一、烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析（论文文献综述）
刘珊珊[1]（2021）在《黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究》文中提出植物病毒病是第二大类植物病害,对世界范围内绝大部分作物均造成不同程度的危害。植物病毒病的防治是研究热点及难点,应用弱毒疫苗的交叉保护策略是预防植物病毒病比较有效的方法。但疫苗存在寄主范围窄、靶标病毒谱窄、疫苗遗传稳定性差等限制因素。其中疫苗稳定性差与突变修复有关,突变修复可以通过RNA重组等机制实现,但对修复机制的触发因素的研究不深入。黄瓜花叶病毒（CMV）是目前已知的寄主最多、分布最广、最具经济危害的植物病毒之一,以CMV作为基础病毒载体的弱毒疫苗,具有潜在的广寄主特性;CMV基因组含有3条正义单链RNA（RNA1、RNA2和RNA3）,共编码5个蛋白（1a、2a、2b、MP、CP）,多节段基因组为致弱突变的位点选择、外源片段插入提供了多种选择,具备研制多联弱毒疫苗的良好潜力。本研究旨在构建基于CMV的弱毒疫苗的基础载体,并结合疫苗载体研制中的突变修复现象,解析突变修复的触发因素和发生时机,为弱毒疫苗的研制与应用提供数据支持。主要结果如下:以CMV RNA2中的基因沉默抑制因子2b蛋白为突变对象,构建得到2种类型的2b翻译提前终止突变体R2-2bPTI和R2-2bPTⅡ。接种实验发现R2-2bPTⅠ仍为强毒,而R2-2bPTⅡ为弱毒突变体。以R2-2bPTⅡ为基础载体构建外源片段插入型突变体R2-2bPTⅡ-P200,R2-2bPTⅡ与R2-2bPTⅡ-P200提前接种5天对后续接种的CMV强毒有交叉保护效果;将2种弱毒突变体侵染的植株连续接种10代,突变能稳定存在,说明弱毒突变体具备遗传稳定性;因此R2-2bPTⅡ既可作为弱毒疫苗预防CMV,也可作为基础载体插入异源病毒片段构建多联弱毒疫苗。不同长度的外源片段插入实验表明,R2-2bPTⅡ插入100 nt外源片段即可引发基因沉默,插入200 nt以上的外源片段则易发生突变回复。因此,以R2-2bPTⅡ作为基础载体,具备开发三价弱毒疫苗的潜力。为进一步提升基础载体容纳外源片段的能力,构建弱毒突变体R2-2bPTⅢ;R2-2bPTⅢ及其片段插入型突变体R2-2bPTⅢ-P200的预先接种均可对后续接种的CMV强毒具有交叉保护效果;不同长度的外源片段插入实验表明,R2-2bPTⅢ至少可以容纳350 nt外源片段并具备遗传稳定性;因此以R2-2bPTⅢ作为基础载体,具备开发四价弱毒疫苗的潜力。为进一步挖掘CMV基因组中致弱位点以及外源片段的插入位点,针对病毒编码的蛋白和部分顺式作用元件进行突变分析。以CMV RNA3的MP编码框的3’端100 nt、CP编码框的5’端100 nt以及完整的基因间隔区（IGR）作为突变区域,构建缺失型突变体R3-m1、R3-m2、R3-m3、R3-m4和外源长片段替换型突变体R3-m1-P300、R3-m2-P400、R3-m3-P400、R3-m4-P400,8种突变体均不能系统侵染植株,不符合弱毒疫苗系统侵染的基本要求。CMV RNA1与CMV RNA3的3’UTR突变体R1-3Um、R3-3Um接种植物后突变稳定存在,且保持较强的致病力;以R1-3Um和R3-3Um为基础载体的外源片段插入型突变体R1-3Um-P200和R3-3Um-P200,侵染植株后突变位点均被修复为野生型,不符合弱毒疫苗的遗传稳定性的基本要求。针对CMV不同基因组节段的TLS元件关键位点进行突变,构建18 nt替换型突变体Tm1(R1-Tm1、R2-Tm1、R3-Tm1)与18nt插入型突变体Tm2(R1-Tm2、R2-Tm2、R3-Tm2),均有较强的致病力且部分突变体有突变修复现象;而以Tm1和Tm2为基础构建的外源片段插入型突变体Tm3(R1-Tm3、R2-Tm3、R3-Tm3)和Tm4(R1-Tm4、R2-Tm4、R3-Tm4),接种植株后突变位点均回复为野生型,不符合弱毒疫苗遗传稳定性的基本要求。为揭示突变修复的触发因素,以TLS突变体为对象进行深入研究。常规浓度(农杆菌OD600=1.2)接种时,RNA1、RNA2和RNA3的TLS突变体存在不同的修复率,RNA1中的TLS突变不能被修复,而RNA2与RNA3中的TLS突变R2-Tm1、R2-Tm2、R3-Tm1、R3-Tm2的修复率分别为50.0%、37.5%、80.0%、62.5%;RNA3中TLS突变修复率高于RNA2的同样类型TLS突变,RNA2或RNA3中Tm1比Tm2具有更高的突变修复率。将RNA1、RNA2和RNA3同类型的TLS突变体混合(R1-Tm1+R2-Tm1+R3-Tm1或R1-Tm2+R2-Tm2+R3-Tm2)接种植株,致病力减弱且所有TLS突变未出现突变修复现象,说明TLS的突变修复需要依赖于模板选择型RNA重组。RNA1、RNA2和RNA3的TLS突变对CMV致病力的影响不同,Northern blot分析发现TLS突变对相应的RNA合成的影响也存在明显差异。R1-Tm1和R1-Tm2不影响RNA1的相对合成量,R2-Tm1中造成RNA2的合成量极低,R2-Tm2造成RNA2的合成量相对减少,R3-Tm1和R3-Tm2造成RNA3及其亚基因组RNA4的尺寸明显变大。说明TLS突变引起RNA2相对合成量减少的数量缺陷和RNA3尺寸变大的质量缺陷是引发突变修复的因素之一。进一步研究表明,RNA1的TLS突变在特定条件下也可以被修复。RNA1 TLS突变体与RNA2弱毒突变体R2-2bPTⅡ混合侵染植株时,RNA1中TLS突变修复率为100%,而RNA3 TLS突变与R2-2bPTⅡ混合侵染植株时,TLS突变修复率也提高到100%。说明,基因沉默抑制因子2b的突变导致基因组整体积累速率变慢,基因组整体数量缺陷是触发突变修复的关键信号。RNA1TLS突变体的梯度稀释接种实验表明,在病毒稀释限点附近也能引发TLS突变修复,说明特定的初始基因组低浓度可以引发TLS突变修复。综上所述,突变修复的引发因素可归纳为突变导致的基因组部分节段的数量、质量缺陷和基因组整体数量缺陷。将RNA2TLS突变体与细胞间运动缺陷型突变体M5混合接种,发现TLS突变修复不发生,说明TLS突变的修复需要细胞间运动。本论文研究,一方面为广寄主多联弱毒疫苗开发构建了多个基础载体;另一方面解析了突变修复的多层次触发因素和突变修复对细胞间运动的需要,为病毒进化研究和弱毒疫苗的研制与应用提供重要启示。
夏烨[2]（2017）在《三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作》文中研究说明烟草（Nicotiana tabacum L）是一种重要经济作物。病毒病给烟草产业带来严重的经济损失。其中,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）的危害最为严重。近年来,烟田中两种或者多种病毒复合侵染的比例日益增高。烟田土壤带有TMV、CMV、PVY是导致烟株带毒的重要因素。为了建立高效的烟田土壤病毒检测方法,搞清烟草中多重病毒互作的机理,本文展开了系列研究,主要结果如下:1本研究建立了完善的烟田土壤携带病毒的检测方法。分别利用ELISA、RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP的方法均可以对烟田土壤中的TMV、CMV、PVY进行有效检测。四种方法检测TMV灵敏度分别为10-3g土/mL、10-3、10-5和10-6;检测CMV的灵敏度分别是10-1g土/mL、10-1、10-3和10-4;检测PVY的灵敏度分别为10-2 g/mL、10-2、10-4和10-5。2侵染烟草的三种主要病毒在土壤中的分布与含量不同。TMV、PVY的分布最为广泛,CMV最少。随着距离感病烟草根部垂直距离和水平距离的增加,土壤中病毒的含量逐渐减少。随着烟株种植时间的增长,土壤中病毒的积累量和扩散能力都增大。烟草连作土壤里的病毒含量多于烟草与水稻轮作土壤里的病毒含量。3在TMV和CMV复合侵染时,CMV对TMV的CP基因、MP基因、p-183基因和p-126基因的表达起干扰作用。TMV对CMV起协生作用,促进CMV 2b基因、CP基因、MP基因、Rep基因的表达。这种干扰/协生作用在接种30天的时候到达一个向上/下的拐点。在TMV、CMV和PVY三种病毒复合侵染时,PVY对CMV起干扰作用,主要体现在抑制CMV 2b基因、CP基因、MP基因、Rep基因的表达。PVY对TMV起协生作用,主要体现在促进TMV的MP基因和p-183基因的表达。复合侵染21天开始,PVY对TMV协生和CMV对TMV的干扰这两种作用逐渐达到平衡。复合侵染2130天时,PVY对CMV的干扰作用强于TMV对CMV的协生作用。复合侵染过程中,TMV、CMV严重干扰甚至抑制了PVY的基因表达。以上工作的完成,对于深入了解烟田主要病毒的传播途径和在烟草中的互作机理,制定有效措施防控病毒病害,减少经济损失具有重要意义。
王德亚[3]（2017）在《烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化》文中认为烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）属于番茄丛矮病毒科幽影病毒属,基因组由一条正义单链RNA（+ssRNA）组成,全长约4,152 nt。5’端缺乏帽子结构（m7GPPPN）,3’末端也不带poly（A）尾,编码4个ORF,包括复制酶组分p35蛋白及其-1位移码产物p98蛋白（RNA依赖RNA聚合酶,RdRp）,运动蛋白p26和p27。前人研究表明,TBTV基因组的3’UTR含有不依赖帽子翻译元件BTE,可以调控报告基因的表达。本文分析了BTE在全长TBTV中对p35蛋白翻译的调控作用以及对TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累的作用。另外从中国云南地区克隆了3个新的TBTV弱毒分离物,发现其p35表达量相对于野生型（TBTV-Ch）明显降低,且p35表达量降低与BTE元件的结构变异相关。利用体外翻译系统WGE,以TBTV基因组全长RNA为材料全面分析其不依赖帽子翻译,发现TBTV基因组中除BTE外还存在至少1种类型的不依赖帽子翻译元件。具体结果如下:（1）TBTV全基因组克隆及分子进化:通过5’RACE和3’RACE结合一步RT-PCR的方法,克隆得到3个新的弱毒分离物TBTV-JC（KM016224）、TBTV-MD-I（KM016225）和TBTV-MD-II（KM067277）。基因组全长均为4,152 nt;与之前报道的TBTV分离物不同,第一个碱基是鸟嘌呤（G）而不是腺嘌呤（A）。序列一致性比对发现ORF1编码区是TBTV基因组中变化最大的区域（75.0%-99.2%）;系统进化树显示各基因独立进化;在已报道的7个TBTV分离物中共发现32个疑似的重组事件。（2）BTE元件对于TBTV翻译和复制的影响:通过萤火虫荧光素酶（Fluc）载体和TBTV全长RNA的体外翻译分析,发现BTE元件发挥调控不依赖帽子翻译作用的核心分子特征包括3方面:SL-I的17 nt保守序列;与5’UTR形成远距离RNA-RNA互作的SL-III A;BTE本身的结构稳定性。BTE的突变也影响TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累,说明BTE通过调控蛋白翻译从而影响病毒的致病性。（3）TBTV不同分离物体内RNA积累量分析:3个TBTV弱毒分离物在烟草原生质体中的RNA积累量是野生型的30%-40%。而其p35蛋白的表达量是野生型的25%,38%和20%,表明p35表达量降低可能与其弱致病力相关。（4）TBTV不同分离物p35蛋白表达差异的分子机制:嵌合病毒的体外翻译表明,造成弱毒分离物p35蛋白表达量降低的主要调控区域是RI区（基因组5’端的500 nt）和包含BTE的RV区（3’端的3,138 nt到3,885 nt区间）。对于RV区而言,弱毒分离物中BTE内的点突变几乎不影响p35表达,而BTE区域外则存在降低p35表达的突变U3580→A3580。进一步的RNA结构预测,在p35表达量低的TBTV分离物和嵌合病毒中均发现含有典型BTE结构的比例很低;而p35表达量高的TBTV分离物则含有高比例的典型BTE结构特征。利用SHAPE技术分析TBTV不同分离物和嵌合病毒的BTE区域的结构,发现TBTV弱毒分离物以及RV嵌合病毒的BTE区域均发生了明显结构变化。说明BTE的结构变异是导致TBTV弱毒分离物p35蛋白表达降低的分子基础,且此BTE结构变异由BTE区域外的突变造成。这是首次关于不依赖帽子翻译元件在特定RNA病毒不同分离物间结构进化的报道。对于RI区而言,其降低p35蛋白表达的机制在于突变造成5’端的局部结构变化,进而抑制了5’UTR与BTE的SL-III A形成远距离RNA-RNA互作。因此,TBTV弱毒分离物的p35低表达的分子基础是BTE元件的结构变异以及远距离RNA-RNA互作的抑制。（5）TBTV中新的不依赖帽子翻译元件:通过对TBTV 3’UTR区域的系列缺失实验,发现TB-D9（4040-4099）和TB-D10（4093-4152）的缺失会明显降低p35蛋白的表达,通过Mflod预测发现4003-4152形成独立结构域,并且利用SHAPE技术分析发现D9和D10的缺失突变并没有影响BTE元件的活性结构。反式竞争实验也证明了4003-4152区对于p35不依赖帽子翻译的调控作用。因此,在TBTV的3’UTR还存在除BTE之外的不依赖帽子翻译调控元件。利用In line-proing技术分析4003-4152的结构,包含5个发夹结构和3个假节点。此结构与TCV的3’UTR的结构类似,也可能存在TSS结构。
宋志波[4]（2014）在《油茶内参基因的筛选与油脂合成相关酶基因的表达特征分析》文中研究说明油茶(（Camellia oleifera）是我国原产的优质油料树种之一,因为所产茶油富含不饱和脂肪酸而被誉为“东方橄榄油”。优良油茶品种所产的茶油中不饱和脂肪酸含量高达90%（以油酸和亚油酸为主,还含有少量的亚麻酸等高价不饱和脂肪酸）,远远高于菜油、花生油和豆油。在植物生长过程中,调控油脂合成的基因：SAD基因是调控油脂中油酸合成的关键基因；GPAT基因、LPAAT基因、PAP基因、DGAT基因和PDAT基因是TAG合成的相关基因,其中DGAT基因是TAG合成Kenendy途径的限速酶,而PDAT基因是TAG合成另一途径的关键基因；FAD基因主要催化多不饱和脂肪酸的合成,其中FAD2基因和FAD6基因则是调控油酸经催化生成亚油酸的关键基因,FAD3基因和FAD7基因则是调控亚油酸经催化生成亚麻酸的关键基因,但它们在植物中都有多个拷贝。目前已经完成了油茶成熟种子cDNA文库以及EST文库的构建,得到了近成熟种子中油脂合成相关基因的表达丰度,并在此基础上已经完成了对SAD基因、DGAT1基因、FAD2基因和FAD6基因的序列克隆。本研究主要完成了：（1）油茶不同器官/织的总RNA提取方法：Ambion（?）NA提取试剂盒+CTAB法,经琼脂凝胶电泳及分光光度计检测,所得RNA浓度高,质量好。（2）在油茶转录组数据基础上对油茶内参基因进行了初步筛选,得到可以应用于油茶种仁表达分析的内参候选基因ALB、EF1α、EF1β、ETIF3H, UBC; α可以应用于油茶根、茎、叶表达分析的候选内参基因ETIF3H,可以应用于油茶根、茎、花、叶及种仁表达分析的候选内参基因EF1α。（3）油茶转录组数据和已克隆油脂合成相关基因的基础上,通过使用RT-qPCR,对优良无性系油茶品种“华硕”中油脂合成相关酶基因的表达模式进行了研究：Ⅰ.油脂合成相关酶基因在种仁内的相对表达量从高到低依次为：FAD2基因、PDAT基因、PAP基因、DGAT基因、FAD7基因、FAD6基因、SAD基因、FAD3基因、LPAAT基因、GPAT基因。其中SAD基因、LPAAT基因、PAP基因、DGAT基因、PDAT基因及FAD基因在花后42周均出现表达高峰,这与油脂含量变化及油酸含量变化规律吻合,而GPAT基因在油脂合成中的调控机制有待进一步研究；在同一时期,亚油酸和亚麻酸的含量出现下降,推测可能是因为油脂中油酸的合成速率要远远大于油酸转化为亚油酸的速率,而亚麻酸的转化速率也因此受到影响,因为FAD基因的拷贝数目很多,所以有关于FAD基因的调控机制有待进一步研究。Ⅱ.采用灰色关联度法分析法对油脂合成相关基因的表达与种仁油脂含量和油脂脂肪酸成分进行关联性分析,结果显示：A.油脂合成相关基因与油茶种仁中油脂含量的灰色关联度由高到低依次为：DGAT （0.9494）、PDAT （0.8356）、 FAD7（0.7716）、GPAT（0.5062）、LPAAT（0.5038）、PAP（0.5024）、FAD2（0.5016）、（0.5014）、FAD6（0.5009）、SAD （0.5004）,结果证明了油茶种仁中DGAT基因和PDAT基因与油脂合成呈正相关的关系,并且发现多不饱和脂肪酸合成基因FAD7的表达与油脂合成变化也呈现出一定的正相关关系。B.SAD基因与油茶种仁中油酸含量的灰色关联度为：0.7853,结果与油酸合成的规律吻合,关于本研究中SAD基因与油茶种仁中油酸的含量变化关系及调控机制还需要进一步探究。C.FAD2和FAD6与油茶种仁中亚油酸含量的灰色关联度分别为0.6897和0.5002,而FAD3和FAD7与油茶种仁中亚麻酸的灰色关联度分别为0.8032和0.5472,这也同样说明油茶种仁中FAD基因的表达调控模式有待进一步进行探究。Ⅲ.油脂合成相关酶基因在油茶不同器官/织中的表达特征均呈现出组织特异性。在这些基因中SAD基因与FAD2基因在叶片中的表达量显着比其他器官/组织的要高,推测可能是由于这两个基因主要调控不饱和脂肪酸的合成,而植物叶片中的不饱和脂肪酸含量越高,其对环境的抗逆性越强。
龙亚芹,王万东,左瑞娟,李凡,尹朝先,陈海如[5]（2011）在《烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用》文中提出为制备烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物（TBTV-BSLLi）的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a（+）中,通过热击转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（plysS）,以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白。用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清。DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草（Nicotiana tabacumL.）样品及传播介体的检测。本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。
龙亚芹,左瑞娟,李凡,赵秀兰,李玲,陈海如[6]（2010）在《烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达》文中进行了进一步梳理利用RT-PCR方法,自烟草丛顶病毒（Tobacco bush topvirus,TBTV）龙陵分离物（TBTV-YLLi）的RNA中扩增出ORF3目的片段,并克隆到pMD18-T载体上进行序列分析.结果表明,TBTV-YLLi的ORF3全长714 bp,与TBTV其他分离物的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为98.3%98.6%和95.4%95.8%;与同属的花生丛簇病毒（Groundnut rosette virus,GRV）、豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus-2,PEMV-2）和胡萝卜拟斑驳病毒（Carrot mottle mimic virus,CMoMV）的核苷酸相似性分别为65.1%、61.6%和49.7%,氨基酸相似性分别为36.4%、34.6%和16.5%.将ORF3克隆到原核表达载体pET28a（+）上,获得的重组子pET28-ORF3转化大肠杆菌BL21-plysS,使用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养4 h时,该融合蛋白表达量最高.融合蛋白经Ni2+亲和柱层析纯化后,SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白相对分子质量约为35 000,与预计的相对分子质量大小相一致.
王凤龙,任广伟,张成省[7]（2010）在《烟草植物保护技术发展现状与趋势》文中指出一、引言烟草植物保护是研究烟草病害、害虫、杂草等有害生物的种类、生物学特性、发生规律、成灾机理以及防治策略与技术的一门综合性学科。烟草植物保护在防御和控制烟草有害生物的发生和危害、确保烟叶生产安全、减少灾害损失、减少环境污染以及促进烟叶生产可持续发展等方面发挥了重要作用。近年来,烟草植物保护研究向生态水平、个体水平、细胞水平和分子水平纵深发展,特别是在重大烟草病虫害发生、灾变规律、害虫与病原菌抗药性等方面的研究取得明显进步,信息技术和生物技术在植保研究领域得到广泛应用。全国烟草病虫害预测预报网络日趋完善,研发出烟草重大病虫害测报技术,制定了烟草病虫害测报调查技术规范,病虫
刘勇[8]（2006）在《云南烟草病毒检测及防治研究》文中研究说明烟草病毒病是危害烟叶生产最重要的病害之一，危害烟草的病毒种类多达30多种，花叶型病毒病田间常见，曲叶型病毒病的危害呈上升趋势。为了弄清云南烟草病毒病的种类，对云南省烟草花叶型和曲叶型病毒病样品进行了血清学和分子检测，并对烟草病毒病控制进行了研究。采用抗原直接包被法和双抗体夹心法对采自云南烟草花叶病样本进行了病毒种类检测，并利用三抗体夹心法对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的亚组类型进行了鉴定。在云南采集的520个病毒病样本中，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、CMV和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）总检出率分别为71.74％、55.01％和6.35％，云南、湖南和福建64个CMV阳性样品中，属亚组Ⅰ的样品为57个，占89.1％，属亚组Ⅱ样品为10个，占15.6％。采用烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）、云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYNV）、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的特异引物，对云南烟草曲叶病样本的病原进行了PCR检测；采用粉虱传双生病毒PA和PB通用引物，对代表性样品进行了扩增、克隆测序和序列比对。检测表明云南烟草曲叶病是由TbCSV、TbLCYNV和TYLCCNV三种病毒引起的。109个烟草曲叶症状的样本中，TbCSV总检出率为41.3％、TbLCYNV总检出率为16.5％、TYLCCNV总检出率为53.2％。其中两种或三种病毒复合侵染的检出率为8.2％。500 bp序列比较表明，这些病毒分离物之间的相似性为77％～100％。依据500 bp序列构建的同源关系树上，所有TYLCCNV的分离物因地理隔离聚为两大类，一类为保山分离物，相互间核苷酸序列相似性为93％，另一类为文山和红河分离物，相互间核苷酸序列相似性为95％，两类之间核苷酸序列相似性为89％。对其中一个分离物Y264 DNA-A的全序列测定表明，Y264 DNA-A全长2741个核苷酸（nts）。具有典型的begomoviruses结构，共编码6个开放读码框（ORFs）。DNA-A全长与中国番茄黄化曲叶病毒分离物Y10的相似性最高，为91.3％，各ORFs编码的氨基酸序列与TYLCCNV的相似性最高。因此，Y264为TYLCCNV的一个分离物。采用三抗体夹心法对云南烟草漂浮苗样本进行了病毒种类检测，在云南采集的1400多个烟草漂浮苗样本中，TMV的检出率占总阳性样本数的95％以上；CMV和马铃薯Y属病毒（包括PVY和TEV）的检出率占总阳性样本数的5％以下。在漂浮苗移栽后至团棵期，在发病率高（20％以上）的田块中采集的480个花叶病样本中，不同田块TMV检出率48.1％～100％，而CMV和马铃薯Y属病毒（包括PVY和TEV）检出率0％～12.2％。表明危害云南烟草漂浮苗的主要病毒种类为TMV。采用半叶法测定了9种药剂对烟草病叶汁液中TMV的钝化效果，采用叶面喷雾法测定了药剂对烟草的药害浓度与药害症状。室温下一定浓度的药剂与1：10000的TMV病叶汁液等体积混合3 min时，30％有效氯漂白粉10倍液、98％磷酸三钠·12H2O 10倍液、7％有效氯次氯酸钠150倍液、美国消毒剂125倍液和75％酒精TMV的抑制率可达100％；10％二氧化氯200倍液和40％育宝150倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率可达100％和96.30％；0.6％菌毒净125倍液、3.95％病毒必克800液和24％毒消800倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率低于80％。除0.6％菌毒净较安全外，供试消毒剂在常用浓度下接触烟草叶片，产生较严重药害，症状因消毒剂种类不同，主要为褪绿斑点、坏死斑点和畸形。试验了在漂浮育苗池中使用消毒剂对TMV的钝化效果和烟苗出苗和生长的影响。枯斑寄主测定表明：与TMV病叶汁液2万倍稀释液接触12 hr，对TMV的抑制率高于80％的消毒剂及浓度为：30％有效氯漂白粉15 mg／L和150 mg／L；7％有效氯次氯酸钠2μl／L和20μl／L；美国消毒剂5μl／L和50μl／L。漂浮池水中加入低浓度消毒剂，出苗率和成苗率与对照差异不显着，但对烟苗后期长势的影响因消毒剂种类而有差异。对烟苗长势有促进作用的消毒剂有：磷酸三钠15mg／L～300mg／L、硫酸铜50mg／L～100mg／L、高锰酸钾10mg／L～40mg／L和24％毒消10μl／L。对烟苗长势低浓度无明显影响而高浓度有抑制作用的消毒剂有：40％育宝、30％有效氯漂白粉、7％次氯酸钠、美国消毒剂和0.6％菌毒净。为避免消毒剂对烟苗生长的影响，池水中消毒剂使用终浓度不能超过下列浓度：40％育宝100μl／L、30％有效氯漂白粉300mg／L、7％次氯酸钠20μl／L、美国消毒剂50μl／L、0.6％菌毒净100μl／L。
杨铁钊,鲁黎明,王瑞华[9]（2006）在《生物技术在我国烟草研究领域的应用》文中研究表明烟草是重要的经济作物,也是研究植物生命活动的模式植物。随着分子生物学研究的不断深入,分子生物学的研究手段在烟草基础理论研究领域得到了越来越多的应用,并且取得了重大进展。本文综述了生物技术在我国烟草研究领域的应用及取得的成就,并对以后的发展趋势进行了展望。
田延平[10]（2006）在《三种马铃薯Y病毒属病毒的分子特性》文中研究说明从河北、北京、山东泰安和潍坊等地的萝卜、大白菜、甘蓝、油菜上分离得到了8个芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）分离物，测定了它们3′末端cDNA片段的序列。根据衣壳蛋白基因（coat protein，CP）核苷酸序列可以将这8个分离物与本实验室得到的另外2个TuMV分离物分为3组：泰安旧镇大白菜（JZBC）、甘蓝（JZGL）和萝卜（JZLB）分离物为一组；北京萝卜（BJLB）、潍坊萝卜（WFLB）与引起萝卜红心病的TuMV分离物（WFLB99）为一组；泰安范镇、河北、潍坊（WFLB04）和泰安旧镇油菜（JZYC）的分离物为一组。与Genbank中其它分离物的衣壳蛋白基因核苷酸序列进行系统分析发现，本研究中的JZYC、FZLB、HBLB位于Basal-BR组，WFLB、BJLB位于Asian-BR组，JZLB、JZGL、JZBC位于World-B组。本研究首次发现中国有TuMV Basal-BR组分离物的存在。 从山东、河南、安徽、云南、甘肃、黑龙江等省的主要烟区采集样品，利用RT-PCR技术克隆到了29个马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）分离物3′-末端部分基因组，测定了其核苷酸序列，同时测定了其中25个分离物HC-Pro基因的核苷酸序列。与Genbank中85个PVY分离物CP基因核苷酸序列分析发现，这些分离物可以分为O、N及C三个组，在N组中还包括一个小的亚组NTN；O组中包括N：O亚组。本研究中山东TX91、AQ1、MY60、F8，河南HN8，安徽A33等6个分离物位于N组中，其中TX91及AQ1位于NTN亚组；黑龙江H20、H18、H11，山东F4、MY55、MY59、Q23、ZC37、ZB3、ZB1、ZC39，安徽A26、A2、A5，河南HN6、HN10、HN43，甘肃G5、G14、G10、G1、G8、G15等23个分离物位于O组。根据69个HC-Pro基因的核苷酸序列分析表明可以分为两个组，山东MY55、F8，河南HN10，安徽A5、A33等位于一个组，山东AQ1、TX91、ZC37、ZC39、MY60、MY59、ZB1、ZB3，河南HN6、HN43、
二、烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物病毒病与综合防治 |
| 1.1.1 植物病毒病简介 |
| 1.1.2 植物病毒病防治 |
| 1.1.2.1 农业防治 |
| 1.1.2.2 培育抗病品种 |
| 1.1.2.3 药剂防治 |
| 1.1.2.4 卫星RNA介导的病毒抗性 |
| 1.1.2.5 弱毒疫苗防治 |
| 1.2 交叉保护 |
| 1.2.1 交叉保护现象与应用 |
| 1.2.2 交叉保护的机制 |
| 1.2.3 疫苗研制的要求与潜在问题 |
| 1.3 RNA病毒重组及发生机制 |
| 1.3.1 重组与进化 |
| 1.3.2 重组的类型 |
| 1.3.3 重组的机制 |
| 1.3.3.1 复制型重组(拷贝选择机制) |
| 1.3.3.2 非复制型重组 |
| 1.3.3.3 重配 |
| 1.3.4 重组率 |
| 1.3.5 RNA重组的生物学意义 |
| 1.4 黄瓜花叶病毒(CMV) |
| 1.4.1 黄瓜花叶病毒的分类与危害 |
| 1.4.2 黄瓜花叶病毒的生物学特性 |
| 1.4.3 黄瓜花叶病毒致病性分析 |
| 1.4.3.1 1a蛋白 |
| 1.4.3.2 2a蛋白 |
| 1.4.3.3 2b蛋白 |
| 1.4.3.4 3a蛋白 |
| 1.4.3.5 CP |
| 1.4.3.6 TLS结构 |
| 1.4.3.7 卫星RNA |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体、植株 |
| 2.1.2 载体及试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 引物与测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.1.1 TransZol法 |
| 2.2.1.2 非TransZol法 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.2.3 突变体构建方法 |
| 2.2.3.1 PCR或反向PCR |
| 2.2.3.2 重叠PCR |
| 2.2.4 DNA纯化 |
| 2.2.4.1 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.4.2 核酸的胶回收 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 同源重组 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞(DH5α)的制备与转化 |
| 2.2.9 阳性克隆筛选 |
| 2.2.9.1 菌落PCR |
| 2.2.9.2 酶切鉴定 |
| 2.2.9.3 质粒测序与序列分析 |
| 2.2.10 质粒提取(碱裂解法) |
| 2.2.11 农杆菌感受态细胞(GV3101)的制备与转化 |
| 2.2.12 本氏烟种植 |
| 2.2.13 本氏烟接种 |
| 2.2.13.1 机械摩擦法 |
| 2.2.13.2 农杆菌注射法 |
| 2.2.14 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.15 Western Blot分析 |
| 2.2.16 Northern Blot分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CMV2b蛋白突变型载体的致病性分析 |
| 3.1.1 两种2b蛋白翻译提前终止型载体 |
| 3.1.1.1 2b蛋白翻译提前终止型突变体构建与致病性分析 |
| 3.1.1.2 R2-2bPTⅡ型突变体交叉保护效果测定 |
| 3.1.1.3 R2-2bPTⅡ型突变体遗传稳定性的继代分析 |
| 3.1.1.4 R2-2bPTⅡ突变载体容纳外源片段长度能力测定 |
| 3.1.2 2b蛋白编码序列的缺失型载体 |
| 3.1.2.1 2b蛋白缺失型突变体构建与致病性分析 |
| 3.1.2.2 R2-2bPTⅢ型突变体交叉保护效果测定 |
| 3.1.2.3 R2-2bPTⅢ型突变载体容纳外源片段长度能力测定 |
| 3.2 CMV其他编码蛋白和部分顺式作用元件突变型载体 |
| 3.2.1 RNA3 序列缺失型突变载体构建与致病性分析 |
| 3.2.2 基因组3’端非翻译区突变型载体 |
| 3.2.2.1 基因组3’UTR18 nt插入型突变载体构建与致病性分析 |
| 3.2.2.2 3’UTR外源片段插入型突变体构建与致病性分析 |
| 3.2.3 TLS突变型载体与致病性分析 |
| 3.2.3.1 TLS18 nt突变型载体构建与致病性分析 |
| 3.2.3.2 TLS200 nt突变型载体构建与致病性分析 |
| 3.3 TLS突变位点修复的机理探究 |
| 3.3.1 TLS突变的修复现象与修复机制 |
| 3.3.2 触发突变修复的因素探究 |
| 3.3.2.1 病毒基因组节段RNA的数量和质量缺陷触发突变修复 |
| 3.3.2.2 病毒基因组的低浓度触发突变修复 |
| 3.3.3 突变修复的发生时机探究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外源片段插入型突变不稳定的因素探讨 |
| 4.2 突变修复的机制 |
| 4.3 影响突变重组修复率的因素探讨 |
| 4.4 突变、适应度与修复的平衡关系 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 黄瓜花叶病毒(CMV)花生分离物侵染性克隆构建 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 烟草及烟草病毒病概述 |
| 1.2 烟草三种常见病毒的基本特征 |
| 1.2.1 TMV |
| 1.2.2 CMV |
| 1.2.3 PVY |
| 1.3 烟草病毒的检测方法 |
| 1.3.1 血清学方法 |
| 1.3.2 PCR技术 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR |
| 1.3.4 环介导等温扩增技术 |
| 1.3.5 烟草病毒TMV、CMV和PVY的检测方法的探究 |
| 1.4 土壤携带病毒研究简介 |
| 1.4.1 土壤中病毒病的研究情况 |
| 1.4.2 烟田土壤病毒研究的重要性 |
| 1.5 植物病毒间的相互作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土壤材料 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 菌株及抗血清 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 土壤样品的处理 |
| 2.2.2 间接ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） |
| 2.2.3 RNA提取用具的处理 |
| 2.2.4 烟草叶片总RNA的抽提 |
| 2.2.5 土壤总RNA的抽提 |
| 2.2.6 引物的设计与合成 |
| 2.2.7 RT-PCR反应 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳反应 |
| 2.2.9 TMV、CMV、PVY的实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.10 RT-LAMP |
| 2.2.11 TMV、CMV、PVY在烟草体内的互作研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 土壤中3种病毒的ELISA检测结果 |
| 3.2 烟草叶片和土壤总RNA的抽提 |
| 3.3 土壤中TMV、CMV、PVY的RT-PCR检测 |
| 3.3.1 土壤样品RT-PCR的灵敏度检测 |
| 3.3.2 RT-PCR扩增产物的检测 |
| 3.4 土壤中TMV、CMV、PVY含量的荧光定量PCR测定 |
| 3.4.1 TMV、CMV、PVY阳性重组质粒DNA标准品的制备 |
| 3.4.2 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.4.3 土壤样品TMV、CMV、PVY含量的测定 |
| 3.4.3.1 荧光定量PCR检测灵敏度分析 |
| 3.4.3.2 土壤样品TMV、CMV、PVY含量的测定 |
| 3.5 土壤中3种病毒的RT-LAMP的检测及灵敏度分析结果 |
| 3.5.1 RT-LAMP检测体系的探究 |
| 3.5.2 土壤样品RT-LAMP的灵敏度检测 |
| 3.6 土壤样品TMV、CMV、PVY的4种检测方法的灵敏度比较 |
| 3.7 土壤样品TMV、CMV、PVY的4种检测方法的特异性比较 |
| 3.8 烟草主要病毒在烟草体内的互作研究 |
| 3.8.1 复合侵染加剧病害症状 |
| 3.8.2 复合侵染改变病毒基因的相对表达水平 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 四种检测方法的优缺点比较 |
| 4.2.2 不同方法检测烟田土壤主要病毒灵敏度的比较与分析 |
| 4.2.3 烟田土壤主要病毒的生态特点分析 |
| 4.2.4 烟草主要病毒的互作研究 |
| 4.2.6 病毒基因沉默抑制子在病毒互作中的作用 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 真核细胞典型的依赖帽子翻译起始 |
| 1.2 植物RNA病毒不依赖帽子翻译机制的研究进展 |
| 1.2.1 植物RNA病毒的5’IRES元件 |
| 1.2.2 植物RNA病毒的3’CITE元件 |
| 1.3 植物RNA病毒的分子进化 |
| 1.4 RNA结构分析方法 |
| 1.5 烟草丛顶病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体、悬浮细胞 |
| 2.1.2 烟草丛顶病样品 |
| 2.1.3 所用载体及试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物合成和测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 cDNA末端快速扩增(RACE) |
| 2.2.4.1 cDNA5’末端快速扩增(5’RACE) |
| 2.2.4.2 cDNA3’末端快速扩增(3’RACE) |
| 2.2.5 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的胶回收 |
| 2.2.7 连接反应 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选重组质粒 |
| 2.2.11 Cracking快速鉴定 |
| 2.2.12 酶切鉴定法 |
| 2.2.13 酶切反应 |
| 2.2.14 碱裂解法小量提质粒 |
| 2.2.15 体外转录 |
| 2.2.16 5 ’加帽体外转录反应体系 |
| 2.2.17 在麦胚提取物(WheatGermExtract)中的体外翻译 |
| 2.2.18 拟南芥原生质体的制备与侵染 |
| 2.2.18.1 拟南芥愈伤组织的培养 |
| 2.2.18.2 原生质体的制备 |
| 2.2.18.3 原生质体的侵染 |
| 2.2.19 WesternBlot分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.21 RNA体外结构分析技术---In-lineprobing |
| 2.2.22 RNA体外结构分析技术-SHAPE(selective2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE) |
| 2.2.22.1 RNA的处理 |
| 2.2.22.2 引物标记 |
| 2.2.22.3 SHAPE反应 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV新分离物全基因组克隆与序列进化分析 |
| 3.1.1 TBTV新分离物的全基因组克隆 |
| 3.1.2 TBTV的分子变异与进化分析 |
| 3.1.2.1 TBTV的分子变异 |
| 3.1.2.2 TBTV系统进化树 |
| 3.1.2.3 TBTVRNA重组分析 |
| 3.2 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的结构特征 |
| 3.2.1 BTE元件对Fluc报告基因的调控作用验证 |
| 3.2.2 BTE元件对TBTV病毒全长p35蛋白的翻译调控作用 |
| 3.3 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的分子进化 |
| 3.3.1 TBTV不同分离物的复制效率与p35蛋白表达分析 |
| 3.3.2 TBTVp35蛋白差异表达的调控区域定位 |
| 3.3.3 RV区调控p35蛋白差异表达的分子基础 |
| 3.3.3.1 RV区中造成p35降低的突变位点定位 |
| 3.3.3.2 TBTV不同分离物中BTE的结构变异与p35蛋白表达的关系 |
| 3.3.3.3 TBTV弱毒分离物的BTE结构变异导致p35蛋白表达量的降低 |
| 3.3.4 RI区调控p35蛋白差异表达的内在机理 |
| 3.4 TBTV不依赖帽子翻译元件类TSS元件的定位与结构特征分析 |
| 3.4.1 TBTV中新的不依赖帽子翻译元件定位 |
| 3.4.1.1 缺失定位 |
| 3.4.1.2 缺失突变体元件的结构分析 |
| 3.4.1.3 类TSS元件与BTE元件的翻译活性分析 |
| 3.4.1.4 类TSS元件的结构特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TBTV分子进化 |
| 4.2 TBTV中的不依赖帽子翻译元件 |
| 4.3 类BTE元件在TBTV不同分离物的结构进化分析 |
| 4.4 CITE的分子进化 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（4）油茶内参基因的筛选与油脂合成相关酶基因的表达特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 油茶 |
| 1.2 植物油脂的功能 |
| 1.3 植物中油脂合成途径及相关酶 |
| 1.3.1 油脂的合成 |
| 1.3.2 油脂合成相关酶基因 |
| 1.4 RT-qPCR |
| 1.4.1 油茶RNA的提取 |
| 1.4.2 油茶内参基因的选择 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 油茶不同器官总RNA的提取 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料及试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 RNA提取前的准备工作 |
| 2.2.2 RNA提取方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 内参基因的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 内参引物的设计 |
| 3.2.2 内参基因的筛选 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 随机模板扩增结果 |
| 3.3.2 以油茶种仁cDNA为模板的扩增结果 |
| 3.3.3 以油茶不同器官cDNA为模板的扩增结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 油茶油脂合成酶基因的表达模式分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 材料及试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 油茶种仁中油脂含量与脂肪酸成分分析 |
| 4.2.2 油茶中油脂合成酶基因的表达量变化分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 油茶种仁中油脂含量变化及脂肪酸成分变化分析 |
| 4.3.2 油茶种仁中油脂合成酶基因的表达模式研究 |
| 4.3.3 油脂合成酶基因与油脂含量及脂肪酸变化的灰色关联度分析 |
| 4.3.4 油脂合成酶基因在油茶不同器官的表达特征 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 常用实验药品配方 |
| 附录B 缩略词 |
| 附录C 攻读硕士学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
（5）烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用（论文提纲范文）
| 1 结果 |
| 1.1 目的片段及序列测定 |
| 1.2 原核表达载体的构建 |
| 1.3 重组ORF3和ORF4的诱导表达及鉴定 |
| 1.4 表达产物的纯化 |
| 1.5 抗血清的制备及效价测定 |
| 1.6 抗血清的Western的鉴定 |
| 1.7 抗血清的初步应用 |
| 1.7.1 DAS-ELISA检测不同地区、烟株不同部位的带毒率 |
| 1.7.2 DAS-ELISA检测传毒介体蚜虫的带毒率 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RT-PCR扩增 |
| 3.2.2 PCR产物的克隆 |
| 3.2.3 ORF3和ORF4原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 ORF3、ORF4的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.5 ORF3和ORF4融合蛋白的纯化 |
| 3.2.6 TBTV ORF3和ORF4抗血清的制备及效价测定 |
| 3.2.7 抗血清的初步应用 |
（6）烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 TBTV ORF3的克隆 |
| 1.2.2 TBTV ORF3原核表达载体构建 |
| 1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.4 原核表达条件的优化 |
| 1.2.5 融合蛋白表达形式的鉴定 |
| 1.2.6 融合蛋白大量诱导表达及纯化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ORF3目的片段的克隆与序列分析 |
| 2.2 原核表达载体构建和鉴定 |
| 2.3 ORF3的诱导表达 |
| 2.4 pET-ORF3原核表达条件的优化和诱导表达蛋白体的鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 3 讨论 |
（8）云南烟草病毒检测及防治研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 病毒缩写与中英文对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 烟草病毒研究进展 |
| 1 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV) |
| 1.1 TMV株系划分 |
| 1.2 烟草抗TMV的抗源 |
| 1.3 烟草抗TMV育种 |
| 2 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV) |
| 2.1 CMV亚组与株系 |
| 2.2 烟草抗CMV的抗源 |
| 2.3 烟草抗CMV育种 |
| 3 马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY) |
| 3.1 株系分化 |
| 3.2 烟草抗PVY抗源 |
| 3.3 烟草抗PVY育种 |
| 4 烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV) |
| 5 烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV) |
| 6 烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV) |
| 7 烟草萎蔫病毒(Tobacco wilt virus,TWV) |
| 8 番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,ToSWV) |
| 9 烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV) |
| 10 番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,ToBRV) |
| 11 番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV) |
| 12 烟草坏死病毒(Tobacco necrosis virus,TNV) |
| 13 苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV) |
| 14 烟草线条病毒(Tobacco streak virus,TSV) |
| 15 马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX) |
| 16 绒毛烟斑驳病毒(Velvet tobacco mottle virus,VTMV) |
| 17 烟草轻绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV) |
| 18 烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV) |
| 19 烟草脉扭病毒(Tobacco vein distorting virus,TVDV) |
| 20 烟草坏死矮缩病毒(Tobacco necrotic dwarf virus,TNDV) |
| 21 烟草斑驳病毒(Tobacco mottle virus,TMoV) |
| 22 烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV) |
| 23 烟草黄脉病毒(Tobacco yellow vein virus,TYVV) |
| 24 烟草黄矮病毒(Tobacco yellow dwarf virus,TYDV) |
| 25 烟草矮化病毒(Tobacco stunt virus,TStV) |
| 第二节 双生病毒 |
| 1 双生病毒的分类与命名 |
| 2 双生病毒的进化 |
| 3 双生病毒的发生与危害 |
| 4 双生病毒的基因组结构 |
| 4.1 玉米线条病毒属(Mastrevirus) |
| 4.2 甜菜曲顶病毒属(Curtovirus) |
| 4.3 番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus) |
| 4.4 菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus) |
| 5 我国烟草上的双生病毒 |
| 5.1 烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV) |
| 5.2 云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV) |
| 5.3 中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV) |
| 第三节 烟草病毒病的发生与防治 |
| 1 云南烟草病毒病的发生状况 |
| 2 烟草病毒病传染源及传播途径 |
| 2.1 土壤带毒 |
| 2.2 水源带毒 |
| 2.3 烟草种子带毒 |
| 2.4 蚜虫传毒 |
| 2.5 农事操作传毒 |
| 2.6 病残体带毒 |
| 2.7 生产上与传染源有关的一些发病情况 |
| 3 综合防治技术措施 |
| 3.1 抗病毒剂 |
| 3.2 苗期尼龙网隔离防虫 |
| 3.3 烟草病毒病综合防治技术措施 |
| 4 立题意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 植物材料 |
| 1.3 菌株和质粒 |
| 1.4 试剂与仪器 |
| 1.5 常用缓冲液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 植物总DNA提取 |
| 2.2 PCR技术 |
| 2.3 PCR产物纯化 |
| 2.4 DNA克隆技术 |
| 2.5 重组质粒的提取与鉴定 |
| 第三章 云南烟草花叶病主要病毒种类检测及黄瓜花叶病毒亚组鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集及抗血清来源 |
| 1.2 样品制备方法 |
| 1.3 病毒种类检测方法 |
| 1.4 CMV样品亚组鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 云南烟草花叶病主要病毒种类 |
| 2.2 云南、福建和湖南省烟草CMV亚组比例 |
| 3 讨论 |
| 第四章 云南烟草曲叶病主要病毒种类检测 |
| 第一节 云南烟草曲叶病的种类与分布 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒分离物 |
| 1.2 植物总DNA提取 |
| 1.3 复合侵染检测 |
| 1.4 病毒基因组DNA-A克隆及序列测定 |
| 1.5 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 云南不同地区烟草双生病毒的分布 |
| 2.2 DNA-A部分序列的相似性比较 |
| 3 讨论 |
| 第二节 中国番茄黄化曲叶病毒保山分离物的全基因组结构 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 植物总DNA提取 |
| 1.3 PCR扩增、克隆和测序 |
| 1.4 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒基因组DNA-A结构 |
| 2.2 Y264 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 云南烟草漂浮苗病毒病控制研究 |
| 第一节 漂浮苗主要病毒病种类 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 病叶样本采集与制备 |
| 1.3 苗根样品采集方法 |
| 1.4 苗根样本制备方法 |
| 1.5 病毒检测方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 移栽前漂浮苗病毒病种类与带毒情况 |
| 2.2 移栽后漂浮苗主要病毒病种类和危害情况 |
| 2.3 漂浮苗干病根不同制样的病毒检测效果 |
| 2.4 不同检测方法对漂浮苗干根中病毒的检测灵敏度 |
| 3 讨论 |
| 3.1 漂浮苗病毒种类与烟苗带毒率 |
| 3.2 漂浮苗旧苗盘残根TMV带毒检测 |
| 第二节 漂浮育苗中剪叶工具与池水消毒与病毒病控制 |
| 一、烟草漂浮育苗中剪叶工具消毒剂评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 钝化效果实验 |
| 1.2 药害实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 几种药剂对TMV的体外抑制效果 |
| 2.2 药害实验 |
| 3 讨论 |
| 二、消毒剂对池水中TMV的灭活效果和烟草漂浮苗出苗及生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试消毒剂 |
| 1.2 供试植物 |
| 1.3 供试病毒 |
| 1.4 抑制率测定 |
| 1.5 池水中加入消毒剂对出苗和生长的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 低浓度消毒剂对TMV的体外抑制效果 |
| 2.2 池水中消毒剂对出苗和生长的影响 |
| 2.3 消毒剂对池水pH的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录A:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 |
| 附录B:常用缓冲液及培养基配方 |
（9）生物技术在我国烟草研究领域的应用（论文提纲范文）
| 1 优质与高光效研究 |
| 2 提高营养元素利用效率的研究 |
| 2.1 钾 |
| 2.2 磷 |
| 3 烟草抗逆研究 |
| 3.1 抗旱 |
| 3.2 抗盐 |
| 3.3 抗热 |
| 3.4 抗冷 |
| 4 抗病虫研究 |
| 4.1 病原菌及病毒分子生物学特征分析 |
| 4.1.1 分子标记的应用 |
| 4.1.2 序列分析与分子进化分析 |
| 4.2 利用基因工程的手段提高烟草抗病性 |
| 4.3 抗虫研究 |
| 4.4 病原菌及病毒的检测 |
| 4.4.1 烟草黑胫病菌的快速检测技术 |
| 4.4.2 烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus, TMV) 的检测 |
| 4.4.3 烟草丛顶病的分子检测 |
| 5 除草剂研究 |
| 6 抗重金属污染 |
| 6.1 汞 |
| 6.2 镉 |
| 7 问题与展望 |
（10）三种马铃薯Y病毒属病毒的分子特性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 引言 |
| 1.1 马铃薯Y病毒属病毒的一般特性 |
| 1.2 马铃薯Y病毒属病毒的分子生物学特性 |
| 1.3 病毒的系统侵染 |
| 1.4 基因组复制 |
| 1.5 病毒移动 |
| 1.6 病毒的传播 |
| 1.6.1 蚜虫传播 |
| 1.6.2 种子传播 |
| 1.7 病害症状形成 |
| 1.8 马铃薯Y病毒属分类标准的确立 |
| 第二部分 芜菁花叶病毒不同分离物3’-cDNA片段的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 病毒RNA的提取 |
| 2.1.3 反转录-聚合酶链式反应 |
| 2.1.4 目的片段回收 |
| 2.1.5 外源片段的连接 |
| 2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.8 质粒DNA的提取 |
| 2.1.9 鉴定重组子 |
| 2.1.10 序列测定及分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同TuMV分离物的RT-PCR结果 |
| 2.2.2 重组质粒的电泳鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒的酶切电泳 |
| 2.3.4 重组质粒PCR鉴定 |
| 2.3.5 8个TuMV分离物的核苷酸序列鉴定 |
| 2.3.6 衣壳蛋白及3’-UTR序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三部分 中国烟草上马铃薯Y病毒的分子变异 |
| 3.1 马铃薯Y病毒的分类现状 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 病毒标本RNA的提取 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 反转录-聚合酶链式反应 |
| 3.2.5 回收目的片段DNA |
| 3.2.6 目的片段的连接 |
| 3.2.7 转化感受态细胞DH5α及蓝白斑筛选 |
| 3.2.8 菌落PCR |
| 3.2.9 质粒DNA的小量提取 |
| 3.2.10 限制性酶切反应 |
| 3.2.11 测序 |
| 3.2.12 序列拼接及系统分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RT-PCR结果 |
| 3.3.2 目的片段的回收结果 |
| 3.3.3 菌落PCR结果 |
| 3.3.4 质粒DNA的提取电泳结果 |
| 3.3.5 酶切结果 |
| 3.3.6 序列测定及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 烟草脉带花叶病毒3’末端基因组的克隆及序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 病毒RNA的提取 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 反转录 |
| 4.1.5 聚合酶链式反应 |
| 4.1.6 回收目的片段DNA |
| 4.1.7 目的片段的连接 |
| 4.1.8 转化大肠杆菌DH5α及蓝白斑筛选 |
| 4.1.9 菌落PCR |
| 4.1.10 质粒DNA的小量提取 |
| 4.1.11 测序 |
| 4.1.12 序列拼接及分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RT-PCR结果 |
| 4.2.2 目的片段回收结果 |
| 4.2.3 菌落PCR鉴定结果 |
| 4.2.4 质粒DNA的电泳鉴定 |
| 4.2.5 测序及序列分析 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究[D]. 刘珊珊. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作[D]. 夏烨. 华南农业大学, 2017(08)
- [3]烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化[D]. 王德亚. 山东农业大学, 2017(08)
- [4]油茶内参基因的筛选与油脂合成相关酶基因的表达特征分析[D]. 宋志波. 中南林业科技大学, 2014(02)
- [5]烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用[J]. 龙亚芹,王万东,左瑞娟,李凡,尹朝先,陈海如. 农业生物技术学报, 2011(02)
- [6]烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达[J]. 龙亚芹,左瑞娟,李凡,赵秀兰,李玲,陈海如. 华南农业大学学报, 2010(02)
- [7]烟草植物保护技术发展现状与趋势[A]. 王凤龙,任广伟,张成省. 2009-2010烟草科学与技术学科发展报告, 2010
- [8]云南烟草病毒检测及防治研究[D]. 刘勇. 浙江大学, 2006(03)
- [9]生物技术在我国烟草研究领域的应用[J]. 杨铁钊,鲁黎明,王瑞华. 中国烟草学报, 2006(03)
- [10]三种马铃薯Y病毒属病毒的分子特性[D]. 田延平. 山东农业大学, 2006(12)