一、绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究（论文文献综述）
褚博[1]（2021）在《转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存》文中认为胚胎体外生产和冷冻保存技术在家畜种质资源保存方面有重要应用价值。近年来,随着动物转基因技术研究的不断推进,各种转基因动物育种新材料不断出现,部分转基因动物已经进入安全性评价阶段,转基因动物新品种培育在家畜种业创新领域具有重要应用价值。目前,所有转基因动物育种材料均在封闭性条件下饲养管理,建立一套转基因动物种质材料保存和利用方法,对促进转基因育种研究有重要意义。口蹄疫病毒的抗原表位大部分集中在VP1上,作为主要的免疫原性蛋白激发Th、B细胞产生免疫应答。本实验室课题组前期制备了转口蹄疫VP1基因奶山羊,本研究通过对转基因奶山羊后代羊进行PCR鉴定,筛选出转基因阳性后代,并验证外源基因在转基因公羊精液中的整合情况。利用转基因公羊精液进行体外受精,获得转基因胚胎,同时采用Cryotop玻璃化冷冻技术,通过对早期囊胚冷冻、解冻复苏的效率和继续培养发育后囊胚扩张率来筛选出玻璃化冷冻保护剂组分并进行优化,并对冷冻复苏后的胚胎质量进行检测,对比其与正常胚胎的囊胚总细胞数、滋养层细胞数（TE）、内细胞团数（ICM）和细胞凋亡情况,确定了适合转基因山羊精液体外受精和胚胎冷冻保存条件,用于转基因山羊胚胎资源的保存和利用。获得如下结果:1.对14只转基因奶山羊后代进行颈静脉采血提取山羊血液基因组进行PCR鉴定,其中8只奶山羊确定为转口蹄疫VP1基因奶山羊（OFMDV-VP1）,4只母羊,4只公羊,同时提取4只公羊精液基因组进行鉴定,精液中也整合有外源基因。2.通过电刺激采精法采集转基因公羊精液,利用Percoll法处理精液进行体外受精,获得体外胚胎,并进行PCR鉴定,确定转基因胚胎,继续培养,用于后续试验进行冷冻保存和胚胎移植。3.确定了采用Cryotop法以40%EG+0.5mol/L L?proline作为冷冻保护剂,可用于转基因山羊胚胎的冷冻保存,冷冻解冻后复苏率89.9%,囊胚扩张率74.5%。对比正常胚胎与冷冻解冻复苏胚胎的囊胚细胞总数、TE、ICM和凋亡细胞数,均差异不显着（P>0.05）。用冷冻后复苏的胚胎进行胚胎移植,母羊妊娠率为50%,可用于临床应用,为转基因羊胚胎资源的冷冻保存及生产应用提供帮助。
李昊[2]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究说明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
史振丹[3]（2016）在《CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究》文中研究指明卵母细胞冷冻在体外胚胎生产技术的研究中尤为突显。但在其冷冻过程中,易受到一系列的损伤。随着分子生物技术的快速发展,研究人员对卵母细胞冷冻损伤的研究逐步转向对其分子机制的探讨,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵结合和融合异常。CD9是目前鉴定的唯一精卵融合必须的卵子蛋白,并且有相关报道CD81也参与精卵融合。胞间CD81和CD9互作时形成一个复合体,该复合体很可能在精卵互作时起作用。然而,它们在膜融合中的作用仍不清楚。本研究首次采用免疫荧光染色技术检测了不同发育期绵羊卵母细胞冻融前后细胞骨架的变化,CD81在绵羊卵巢组织、睾丸和附睾组织、卵母细胞及精子上的分布；采用实时荧光定量PCR技术,检测了CD81在不同发育期冻融前后的绵羊卵母细胞中：mRNA水平的表达量,并比较分析了不同发育阶段CD81基因mRNA水平的表达差异；利用IVF技术,检测了抗CD81抗体对绵羊精卵结合的影响,及冻融GV期和M Ⅱ期卵母细胞对IVF的影响。本研究得到如下几点结果：1.冷冻对卵母细胞器及细胞骨架的影响结果表明,冷冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞的形态正常率显着低于冷冻前,微丝、微管及核受到不同程度的损伤。说明冷冻保存损伤其结构和细胞骨架,可能影响卵母细胞的后期发育；2.CD81在绵羊卵巢组织、卵母细胞、睾丸和附睾组织及精子上的表达检测结果显示：（1）CD81表达于初级、次级和三级卵泡的卵泡细胞上,并且在卵泡发育成熟时,其在卵丘细胞、颗粒细胞、基膜、内膜细胞和外膜细胞上均表达；（2）CD81在成熟前后卵母细胞上均有表达,但GV期卵母细胞上CD81主要在卵母细胞膜上表达,而MⅡ期卵母细胞上CD81的表达主要在卵母细胞膜和透明带上,并且在透明带上的表达较GV期明显；（3）CD81在绵羊睾丸曲细精管上皮细胞上表达,靠近管腔基部信号更强。附睾头、体假复层纤毛柱状上皮细胞中高柱状纤毛上皮细胞和游离缘的纤毛中均检测到CD81阳性信号。附睾体、尾管腔中检测到CD81阳性信号,且附睾尾管腔内CD81阳性信号明显。CD81于附睾头、体、尾部的基细胞层表达,且在附睾体、尾的基细胞层强表达；（4）CD81强表达于精子的顶体部,其余部位均未检测到CD81蛋白荧光信号；3.CD81在不同发育阶段冷冻的卵母细胞中mRNA表达规律结果显示：新鲜MⅡ期卵母细胞中CD81 mRNA表达量显着高于冷冻MⅡ、新鲜GV和冷冻GV（P<0.01）,冷冻M Ⅱ显着高于新鲜GV和冷冻GV（P<0.01）,新鲜GV与冷冻GV差异不显着（P>0.05）;4.抗CD81抗体和超低温冷冻对精卵结合和融合的影响。卵母细胞与CD81单克隆抗体共孵育处理后的试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（4.2±0.8,30%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。冻融后GV期卵母细胞对IVF的影响结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（5.8±0.8,45%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。冻融后M Ⅱ期卵母细胞经IVF后试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（7.0±1.0,62%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。并且,冻融后M Ⅱ期和GV期卵母细胞经IVF后每卵黏附精子数和精子穿透率差异显着（P<0.01）。
乌丽雅苏[4]（2016）在《绵羊卵母细胞CD9对其冻融后发育能力的影响》文中认为哺乳动物卵母细胞冷冻保存对生物学和人类医学的研究与发展具有十分重要的价值,可为哺乳动物种质资源长期保存、人类辅助受精技术等生物技术的所需试验提供有效技术手段。但是,卵母细胞解冻后难以与精子结合、融合受精,其主要原因可能是卵母细胞在超低温冷冻保存过程中膜蛋白等结构发生不可逆变化,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵不能粘附在一起或精子不能穿透卵母细胞的质膜。CD9属于四跨膜蛋白超家族成员之一,在多种组织、细胞上广泛表达,参与精卵结合和融合等重要生命活动。本研究以绵羊为模型动物,采用免疫荧光染色法、实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法对冷冻前后GV期和MⅡ期卵母细胞CD9的分布进行定量定位分析；通过体外受精技术,探讨卵母细胞冷冻前后CD9表达量对精卵结合和融合能力的影响。本试验的主要研究结果如下：1 本研究收集和培养成熟的GV期和M Ⅱ期卵母细胞分别随机分为新鲜组和冷冻组。采用EG、DMSO和PROH联合冷冻保护剂的冷冻液进行冷冻不同发育期卵母细胞,探讨冷冻对卵母细胞发育能力的影响。结果显示,经过冷冻解冻后GV期卵母细胞成熟率（31%）显着低于新鲜组的（75%）（P<0.05）。细胞形态观察结果表明,冷冻解冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为55%和70%,新鲜GV期和M Ⅱ期卵母细胞形态正常率分别为92%和90%,两组之间差异显着（P<0.05）。2 采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在绵羊卵巢组织上的定位表达发现,CD9在卵泡壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和细胞膜上均有表达。并且原始卵泡时期即可检测到CD9荧光信号,随着卵泡的发育成熟,荧光信号逐渐增强,到达成熟卵泡时荧光信号达到最强。3 用实时荧光定量PCR检测CD9 mRNA表达水平。结果显示,新鲜MⅡ期卵母胞中CD9 mRNA的表达显着增高（P<0.05）,其次为冷冻M Ⅱ期卵母细胞中的表达量（P<0.05）,冷冻GV期卵母细胞CD9 mRNA的表达量最少（P<0.05）。免疫印迹法检测CD9蛋白水平上的表达量趋势和在冷冻解冻过程中GV期和M Ⅱ期卵母细胞CD9荧光显示趋势都与mRNA水平上的表达量趋势一致,即新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9表达量最多,其次为冷冻MⅡ期卵母细胞中的表达,冷冻GV期卵母细胞上表达量最少。4 经体外受精试验检测CD9在每卵粘附精子数及精子穿透率中的影响。结果显示为冷冻GV期经IVM-IVF后粘附数和穿透率分别为2.9±0.6,34%；M Ⅱ期卵母细胞经冷冻解冻-IVF的数据为3.5±0.1,41%。以上两组实验结果都显着低于对照组的粘附数和精子穿透率（6.0±0.5,78%）（P,<0.05）。
马媛,权国波,洪琼花[5]（2015）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中研究指明近年来,绵羊、山羊胚胎工程技术的快速发展致使对卵母细胞的需求量越来越大。此外,作为家畜种质资源保护体系的组成部分,卵母细胞也是保存优秀雌性家畜遗传资源的重要方式之一。然而,作为胚胎生物技术的重要环节,由于其自身特殊的结构功能特点,卵母细胞对低温和冷冻极其敏感,其冷冻保存研究水平远低于胚胎。因此,如何提高冷冻保存卵母细胞质量是低温生物学和胚胎生物技术研究领域的热点和难点。针对目前绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存的最新研究进展和存在问题进行综述,同时针对如何进一步提高绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存质量提出建议,以期为之后的研究工作提供理论指导。
宁方勇[6]（2013）在《转蜘蛛Spidroin1基因绵羊早期克隆胚的研究》文中进行了进一步梳理蜘蛛丝无与伦比的生物学特性决定了其在应用领域具有广阔的应用前景。以生物学方法获取具有蜘蛛丝特性的活性蛋白,亦或是通过转基因的方法直接获得类似蜘蛛丝的动物纤维,一直以来是许多科学研究者的奋斗目标。本研究利用蜘蛛拖丝蛋白基因四聚体4S、pcDNA3.1和pIRES2-EGFP载体,在构建pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S表达载体的基础上,以脂质体转染法将蜘蛛拖丝蛋白（Spidroin1）基因转染细胞并获得转基因阳性细胞株；以转基因阳性细胞为核供体,采用体细胞核移植的方法获得转蜘蛛Spidroinl基因绵羊克隆胚；采用PCR方法检测转基因克隆胚的蜘蛛拖丝蛋白（Spidroinl）基因整合状况。本研究的结果如下：1. pcDNA3.1-4S及pIRES2-EGFP-4S表达载体的构建利用pcDNA3.1载体和蜘蛛拖丝蛋白基因四聚体4S构建了pcDNA3.1-4S表达载体,BgtlⅡ, BamHI双酶切及PCR鉴定显示,蜘蛛拖丝蛋白基因4S已连接到pcDNA3.1-4S中；利用pIRES2-EGFP载体和蜘蛛拖丝蛋白基因4S构建了pIRES2-EGFP-4S, XhoⅠ、BglⅡ双酶切及PCR鉴定显示,蜘蛛拖丝蛋白基因4S连接到pIRES2-EGFP中。2.转蜘蛛Spidroin1基因绵羊成纤维细胞系的建立将0.44g/mL经线性化的pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S,通过脂质体法分别转染利用常规方法经原代和传代培养的绵羊成纤维细胞,用含有抗生素和含400μg/mL G418的培养基进行筛选,获得转pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞；对获得的转基因阳性细胞进行形态学观察、生长曲线、倍增时间等生物学特性检测结果,符合正常成纤维细胞的特性。3.绵羊卵母细胞获取方法的筛选通过比较抽吸、切割、抽吸结合切割的方法对绵羊的获卵效果,其结果,与抽吸和切割法相比,划线法辅助的切割法,能够获得最多的A、B级卵母细胞（约8个/每个卵巢）。4.绵羊卵母细胞体外成熟将A、B级卵母细胞以TCM199-HCO3+2.2g/mL NaHCO3+5μg/mL FSH+1IU/mL LH+1μg/mL雌二醇+50μg/mL庆大霉素+10%FBS+0.38mmol/L丙酮酸钠+10mmol/L Hepes为培养液,对绵羊卵母细胞进行体外成熟培养,可以获得83.4%的最高成熟率。表明该成熟液适合用于绵羊卵母细胞的体外成熟。5.成熟卵母细胞孤雌激活体外成熟绵羊卵母细胞用5μmol IA23187激活5min后,再用2mmol/L的6-DMAP培养4h,能够获得最高91.5%的激活率,激活后的孤雌胚经培养后84.7%胚胎发育至桑椹胚。本研究结果显示,IA23187联合6-DMAP的激活方法可用于绵羊体外成熟卵母细胞的孤雌激活。6.转基因阳性细胞的体细胞核移植利用上述研究中建立的体细胞核移植程序,分别以绵羊成纤维细胞和转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞进行体细胞核移植,其结果,正常绵羊体细胞融合率（72.7%）,与其相比,转基因细胞的融合率（70.7%）,两者差异不显着,表明外源基因的转入对早期核移植重构胚的发育能力没有显着影响。7.转蜘蛛拖丝蛋白基因阳性细胞的体细胞重构胚的发育能力将采用体细胞核移植方法获得的转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚进行体外培养,其结果与正常的绵羊成纤维细胞通过体外发育桑椹胚的比率（13.8%）相比,转基因阳性细胞的体细胞的核移植的体外发育至桑椹胚的比率（11.6%）,两者之间的差异不显着；将获得的转蜘蛛拖丝蛋白基因融合重构胚直接移入未妊娠的受体绵羊输卵管中,观察到受体妊娠,但未能获得转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊后代。综上所述,本研究利用所构建的蜘蛛拖丝蛋白基因表达载体pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S,获得转基因阳性细胞；利用转基因阳性细胞,采用体细胞核移植方法建立了获取转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚的方法；获得的重构胚具有体外发育至桑椹胚的能力。本研究为进一步开展被毛中表达蜘蛛拖丝蛋白的转基因绵羊相关研究奠定了坚实的基础。
任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜[7]（2012）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中指出哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅对于濒危物种的保存具有重要意义,而且可以对胚胎生物技术的发展、生物资源保护与利用以及人类辅助受精技术的研究等具有重要意义,同时为基础研究提供大量可利用的材料。卵母细胞玻璃化冷冻保存的应用前景非常广阔,利用卵母细胞玻璃化冷冻保存技术建立"卵子库"不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题,还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制,并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质
任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜[8]（2012）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中进行了进一步梳理哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅对于濒危物种的保存具有重要意义,而且可以对胚胎生物技术的发展、生物资源保护与利用以及人类辅助受精技术的研究等具有重要意义,同时为基础研究提供大量可利用的材料。卵母细胞玻璃化冷冻保存的应用前景非常广阔,利用卵母细胞玻璃化冷冻保存技术建立"卵子库"不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题,还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制,并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质
王静,林嘉鹏,石庆华,陈博,汪立芹,赵云程,黄俊成[9]（2011）在《玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响》文中指出为详细了解玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响,分别玻璃化冷冻GV期和IVM期（18、24h）绵羊卵母细胞,解冻后进行体外培养。GV期和IVM期卵母细胞经过冷冻-解冻后,卵裂率（10.37%、23.17%、33.07%）均极显着低于对照组（82.96%,P<0.01）,且冷冻-解冻后的GV期卵母细胞卵裂率极显着低于冷冻-解冻后的IVM期卵母细胞（P<0.01）。本试验利用荧光实时定量PCR技术检测4种母源基因:Gdf9（生长分化因子-9）、Zar1（合子阻泄因子）、Mater（胚胎必要的母体抗原）、Dnmt1（DNA甲基化转移酶1）在不同处理后的绵羊卵母细胞中的mRNA含量。结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于IVM期的卵母细胞（P<0.01）;经玻璃化冷冻处理后,4个基因的mRNA表达量升高,其中GV期含量最高（P<0.01）。结果提示,绵羊GV或IVM期卵母细胞玻璃化冷冻导致母源基因mRNA表达量升高,可能会对胚胎发育产生负面影响。
莫显红[10]（2011）在《影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究》文中研究说明卵母细胞玻璃化冷冻保存对于珍稀和濒危种质资源保存、“卵子库”的建立、胚胎生物技术的发展具有重要意义。本实验以绵羊卵母细胞为研究模型,通过比较卵母细胞不同发育阶段、卵丘细胞有无及冷冻前用紫杉醇及细胞松弛素B预处理对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响,并对解冻后卵母细胞进行体外受精、孤雌激活,结果表明:（1）体外成熟24h绵羊卵母细胞（MⅡstage）与未成熟卵母细胞（GV stage）相比,玻璃化冷冻-解冻后FAD染色存活率为（70.63% vs. 58.51%）;体外受精卵裂率（38.42%vs.22.68%）,囊胚率（5.89%vs.0）具有显着性差异（P<0.05）。表明:成熟的绵羊卵母细胞更适宜冷冻保存。（2）卵丘细胞的有无对玻璃化冷冻MⅡ期卵母细胞解冻后存活率、卵裂率、囊胚率均无显着性差异（P>0.05）。（3）采用浓度为0.5μmol/L紫杉醇预处理绵羊卵母细胞冷冻保存效果最佳,解冻后卵母细胞的存活率（82.38%）与其他三个实验组相比有显着差异性（P<0.05）;体外受精卵裂率（51.17%）和桑囊胚率（20.30%）亦显着高于其他实验组（P<0.05）,但低于对照组（69.42%,34.77%）（P<0.05）;0.5μmol/L紫杉醇处理组孤雌激活卵裂率（53.61%）和桑囊胚率（22.64%）,显着高于其他实验组,但于对照组（73.40%,33.79）（P<0.05）。（4）7.5μg/mL的细胞松弛素B预处理绵羊卵母细胞冷冻-解冻后的存活率（64.50% vs.68.87%）无显着性差异,体外受精卵裂率及桑囊胚率和孤雌激活卵裂率及桑囊胚率两组之间亦无显着性差异（P>0.05）,但均显着低于对照组（P<0.05）。综上所述,与GV期绵羊卵母细胞相比,MⅡ期卵母细胞更适宜冷冻保存; 0.5μmol/L紫杉醇有利于提高绵羊体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存效果。
二、绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究（论文提纲范文）
（1）转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 体外胚胎生产及胚胎玻璃化冷冻研究进展 |
| 1.1 体外胚胎生产研究进展 |
| 1.2 玻璃化冷冻研究进展 |
| 1.2.1 玻璃化冷冻的原理 |
| 1.2.2 胚胎冷冻的历史 |
| 1.2.3 玻璃化冷冻的方法 |
| 1.2.4 冷冻保护剂 |
| 1.2.5 胚胎冷冻的意义与展望 |
| 1.3 本论文研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 转基因山羊的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 山羊血液基因组提取 |
| 2.2.2 山羊精液基因组提取 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 PCR反应体系 |
| 2.2.5 PCR反应程序 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶回收测序鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转基因奶山羊血液基因组PCR鉴定 |
| 2.3.2 转基因奶山羊精液基因组PCR鉴定 |
| 2.3.3 测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转基因羊体外胚胎生产及冷冻保存 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物、组织和细胞 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 山羊卵母细胞采集和体外成熟 |
| 3.2.2 山羊精液采集 |
| 3.2.3 山羊卵母细胞体外受精和体外培养 |
| 3.2.4 胚胎冷冻液筛选 |
| 3.2.5 胚胎冷冻液优化 |
| 3.2.6 囊胚质量评级 |
| 3.2.7 胚胎冷冻与解冻 |
| 3.2.8 冷冻解冻后囊胚免疫荧光染色 |
| 3.2.9 冷冻解冻后囊胚凋亡检测 |
| 3.2.10 体外胚胎鉴定 |
| 3.2.11 同期发情 |
| 3.2.12 胚胎移植 |
| 3.2.13 数据统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胚胎冷冻液筛选结果 |
| 3.3.2 胚胎冷冻液优化结果 |
| 3.3.3 冷冻对囊胚细胞数的影响 |
| 3.3.4 冷冻对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 转基因胚胎体外生产效率 |
| 3.3.6 体外胚胎PCR鉴定 |
| 3.3.7 胚胎移植妊娠结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 四次跨膜蛋白 |
| 1.2 CD81的分子结构 |
| 1.3 CD81参与细胞融合 |
| 1.4 CD81在免疫系统中的作用 |
| 1.4.1 CD81在CD19转运到细胞表面的过程中有重要作用 |
| 1.4.2 CD81在B细胞信号传导过程中的作用 |
| 1.4.3 CD81在抗原呈递中的作用 |
| 1.4.4 CD81在T细胞中的作用 |
| 1.4.5 CD81存在于B与T细胞免疫突触(IS)的中央区域 |
| 1.5 CD81与人类疾病 |
| 1.5.1 CD81与肿瘤侵袭和转移 |
| 1.5.2 CD81与生物标记 |
| 1.5.3 CD81与病毒感染 |
| 1.6 卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究 |
| 1.6.1 卵母细胞玻璃化冷冻保存方法 |
| 1.6.2 卵母细胞冷冻保护剂 |
| 1.6.3 卵母细胞细胞骨架稳定剂 |
| 1.6.4 卵母细胞在冷冻过程中的损伤 |
| 1.6.5 冷冻对卵母细胞结构和发育潜力的影响 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.8 试验研究内容 |
| 1.9 本研究的技术路线 |
| 2 实验一 绵羊卵母细胞玻璃化冷冻对其细胞骨架的影响 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 卵巢来源 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 2.2.2 绵羊卵母细胞的成熟鉴定 |
| 2.2.3 卵母细胞的玻璃化冻融 |
| 2.2.4 微丝微管核染色 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 冻融后卵母细胞微丝的细胞学观察 |
| 2.3.2 冻融后卵母细胞微管的细胞学观察 |
| 2.3.3 冻融后卵母细胞染色体的细胞学观察 |
| 2.3.4 不同发育时期绵羊卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 CD81在绵羊卵巢组织和卵母细胞上的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验仪器 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 GV期和MⅡ期卵母细胞的获取 |
| 3.2.2 免疫组织化学法检测CD81在绵羊卵巢中的表达 |
| 3.2.3 免疫细胞化学法检测CD81在卵母细胞上的表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CD81在绵羊卵母细胞上的分布 |
| 3.3.2 CD81在绵羊卵巢组织上的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三 CD81mRNA在冷冻前后不同发育阶段卵母细胞中的表达规律 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实时荧光定量PCR法检测冻融前后GV期和MⅡ期绵羊卵母细胞中CD81mRNA表达水平 |
| 4.2.2 统计学处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CD81基因和GAPDH基因普通PCR扩增 |
| 4.3.2 实时荧光定量PCR结果 |
| 4.3.3 CD81基因的时空特异表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四 CD81在绵羊睾丸、附睾及精子中的表达检测 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 CD81在绵羊睾丸上的分布 |
| 5.3.2 CD81在绵羊精子上的分布 |
| 5.3.3 CD81在绵羊附睾上的分布 |
| 5.4 讨论 |
| 6 实验五 CD81的表达和超低温冷冻对IVF的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 绵羊卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 绵羊卵母细胞体外成熟 |
| 6.2.3 绵羊卵母细胞的成熟鉴定 |
| 6.2.4 绵羊体外受精 |
| 6.2.5 检测精子黏附每卵数 |
| 6.2.6 检测穿透每卵的精子穿透率 |
| 6.2.7 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 CD81单克隆抗体对MⅡ期卵母细胞IVF的影响 |
| 6.3.2 冻融后GV期卵母细胞对IVF的影响 |
| 6.3.3 冻融后MⅡ期卵母细胞对IVF的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）绵羊卵母细胞CD9对其冻融后发育能力的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 四跨膜蛋白超家族 |
| 1.2 四跨膜蛋白CD9结构及分布 |
| 1.3 四跨膜蛋白CD9与受精关系 |
| 1.4 四跨膜蛋白家族与Izumo |
| 1.5 绵羊卵母细胞超低温冷冻保存研究 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 1.7 试验主要内容与技术路线 |
| 2 超低温冷冻对绵羊体外成熟卵母细胞的形态学和成熟影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 组织样品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM) |
| 2.2.3 卵母细胞成熟鉴定 |
| 2.2.4 卵母细胞的冷冻保存 |
| 2.2.5 卵母细胞的解冻2.1.2主要仪器设备 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.5 讨论 |
| 3 CD9在绵羊卵巢组织中的定位表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 组织样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 冷冻对卵母细胞CD9的影响 |
| 4.1 试剂材料 |
| 4.1.1 细胞收集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 卵母细胞总RNA的提取 |
| 4.2.2 总RNA反转录合成cDNA |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR |
| 4.2.4 卵母细胞CD9免疫荧光染色 |
| 4.2.5 提取卵母细胞CD9蛋白 |
| 4.2.6 卵母细胞CD9蛋白Western blot检测 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 总RNA质检及Q-PCR检测 |
| 4.4.2 实时荧光定量PCR结果 |
| 4.4.3 免疫印迹结果 |
| 4.4.4 CD9蛋白免疫荧光染色结果 |
| 4.5 讨论 |
| 5 冷冻对精卵结合的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 组织样品 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要设备 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 卵母细胞的采集及成熟 |
| 5.2.2 体外受精 |
| 5.2.3 检测粘附率 |
| 5.2.4 检测穿透率 |
| 5.3 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.5 讨论 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）羊卵母细胞冷冻保存研究进展（论文提纲范文）
| 1 卵母细胞冷冻损伤机制研究现状 |
| 2 羊卵母细胞冷冻保存技术研究现状 |
| 2.1 冷冻保存方法的筛选 |
| 2.2 抗冻保护剂的选择 |
| 3 羊卵母细胞冷冻保存中存在的问题 |
| 3.1 卵巢来源复杂、质量参差不齐 |
| 3.2 卵母细胞自身结构功能有其特殊性 |
| 3.3 卵母细胞质量评价体系不完善 |
| 3.4 玻璃化操作水平尚未实现标准化 |
| 4 展 望 |
（6）转蜘蛛Spidroin1基因绵羊早期克隆胚的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 蜘蛛丝 |
| 1.1.1 蜘蛛丝的构造及特性 |
| 1.1.2 蜘蛛丝的相关研究 |
| 1.1.3 蜘蛛丝蛋白基因及相关研究 |
| 1.2 逆转录病毒载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒概述 |
| 1.2.2 逆转录病毒载体的研究进展 |
| 1.2.3 逆转录病毒载体的应用前景 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.3.1 细胞培养概述 |
| 1.3.2 细胞系的建立 |
| 1.3.3 细胞培养的条件 |
| 1.3.4 细胞培养的应用与意义 |
| 1.4 哺乳类动物的细胞核移植 |
| 1.4.1 转基因克隆动物 |
| 1.4.2 绵羊的同期发情与胚胎移植 |
| 1.4.3 影响哺乳类动物核移植效率的因素 |
| 1.4.4 哺乳动物的核移植研究概况 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 转基因绵羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验试剂的配制 |
| 2.1.4 载体信息 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pcDNA3.1-丝蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 pIRES2-EGFP丝蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 2.2.4 G418筛选浓度及DNA转染浓度的确定 |
| 2.2.5 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 2.2.6 转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞系的鉴定 |
| 2.2.7 转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞的冷冻保存 |
| 2.2.8 冷冻转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞的复苏与检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 蜘蛛拖丝蛋白基因4S与pcDNA3.1表达载体的连接与鉴定 |
| 2.3.2 pIRES2-EGFP-4S真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养及形态 |
| 2.3.4 最适G418筛选及DNA转染浓度 |
| 2.3.5 经G418筛选后的转基因细胞形态学观察 |
| 2.3.6 转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞的生物学检测及PCR鉴定 |
| 2.3.7 转蜘蛛拖丝蛋白基因细胞冷冻复苏后的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 转蜘蛛Spidroin1基因绵羊克隆胚核移植 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 3.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 3.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 3.2.4 转蜘蛛拖丝蛋白基因供核细胞的准备 |
| 3.2.5 成熟卵母细胞的去核、注核 |
| 3.2.6 转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚的融合-激活及体外培养 |
| 3.2.7 转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚的PCR鉴定 |
| 3.2.8 转蜘蛛拖丝蛋白基因核移植重构胚的移植 |
| 3.2.9 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 3.3.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 3.3.3 成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 3.3.4 成熟卵母细胞的去核、注核 |
| 3.3.5 转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚的融合-激活及其体外培养 |
| 3.3.6 转蜘蛛拖丝蛋白基因重构胚的PCR鉴定 |
| 3.3.7 受体母羊的同期发情与胚胎移植 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 不同因素对绵羊卵母细胞采集的影响 |
| 3.4.2 不同因素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4.3 成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 3.4.4 重构胚的融合-激活、体外培养及移植 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）羊卵母细胞冷冻保存研究进展（论文提纲范文）
| 1 羊卵母细胞冷冻保存 |
| 1.1 慢速冷冻法 |
| 1.2 玻璃化冷冻法 |
| 2 冷冻损伤 |
| 3 小结 |
（9）玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵母细胞收集和成熟 |
| 1.2 玻璃化冷冻和复苏 |
| 1.3 卵母细胞的孤雌激活 |
| 1.4 胚胎的体外培养 |
| 1.5 卵母细胞总RNA提取与RT-PCR |
| 1.6 标准曲线的制作 |
| 1.7 Quantitative RT-PCR检测 |
| 1.8 数据统计与分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 玻璃化冷冻对卵母细胞母源基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.2 不同成熟时间的绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果 |
| 3 讨 论 |
| 3.1 玻璃化冷冻对不同发育阶段卵母细胞母源基因mRNA表达量的影响 |
| 3.2 玻璃化冷冻对不同体外成熟 (IVM) 时间的卵母细胞母源基因mRNA表达量的影响 |
| 4 结 论 |
（10）影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 卵母细胞冷冻保存的意义 |
| 1.2 卵母细胞冷冻保存的原理 |
| 1.3 卵母细胞冷冻保存的研究进展 |
| 1.3.1 玻璃化冷冻保存的方法 |
| 1.3.2 冷冻保存对卵母细胞所造成的损伤 |
| 1.3.3 提高卵母细胞冷冻保存效果的措施 |
| 1.4 卵母细胞自身的特性 |
| 1.4.1 卵母细胞的不同发育阶段 |
| 1.4.2 卵母细胞周围的卵丘细胞 |
| 1.5 细胞骨架稳定剂 |
| 1.5.1 紫杉醇(Taxol) |
| 1.5.2 细胞松弛素 B(CytochalasinB) |
| 1.6 本研究的主要目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作液及配制 |
| 2.1.4 卵巢来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 绵羊卵巢的采集与运输 |
| 2.2.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.2.3 卵母细胞成熟情况评定 |
| 2.2.4 卵母细胞冷冻 |
| 2.2.5 卵母细胞解冻 |
| 2.2.6 绵羊卵母细胞体外受精 |
| 2.2.7 绵羊卵母细胞孤雌激活 |
| 2.2.8 早期胚胎体外培养 |
| 2.2.9 卵母细胞存活率的检测 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.3.1 不同发育阶段绵羊卵母细胞冷冻·解冻后体外受精及其胚胎发育效果 |
| 2.3.2 卵丘细胞的有无对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.3.3 紫杉醇预处理对绵羊体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.3.4 细胞松弛素B 处理对玻璃化冷冻绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.4 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同发育阶段(GV,MⅡ)卵母细胞冷冻-解冻后体外受精胚胎发育效果 |
| 3.2 卵丘细胞有无对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 3.3 紫杉醇预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 3.3.1 不同浓度紫杉醇对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻存活率的影响 |
| 3.3.2 紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊MⅡ期卵母细胞体外受精效果的影响 |
| 3.3.3 紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊MⅡ期卵母细胞孤雌发育效果的影响 |
| 3.4 CB 预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 3.4.1 CB 预处理对玻璃化冷冻后绵羊MⅡ期卵母细胞体外受精发育效果的影响 |
| 3.4.2 CB 预处理对玻璃化冷冻后绵羊MⅡ期卵母细胞孤雌发育效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵母细胞发育阶段（GV，MⅡ）对玻璃化冷冻效果的影响 |
| 4.2 卵丘细胞有无对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 4.3 紫杉醇预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 4.4 CB 预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究（论文参考文献）
- [1]转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存[D]. 褚博. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [3]CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究[D]. 史振丹. 内蒙古农业大学, 2016(02)
- [4]绵羊卵母细胞CD9对其冻融后发育能力的影响[D]. 乌丽雅苏. 内蒙古农业大学, 2016(02)
- [5]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 马媛,权国波,洪琼花. 家畜生态学报, 2015(01)
- [6]转蜘蛛Spidroin1基因绵羊早期克隆胚的研究[D]. 宁方勇. 东北林业大学, 2013(02)
- [7]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[A]. 任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜. 中国畜牧兽医学会养羊学分会2012年全国养羊生产与学术研讨会议论文集, 2012
- [8]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜. 中国草食动物科学, 2012(S1)
- [9]玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响[J]. 王静,林嘉鹏,石庆华,陈博,汪立芹,赵云程,黄俊成. 畜牧兽医学报, 2011(09)
- [10]影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究[D]. 莫显红. 河北农业大学, 2011(07)