血清,采用血凝抑制试验检测ND抗体水平;并采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA,用实时荧光定量PCR检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽,并于攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对商品蛋鸡免疫效果比较研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡240只分成3个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为IBD活苗免疫组,雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlIBD活疫苗;C组为ND-IBD二联灭活疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期42d,免疫后每7d采血分离血清,采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA用实时荧光定量PCR法检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽。攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。结果:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。抗体检测结果表明:在28～56日龄,C组的IBD和ND抗体水平显着高于A组与B组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护率显着优于A组,且相差10%。实时荧光定量PCR法检测结果表明:在法氏囊与脾脏中,28～56日龄时,C组基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,相比A组与B组显着升高（P<0.05）。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果比较研究。抗体检测结果表明:28～42日龄,C组IBD体水平显着高于B组与A组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护效果高于B组与A组。实时荧光定量PCR结果表明:21～42日龄时,法氏囊与脾脏中基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,C组显着高于B组与A组（P<0.05）。结论:1.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡可显着提高IBD与ND抗体水平和免疫器官中细胞因子的mRNA表达量,增强机体免疫功能。2.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡,免疫效果优于IBD弱毒苗。
赖隆永[6]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由双股核糖核酸病毒科的传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的以感染雏鸡为主的免疫抑制性、高度接触性传染病;新城疫（Newcastle Disease,ND）是由副黏病毒科鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起鸡的急性、高度接触性和致死性传染病,不同年龄、品种以及性别的鸡均能感染ND,但是幼雏的发病率和死亡率明显更高。研究发现国内对ND-IBD二联灭活苗的研发及其对种母鸡免疫效果研究较少,因此,针对这种情况,对ND-IBD二联灭活苗对种母鸡免疫效果研究仍需要进一步研究;同时在生产临床实践中或者科研试验研究中,血清学方法监测雏鸡抗体水平在一定程度上,都会引起雏鸡应激,影响其生长性能和经济效益。通过从鸡蛋中提取ND和IBD卵黄抗体间接预估ND和IBD血清抗体,获取样品方便,减少雏鸡的反复应激,考虑到ND和IBD卵黄抗体与子代雏鸡ND和IBD血清抗体的关系尚不明确,因此通过测定ND和IBD卵黄抗体与ND和IBD血清抗体,进行ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析;另外,研究表明在临床实践中,机体内存在IBDV野毒和苗毒的感染,引起法氏囊病变和免疫失败,因此建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法具有重要意义。本研究拟对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,对其ND和IBD抗体水平进行检测,观察种母鸡及其子代的免疫效果,此外,对提取的种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平进行相关性分析,最后建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法。本试验的研究内容及结果如下:1.ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究。本试验通过对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,分别于免疫前、免疫后每隔15 d采血分离血清,利用血清学方法检测其ND和IBD抗体水平,并对其抗体水平进行分析,结果表明种母鸡接种ND-IBD二联灭活苗之后产生了较高的ND和IBD抗体水平,种母鸡得到了很好的免疫保护,并且其免疫保护力能够持续120d。可见,种母鸡免疫ND-IBD二联灭活苗,不仅可以有效地提高种母鸡的抗体水平,也可以提高子代的母源抗体水平。2.ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析。本试验通过检测种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平及其子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平,结合SPSS 18.0软件的分析,得到免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代ND血清抗体水平关系的最优方程为y=0.923+0.701x;免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代IBD血清抗体水平关系的最优方程为y=2.365+0.7x。3.IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立。根据NCBI中不同毒株的VP2共保守区段序列比对分析设计两对引物（片段长度为856bp和1356bp）和选择限制性内切酶BamHI和PstI进行RT-PCR扩增,并选择片段长度为856 bp的PCR产物,胶回收其目的基因进行限制性内切酶酶切,最后验证其特异性、敏感性和重复性,建立了IBDV强弱毒株鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。综上,种母鸡免疫接种ND-IBD二联灭活苗后种母鸡及其子代获得较高抗体水平;此外,分析免疫组种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平的相关性,获得了它们之间的最优方程;最后建立了一种高效简便的IBDV野毒与苗毒的鉴别诊断RT-PCR-RFLP方法,为临床和生产实践制定科学的免疫程序提供科学依据和提供高效便利的监测手段;同时,为IBD的流行病学和诊断治疗研究提供了一种新的手段。
蒋大伟[7]（2016）在《鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究》文中指出鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease virus,IBDV）引起的一种严重危害雏鸡免疫器官,致使雏鸡免疫失败,造成B淋巴细胞严重受损的高发性、高接触性的病毒性传染病。其主要特征是IBDV侵袭雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,并在法氏囊B淋巴细胞中大量增殖,对该细胞造成严重杀伤,从而导致严重的免疫抑制,使机体免疫力下降,使疫苗免疫失效,给养禽业的疫病防控带来很大的困难。该病于上世纪八十年代开始在我国广泛流行,给我国的养禽业带来了巨大的经济损失。因此该病的防治防控对养殖业具有重要的价值和意义。VP2位于IBDV基因组中的A节段,是主要免疫保护性抗原,在其高变区含有主要的中和性抗原表位,因此被作为研发预防IBD亚单位疫苗的主要蛋白。目前,科研人员通过不同的表达系统表达VP2蛋白,其中以真核表达系统为主,该系统有很多优势,如表达水平较高,表达产物有翻译后加工修饰,表达产物纯度高利于后期纯化等,但由于真核表达成本高,操作也更繁琐,因此该系统并不利于大量表达VP2蛋白。尽管原核表达系统大肠杆菌表达IBDV VP2蛋白可溶性表达量较低,其主要表达产物是无活性的包涵体,且背景蛋白较多限制了其后期的纯化。但大肠杆菌表达系统的最大优势在于成本低,操作简单,为亚单位疫苗产业化提供了可能。因此,本研究主要利用大肠杆菌表达VP2蛋白,分别构建9种含有不同可溶性标签的表达载体,探讨不同可溶性标签对VP2蛋白的可溶性表达及纯化的影响。此外,本研究从技术方法上优化VP2的可溶性表达条件,明显提高了VP2蛋白的可溶性表达,利用亲和层析、分子筛和蔗糖梯度离心纯化VP2蛋白,并用电镜观察VP2蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）。最后,将表达的VP2蛋白及纯化形成的VLPs制备成亚单位疫苗进行免疫保护试验,结果显示制备的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,其免疫保护作用明显高于目前的IBDV商业化疫苗。本研究为研发新型IBDV基因工程亚单位疫苗奠定了坚实基础,提供了高效的亚单位候选疫苗。1、为了解决VP2在原核大肠杆菌中可溶性表达量较低且难以纯化的技术问题,本试验将9种不同可溶性标签插入原核表达载体p ET21b,构建9种可溶性表达载体,并与VP2连接后转化至大肠杆菌进行融合表达,其中Grifin,MBP,SUMO,Thioredoxin,γ-crystallin,Ars C和Ppi B这7种标签可有效改善与VP2的可溶性表达。将这7种融合蛋白进一步通过亲和层析的方法纯化,结果显示,融合蛋白γ-crystallin-VP2的回收率最高,融合蛋白MBP-VP2的纯度最高,可达到90%以上的纯度。为了验证融合VP2蛋白和切除标签后的VP2蛋白是否存在活性,利用琼扩试验（AGP）检测这7种纯化后的融合蛋白。融合VP2蛋白和被切除标签的VP2蛋白都均能与IBDV的阳性血清抗体结合发生沉淀反应,表明含有标签的融合蛋白及被切除标签的VP2蛋白均具有活性。此外,电镜观察结果显示,融合蛋白MBP-VP2切除MBP标签后的VP2蛋白可观察到大小为25～50nm的颗粒,暗示切除标签后的VP2蛋白仍具有形成病毒样颗粒（VLPs）的能力。2、为了研究相关方法对VP2蛋白表达的影响,构建了重组表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）p Lys S（p ET28a-VP2）,通过优化表达条件,使VP2的可溶性表达有了明显提高,经琼脂扩散试验检测表达VP2含量,琼扩效价可达到1:64。利用亲和层析方法、亲和层析结合分子筛纯化及亲和层析结合蔗糖梯度离心纯化,三种方法均能对VP2起到较好的纯化作用,其中镍柱纯化产物的纯度可达90%。经电镜观察,大肠杆菌表达的VP2蛋白经纯化后可组装成与天然IBDV构象类似的VLPs。亲和层析纯化后形成的VLPs含量高于亲和层析方法结合蔗糖梯度离心纯化后形成的VLPs含量。动态光散射分析,自组装成的VLPs均一度很高,直径为25nm的颗粒。本试验明显改善了VP2可溶性表达量,初步摸索了VP2形成VLPs的条件,为进一步制备基因工程亚单位疫苗奠定了基础。3、为了对上述VP2蛋白及其形成的VLPs进行免疫原性研究,用中等毒力B87株和超强毒力0504株分别制备纯化和未纯化免疫原各6种,按一定比例加油佐剂,共制备了12种不同抗原含量的基因工程亚单位疫苗。按生物制品标准进行理化检验和无菌检验,结果均符合要求。安全试验表明所制疫苗安全性好、无不良反应。用检验合格的疫苗分别免疫SPF鸡群,并设立对照,定期采血测定各组的免疫抗体滴度并进行比较。结果显示各组呈现不同的免疫抗体水平,自制的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,可有效提高鸡群的体液免疫水平。免疫攻毒保护试验结果显示,各组均呈现了不同程度的免疫保护作用,自制疫苗可产生良好的免疫保护作用,尤其是B87株和0504株纯化组高含量VLPs和B87株未纯化组的中琼扩效价VP2亚单位疫苗其免疫保护率均可达90%,0504株未纯化组的低琼扩效价VP2亚单位疫苗其免疫保护率高达100%,因此,确定这4种IBDV亚单位油乳剂为候选疫苗。总之,筛选的4种候选疫苗其抗体水平和免疫保护率均显着高于目前商业化基因工程亚单位疫苗和中等毒力活疫苗,且抗体水平略高于商业化的全病毒灭活苗。本研究确定的候选疫苗具有良好的免疫保护作用、安全可靠,能有效地预防鸡传染性法氏囊病的发生,对养禽业的发展具有重要的意义和价值,同时也为制备最佳性价比的亚单位疫苗奠定了坚实的基础。关于候选疫苗的免疫期、保存期及其相关免疫程序的制定等问题,有待今后进一步深入研究。
李松[8]（2015）在《鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定》文中进行了进一步梳理鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的一种急性、高度接触性的传染性疾病。IBDV主要是侵害鸡法氏囊组织中的B淋巴细胞,使B细胞数量减少,引起严重的免疫抑制,进而导致免疫失败和诱发继发感染。近几年来,IBD流行毒株不断产生新的变异。本研究从福建某地区疑似IBD病鸡的法氏囊、脾脏等组织中成功地分离到一株病毒,通过鸡胚培养、RT-PCR检测、基因测序、动物回归试验等方法对这株病毒进行了鉴定,结果如下:1.经绒毛尿囊膜接种该分离病毒,鸡胚头部、四肢末端等出血,其鸡胚半数致死量（EID50）为10-4.5/0.2mL。2.动物回归试验中,感染该病毒的SPF雏鸡大腿肌和胸肌出血,法氏囊、脾脏肿大出血。3.通过测序比对分析发现,该分离病毒株与参考的中等偏强毒力疫苗株的核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性高,分别为98.7%-99.0%,99.0%-99.5%,七肽区均为SWSASGS,毒力相关位点的氨基酸相同,在遗传进化关系上也处于同一进化分支,亲缘关系近,可能存在相同的来源。结果表明,本研究所分离的病原为IBDV,具有较强的毒力。
常婧竹[9]（2014）在《河南HN12株鸡传染性法氏囊病病毒生物学特性研究》文中研究说明鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的,主要侵害雏鸡免疫器官的一种急性、接触性、免疫抑制性病毒传染病。IBDV感染鸡群可造成鸡群发病死亡、生产性能下降,尤其80年代以来vvlBDV的出现,使鸡群出现70%-100%的死亡率,造成直接的经济损失。传染性法氏囊病病毒可引起雏鸡免疫抑制性疾病,使雏鸡免疫机能低下,降低对其他疫苗免疫应答效力,增强对其他疫病的易感性,增加并发或继发感染其它疾病的几率,造成间接的损失。RNA病毒的RNA聚合酶高变区的高突变率导致IBDV抗原变异株和致弱毒株的出现,他们可能是近年来IBD免疫后疫病频发的一个重要原因之一。本病对于养禽业存在很大的危害,受到国内外养殖业的普遍高度重视。河南省动物性食品安全重点实验室从2011年1月到2012年12月从河南郑州、洛阳、焦作、濮阳等地市共分离毒株35份,引起病变特征比较明显和实验室诊断结果比较确切的共有12份,从中选取4个分离株为重点研究对象,将分离自河南郑州登封的鸡传染性法氏囊病病毒其命名为HN12分离株。以HN12株为代表采用常规方法和分子生物学方法进行系统研究。该毒株经过鸡只发病特性、剖检变化、实验室常规检测方法和分子生物学技术检测方法,证明分离毒株实为传染性法氏囊病病毒。用其对4周龄SPF鸡进行回传,其发病症状、血清学及分子生物学试验数据显示：HN12号分离株为超强毒株,可引起鸡只高致病率和死亡率。将IBDV分离株在SPF鸡胚上培养4代,传到DF-1细胞上进行培养,盲传至第四代时出现细胞病变。将传至第八代细胞毒命名为HN12C8毒株。连续传代至毒株增殖稳定。通过IBDV吸附时间、不同接种量、维持液血清浓度对IBDV在DF-1细胞内增殖的影响等研究,结果表明将IBDV鸡胚毒稀释10-3后接种细胞,吸附1h后加入2%胎牛血清的维持液,病毒滴度达到最高,为10-5.8。分离株适应细胞培养后,不能凝集红细胞,对PH12敏感,对PH2、有机溶剂等不敏感。将分离株原毒HN12B1、鸡胚毒HN12E4、细胞适应毒株HN12C8提取RNA,通过基因组RNA克隆、核苷酸序列测定和氨基酸序列分析,摸索HN12号分离株在鸡胚传代及细胞传代过程中VP2核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的变化规律。毒株在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中（206-350）,有11个位点发生了变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致。氨基酸变异位点主要集中在222位（A→P）、 242位（T→V）、249位（Q→K）、253位（Q→H）、256位（T→V）、279位（D→N）、284位（A→T）、290位（M→L）、294位（T→L）、299位（S→N）、330位（S→R）。在此基础上,与已报道的毒株VP2片段进行同源性比较,构建系统进化树。实验进一步证明VP2高变区氨基酸的大部分变异与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切,出现规律性的变异。分别用灭活的HN12B1、HN12E4、HN12C8由乳剂苗免疫SPF实验鸡,于免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d采血分离血清,采用琼脂扩散试验、细胞中和试验检测鸡只抗体水平,研究不同毒株灭活乳剂对SPF鸡群的免疫效果。鸡只在免疫3周后琼扩达到1：16,随后曾线性增长至1：64,4周抗体水平最高,HN12C8毒株乳化剂免疫产生的抗体中和效价可达到10-3.16,即该血清1：1445稀释时,可保护50%的细胞不出现CPE。本试验为IBDV毒株基因变异特点提供了基础理论依据,为利用IBDV地方分离经细胞培养毒株进行IBDV的预防提供了一定的技术依据。
蔡梅红[10]（2011）在《传染性法氏囊病基因工程疫苗及两种免疫增强剂的研究》文中认为传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是指由传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）感染禽法氏囊（Bursa of Fabricius,BF）而引起的一种急性、接触性的传染病,其主要以侵害未成年家禽免疫器官（法氏囊）为特征。目前,IBD在世界范围内分布广泛,其给养殖业带来的危害主要体现为IBDV感染鸡群后导致鸡群死亡所带来的直接经济损失和发病鸡群产肉、产蛋等生产性能下降带来的间接经济损失。传统的IBD灭活苗和活疫苗免疫动物后产生的抗体对IBD经典毒株的感染具有很好的预防作用,但是,其在生产或使用过程中有散毒的危险,且不能预防法氏囊病毒超强毒株（Very viru1ent infectious bursa1 disease virus,vvIBDV）和变异毒株对禽类的感染。因此,我们将通过探索以下三种基因工程生物制品的研究,旨在（1）通过给鸡群注射IBD基因工程疫苗使其产生抵抗IBDV的抗体,预防IBD的发生,减少因使用传统的IBD活疫苗导致的疫苗毒的散播;（2）使用具有免疫佐剂效应的基因工程杂合肽囊素,来增加商品化IBD疫苗免疫后鸡群产生抗体的效价和提高鸡群抵御IBD感染的能力;（3）把具有抗病毒活性的重组鸡β干扰素应用于鸡群,借以增强鸡群抵抗IBDV在其体内的繁殖能力。具体内容如下:1.IBD基因工程疫苗的研究（1）mVP2疫苗抗原的研究目前关于IBD基因工程疫苗相关的研究比较多,我们设计了IBDVmVP2序列（在鸡vvIBDVVP2基因的5’端和3’端各添加了一个IBDVVP2蛋白的中和性B细胞抗原表位核酸序列）。我们首先选择在巴士德毕赤氏酵母中表达mVP2的核酸序列,实验结果表明酵母系统实现了对mVP2序列的表达和翻译后的糖基化修饰。但是,由于mVP2在酵母中表达水平比较低（约0.06mg/ml）,不符合禽用产品成本低的要求,因此,我们又探索利用大肠杆菌系统来表达mVP2的核酸序列。实验结果表明,其在大肠杆菌的表达量可占总蛋白的8%左右,这比在酵母中的表达水平提高了近20倍。免疫琼扩实验结果表明重组大肠杆菌mVP2蛋白的琼扩效价可以达到1:16,这说明大肠杆菌表达的mVP2具有较好的体外免疫学活性。以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗免疫SPF鸡群,实验结果表明:免疫后鸡群中,有一部分鸡只产生了抗体,用标准鸡法氏囊强毒BC6/85毒株攻毒后,各免疫组鸡群法氏囊细胞坏死的情况和淋巴小结完整性等情况均比阳性对照组鸡群法氏囊的病理分析结果要好。但是,各免疫组与阴性对照组相比,其淋巴小结出现结构不完整,皮质和髓质界限模糊的病理特点,这说明以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗的免疫效果欠佳。我们尝试了使用基因工程杂合肽囊素和基因工程鸡β干扰素等来提高其免疫效果。实验结果显示:虽然产生抗体的鸡群比例有所提高,但其并不能完全保护法氏囊免受IBDV感染。因此,我们需要在以后的研究中进一步提高mVP2的免疫性能。（2）IBDVSOE多表位肽疫苗抗原的研究目前已经有许多研究报道人工合成的多肽疫苗和基因工程表达的肽疫苗可以成功地诱导动物机体产生抗体。本研究通过SOE PCR的方法把4个IBDV的抗原表位串联之后,获得了 IBDVSOE多表位肽的核酸序列,其在大肠杆菌的表达量占总蛋白的18%左右。体外免疫学实验证实:大肠杆菌表达的IBDV SOE多表位肽的琼扩实验效价高达1:32,这说明其具有很高的体外免疫学活性。但动物实验证实其作为疫苗抗原免疫效果比较低,我们试图从改变佐剂的种类和使用免疫增强剂及抗病毒细胞因子等各方面来提高其体内免疫效果,虽然免疫后鸡群的抗体效价从1:2提高至1:4,但攻毒后鸡群法氏囊的病理损伤仍然比较明显。因此,如果要把IBDVSOE制备成为具有理想免疫效果的疫苗,这还需要以后的实验进一步探索。不过,由于IBDV SOE具有很好的体外免疫反应性（比标准IBD琼扩抗原的效价高16倍）,所以,其具有作为鸡法氏囊琼扩检测抗原的潜力。2.免疫增强剂--基因工程杂合肽囊素的研制研究表明天然的囊素三肽（Lys-His-Gly-NH2）和B淋巴四肽（Lys-Asn-Pro-Tyr）刺激物均具有诱导B淋巴细胞的分化,提高机体免疫能力,增强疫苗免疫效果的能力。因此,在前人研究的基础上,本实验合成了 14个囊素三肽的重复序列和2个四肽序列的串联物,形成了杂合肽囊素的核酸序列,并在大肠杆菌系统中进行表达,期望表达的基因工程杂合肽囊素能提高商品化疫苗的免疫效果。实验结果显示:杂合肽囊素的核酸序列在大肠杆菌中的表达量占总蛋白量的20%,之后我们纯化了基因工程杂合肽囊素,并分析了其在体外刺激B淋巴细胞增殖能力。我们发现0.9mg/ml的基因工程杂合肽囊素能很好地诱导鸡外周血B淋巴细胞的分化,这初步说明其具有理想的体外免疫学活性。SPF级动物实验结果表明:基因工程囊素可以明显增加商品化鸡法氏囊灭活疫苗4倍的抗体效价（从1:4增加至1:16）。对实验组鸡群法氏囊的病理切片分析结果显示:基因工程囊素可以明显改善大剂量IBDV感染后商品化鸡IBD疫苗免疫后鸡群法氏囊的病理变化。因此,我们可以初步确定,基因工程杂合肽囊素是一种具有免疫佐剂功能的免疫增强剂。3.免疫增强剂--基因工程鸡β干扰素的研制β干扰素是一种具有广谱抗病毒能力和调节机体免疫力的免疫增强剂,但用人工提取的方法成本太高,因此,目前基本都是采用基因工程的方法进行制备。为了增加鸡群抵抗IBD等病毒性疾病的能力,我们探索了在体外制备基因工程鸡β干扰素的方法。首先,我们以鸡肝全基因组为模板,扩增了鸡β干扰素成熟蛋白基因,并在大肠杆菌体系中实现了鸡β干扰素的较高表达（总蛋白量18%）。细胞病变抑制实验结果表明:大肠杆菌表达的鸡β干扰素（蛋白浓度为0.25mg/ml）在44倍稀释后能较好地抑制100TCID50水泡性口炎病毒繁殖,同时其在65倍稀释后能有效抑制100TCID50鸡传染性法氏囊病毒（HN3）株的复制。SPF鸡群动物实验结果显示:重组鸡β干扰素协同商品化IBD疫苗免疫后能完全保护鸡群免受大剂量（1000EID）IBDV 的感染。总之,本研究制备的mVP2蛋白和IBDV SOE的多表位肽具有很好的体外免疫学活性,因此,它们具有作为IBD琼扩检测抗原的潜力,但若将它们作为疫苗抗原,还需要进一步探索提高其免疫效果的方法。不过令人欣喜的是,本研究成功地研制出两种基因工程免疫增强剂:基因工程杂合肽囊素（具有免疫佐剂功能）和基因工程鸡β干扰素（具有增加抗病毒的免疫功能）,体外免疫学实验和动物体内实验结果均证实它们都是很好的免疫增强剂,具有很好的应用价值。
二、鸡传染性法氏囊病疫苗毒株的生物学特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性法氏囊病疫苗毒株的生物学特性研究（论文提纲范文）
（1）传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 传染性法氏囊病文献综述 |
| 1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1 病毒形态 |
| 1.2 基因组结构 |
| 2 传染性法氏囊病流行病学 |
| 2.1 易感动物 |
| 2.2 流行特点 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 IBDV分子流行病学 |
| 3 传染性法氏囊病的诊断 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 4 传染性法氏囊病的防控 |
| 5 传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 5.1 传统疫苗 |
| 5.2 新型基因工程疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 病料信息 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR检测病毒 |
| 2.3 NT2020-8株VP2基因及VP1部分基因片段扩增及载体连接 |
| 2.4 NP2104株全基因测序 |
| 2.5 遗传进化树分析 |
| 2.6 氨基酸变异分析 |
| 2.7 同源性分析 |
| 2.8 病毒在鸡胚上培养 |
| 2.9 动物回归实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料RT-PCR检测结果 |
| 3.2 NT2020-8株VP2及VP1部分基因扩增结果 |
| 3.3 NT2020-8株VP2及VP1基因遗传进化树分析结果 |
| 3.4 NT2020-8株VP2及VP1部分基因编码氨基酸变异分析结果 |
| 3.5 NT2020-8株同源性分析结果 |
| 3.7 NP2104株全基因扩增结果 |
| 3.8 NP2104株遗传进化分析结果 |
| 3.9 NP2104株氨基酸序列分析结果 |
| 3.10 NP2104株同源性分析结果 |
| 3.11 鸡胚培养结果 |
| 3.12 NP2104株动物回归实验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要化学试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 IBDV超强毒株JS株总RNA的提取 |
| 2.2 原核表达VP2基因的扩增 |
| 2.3 VP2基因与原核表达载体连接 |
| 2.4 原核表达重组质粒的小量诱导表达及鉴定 |
| 2.5 重组转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的构建 |
| 2.6 杆状病毒转移载体转座DH10 Bac感受态细胞 |
| 2.7 重组杆状病毒质粒的提取 |
| 2.8 重组杆状病毒质粒鉴定 |
| 2.9 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞 |
| 2.10 收获P1代重组杆状病毒及鉴定 |
| 2.11 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 2.12 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 2.13 重组杆状病毒大量表达及收获蛋白 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核表达载体pET-28a-VP2酶切鉴定 |
| 3.2 原核表达重组蛋白SDS-PAGE分析及最佳表达菌株的筛选 |
| 3.3 原核表达重组蛋白Western Blot分析 |
| 3.4 原核表达诱导表达条件优化 |
| 3.5 大量诱导表达及包涵体提取效果 |
| 3.6 杆状病毒转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的酶切鉴定 |
| 3.7 重组杆状病毒质粒的鉴定 |
| 3.8 P1代重组杆状病毒的收获及鉴定 |
| 3.9 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 3.10 测定重组杆状病毒TCID50 |
| 3.11 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 3.12 重组杆状病毒优化表达条件后蛋白表达结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四章 两种VP2重组蛋白免疫原性比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原制备 |
| 2.2 SPF鸡免疫方案 |
| 2.3 IFA抗体检测 |
| 2.4 中和抗体检测 |
| 2.5 琼扩抗体检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 法氏囊组织病理学评价 |
| 2.8 荧光定量PCR方法检测法氏囊病毒载量及泄殖腔排毒量 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清IFA抗体效价 |
| 3.2 血清中和抗体效价 |
| 3.3 血清琼扩抗体效价 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 法氏囊组织病理学评价结果 |
| 3.6 法氏囊病毒载量及肛拭子排毒量结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文中所用英文缩略词列表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 传染性法氏囊病概述 |
| 1.1.1 IBDV病原学 |
| 1.1.2 IBDV基因组结构及其序列特征 |
| 1.1.3 IBDV的主要病毒蛋白及其功能 |
| 1.2 传染性法氏囊病的流行病学 |
| 1.2.1 IBDV流行病学研究 |
| 1.2.2 IBDV分子流行病学研究 |
| 1.2.2.1 基于vVP2与VP1-b基因的基因分型 |
| 1.2.3 IBDV血清学研究 |
| 1.3 IBD的诊断 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 IBDV致病性的研究 |
| 1.4.1 IBDV致病机理 |
| 1.4.2 IBDV致病性的研究方法 |
| 1.5 本课题的主要研究内容及其目的和意义 |
| 第二章 广西地区2017-2019 年IBDV的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病料中IBDV的 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2、VP1-b基因序列的扩增及测定 |
| 2.2.5 vVP2、VP1-b基因序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定结果 |
| 2.3.2 基因序列分析结果 |
| 2.3.2.1 vVP2 基因核苷酸序列相似性分析结果 |
| 2.3.2.2 VP1-b基因核苷酸序列相似性分析结果 |
| 2.3.2.3 vVP2 基因中关键氨基酸位点分析结果 |
| 2.3.2.4 VP1-b基因中关键氨基酸位点分析结果 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.3.1 vVP2 基因系统进化树分析结果 |
| 2.3.3.2 VP1-b基因系统进化树分析结果 |
| 2.3.4 基于vVP2 基因与VP1-b基因系统进化树基因分型结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 IBDV新型变异株及新型变异重排毒株的全基因组序列测定与分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 IBDV毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 IBDV分离株接种HD11 细胞上的特性生长 |
| 3.2.2 病毒的蚀斑纯化 |
| 3.2.3 全基因组分段扩增引物的设计与合成 |
| 3.2.4 IBDV基因组A、B节段分段扩增 |
| 3.2.5 连接、转化与鉴定 |
| 3.2.6 全基因组序列分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBDV分离株感染HD11 细胞产生的CPE |
| 3.3.2 蚀斑纯化结果 |
| 3.3.3 分离株A、B节段分段扩增结果 |
| 3.3.4 分离株全基因序列分析结果 |
| 3.3.5 A节段核苷酸序列与参考毒株相似性比较分析结果 |
| 3.3.6 B节段核苷酸序列与参考毒株相似性比较分析结果 |
| 3.3.7 基于分离株全基因A节段构建的系统进化树分析结果 |
| 3.3.8 基于分离株全基因B节段构建的系统进化树分析结果 |
| 3.3.9 分离株全基因A节段氨基酸位点突变分析 |
| 3.3.9.1 VP5 蛋白氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.3.9.2 VP2-VP4-VP3 蛋白氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.3.10 分离株全基因B节段氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 传染性法氏囊病病毒新型变异株及新型变异重排毒株的致病性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、试验动物和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒的增殖 |
| 4.2.2 病毒毒价的测定 |
| 4.2.3 IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.2.3.1 引物设计与样品质粒的构建 |
| 4.2.3.2 标准曲线的建立 |
| 4.2.3.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.4 致病性试验分组情况 |
| 4.2.5 血清中IBDV抗体水平的检测 |
| 4.2.6 试验鸡临床症状指数观察 |
| 4.2.7 法氏囊病变 |
| 4.2.7.1 试验鸡法氏囊损伤记录 |
| 4.2.7.2 试验鸡免疫器官比重(法氏囊和脾脏)及囊病变指数的统计 |
| 4.2.8 试验鸡法氏囊和脾脏组织病毒载量检测 |
| 4.2.9 试验鸡法氏囊组织病理学病变指数观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒增殖结果 |
| 4.3.2 病毒毒价的测定结果 |
| 4.3.3 IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立结果 |
| 4.3.3.1 所获得质粒的拷贝数结果 |
| 4.3.3.2 实时荧光定量标准曲线的获得 |
| 4.3.3.3 灵敏度和重复性试验结果 |
| 4.3.4 试验鸡血清中IBDV抗体水平的检测结果 |
| 4.3.5 试验鸡临床症状指数观察结果 |
| 4.3.6 法氏囊眼观病变图 |
| 4.3.7 试验鸡免疫器官比重(法氏囊和脾脏)及囊病变指数的统计结果 |
| 4.3.8 试验鸡法氏囊和脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.8.1 试验鸡法氏囊组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.8.2 试验鸡脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.9 试验鸡法氏囊组织病理学病变指数观察统计结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述:传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗研究进展 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒概述 |
| 1.1.1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1.2 传染性法氏囊病病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学研究进展 |
| 1.2.1 传染性法氏囊病流行病学 |
| 1.2.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学 |
| 1.2.3 分子进化与系统发育重建 |
| 1.3 传染性法氏囊病病毒新型疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3.3 免疫复合物疫苗 |
| 1.3.4 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3.5 核酸疫苗 |
| 1.3.6 反向遗传重组疫苗 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 2012-2015年广西传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床样品的采集与处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2与VP1b基因扩增及序列测定 |
| 2.2.5 vVP2与VP1b基因序列分析 |
| 2.2.6 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.2.7 vVP2与VP1b基因选择压力分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 基因序列分析 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.4 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.3.5 vVP2、VP1b基因选择压力分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国传染性法氏囊病病毒株时空进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株序列信息来源 |
| 3.1.2 数据处理软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集的构建 |
| 3.2.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集系统进化和种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集重组分析及饱和度检测 |
| 3.3.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型检测 |
| 3.3.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集碱基替换速率分析 |
| 3.3.4 传染性法氏囊病病毒系统进化分析 |
| 3.3.5 中国传染性法氏囊病病毒种群动态分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 泛素介导的传染性法氏囊病病毒及传染性法氏囊病病毒-鸡传染性支气管炎病毒二联核酸疫苗的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、疫苗与单克隆抗体 |
| 4.1.2 鸡胚及试验动物 |
| 4.1.3 细胞、菌株、载体及质粒 |
| 4.1.4 主要分子生物学试剂 |
| 4.1.5 主要生化试剂及标准阳性血清 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因的扩增 |
| 4.2.3 Ub-linker-VP2 基因的扩增 |
| 4.2.4 pVAX1-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2-VP1和pVAX1-Ub-linker-N-S1-VP2重组质粒的构建 |
| 4.2.5 重组质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因扩增结果 |
| 4.3.2 Ub-linker-VP2 基因扩增结果 |
| 4.3.3 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.4 重组质粒体外瞬时转染VP2基因的表达 |
| 4.3.5 重组质粒体外瞬时转染N-S1基因的表达 |
| 4.3.6 动物免疫保护试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 传染性法氏囊病病毒B87疫苗株反向遗传学改造及拯救 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、病毒、鸡胚和细胞 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B87疫苗株全基因组扩增 |
| 5.2.2 B87疫苗株全基因组真核表达质粒的构建 |
| 5.2.3 引入分子标签 |
| 5.2.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.2.5 病毒拯救 |
| 5.2.6 鸡胚感染 |
| 5.2.7 拯救病毒RT-PCR及测序鉴定 |
| 5.2.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.2.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B87疫苗株全基因组克隆 |
| 5.3.2 B87疫苗株全基因组感染性克隆 |
| 5.3.3 B87疫苗株全基因组分子标签鉴定 |
| 5.3.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.3.5 B87疫苗株基因组B节段重组病毒的拯救 |
| 5.3.6 拯救病毒感染SPF鸡胚 |
| 5.3.7 拯救病毒RT-PCR鉴定和序列分析 |
| 5.3.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.3.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）稳定表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的细胞系的构建及IBDV疑似受体的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 禽传染性法氏囊病病毒的研究进展 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒受体研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 研究内容一 稳定表达IBDV的VP2蛋白的细胞系的构建 |
| 引言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性法氏囊病病毒受体的分离鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.质谱结果分析与讨论 |
| 研究内容三 IBDV受体特性验证分析与鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 研究内容四 传染性法氏囊病病毒受体HSC70和vimentin受体重建实验 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩词列表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 ND与IBD研究进展 |
| 2 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 2.1 ND与IBD活苗的研究进展 |
| 2.2 ND与IBD灭活苗的研究进展 |
| 2.3 疫苗佐剂 |
| 2.4 ND与IBD的疫苗免疫研究进展及注意事项 |
| 3 ND-IBD二联灭活苗研究进展 |
| 4 疫苗对免疫因子的影响 |
| 5 本课题研究的目的与意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活疫苗免疫1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物的设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 商品蛋鸡血清IBD抗体水平检测 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡ND抗体的影响 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.6 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活疫苗免疫7日龄商品蛋雏鸡的效果比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.2 攻毒保护试验结果 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.4 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IBD研究进展 |
| 1.1 IBD流行病学特点 |
| 1.2 IBD病原学特征 |
| 1.3 IBDV基因组结构与VP2蛋白 |
| 1.4 IBDV毒株 |
| 1.5 IBDV的诊断 |
| 1.6 IBD的防治 |
| 2 ND研究进展 |
| 2.1 ND流行病学特点 |
| 2.2 ND病原学特征 |
| 2.3 ND的诊断 |
| 2.4 ND的防制 |
| 3 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 3.1 IBD疫苗研究进展 |
| 3.2 ND疫苗研究进展 |
| 3.3 疫苗的基本要求 |
| 3.4 免疫失败的原因 |
| 4 疫苗免疫监测方法 |
| 5 PCR-RFLP研究进展 |
| 5.1 PCR-RFLP的基本原理 |
| 5.2 PCR-RFLP技术的应用 |
| 6 本研究目的和意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 免前抗体水平检测 |
| 2.2.1 HA试验(微量法) |
| 2.2.2 HI试验(微量法) |
| 2.2.3 TCVN(固定病毒稀释血清) |
| 2.3 免后抗体水平检测 |
| 2.4 种蛋的收集 |
| 2.5 子代雏鸡抗体水平检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡ND抗体水平的影响 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡IBD抗体水平的影响 |
| 3.3 四批次孵化雏鸡ND抗体水平的分析 |
| 3.4 四批次孵化雏鸡IBD抗体水平的分析 |
| 3.5 攻毒保护结果 |
| 3.6 中和试验中DF-1细胞病变观察 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND和IBD卵黄抗体与子代血清抗体的相关性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 氯仿法提取卵黄抗体 |
| 2.3 HI试验和ELISA试验 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.5 结果的比对 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 种蛋ND卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.2 种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.3 免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代血清ND抗体水平相关性分析 |
| 3.4 免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平相关性分析 |
| 3.5 血清抗体水平与卵黄抗体水平比对结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病毒RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR以及PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物测序 |
| 2.5 琼脂糖凝胶回收目的基因 |
| 2.6 限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 病料检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 BC6-85和B87 VP2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 BC6-85和B87酶切结果 |
| 3.3 特异性试验结果 |
| 3.4 敏感性试验结果 |
| 3.5 重复性试验结果 |
| 3.6 病料PCR-RFLP检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病的概述 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒的生物学特性 |
| 1.3 IBDV的基因组 |
| 1.4 IBDV的编码蛋白 |
| 1.5 IBDV的毒力及致病性研究 |
| 1.6 IBDV VP2蛋白的B细胞表位研究进展 |
| 1.7 IBD的诊断 |
| 1.8 IBD疫苗的研究进展 |
| 1.9 目前存在的问题及本研究的目的意义 |
| 2 9种标签对IBDV VP2蛋白可溶性表达及纯化的影响 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的原核表达与纯化 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 IBDV VP2 蛋白免疫原性的研究 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（8）鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 研究历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 形态特征及其结构 |
| 1.2.3 理化特性 |
| 1.2.4 培养特性 |
| 1.3 IBDV基因组 |
| 1.3.1 IBDV基因组结构及其功能 |
| 1.3.2 IBDV编码蛋白及其生物学功能 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 发病机理 |
| 1.6 临床症状 |
| 1.7 病理变化 |
| 1.8 血清型 |
| 1.9 IBDV研究展望 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 其它 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的分离 |
| 2.2.3 鸡胚接毒试验 |
| 2.2.4 鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定试验 |
| 2.2.5 SPF雏鸡攻毒试验 |
| 2.2.6 RT-PCR扩增 |
| 2.2.7 VP2基因序列克隆和测定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验结果 |
| 3.2 ELD_(50)的测定试验结果 |
| 3.3 SPF雏鸡攻毒试验结果 |
| 3.4 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.5 VP2基因的克隆 |
| 3.5.1 RT-PCR扩增 |
| 3.5.2 纯化的PCR产物电泳鉴定 |
| 3.5.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.6 VP2基因序列测定及其序列分析结果 |
| 3.6.1 VP2基因序列、同源性及进化树分析 |
| 3.6.2 氨基酸序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验 |
| 4.2 流行病学 |
| 4.3 IBDV宿主 |
| 4.4 IBD的预防 |
| 4.5 IBD疫苗 |
| 4.6 VP2基因序列测定与分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）河南HN12株鸡传染性法氏囊病病毒生物学特性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略语英汉对照表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 鸡传染性法氏囊病概述 |
| 2 IBDV的历史简介 |
| 3 IBDV病原学研究进展 |
| 3.1 IBDV的生物学特性 |
| 3.1.1 病毒的分类及形态结构 |
| 3.1.2 病毒的理化性质 |
| 3.1.3 病毒的增殖特性 |
| 3.1.4 病毒的抗原性 |
| 3.2 IBDV的分子生物学特性 |
| 3.2.1 病毒基因组的结构特性 |
| 3.2.2 病毒蛋白结构与作用 |
| 4. IBDV的致病机制及毒力的分子基础 |
| 4.1 IBDV的致病性研究 |
| 4.2 IBDV的毒力变异 |
| 4.3 VP2和毒力间的关系 |
| 5 IBDV的流行病学 |
| 6 IBDV的诊断方法与技术 |
| 6.1 病毒的分离鉴定 |
| 6.2 血清学诊断方法 |
| 6.2.1 琼脂免疫扩散试验 |
| 6.2.2 病毒血清中和试验 |
| 6.2.3 酶联免疫吸附试验 |
| 6.2.4 其他免疫学诊断方法 |
| 6.3 分子生物学诊断技术 |
| 7 IBDV的细胞培养技术 |
| 7.1 动物细胞培养的起源 |
| 7.2 动物细胞培养的方法 |
| 7.2.1 贴壁培养 |
| 7.2.2 悬浮培养 |
| 7.3 IBDV适应增殖的细胞 |
| 引言 |
| 试验一 鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 SPF鸡胚及SPF鸡 |
| 1.1.3 IBDV抗原和标准阳性血清 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料来源 |
| 1.2.2 病料处理 |
| 1.2.3 琼脂免疫扩散试验(AGID) |
| 1.2.4回归易感鸡试验 |
| 1.2.5 病毒在SPF鸡胚上的分离培养 |
| 1.2.6 分离株毒力测定 |
| 1.2.7 引物合成 |
| 1.2.8 RT-PCR扩增鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 琼脂免疫扩散试验(AGID) |
| 2.2 动物回归试验 |
| 2.3 病毒在SPF鸡胚上传代结果 |
| 2.4 IBDV分离株毒力测定 |
| 2.4.1 SPF鸡只发病情况及剖检变化 |
| 2.4.2 SPF鸡只发病率及死亡率 |
| 2.4.3 SPF鸡胚病变 |
| 2.4.4 分离株ELD_(50)的测定 |
| 2.5 PCR检测结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 试验二 分离株细胞驯化培养及特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 耗材 |
| 1.1.3 主要试剂及配制 |
| 1.1.4 细胞与毒株 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DF-I细胞培养 |
| 1.2.2 IBDVHN12株在DF-1细胞上培养条件优化 |
| 1.2.3 IBDV细胞适应毒株毒力测定 |
| 1.2.4 细胞适应毒株的理化特性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IBDV在DF-1细胞上培养条件优化 |
| 2.1.1 细胞生长曲线 |
| 2.1.2 IBDV最佳接毒量的确定 |
| 2.1.3 IBDV接种细胞吸附时间的确定结果 |
| 2.1.4 血清浓度对IBDV增殖的影响 |
| 2.2 细胞适应毒株AGID检测 |
| 2.3 细胞适应毒株毒力 |
| 2.3.1 DF-1细胞病变 |
| 2.3.2 TCIDso测定 |
| 2.4 IBDV细胞适应毒株的理化试验结果 |
| 2.4.1 病毒的凝集试验结果 |
| 2.4.2 有机溶剂试验和耐酸碱性试验 |
| 2.4.3 耐热性试验结果表明 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 试验三 分离株原毒、鸡胚毒和细胞毒VP2的克隆及序列分析 |
| l材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 毒株 |
| 1.1.3 菌株及载体 |
| 1.1.4 主要生物学试剂 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料的处理 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 病毒RNA的提取 |
| 1.2.4 反转录PCR(RT-PCR)扩增 |
| 1.2.5 1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.2.6 PCR产物的回收与纯化 |
| 1.2.7 重组克隆质粒的构建 |
| 1.2.8 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.9 3株不同IBDV适应毒株核苷酸序列测定及序列分析 |
| 1.2.10 各适应毒株系统进化树分析 |
| 1.2.11 各适应毒株2级结构比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.0 IBDV不同适应毒株VP2的RT-PCR扩增结果 |
| 2.1 IBDV不同适应毒株VP2基因片段PCR产物纯化结果 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定及测序鉴定 |
| 2.3 IBDVVP2基因片段的测序及序列分析 |
| 2.3.1 3株IBDVVP2间基因片段及推导的氨基酸比较分析 |
| 2.3.2 各适应毒株同源性比较分析 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.4 3株IBDV适应毒株VP2基因2级结构比较分析 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 试验四 分离株囊毒、胚毒和细胞毒对SPF鸡免疫效果实验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 种蛋及SPF鸡 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒准备 |
| 1.2.2 病毒毒力测定 |
| 1.2.3 不同毒株灭活免疫乳化剂的制备 |
| 1.2.4 安全性检验 |
| 1.2.5 效力检验 |
| 1.2.6 血清AGID滴度检测 |
| 1.2.7 血清中和试验 |
| 1.2.8 免疫保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒毒力测定 |
| 2.1.1 HN12B1毒株ELD_(50)测定 |
| 2.1.2 HN12E4毒株ELD_(50)测定 |
| 2.1.3 HN12C8毒株TCID_(50)测定 |
| 2.2 安全试验 |
| 2.3 血清AGID滴度测定 |
| 2.4 中和试验结果 |
| 2.5 免疫保护试验 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一：VP2推导氨基酸序列对比 |
| 英文摘要 |
（10）传染性法氏囊病基因工程疫苗及两种免疫增强剂的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩略词 |
| 第一章 综述 |
| 1 鸡传染性法氏囊病(IBD)的背景知识 |
| 1.1 法氏囊的简介 |
| 1.2 鸡传染性法氏囊病的简介 |
| 1.3 IBD流行背景及目前在我国流行的动向 |
| 1.4 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) |
| 1.5 目前我国IBD疫苗的临床使用和基础研究情况 |
| 2 免疫增强剂的研究进展 |
| 2.1 免疫增强剂的种类 |
| 2.2 免疫增强剂囊素的研究进展 |
| 2.3 免疫增强剂鸡β干扰素的研究进展 |
| 3 本课题设计背景和思路 |
| 第一章 参考文献 |
| 第二章 IBD基因工程蛋白质疫苗的研制 |
| 第一节 IBDV mVP_2在酵母中的表达 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 IBDV mVP_2在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 参考文献 |
| 第三章 IBDV多表位肽疫苗的研究 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 参考文献 |
| 第四章 基因工程免疫增强剂-杂合肽囊素的研究 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 参考文献 |
| 第五章 基因工程免疫增强剂-鸡β干扰素的研究 |
| 第一节 重组酵母鸡β干扰素的研究 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 重组大肠杆菌鸡β干扰素的研究 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 参考文献 |
| 本研究创新点 |
| 全文总结 |
| 附录一 酵母培养基的组成及相关储存液的配制 |
| 附录二 攻读博士学位期间完成的论文及成果 |
| 致谢 |
四、鸡传染性法氏囊病疫苗毒株的生物学特性研究（论文参考文献）
- [1]传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析[D]. 秦颖. 扬州大学, 2021(02)
- [2]广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究[D]. 黄宇. 广西大学, 2021(12)
- [3]传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究[D]. 陈果. 广西大学, 2019(02)
- [4]稳定表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的细胞系的构建及IBDV疑似受体的分离鉴定[D]. 陈春波. 扬州大学, 2017(01)
- [5]ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究[D]. 星东. 福建农林大学, 2017(01)
- [6]ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究[D]. 赖隆永. 福建农林大学, 2017(01)
- [7]鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的可溶性表达及其免疫特性的研究[D]. 蒋大伟. 河南农业大学, 2016(06)
- [8]鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定[D]. 李松. 福建农林大学, 2015(01)
- [9]河南HN12株鸡传染性法氏囊病病毒生物学特性研究[D]. 常婧竹. 河南农业大学, 2014(03)
- [10]传染性法氏囊病基因工程疫苗及两种免疫增强剂的研究[D]. 蔡梅红. 南京大学, 2011(06)