一、NO、NOS与血管平滑肌细胞周期调控（论文文献综述）
张振东[1]（2021）在《基于多组学分析AEE抗血管内皮细胞氧化损伤的分子机制》文中研究指明本研究以H2O2诱导的人脐内静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）为体外氧化损伤模型,将HUVECs随机分成三组,分别为对照组（正常组）、H2O2组（模型组）和AEE组。采用转录组学、蛋白组学和乙酰化修饰组学技术,从细胞水平上揭示阿司匹林丁香酚酯（Aspirin eugenol ester,AEE）抗内皮细胞氧化损伤的分子机制。采用细胞免疫荧光、蛋白质免疫印迹、基因敲减等分子生物学技术,并通过AMPK/m TOR、PI3K/AKT和ASK1信号通路验证AEE抗血管内皮损伤的分子调控机制。1、与H2O2组相比,AEE组中共有9111个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）（p<0.05）,其中上调DEGs 4532个,下调DEGs 4579个。DEGs的基因本体论（GO）富集在蛋白质结合、蛋白磷酸化、转移酶活性、细胞核、线粒体膜和内质网上。京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集在三羧酸循环、MAPK和m TOR等信号通路上。其中201个DEGs（p<0.01）参与了脂质合成与降解、应激反应和细胞自噬等过程。2、与H2O2组相比,AEE组中共有355个差异表达蛋白（Differentially expressed proteins,DEPs）（p<0.05）,其中上调DEPs 205个,下调DEPs 150个。GO富集在抗氧化活性、信号转导上。DEPs主要富集在细胞凋亡、AMPK/m TOR信号通路上。其中,154个DEPs（p<0.01）参与了细胞凋亡、动脉粥样硬化等过程。3、与H2O2组比,AEE组中共有383个差异表达乙酰化蛋白（p<0.05）,其中上调154个,下调229个,519个差异表达乙酰化位点（p<0.05）,其中上调差异表达乙酰化位点329个,下调差异表达乙酰化位点190个。差异表达乙酰化蛋白的GO富集主要在分子转导和抗氧化活性上。差异表达乙酰化蛋白的KEGG富集主要在细胞糖异生与代谢途径、氧化磷酸化上。其中,109个差异表达乙酰化蛋白和123个乙酰化位点（p<0.01）参与了细胞氧化磷酸化、细胞自噬等过程。4、相对于H2O2组,AEE预处理能显着提高p-AMPK、p-ULK1和Bcl2的表达,显着抑制p-m TOR、p-p70S6K和Bax的表达。分别使用抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、自噬抑制剂氯喹（CQ）、自噬激活剂雷帕霉素（RAPA）、AMPK抑制剂和sh RNA技术干预HUVECs,结果表明,AEE能够通过AMPK/m TOR信号通路介导细胞自噬有效地预防H2O2诱导的HUVECs氧化损伤。5、相对于H2O2组,不同浓度的AEE（0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM）在不同时间点（6h、12 h、24 h、36 h）处理HUVECs后,p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT表达显着升高。分别使用PI3K抑制剂和sh RNA技术敲减PI3K蛋白,结果表明,AEE能够通过PI3K/AKT信号通路有效地预防H2O2诱导的HUVECs氧化损伤。6、相对于正常对照组,H2O2在不同时间点（8 h、16 h）能够显着提高ASK1、p-p38MAPK和p-SAPK/JNK的表达,显着抑制p-ERK1/2的表达。相对于H2O2组,AEE（1.0μM）在不同时间点（0.5 h、2 h、8 h、16 h）处理HUVECs后,p-p38MAPK、p-SAPK/JNK和ASK1显着降低,p-ERK1/2显着升高。分别使用ASK1、ERK1、ERK2相应的抑制剂和sh RNA敲减ASK1和ERK1/2,结果表明,AEE能够通过ASK1信号通路有效地预防H2O2诱导的HUVECs氧化损伤。综上所述,基于转录组学、蛋白质组学和乙酰化修饰组学联合分析,AEE抗血管内皮氧化损伤的药理活性可能与AMPK/m TOR、PI3K/AKT和ASK1信号通路有关。
王耀振[2]（2021）在《基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制》文中指出二型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是全球范围内的主要健康问题,其对血管可产生严重的危害作用,即糖尿病血管病变,这也是导致T2DM患者致残致死的主要原因。胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）作为T2DM的典型特点,不仅是促进其发生发展的关键因素,还是代谢综合征导致内皮功能障碍的重要原因。内皮是血管的第一道屏障,承担多种自分泌、旁分泌和内分泌功能,而内皮功能障碍是血管功能障碍的早期致病事件,其与IR相互促进,共同在糖尿病心血管并发症中发挥了重要作用。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）是一种具有内分泌特点的肽能系统,主要负责维持血压和水电解质的平衡,其中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）/血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）/血管紧张素1型受体（angiotensin type 1 receptor,AT1R）轴在糖尿病及其并发症的发生发展中起到了重要作用,该轴的关键效应分子-Ang II,参与多种病理生理过程,包括氧化应激、炎症反应、纤维化、肥大和内皮功能障碍等。血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）/血管紧张素1-7[angiotensin-（1-7）,Ang-（1-7）]/Mas轴拮抗了ACE/Ang II/AT1R轴的功能,其保护作用不仅依赖于对Ang II的降解,还依赖于生成Ang-（1-7）作用于Mas所产生的抗氧化、抗炎、抗肥大、血管舒张及改善内皮功能障碍等作用。尽管有研究表明ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴可改善代谢IR,并且Ang-（1-7）可改善db/db小鼠内皮功能障碍和Ang II诱导的内皮细胞IR,但ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴与内皮IR的相关研究仍鲜有报道,因此进一步研究其与内皮细胞IR的关系有助于深入理解IR的分子机制,从而以新的角度防治糖尿病心血管并发症。人参皂苷Rc是原人参二醇组皂苷的单体成分并且是人参皂苷的主要成分之一,有关人参皂苷Rc药理活性的研究相对较少,仅有少数研究报道了其具有强大的抗炎和抗氧化活性,而人参皂苷Rc对糖尿病心血管并发症是否具有潜在的保护作用尚不清楚。其同分异构体人参皂苷Rb2与人参皂苷Rb3已被证实具有显着的心血管保护作用,并且还有研究表明了人参皂苷与RAS具有密切关系。鉴于炎症和氧化应激是导致IR的关键机制以及ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴在心血管疾病中的重要保护作用,我们推测人参皂苷Rc可能通过激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴改善内皮IR与内皮功能障碍,故开展此研究对其进行初步验证。我们首先应用高糖（high glucose,HG）建立了人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）IR模型（30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h）。实验结果显示,HG对HUVECs的存活率和形态无明显影响;HG可显着降低HUVECs的NO分泌含量并升高ET-1 mRNA水平,提示其破坏了血管舒缩因子的平衡;HG可显着降低HUVECs的p-IRS1Tyr896、p-PI3K p85Tyr607、p-Akt Ser473及p-eNOSSer1177水平并升高p-IRS1Ser307水平,提示其损害了胰岛素信号转导;HG可显着减少HUVECs的ACE2及Mas蛋白表达,提示其可能损害了ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴的保护作用。以上结果表明HG成功诱导HUVECs IR并可减少ACE2及Mas蛋白表达。我们进而加入人参皂苷Rc（25、50 mmol/L）与HG同步处理,观察其对HUVECs IR是否具有改善作用。实验结果显示,人参皂苷Rc可显着升高HUVECs的NO分泌含量并降低ET-1 mRNA水平,提示其纠正了血管舒缩因子的失衡;人参皂苷Rc可减少HUVECs的ROS产生,显着降低培养液上清MDA含量并升高SOD活性,提示其增强了HUVECs的抗氧化应激能力;人参皂苷Rc可显着降低HUVECs的TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA水平,提示其增强了HUVECs的抗炎能力;人参皂苷Rc可显着降低HUVECs培养液上清Ang II含量,进一步升高Ang-（1-7）含量,增加ACE2及Mas蛋白表达,而HG或人参皂苷Rc对ACE2及Mas mRNA水平无明显影响,提示人参皂苷Rc可通过非转录调控方式激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴;人参皂苷Rc可显着升高HUVECs的p-IRS1Tyr896、p-PI3K p85Tyr607、p-AktSer473及p-eNOSSer1177水平并降低p-IRS1Ser307水平,提示其恢复了胰岛素信号转导;人参皂苷Rc可显着减少NOX2蛋白表达,降低p-IKKβSer177/181、p-JNKThr183/Tyr185及p-NF-κB p65Ser536水平,提示其抑制了IR相关的氧化应激和炎症信号。以上结果表明,人参皂苷Rc可能通过抗氧化、抗炎和上调ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴改善内皮IR。为进一步明确人参皂苷Rc改善内皮IR的潜在机制,我们应用ACE2特异性抑制剂MLN-4760（100 nmol/L）与HG及人参皂苷Rc同步处理。实验结果显示,MLN-4760可显着抑制人参皂苷Rc纠正血管舒缩因子失衡、抗炎、激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴、恢复胰岛素信号转导及抑制IR相关氧化应激和炎症信号的作用;然而,MLN-4760未能抑制人参皂苷Rc减少HUVECs的ROS产生、降低培养液上清MDA含量并升高SOD活性的作用,提示人参皂苷Rc具有独立于ACE2的抗氧化应激能力。以上结果表明,人参皂苷Rc的抗氧化及抗炎作用一定程度上依赖于上调ACE2,并且其通过上调ACE2改善了内皮IR。基于体外实验结果,我们应用T2DM模型的db/db小鼠和MLN-4760,进一步观察人参皂苷Rc是否对在体的内皮功能障碍同样具有改善作用及其机制是否同样依赖于上调ACE2。实验结果显示,人参皂苷Rc对db/db小鼠体重、空腹血糖、血清脂质（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及胰岛素含量无明显影响,提示其无降血糖及调血脂的作用;人参皂苷Rc可显着降低db/db小鼠血清TNF-α含量,提示其在体内同样具有抗炎作用,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc对db/db小鼠血清Ang II、Ang-（1-7）及主动脉Ang-（1-7）含量无明显影响,但可显着降低主动脉Ang II含量并增加ACE2及Mas蛋白表达,提示其在体内同样可上调ACE2及Mas,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc可显着改善db/db小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张并恢复Akt/eNOS信号转导,提示其在体内可改善内皮功能,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc可显着减少db/db小鼠主动脉NOX2及NOX4蛋白表达,提示其在体内同样具有抗氧化作用,而MLN-4760可一定程度拮抗这种作用。以上结果表明,人参皂苷Rc可改善db/db小鼠主动脉内皮功能障碍,其机制可能更依赖于降解Ang II而不是生成Ang-（1-7）,且不依赖于对血糖和血脂的调节。综上所述,本研究从细胞水平和整体动物水平上,证实了人参皂苷Rc可通过上调ACE2蛋白改善HUVECs IR及db/db小鼠内皮功能障碍,不仅发现了人参皂苷Rc的新作用及其潜在机制,还为防治糖尿病心血管并发症提供了新的视角。
谌子诺[3]（2021）在《基于靶点预测和高通量测序的丹蒌片干预稳定型心绞痛作用机制研究》文中指出越来越多的研究表明,中医治疗通过病证结合的辨治模式,在防治冠心病及其并发症方面发挥了重要作用。国内学者研究发现冠心病心绞痛患者常见证候要素中,属实证的证候要素以血瘀和痰浊出现频率最高。因此可见,痰与瘀是冠心病常见的证候要素,两者又多相互兼杂。《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗专家共识》中指出针对痰瘀互结证患者,可选用中成药丹蒌片。现代研究表明丹蒌片对痰瘀互结型冠心病患者具有良好的临床治疗效果,能够调节血脂代谢系统,改善动脉粥样硬化,恢复心肌供血。目的:1.构建丹蒌片干预冠心病稳定型心绞痛的“成分-靶点”网络。2.聚类富集分析丹蒌片“寒、凉、温”不同药性的作用机制。3.临床研究获取丹蒌片干预稳定型心绞痛前后的差异基因,生信分析并验证药理预测网络。方法:1.丹蒌片干预稳定型心绞痛的“成分-靶点”网络预测。通过数据库与系统文献检索,收集丹蒌片药物成分;运用TCMSP、TCMID数据库和文献检索筛选成分的对应靶点;利用Cytoscape构建“成分-靶点”网络。结合STRING6等数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用映射,以MC.ODE算法识别核心节点,进行PPI网络功能注释。2.丹蒌片中药四性的分类功能富集。在构建的丹蒌片“成分-靶点”数据库中分别提取寒药、凉药、温药中活性成分对应的靶点,将获得的成分靶点分别输入Webgestalt生信分析工具,选择物种为人类基因组,运用ORA富集方法,通路选择KEGG与GO（BP、CC、MF）项目进行可视化分析。3.丹蒌片干预稳定型心绞痛痰瘀互结证的差异基因检测。选择试验组与对照组各5例受试者,采集干预前后血液4ml,进行高通量RNA测序,筛选找到丹蒌片干预稳定型心绞痛痰瘀互结证的差异基因表达谱,统一为Gene Symbol格式,与预测的药物成分靶点映射取交集,进行生物学注释与通路分析。结果:1.通过TCMSP数据库检索到丹蒌片药物活性成分共190个,根据《中国药典》与文献检索补充57个成分,将补充数据与TCMSP数据库检索数据比较去重后获得丹蒌片活性成分（瓜萎15个、薤白13个、葛根17个、川芎17个、丹参80个、赤芍36个、泽泻13个、黄芪26个、骨碎补20个和郁金17个）。通过TCMSP、TCMID数据库和文献检索筛选出丹蒌片活性成分对应的药理作用靶点,去除重复值后共得到369个药物成分靶点。利用OMIM、Drugbank、GeneCards、TTD与DisGeNET数据库查找稳定型心绞痛相关基因,去重后共计3385个疾病靶点。将丹蒌片的成分靶点与稳定型心绞痛的疾病靶点取交集得到292个基因,利用Cytoscape软件对其网络对应关系进行可视化处理。根据节点度值筛选发现排名前5的药物成分包括quercetin（槲皮素）、Daidzein（黄豆苷元）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、Puerarin（葛根素）,以上成分的度值均超过50,与多个疾病靶点相关,可能是丹蒌片干预稳定型心绞痛的主要活性成分。度值排名前5的靶点有6个,包括PTGS1（前列腺素内过氧化物合成酶1）、PTGS2（前列腺素内过氧化物合成酶2）、HSP90AA1（热休克蛋白90 α家族A类成员1）、NCOA2（核受体辅激活蛋白2）、ADRB2（β2肾上腺素能受体）、F2（凝血酶）,以上靶点的度值均超过40,与多个药物成分有靶向关系,可能是丹蒌片干预稳定型心绞痛药理网络中的核心节点。基于成分靶点与疾病靶点交集的292个基因,通过Metascape平台映射蛋白质间的相互作用关系,选取其中7类具有代表性的MCODE模块可视化分析,发现丹蒌片可能具有抗病毒感染、保护脊髓损伤、调节类固醇激素代谢、与GPCR配体结合、介导抗炎细胞因子、转运调节生长因子、活化中性粒细胞等多种药理作用。2.根据2020年版《中国药典》中关于丹蒌片组成的中药四性记载,将丹蒌片组成药物按药性分类,将大寒、寒、微寒统一归于寒,将温、微温均归于温。结果发现方中有寒药（瓜蒌、泽泻、郁金、丹参、赤芍）、凉药（葛根）、温药（薤白、川芎、骨碎补、黄芪）,无热性药物。基于第二章研究结果,在文献与TCMSP数据库提取到丹蒌片中寒药104个活性成分,检索获得对应的247个作用靶点;凉药12个活性成分,检索获得对应的159个作用靶点,温药58个活性成分,检索获得对应的296个作用靶点。按寒药、凉药、温药分类输入Webgestalt生信分析工具,选择物种为人类基因组,运用ORA富集方法,开展KEGG与GO通路富集,并进行可视化分析。结果发现在KEGG前10通路上,丹蒌片中寒药与凉药作用共同的通路“流体剪应力与动脉粥样硬化”,其原理可能与两者的组成药物皆具有辅助血行的功效有关。此外,寒药与温药均作用于IL-17信号通路。GO富集前10的结果表明寒药与温药的生物学过程都作用于炎症反应与免疫调节、应激反应与防御反应、细胞活化与分泌等方向。而凉药与另外两组存在部分差异,具体包括正调控多细胞生物过程、正调节催化活性、正调控细胞迁移、负调节刺激反应、稳态过程与细胞内信号转导的调节等方面。在细胞组成上,寒、温、凉药均与神经元投射相关、膜筏与质膜相关。其中寒药和温药还涉及树突区室,即神经元主要接受信号的部分。在分子功能上,寒药与凉药均与神经递质受体活性、G蛋白偶联胺受体活性、蛋白激酶结合、蛋白质同源二聚活性相关,而仅温药具有核受体活性。3.临床研究纳入受试者10例,干预前两组基线比较无显着性差异。试验过程中对照组1例患者脱落,4周药物干预结束后共计获实验组样本5例,对照组样本4例。依据2018年《冠心病心绞痛中医疗效评价标准》进行中医疗效评价,结果发现干预前试验组与对照组无统计学差异（p>0.05）,干预后试验组与对照组有统计学差异（p<0.05）。高通量测序后根据蛋白编码基因在不同样本中的表达量进行差异筛选,去除试验组中与对照组交集的33个基因（混杂因素）,剩下64个丹蒌片作用基因（其中52个上调,12个下调）,绘制火山图以查看两组治疗前后差异基因的整体分布情况。富集GO项目的显着节点发现试验组在生物学过程中下调较上调基因增加“节律过程”;细胞组成中,“突触”为下调项目独有,而“细胞外基质”为上调项目独有;分子功能中,上调项目较下调增加“酶调节活性”、“分子传感器活性”、“核酸结合转录因子,活性”、“蛋白质结合转录因子活性”、“受体调节活性”。KEGG top20分析发现试验组较对照组增加“幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导”、“上皮细胞的细菌入侵”、“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“造血细胞谱系”、“紧密连接”、“粘附连接”与“EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗”。将高通量测序得到的64个基因与预测的丹蒌片药物成分靶点数据库（369个靶点）比对,映射得到4个基因（EGF、F3、MET、MGST1）。以上基因对应药物成分的口服利用度均大于30,推测口服利用度高可能是药物疗效作用的基础。将这4个基因与构建的稳定型心绞痛的疾病靶点库（3385个靶点）比对,结果发现只有EGF、F3同时录属疾病靶点。综上,高通量测序结果验证了“成分-靶点”预测网络中的部分节点。结论:1.丹蒌片干预稳定型心绞痛具有复杂的多靶点药理作用机制,其核心药物成分可能与黄酮类化合物相关,主要药物靶点可能与炎症等基因相关。2.在药物共通性上,KEGG富集前10结果提示丹蒌片中寒药与凉药都作用于通路“流体剪应力与动脉粥样硬化”,其原理可能与寒药及凉药的组成药物皆具有辅助血行的功效有关。此外,寒药与温药均作用于IL-17信号通路。3.高通量测序结果表明丹蒌片干预冠心病稳定型心绞痛的活性成分之一可能是槲皮素,主要的靶点包括EGF与F3,这与“成分-靶点”预测网络的结果部分吻合。
范韶华[4]（2021）在《胰高血糖素样肽1及其受体在心血管中保护作用的分子机制研究》文中认为在全球范围内,每年因心血管疾病发病死亡的人数约占总体死亡人数的三分之一。目前,随着心血管疾病的患病率及死亡率还正处于持续攀升的阶段,心血管疾病患者的住院医疗费用正在快速增加。心血管疾病的压力和负荷日渐增强,已发展成为了全世界严峻的公共健康安全问题,心血管疾病的防治刻不容缓。胰高血糖素样肽1（Glucagon like peptide-1,GLP-1）是一种由肠道L细胞直接分泌的肠促胰岛素多肽,目前已被广泛应用于II型糖尿病的临床治疗中。最近几年在研究GLP-1时,发现它能够良好地保护人体的心血管系统。然而,GLP-1在改善心血管疾病中的详细作用分子机制还不清楚。本研究将自发性高血压患者大鼠（Spontaneous Hypertension Rat,SHR）作为体内的心肌肥厚和血管重构模型,血管紧张素II（Angiotensin II,Ang Ⅱ）诱导的H9C2心肌细胞构建体外心肌肥厚模型,Ang Ⅱ诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（Rat aorta smooth muscle cells,RASMC）构建体外血管重构模型。从心血管疾病的心肌肥厚和血管重构两方面阐述GLP-1在心血管中发挥保护作用的分子机制。主要研究内容包括以下几个部分:（1）GLP-1改善心肌肥厚分子机制研究。在体内心肌肥厚动物模型中,通过BL-420生物信号采集与分析系统、HE染色、Masson染色和透射电镜检测GLP-1类似物Liraglutide和二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase-4,DPP4）抑制剂Alogliptin对SHR大鼠心肌肥厚的影响。结果表明Liraglutide和Alogliptin可以降低SHR的心率、心重;改善SHR造成的心肌细胞肥厚;减弱SHR心脏胶原纤维含量;防止线粒体增生、肿大,促使心脏规则排列,保持心肌细胞形态完整。在体外的心肌肥厚模型中,使用不同浓度的GLP-1（5 n M、10 n M和20 n M）处理H9C2,检测GLP-1对心肌肥厚的影响。免疫荧光和免疫印迹结果表明GLP-1呈浓度依赖的方式减弱Ang Ⅱ造成的H9C2心肌细胞肥大,同时下调心肌肥厚标志基因（ANP、BNP和β-MHC）的表达。蛋白激酶A（PKA）和含Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2（ROCK2）的抑制剂H89和Y27632能够削弱GLP-1改善心肌肥厚的效果。上述结果揭示GLP-1改善心肌肥厚的分子机制:GLP-1通过c AMP/PKA/Rho A/ROCK2信号途径降低引发心肌肥厚的相关蛋白表达进而改善心肌肥厚,揭示ROCK2可以作为抵抗心肌肥厚的一个治疗靶点。（2）GLP-1改善血管重构的分子机制研究。在体内血管重构动物模型中,采用HE染色、Masson染色和免疫印迹法检测Liraglutide和Alogliptin对血管壁厚度、血管腔、血管胶原纤维和细胞外基质的影响。结果表明Liraglutide和Alogliptin能够减轻SHR引起的血管壁增厚、血管腔狭窄和细胞外基质紊乱。在体外的血管重构模型中,通过MTT、细胞流式和免疫印迹检测GLP-1对RASMC细胞增殖和细胞周期的影响,结果表明GLP-1能够呈浓度依赖型抑制Ang Ⅱ造成的RASMC细胞异常增殖。细胞划痕实验结果表明GLP-1以同样的方式抑制Ang Ⅱ引起的RASMC细胞异常迁移。GLP-1R拮抗剂Exendin 9-39的处理使GLP-1对Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞异常增殖和迁移的抑制作用消失。免疫印迹实验结果表明GLP-1可以减弱Ang Ⅱ造成的细胞外基质中col1a、col3a1、MMP9、MMP2和MMP1表达的上调。但基质金属蛋白酶1（MMP1）的敲除及其抑制剂的处理加强了GLP-1对Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞异常增殖和迁移的抑制作用。细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）信号通路的失活使GLP-1对MMP1表达的下调作用增强,此外,GLP-1阻止了Ang Ⅱ引起的核因子激活的B细胞的κ-轻链增强（NF-κB）的核输入。这些实验结果显示GLP-1对血管重构发挥有益作用的分子机制:GLP-1通过激活GLP-1R,促使ERK1/2-NF-κB信号失活进而降低MMP1的表达,MMP1表达的下调阻止RASMC细胞的异常增殖和迁移,进而改善血管重构引起的血管壁增厚。（3）Ang Ⅱ诱导的GLP-1R核输出分子机制研究。采用免疫荧光和免疫组化分别检测体内和体外血管重构模型中GLP-1R的亚细胞定位。结果表明在正常的生理条件下和静息状态的RASMC细胞中,GLP-1R亚细胞定位主要集中在细胞核,而在血管重构的病理条件下和Ang Ⅱ刺激RASMC细胞时,GLP-1R的亚细胞定位从细胞核向细胞质发生转移。利用生物信息学和基因缺失实验,确定GLP-1R的8-17氨基酸序列是GLP-1R的NES序列。经典核输出抑制剂LMB的干预能够抑制Ang Ⅱ诱导的核输出现象,当NES缺失后,Ang Ⅱ诱导的GLP-1R核输出被抑制。免疫共沉淀结果也表明Ang Ⅱ能够促进GLP-1R与核转运受体CRM1的结合,而NES缺失时,Ang Ⅱ诱导的GLP-1R不再与CRM1结合。在Ang Ⅱ诱导的血管重构体外模型中,利用Ang Ⅱ/AT1R信号途径的常见的几种信号通路抑制剂,结合GLP-1R亚细胞定位的检测,探究Ang Ⅱ引起GLP-1R核输出的分子机制。实验结果表明Ang Ⅱ是通过激活PI3K/PDK1/Akt/PKCθ信号通路促进GLP-1R核输出的,进一步分析了PKCθ对GLP-1R核输出的调控,结果表明Akt促进PKCθ核输入,在细胞核内磷酸化GLP-1R的Ser416位点,引起GLP-1R与CRM1结合,通过经典的核输出途径引发GLP-1R核输出现象。一旦PKCθ特异性抑制剂提前处理Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞,PKCθ的核输入被抑制,GLP-1R不再发生核输出;但当GLP-1R中Ser416突变为Ala（S416A）时,GLP-1R与PKCθ共定位在细胞核,GLP-1与CRM1的结合消失;而当Ser416模拟磷酸化（S416D）后,GLP-1R S416D能够与CRM1结合,发生核输出。总之,本部分首次阐述了Ang Ⅱ诱导的血管重构病理生理状态下,GLP-1R发生核输出的具体分子机制:Ang Ⅱ通过与AT1R受体结合激活PI3K/PDK1/Ak/PKCθ信号通路,磷酸化的PKCθ进入细胞核磷酸化GLP-1R Ser416位点,磷酸化后的GLP-1R通过与CRM1结合发生核输出。（4）GLP-1R亚细胞定位对RASMC细胞增殖和迁移的调控分子机制研究。我们将RASMC细胞内源性的GLP-1R进行沉默,然后人为构建缺失NES和核定位信号序列（Nuclear localization sequences,NLS）的GLP-1R缺失体,使其分别定位在细胞核或细胞质中,通过MTT、免疫印迹和细胞划痕实验检测了GLP-1R亚细胞定位对RASMC细胞增殖和迁移的影响。实验结果表明GLP-1R的胞质定位能够明显促进RASMC细胞增殖和迁移,此外,我们还发现当Ang Ⅱ诱导的GLP-1R核输出被LMB抑制后,Ang Ⅱ促进RASMC细胞增殖和迁移的作用也被减弱。我们分别将C14orf166进行敲除和过表达检测了其对Ang Ⅱ促进RASMC细胞增殖和迁移的影响,实验结果表明C14orf166表达的降低能够抑制Ang Ⅱ对RASMC细胞增殖和迁移的促进作用,C14orf166表达的上调能够加强Ang Ⅱ促进RASMC细胞增殖和迁移的作用。然而Ang Ⅱ对C14orf166的蛋白表达和m RNA水平没有影响,说明C14orf166并不是通过调节表达量的高低来发挥作用。进一步我们检测了C14orf166与GLP-1R的相互作用。免疫共沉淀结果表明C14orf166与GLP-1R在Ang Ⅱ干预前可以形成复合物,一旦经Ang Ⅱ的处理,则发生复合物的解离。我们还发现C14orf166与模拟磷酸化状态的GLP-1R（S416/D）不存在结合,却可以与去磷酸化状态的GLP-1R（S416/A）结合。当PKCθ活性被抑制后,会逆转Ang Ⅱ对C14orf166和GLP-1R复合物的解离作用。本部分首次阐述了GLP-1R核输出调控RASMC细胞增殖和迁移的分子机制:正常情况下在细胞核内GLP-1R与C14orf166结合抑制了RASMC细胞的增殖和迁移,一旦Ang Ⅱ干预后,GLP-1R和C14orf166形成的复合物解离,GLP-1R发生核输出,导致细胞内失去对C14orf166的抑制作用,C14orf166本身就是促细胞增殖的因子,导致RASMC细胞增殖和迁移。总之,本研究论述了GLP-1在心肌肥厚和血管重构的积极作用和具体的分子机制。在GLP-1改善血管重构的过程中,我们首次观察到了GLP-1R亚细胞定位从细胞核向细胞质的转移,并对Ang Ⅱ引发GLP-1R核输出的分子机制进行了详细的阐述;进一步讨论了GLP-1R的核输出引发RASMC细胞的异常增殖和迁移原因。本工作为GLP-1R功能的深入分析提供了新的研究方向,为GLP-1及GLP-1R在心血管疾病的预防策略和治疗手段方面提供了一定的临床基础研究理论和依据。
占钻[5]（2021）在《咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究》文中研究指明第1部分人体腹主动脉瘤组织的病理学研究目的:观察人体腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）组织的病理学特点及沉默信息转录调控因子1（silent information regulator of transcription 1,SIRT1）、核因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）及CD40等蛋白的表达情况,为后续深入研究早期AAA的药物治疗方法及相关机制建立基础。方法:1、收集我院外科手术切除的人体AAA标本及正常人腹主动脉标本（各3例）,HE染色观察组织的病理学表现,VG染色观察血管壁弹力纤维破坏程度;2、通过免疫组织化学染色法检测CD31及CD68表达水平,评估AAA瘤壁组织新生血管形成及巨噬细胞浸润水平;3、免疫组织化学染色法检测SIRT1、NF-κBp65、基质金属蛋白酶2（Matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶9（Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9）及CD40蛋白表达水平。结果:1、HE染色显示人体AAA组织中膜变薄,中膜和外膜见明显炎症细胞浸润聚集,可见明显新生血管形成。VG染色显示血管壁弹力纤维降解,连续性中断,大量的炎性细胞浸润破坏分隔中膜;2、免疫组化染色显示人体正常腹主动脉组织CD31及CD68几乎不表达,AAA瘤壁CD31及CD68表达明显增多,以中膜及外膜区域为主,与正常腹主动脉相比差异有显着性（p<0.05）;3、正常腹主动脉组织CD40、NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白呈较低表达,SIRT1蛋白呈高表达,与正常腹主动脉组织相比,AAA瘤壁CD40、NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白表达水平明显升高,SIRT1蛋白表达水平下降,差异有显着性（p<0.05）。结论:人体AAA形成与炎症浸润、新生血管形成、MMPs、SIRT1、NF-κB及CD40等蛋白表达有关,从这些角度出发通过体内外实验进一步研究AAA的内科治疗方法及机制具有一定的意义。第2部分咖啡酸苯乙酯对大鼠AAA形成早期保护作用的研究目的:研究咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phenethyl ester,CAPE）在大鼠AAA形成早期的保护作用及可能的相关机制,探索CAPE在早期AAA的内科治疗中的潜力。方法:1、18只健康雄性SD大鼠被随机分为假手术组、模型组及CAPE干预组（每组各6只）。模型组通过注射（猪胰）弹性蛋白酶法建立AAA模型,CAPE干预组腹腔注射CAPE 10μmol/kg/d,持续14 d,模型组和假手术组在相同时间点注射等剂量生理盐水。14 d后处死大鼠,采用游标卡尺测量瘤体及腹主动脉最大直径,判断动脉瘤大小,模型组及CAPE干预组留取弹性蛋白酶灌注处动脉组织,假手术组留取正常肾下腹主动脉组织标本,;2、HE染色、VG染色分别观察动脉瘤组织炎症浸润和弹力纤维破坏程度等病理改变;3、免疫组化法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达,TUNEL检测血管平滑肌细胞凋亡水平;4、组织ROS水平测定判断氧化应激水平;5、CD31免疫组织化学染色研究内膜新生血管形成;6、CD68、i NOS及CD206免疫组织化学染色研究巨噬细胞表型变化;7、免疫组织化学法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达;8、蛋白印迹法检测IL-6、SIRT1、NF-κBp65、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CD40蛋白的表达。结果:1、所有大鼠均存活,模型组大鼠术后14 d AAA成瘤率100%。CAPE干预组术后14 d有一只未达AAA标准,其余5只瘤体直径均超过灌注前直径的50%,成瘤率83%。三组大鼠腹主动脉直径于弹性蛋白酶灌注前无显着差异（p>0.05）。模型组及CAPE干预组大鼠腹主动脉直径于弹性蛋白酶灌注后即刻无显着差异（p>0.05）,但均较假手术组显着增加（p<0.05）。术后14 d模型组及CAPE干预组大鼠腹主动脉直径较假手术组显着增加（p<0.05）,但CAPE干预组较AAA模型组显着下降（p<0.05）;2、HE染色显示模型组动脉管壁呈瘤样扩张,组织结构紊乱,管壁炎症浸润明显。而在CAPE干预后瘤样扩张不明显,组织结构相对完整,有炎症浸润,但较模型组明显减少。VG染色结果显示,模型组AAA管壁中膜肌纤维较假手术组明显减少,胶原纤维紊乱不连续,降解明显,外膜增厚,与模型组相比,CAPE干预组中管壁中膜肌纤维增加,胶原纤维断裂及降解情况好转;3、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织α-SMA水平显着降低（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组表达则显着升高（p<0.05）。TUNEL法检测各组血管壁平滑肌细胞凋亡水平,结果显示,假手术组凋亡细胞几乎不可见,模型组及CAPE组可见明显增多（p<0.05）,而CAPE干预组凋亡细胞数量较模型组明显减少（p<0.05）;4、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织ROS含量显着增加（p<0.05）;与模型组相比,CAPE干预组ROS含量明显降低（p<0.05）;5、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD31表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组中CD31表达水平显着降低（p<0.05）;6、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD68、CD206及iNOS表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组CD68、iNOS表达水平显着降低（p<0.05）,而CD206表达水平增加（p<0.05）;7、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织MMP-2及MMP-9表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组MMP-2及MMP-9表达水平显着降低（p<0.05）;8、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD40、IL-6、MCP-1、MMP2、MMP9和NF-κBp65的蛋白表达水平均显着上升（p<0.05）,SIRT1表达显着下降（p<0.05）;与模型组相比,CAPE干预组中CD40、IL-6、MCP-1、MMP9和NF-κBp65的蛋白表达水平均显着降低（p<0.05）,SIRT1表达显着升高（p<0.05）,MMP-2无显着差异（p>0.05）,但呈下降趋势。结论:CAPE对大鼠早期AAA具有保护作用,这种保护作用可能与其抑制炎症反应、氧化应激、新生血管形成、血管平滑肌细胞凋亡、巨噬细胞促炎型M1极化及影响SIRT1、NF-κB、CD40等蛋白表达有关。第3部分CAPE抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的机制研究目的:研究CAPE对肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）刺激人脐静脉内皮细胞后炎症反应的抑制作用及与SIRT1、NF-κB、CD40蛋白相关的可能分子学机制,为探讨CAPE对早期AAA的保护作用提供理论基础。方法:1、体外培养人脐静脉内皮细胞,将细胞分为对照组及40μg/L、20μg/L及10μg/L的TNF-α刺激组,通过Western blot检测细胞孵育12 h后白介素6（Interleukin-6,IL-6）及单核细胞趋化因子1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）蛋白的表达水平;2、将细胞分为对照组、TNF-α组及80μM、40μM、10μM三种浓度CAPE干预组,通过Western blot检测各组细胞IL-6及MCP-1蛋白的表达水平;3、将细胞分为对照组、TNF-α组及CAPE+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中SIRT1蛋白的表达;4、将细胞分为对照组、TNF-α组,CAPE组、NAM+CAPE+TNF-α组及PDTC+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中CD40蛋白的表达;5、将细胞分为对照组、TNF-α组、CAPE+TNF-α组及NAM+CAPE+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中NF-κBp65蛋白的表达。结果:1、TNF-α呈浓度依赖性影响IL-6及MCP-1蛋白的表达,且10μg/L的TNF-α刺激后IL-6及MCP-1表达水平即较对照组显着升高（p<0.05）;2、各浓度组CAPE预刺激可显着抑制TNF-α刺激后MCP-1表达水平的升高,80μM及40μM的CAPE显着抑制TNF-α刺激后IL-6表达水平的升高（p<0.05）,但10μM干预组IL-6表达水平与TNF-α刺激组无显着差异（p>0.05）;3、正常内皮细胞SIRT1呈高表达,10μg/L TNF-α刺激后SIRT1表达水平较正常细胞组显着降低（p<0.05）,而40μM CAPE干预后SIRT1表达水平较TNF-α组显着升高（p<0.05）;4、10μg/L TNF-α刺激后CD40表达水平较对照组显着升高（p<0.05）,40μM CAPE干预后CD40表达水平较TNF-α组显着下降（p<0.05）,加入NAM后CAPE对CD40的抑制作用减弱,与CAPE组相比有显着差异（p<0.05）,与TNF-α组相比,加入PDTC对CD40有显着抑制作用（p<0.05）,且作用与CAPE组无明显差异（p>0.05）;5、与对照组相比,10μg/L TNF-α刺激后HUVECs的NF-κBp65表达水平显着升高（p<0.05）,而40μM CAPE干预后可以显着抑制TNF-α刺激引起的NF-κBp65表达升高（p<0.05）。加入NAM后,CAPE对NF-κBp65的抑制作用减弱。结论:CAPE可抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞后的炎症反应,这种作用与其通过SIRT1介导的NF-κB p65亚基去乙酰化抑制TNF-α诱导的内皮细胞中CD40表达有关。因此我们推测CAPE对早期AAA保护作用的机制可能与SIRT1/NF-κB/CD40通路有关。
文豪[6]（2020）在《17β-雌二醇上调METTL3促进PFKFB3 mRNA甲基化促进MCT诱导的肺动脉高压发展的机制研究》文中提出[研究背景]肺动脉高压（Pulmonary hypertension,PH）是一组严重的进行性肺动脉重塑性疾病,诊断标准为平均肺动脉压≥25 mmHg,最终将导致肺血管阻力增加、右心室衰竭。根据其病因可分为动脉性肺动脉高压、左心疾病所致肺动脉高压、缺氧和/或肺部疾病引起的肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、多种机制和/或不明机制引起的肺动脉高压,其中动脉性肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）是肺动脉高压五大类中的第一大类。临床上以钙离子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等药物治疗为主,但大部分患者疗效不佳,预后极差,中位生存期仅为2-8年。因此深入探究PAH的发病机制,积极探索治疗PAH的新靶点,将为PAH的预防和治疗,提高患者生活质量具有重要意义。PAH最主要的病理组织学特征是远端微小肺动脉血管重构。细胞代谢异常、内质网异常应激、钙稳态、线粒体功能及结构失调、表观遗传学异常修饰等均可导致肺血管中膜血管平滑肌由收缩型向合成型转化,合成型平滑肌具有更强的增殖、迁移能力,最终形成PAH典型血管丛状病变,表现为小血管呈丛状、网状或球样,或裂隙状杂乱增生重构。因此,进一步研究肺血管平滑肌细胞的功能及调控机制,将为PAH的治疗提供更多的理论基础和实验依据。近年来的研究证实,PAH与体内雌激素（E2）水平有关。流行病学资料显示PAH好发于女性,女性患病率为男性2-4倍。提示高水平E2可能促进PAH的发生和发展。进一步研究E2在PAH发生和发展中的作用及其分子机制,对选择有效的干预措施（雌激素替代疗法或拮抗疗法）和探索PAH防治新型靶点均具有重要意义。研究显示,PFKFB3在PAH中起关键促进作用。PFKFB3（磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3,phosphofructo kinase-2/fructose-2,6-bisphos phatase 3）是糖酵解（葡萄糖转化为乳酸并提供能量）的关键促进酶,其表达增高促进乳酸增多,进而刺激血管新生。此外,PFKFB3可激活细胞周期蛋白依赖性激酶,促进细胞增殖。肺血管平滑肌细胞PFKFB3可增加糖酵解水平,激活依赖ERK1/2的钙激活中性蛋白酶2磷酸化,促进平滑肌细胞的异常增殖,加速并加重肺血管重构。有研究显示E2可诱导MCF-7细胞中PFKFB3的表达,促进癌细胞的增殖和迁移。提示E2同样可能通过影响肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达,促进肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移,进而影响肺动脉高压的发生发展。因此,本课题将以PFKFB3为切入点,探讨E2在促进肺血管平滑肌增殖、迁移中的关键作用。新近研究显示,m6A作为mRNA最为普遍的修饰方式,在转录后调控发挥重要作用。m6A是指对mRNA上的腺嘌呤（A）进行甲基化修饰。这一修饰过程可逆,由甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化阅读蛋白（Readers）等共同参与,广泛参与哺乳动物的生殖发育、免疫、代谢、肿瘤生成和转移等过程。近期研究显示,甲基化转移酶3（METTL3）可以促进几种关键癌蛋白的表达,其高表达可增强癌细胞的增殖,迁移和侵袭。目前尚未有E2影响m6A修饰调控靶蛋白的报道。因此我们推测E2是否通过调控m6A mRNA甲基化酶METTL3表达,进而调控PFKFB3蛋白表达,影响肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移,这是本课题所研究的内容。为进一步验证E2通过METTL3促进PFKFB3的表达对PAH发生和发展的影响,本课题在整体动物水平上确认METTL3/PFKFB3在E2促进PAH发生、发展中的重要作用,即在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型+卵巢去势（OVX）模型中,通过免疫组织化学方法、Western blot、m6A检测试剂盒以及实时RT-PCR法检测各组大鼠模型METTL3/PFKFB3的表达水平,观察METTL3/PFKFB3在E2促进PAH发生和发展中的关键作用。[研究目的]本课题拟探讨E2通过调控METTL3上调PFKFB3的蛋白表达,进而促进肺血管平滑肌功能、促进肺动脉高压的发生发展,并研究其分子调控机制,证实METTL3/PFKFB3在E2促进肺动脉高压的发生和发展中的重要作用。[研究方法与结果]1.E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型的发展1.1 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型的疾病进展体重为200-250g的实验用6-8周龄成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠,给予正常饮食,随机分成6组（每组6只）。分组为:a)假手术组;b)OVX组;c)OVX+E2组。OVX组于颈部皮下植入17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）缓释片（0.25mg E2/60 days）。上述处理完成后恢复1周,即行常氧PAH造模:雌性SD大鼠一次性大腿前侧皮下注射野百合碱（MCT,50mg/kg）,对照组SD大鼠（假手术组、OVX组、OVX+E2组）注射相同体积剂量的生理盐水,置于SPF级动物房饲养,给予正常饮食。上述各组大鼠接受处理4周后,检测相关指标。1.1.1 MCT诱导的PAH各组大鼠模型血清中E2水平检测上述各组共36只成年雌性Sprague-Dawley大鼠,平均6-8周龄,采集血清,检测各组大鼠血清中17β-雌二醇（E2）表达水平。结果显示:与假手术组（Sham组）相比,OVX组大鼠血清E2水平明显降低,OVX+E2组大鼠血清E2水平较于OVX组明显增加,增加率为（165.3±23.7）%（n=6,P<0.01）;与Sham组相比,Sham+MCT组大鼠血清E2水平显着增加,增加率为（155.3±26.7）%（n=6,P<0.01）,OVX+MCT 组较于 Sham+MCT 组大鼠血清 E2 水平降低,但仍高于Sham组大鼠;而补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组（n=6）大鼠血清中E2水平显着高于OVX+MCT组,说明MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型体内血清E2水平高于正常大鼠（n=6,P<0.01）。1.1.2 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型右心室收缩压的影响结果显示:经皮下注射生理盐水的各组大鼠（n=6）右心室收缩压（RVSP）、在正常范围之内,与Sham+MCT组（n=6）比较,OVX+MCT组大鼠RVSP明显降低,降低率为（168.6±20.7）%（n=6,P<0.01）;与OVX+MCT组比较,补充E2缓释片后的 OVX+MCT+E2 组大鼠 RVSP 明显增加,增加率为（150.6±18.9）%（n=6,P<0.01）。1.1.3 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型右心肥厚指数的影响对各组大鼠采集完血流动力学指标后,打开胸腔取出心肺组织,分别测定各组大鼠右心肥厚指数。经皮下注射生理盐水的各组大鼠（n=6）右心肥厚指数（RI）在正常范围之内,与Sham+MCT组（n=6）比较,OVX+MCT组大鼠RI显着降低,降低率分别为（258.3+23.7）%（n=6,P<0.01）;与 OVX+MCT 组比较,补充 E2 缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠RI明显增加,增加率分别为（223.3±21.8）%（n=6,P<0.01）。1.1.4 E2对MCT诱导的PAH大鼠模型肺部组织病理改变的影响右心肥厚指数测定完成后行肺组织石蜡切片,伊红（HE）染色,观察各组大鼠肺部组织病理改变、远端肺小血管的中膜厚度。结果显示:经皮下注射生理盐水的各组大鼠（n=6）组大鼠的远端肺小血管的内膜完整,平滑肌层细胞排列规则,没有炎症细胞的浸润,全层无增厚。相对比Sham+生理盐水（n=6）、OVX+生理盐水（n=6）、OVX+E2+生理盐水（n=6）组,肺部组织免疫组化染色切片结果显示Sham+MCT组（n=6）大鼠的平滑肌细胞和细胞核的排列紊乱,平滑肌层增厚,血管管腔狭窄,肺血管及肺组织中有较多的中性粒细胞以及淋巴细胞的浸润;与Sham+MCT组（n=6）比较,OVX+MCT组（n=6）大鼠血管中膜厚度明显减少,减少率为（218.6±20.7）%（n=6,P<0.01）,在上述肺小血管组织病理上的变化有所改善;与OVX+MCT组（n=6）比较,补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠血管中膜厚度明显增加,增加率为（226.6±19.8）%（n=6,P<0.01）,上述肺小血管组织病理的变化显着恶化。1.2 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型肺动脉平滑肌层PFKFB3蛋白的表达将上述各组大鼠的远端肺小动脉从肺组织中分离,用显微镊将其外膜和内膜剥离干净后,冻存在-80℃冰箱中,随后将分离好的肺小动脉平滑肌层取出并称重并按一定的比例分别加入肺组织裂解液,使用机械匀浆器进行匀浆后放置于冰上,使用超声波破碎仪进行破碎、离心,留取上清液并分装于1.5 ml的离心管中,放置于-80℃冰箱进行保存。通过BCA法测定蛋白浓度后,利用Western blot法检测各组大鼠远端肺小动脉中PFKFB3的蛋白表达情况。用Trizol法提取肺小动脉平滑肌层RNA,用实时RT-PCR法检测各组大鼠远端肺小动脉中PFKFB3的mRNA表达情况。结果显示:与经颈部注射生理盐水的各组大鼠相比,Western blot和RT-PCR显示Sham+MCT组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显增加,增加率为（151.6±18.6）%（n=6,P<0.01）,PFKFB3 mRNA 水平无明显变化;与 Sham+MCT 组比较,OVX+MCT组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显降低,降低率为（152.8±19.6）%（n=6,P<0.01）,PFKFB3 mRNA 水平无明显变化;与 OVX+MCT 组比较,补充E2缓释片后的OVX+MCT+E2组大鼠远端肺小动脉的PFKFB3的蛋白表达明显增加,增加率为（268.6±25.7）%（n=6,P<0.01）,PFKFB3 mRNA水平无明显变化。2.E2增加肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的作用机制2.1 E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达2.1.1不同浓度E2处理相同时间,增加肺血管平滑肌细胞PFKFB3蛋白表达,不影响肺血管平滑肌细胞PFKFB3 mRNA表达。体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,给予不同浓度梯度（1nM-1μM）的E2处理24 h,应用Western blot方法观察PFKFB3蛋白表达情况,应用实时RT-PCR法观察PFKFB3 mRNA表达水平。结果显示:与对照组比较,分别给予不同浓度的E2（1 nM-1uM）处理24 h后,均能增加PFKFB3蛋白表达,增加率分别为（205.3±28.5）%（n=3,P<0.01）、（225.6±25.7）%（n=3,P<0.01）、（180.3±23.5）%（n=3,P<0.01）、（165.6±22.7）%（n=3,P<0.01）,而对PFKFB3 mRNA表达无明显影响。2.1.2同一浓度E2处理不同时间,增加肺血管平滑肌细胞PFKFB3蛋白表达,不影响肺血管平滑肌细胞PFKFB3 mRNA表达。体外培养PASMCs,给予E2（10nM）分别处理大鼠肺动脉平滑肌细胞不同时间（2h,4h,6h,8h,12h,24h）后,应用Western blot法观察PFKFB3蛋白表达水平,应用实时RT-PCR法观察PFKFB3 mRNA表达水平。结果显示:与对照组比较,分别给予E2（10 nM）处理2h,4h,6h,8h,12h,24h后,均能增加PFKFB3蛋白表达,增加率分别为（165.3±28.5）%（n=3,P<0.01）、（180.6±25.7）%（n=3,P<0.01）、（220.3±23.5）%（n=3,P<0.01）、（265.6±25.7）（n=3,P<0.01）、（320.3±21.5）%（n=3,P<0.01）、（150.6±23.7）%（n=3,P<0.01）,而对 PFKFB3 mRNA 表达无明显影响。2.2 E2通过ERα上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达体外培养 PASMCs,分别用 E2（10 nM）,PPT（ERα 激动剂,1 nM）,DPN（ERβ 激动剂,1 nM）,MPP（ERα 抑制剂,1nM）,PHTPP（ERβ抑制剂,1nM）,G15（GPR30抑制剂,1nM）处理大鼠肺动脉平滑肌细胞24 h,用Western blot法检测PFKFB3蛋白表达情况。结果显示,E2,PPT均能上调PFKFB3蛋白表达,上调幅度分别为（150.3±18.5）%（n=3,P<0.01）、（280.6±21.7）%（n=3,P<0.01）,而 DPN 上调作用不明显;E2 上调 PFKFB3的作用可被MPP所抑制,而不能被PHTPP或G15所抑制。结果说明,ERα参与E2上调PFKFB3蛋白表达的作用。2.3 E2通过上调PFKFB3蛋白表达促进肺血管平滑肌细胞的增殖、迁移体外培养PASMCs,分别转染大鼠PFKFB3过表达质粒或相应的空载质粒48h,或用PFKFB3小分子抑制剂3PO处理24h后,再给予E2（10 nM）处理PASMCs 24 h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:E2可促进肺血管平滑肌细胞的增殖、迁移能力;3PO抑制PFKFB3表达后,可显着抑制E2的上述作用（n=3,P<0.01）。此外,E2（10nM）处理细胞24 h,或同时转染PFKFB3过表达质粒,与对照组相比,E2处理可促进肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移;过表达PFKFB3后,可进一步促进肺血管平滑肌细胞增殖和迁移能力（n=3,P<0.01）。3.METTL3介导E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的作用机制3.1 E2对肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 mRNA m6A水平的影响体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,待细胞生长至90%融合时,提取total RNAs,按Magna MeRIPTM m6AKit试剂盒说明书操作:a)细胞mRNA提取纯化。b)mRNA片段化:热循环仪94℃加热mRNA 6min,使mRNA断裂成小于200nt片段。c)免疫沉淀:1×IP缓冲液重悬Protein A/G Magnetic Beads,加入抗m6A抗体孵育弃上清,加入片段化的mRNA溶液后,孵育弃上清。d)RNA的洗脱及纯化:在上述所得的沉淀中,加入RNA洗脱液,取上清液。采用RNA纯化试剂盒纯化RNA,溶于DEPC水中。e)RT-PCR:设计引物,行RT-PCR,分析各组CT值变化。结果显示:用E2（10nM）处理后,PFKFB3 mRNA发生m6A甲基化的水平增加,增加率为（203.6±20.9）%（n=3,P<0.01）。3.2 E2上调肺血管平滑肌细胞中m6A相关蛋白METTL3表达水平体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,予以不同浓度梯度（1nM-1μM）E2处理PASMCs 24h或用相同浓度E2（10nM）处理PASMCs不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,利用Western blot法观察E2对PASMCs中m6A主要相关蛋白（METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5）表达情况。结果显示:用不同浓度梯度的E2（1nM-1μM）处理PASMCs 24h后,METTL3蛋白表达水平均增加,增加率分别为（165.3±22.5）%（n=3,P<0.01）、（155.6±15.7）%（n=3,P<0.01）、（205.3±21.5）%（n=3,P<0.01）、（210.6±23.7）%（n=3,P<0.01）;用相同浓度E2（10nM）处理不同时间（1h、3h、6h、12h,24h）后,METTL3蛋白表达水平均增加,增加率分别为（145.3±28.5）%（n=3,P<0.01）、（155.6±26.7）%（n=3,P<0.01）、（148.3±21.6）%（n=3,P<0.01）、（205.6±23.8）%（n=3,P<0.01）、（195.3±22.5）%（n=3,P<0.01）,而METTL14、FTO、ALKBH5蛋白表达水平基本不变或降低。3.3 E2促进MCT诱导的PAH大鼠模型肺动脉平滑肌层METTL3表达实验方法同第一部分。结果显示:与经颈部注射生理盐水的各组大鼠相比,Western blot和RT-PCR显示假手术组+MCT组大鼠远端肺小动脉的METTL3的蛋白及 mRNA 表达明显增加,增加率分别为（205.6±23.6）%（n=6,P<0.01）、（165.6±21.9）%（n=6,P<0.01）;与假手术组+MCT组比较,OVX+MCT组大鼠远端肺小动脉的 METTL3 的蛋白及 mRNA 表达明显降低,降低率分别为（175.6±20.6）%（n=6,P<0.01）、（195.6±20.8）%（n=6,P<0.01）;与 OVX+MCT 组比较,补充雌激素后的OVX+MCT+E2组大鼠远端肺小动脉的METTL3的蛋白及mRNA表达则明显增加,增加率分别为（285.6±21.6）%（n=6,P<0.01）、（280.6±25.9）%（n=6,P<0.01）。3.4 METTL3介导E2上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 mRNA m6A水平从体外培养的大鼠PASMCs中提取total RNAs,并按Magna MeRIPTM m6A Kit试剂盒说明书操作,通过m6ARNA甲基化免疫沉淀试剂盒检测并给予E2处理后,分析METTL3对PFKFB3 mRNA发生m6A甲基化的情况。结果显示:通过MeRIP和RT-PCR法对METTL3敲低的大鼠PASMCs中的PFKFB3 m6A水平进行了评估,证实了 PFKFB3 m6A水平的降低,降低率为（805.6±22.9）%（n=3,P<0.01）,且 E2 处理后显着增加了 PFKFB3 mRNA 的 m6A 水平,增加率为（208.6±20.7）%（n=3,P<0.01）。3.5 E2通过ERα上调肺血管平滑肌细胞中METTL3蛋白表达水平体外培养 PASMCs,分别用 E2（10nM）,PPT（ERα 激动剂,1nM）,DPN（ERβ激动剂,1nM）,MPP（ERα抑制剂,1nM）,PHTPP（ERβ抑制剂,1nM）、G15（GPR30抑制剂,1nM）处理大鼠肺动脉平滑肌细胞24 h,用Western blot法检测METTL3蛋白表达情况。结果显示:E2,PPT均能上调METTL3蛋白表达,上调幅度分别为（180.3±18.9）%（n=3,P<0.01）、（240.6±20.7）%（n=3,P<0.01）,而 DPN 上调作用不明显;E2上调METTL3的作用可被MPP所抑制,而不能被PHTPP和G15所抑制。由此说明,ERα参与E2上调肺血管平滑肌细胞中METTL3蛋白表达的作用。3.6 METTL3介导E2对肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠阴性对照病毒、METTL3过表达慢病毒载体48h 或转染 METTL3 siRNA24h 后,再给予 E2（10 nM）处理 PASMCs 24h,用 Western blot法检测PFKFB3蛋白表达情况,实时RT-PCR法检测PFKFB3 mRNA表达情况。结果显示:与对照组相比,当用METTL3过表达慢病毒载体过表达METTL3时E2上调PFKFB3蛋白水平的作用增加,增加率为（250.8±22.7）%（n=3,P<0.01）,基本不影响PFKFB3 mRNA的表达,而用METTL3 siRNA沉默METTL3表达时E2增加PFKFB3表达的作用被抑制,而对PFKFB3 mRNA表达亦无明显影响（n=3,P<0.01）。由此说明,E2通过METTL3上调肺血管平滑肌细胞中PFKFB3蛋白表达（图2-6）。3.7 E2可促进肺血管平滑肌细胞中METTL3转录活性3.3.7.1不同浓度E2处理PASMCs以及相同浓度E2（10nM）处理PASMCs不同时间,均增加METTL3 mRNA表达。体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,予以不同浓度梯度的E2处理PASMCs 24h,或用10nM浓度的E2分别处理平滑肌细胞1h,3h,6h,12h,24h后,应用实时RT-PCR法观察METTL3 mRNA表达情况。结果显示:与对照组比较,分别给予不同浓度的E2（1nM-1uM）处理PASMCs 24 h后显着增加大鼠PASMCs中METTL3 mRNA表达,增加率分别为:（235.6±24.7）%（n=3,P<0.01）,（228.3±21.6）%（n=3,P<0.01）,（201.6±23.8）%（n=3,P<0.01）和（195.3±22.5）%（n=3,P<0.01）;以及给予 E2（10nM）处理不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）后,大鼠PASMCs METTL3 mRNA 表达显着增加,增加率分别（185.3±26.5）%（n=3,P<0.01）,（195.6±24.6）%（n=3,P<0.01）,（220.3±21.8）%（n=3,P<0.01）,（235.6±22.9）%（n=3,P<0.01）和（245.3±21.7）%（n=3,P<0.01）。3.3.7.2将大鼠PASMCs接种于24孔板中,生长到80%,分别在PASMCs中瞬时转染METTL3 的ERE荧光素酶质粒（METTL3-Luc,750ng）、ERE表达质粒（pLV-ERE-Luc,750ng）和空质粒 PGL3（250 ng）,然后用 E2（10nM）,PPT（1nM）,ICI（10 nM）处理细胞24h,检测对应的发光单元荧光值。结果显示:E2,PPT能显着增加METTL3转录活性,增加率分别为（285.6±21.7）%（n=3,P<0.01）、（268.6±23.8）%（n=3,P<0.01）,这一作用可被 ICI 逆转（图 2-6）。3.8抑制METTL3表达对E2促进肺血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠METTL3 siRNA或对应的Scrambled siRNA后,给予E2（10nM）处理PASMCs 24h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:与对照组相比,转染Scrambled siRNA施加E2处理可促进PASMCs的增殖和迁移,而转染了 METTL3 siRNA后,显着抑制了 E2处理后促进PASMCs增殖和迁移的效应（n=3,P<0.01）。3.9抑制METTL3表达,同时过表达PFKFB3对E2促进肺血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响体外培养PASMCs,分别转染大鼠METTL3 siRNA或转染大鼠METTL3 siRNA的同时转染PFKFB3过表达质粒后,给予E2（10 nM）处理细胞24 h,通过CCK8检测试剂盒和细胞划痕实验观察PASMCs的增殖和迁移情况。结果显示:与对照组相比,转染Scrambled siRNA施加E2处理可促进PASMCs的增殖和迁移,而转染了 METTL3 siRNA后,显着抑制E2促进PASMCs增殖和迁移的效应。回补PFKFB3蛋白后,细胞增殖、迁移能力增强（n=3,P<0.01）。[结论]一方面,E2可促进MCT诱导的肺动脉高压的发展;另一方面,E2通过上调METTL3水平,促进PFKFB3 mRNA m6A甲基化水平,促进PFKFB3蛋白的表达,最终促进平滑肌细胞的增殖、迁移能力。
邵明明[7]（2020）在《LNK在高血压血管重构中的作用研究》文中指出目的:观察LNK对高血压血管平滑肌细胞（VSMC）及对炎性细胞因子水平的影响,探讨LNK在高血压血管重构中的作用。方法:选取大鼠胸主动脉平滑肌细胞,在一定条件下构建高血压细胞模型;根据不同处理方法分为对照组,空白组,空载组,LNK组;流式细胞仪检测VSMC周期、凋亡及增殖的水平;ELISA检测IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达水平。结果:（1）各组大鼠血管平滑肌细胞周期、凋亡及增殖的水平:与对照组比较,空白组和空载组VSMC处于G0/G1期减少,S期增加,G2/M期增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与空载组比较,LNK组VSMC处于G0/G1期增加,S期减少,G2/M期减少,差异有统计学意义（P<0.05）;LNK组VSMC细胞凋亡率高于空白组和空载组（P<0.05）;空白组和空载组VSMC细胞增殖水平高于对照组（P<0.05）;LNK组VSMC细胞增殖水平低于空白组和空载组（P<0.05）。（2）各组大鼠血管平滑肌细胞上炎性细胞因子水平:与对照组相比,空白组和空载组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高,LNK组IL-6、IFN-γ表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,空载组IL-6、TNF-α、IFN-γ表达升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与空白组和空载组相比,LNK组的IL-6、TNF-α、IFN-γ表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:LNK通过介导炎症反应影响血管平滑肌的周期、凋亡及增殖参与高血压血管重构。
阳一栋[8]（2019）在《内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究》文中认为研究背景:低氧性肺动脉高压表现为持久的肺血管收缩及显着的肺血管重构,引起肺动脉压力明显增加,最终导致致命性的右心衰竭。以血管平滑肌细胞增殖及内皮细胞损伤为核心的细胞增殖/凋亡失衡是血管重构的关键因素。持续的低氧暴露可促进平滑肌细胞增殖,促进血管重构。血管内的平滑肌细胞同时也受其他细胞调控,内皮细胞位于血管壁的内层,调节平滑肌细胞增殖、血小板黏附和聚集、内源性舒张物质分泌等。低氧可诱导内皮细胞凋亡,激活NF-κB途经介导的黏附分子及促炎细胞因子表达,招募炎性细胞浸润。同时,舒张血管物质生成减少,收缩性物质分泌增多,进一步加重血管重构。线粒体不仅作为能量工厂,更是细胞内各种信号汇集传导的中转站,广泛参与细胞自噬,炎症应答,增殖/凋亡等生物进程。低氧时内皮细胞与平滑肌细胞均存在线粒体结构和功能的异常改变。低氧可促进平滑肌细胞糖酵解,抑制线粒体的有氧氧化。线粒体钙水平降低是抑制线粒体有氧氧化的主要因素之一,包括丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶和ATP合酶等线粒体呼吸相关酶的活性依赖Ca2+的参与。因此,线粒体钙的减少可抑制氧化呼吸,并伴随线粒体氧自由基的失衡。而线粒体功能异常可激活下游增殖信号通路如HIF-1α,NFATc及Kv1.5的下调,从而促进细胞增殖。在血管重构的另一关键细胞中,低氧可诱导内皮线粒体嵴断裂,肿胀,也可激活线粒体自噬,损伤线粒体生物合成,从而激活NF-κB途径介导的炎性分子表达并抑制NO生成,促进收缩性因子的分泌。内质网-线粒体相关膜（Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum membranes/mitochondria-associated membranes,MAMs）是内质网与线粒体膜之间接触的区域,广泛参与线粒体功能调节。MAMs通过位于内质网膜和线粒体外膜蛋白之间的连接作用促进膜的接触。IP3Rs/GRP75/VDAC1是内质网-线粒体蛋白连接子之一,介导内质网-线粒体钙转移,影响线粒体功能。同时,IP3Rs可被MAMs界面分子伴侣蛋白结合或激酶Akt磷酸化,影响钙的释放。因此,内质网-线粒体钙转移受MAMs形成及IP3Rs/Grp75/VDAC1钙转移轴相关修饰信号的共同调节。除调控胞内钙转移信号外,众多生物进程中的核心蛋白表达于MAMs界面,使得MAMs广泛参与脂类代谢,自噬,线粒体分裂,免疫应答,凋亡和内质网应激等。一系列研究表明,肝脏及脑组织蛋白组学检测发现MAMs界面表达上千种蛋白和数十种激酶及磷酸酶,病理条件下,此界面蛋白表达、修饰化水平及蛋白通路等发生显着转变,参与疾病的发生与发展。最近报道,沉默Nogo-B的表达可增强低氧时MAMs的形成,介导内质网-线粒体钙转移,促进平滑肌细胞凋亡,改善低氧性肺动脉高压表型。Nogo-B受体（Nogo-B receptor,NgBR）在先天性肺动脉高压模型中表达降低,通过ROS的生成介导平滑肌细胞增殖,其相关机制有待进一步明确。同时,低氧时内皮细胞MAMs的改变及其作用尚不清楚。因此,本研究拟以血管重构的关键靶点内皮细胞和平滑肌细胞为研究对象,探讨低氧时MAMs形成和界面蛋白通路的转变及其作用,明确介导MAMs改变的调控机制,以加深对低氧诱导平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤的理解。方法:1.建立低氧诱导的平滑肌细胞增殖模型,通过MAMs组成蛋白WB及电镜检测明确低氧时MAMs的形成改变。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞,促进MAMs形成,通过线粒体呼吸、增殖/凋亡等蛋白检测探讨其对低氧时平滑肌细胞增殖/凋亡的影响。2.获取足够的平滑肌细胞MAMs界面蛋白,通过蛋白组学检测分析低氧时MAMs蛋白组学改变表征及其在内质网-线粒体钙转移中的作用。3.探讨Nogo-B/NgBR对平滑肌细胞MAMs形成和内质网-线粒体钙转移通路的调控作用。利用低氧性肺动脉高压自然逆转和体外低氧-复氧模型检测平滑肌细胞Nogo-B及NgBR表达。过表达和抑表达Nogo-B或NgBR后,WB检测MAMs组成蛋白及内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路。通过氧耗率测定,激光共聚焦,WB等检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及线粒体氧自由基等线粒体功能指标和细胞增殖水平。4.建立低氧诱导的内皮细胞损伤模型,通过MAMs组成蛋白WB检测、内质网-线粒体标志蛋白IF检测明确低氧时内皮细胞MAMs的形成改变。下调MAMs组成蛋白PACS-2,IP3R1表达以抑制MAMs形成,探讨其对低氧诱导内皮细胞损伤的保护作用。检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及氧自由基等线粒体功能指标,检测流式细胞,PARP,PCNA及上清LDH酶活性等凋亡指标,检测炎性分子蛋白及mRNA表达,并检测eNOS-NO通路。结果:1.WB提示低氧时平滑肌细胞增殖相关蛋白PCNA表达增加,而凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达降低。同时,IF显示Edu标记的阳性细胞百分比增加。低氧时MAMs组成蛋白表达降低,电镜显示内质网与线粒体膜之间的最短距离增加,反映MAMs的形成受到破坏。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞后,线粒体呼吸增强,低氧时pAMPKα,PCNA增加,剪切型PARP比值减少。2.GO分析提示,低氧时MAMs界面差异蛋白主要定位于内质网,具有结合及催化活性,参与信号处理,生物学调控,刺激应答及蛋白定位等生物进程。富集分析发现差异蛋白主要与酰胺合成,抑制细胞分化有关。KEGG通路富集分析表明低氧时内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显着激活。Nogo-B表达于MAMs界面,且在低氧时增加。3.IF提示低氧诱导的血管重构中平滑肌Nogo-B蛋白表达增加,NgBR降低,随着复氧后结构改建的自然逆转Nogo-B表达降低,NgBR增加。体外平滑肌细胞低氧时,Nogo-B在全细胞匀浆水平中表达未改变,WB及免疫沉淀作用结果表明低氧时MAMs界面Nogo-B表达增加。而NgBR在体外低氧的平滑肌细胞中表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR能抑制MAMs形成,表现为MAMs组成蛋白表达下调或内质网-线粒体标记荧光共区域指数降低,电镜发现内质网膜与线粒体外膜之间的最短距离增加。同时,WB提示MAMs内质网-线粒体钙转移通路pAkt-IP3R3激活。Rhod-2 am检测发现线粒体钙水平降低,而耗氧率测定表明线粒体呼吸受到抑制。同时,IF提示线粒体膜电位增加,线粒体氧自由基减少,HIF-1α入核的阳性细胞百分比增加。MTT,PCNA、Cyclin D1蛋白或Edu标记阳性百分比检测表明过表达Nogo-B或抑表达NgBR能在常氧条件下促进平滑肌细胞增殖。抑表达Nogo-B或过表达NgBR能逆转上述效应,抑制低氧诱导的平滑肌细胞增殖。4.WB及IF提示低氧时HPAEC及HUVEC MAMs组成蛋白表达增加,内质网-线粒体标记荧光共区域指数增加。利用siRNA下调MAMs组成蛋白PACS-2或IP3R1以抑制MAMs形成。干预MAMs后,IF提示低氧时线粒体钙信号降低,线粒体膜电位值增加,ROS减少。氧耗率测定显示基础呼吸增加,ATP生成增多。干预MAMs后,流式细胞检测提示低氧时增加的早期凋亡、晚期凋亡和总的凋亡细胞百分比降低。WB表明,剪切型PARP比值降低,PCNA增加。细胞培养上清LDH活性降低。干预MAMs后,WB发现低氧诱导的NF-κB磷酸化受到显着抑制。Realtime PCR,WB及Elisa检测提示促炎分子ICAM-1,VCAM-1,E-selectin,MCP-1,IL-6,IL-1β表达降低。干预MAMs后,WB及Elisa检测表明低氧抑制的eNOS S1177磷酸化增加,eNOS活性增强。细胞上清中NO含量增多。结论:1.低氧可诱导平滑肌细胞增殖,MAMs形成减少。促进MAMs形成可促进低氧时平滑肌细胞凋亡和抑制增殖。2.低氧时MAMs界面内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显着激活,Nogo-B蛋白表达增加,从而参与内质网应激应答,神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇等鞘脂代谢及内质网-线粒体钙转移信号调控,影响平滑肌细胞增殖。3.Nogo-B与NgBR蛋白表达在低氧诱导的平滑肌细胞增殖中出现分离。低氧时,Nogo-B于MAMs界面分布增多,在全细胞水平上未改变。低氧时NgBR表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR可抑制MAMs形成和激活MAMs内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路,降低线粒体钙水平,损害线粒体功能,促进平滑肌细胞增殖。4.低氧时内皮细胞MAMs形成增多。破坏MAMs形成可减少低氧引起的线粒体功能损害,抑制细胞凋亡和炎症应答,并增加NO生成。上述研究表明MAMs有望成为干预或防治低氧性肺动脉高压的有效靶点。
田新涛[9]（2019）在《hsa-miR-199a-5p在原发性高血压中的表达及其机制的研究》文中提出目的:研究miR-199a-5p在高血压患者外周血中的表达及其血管内皮细胞损伤的作用和机制。方法:招募87例原发性高血压患者及31例正常健康人,作为研究对象。采用实时定量PCR检测miR-199a-5p的表达;体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并分为NC组（scramble control miRNA）、hsa-miR-199a-5p mimics和Rescue组。将control miRNA、hsa-miR-199a-5p mimics及hsa-miR-199a-5p mimics+inhibitor分别转染至HUVEC NC组和HUVEC Rescue组中,分别采用CCK-8、流式细胞术分子探索对hsa-miR-199a-5p对HUVECs的细胞增殖、细胞周期、细胞调亡及细胞迁移能力的影响;采用Western Blot印迹杂交检测下调hsa-miR-199a-5p表达后,HUVECs中hsa-miR-199a-5p的靶基因AMPK蛋白及信号通路中ULK1蛋白的表达。结果:hsa-miR-199a-5p在原发性高血压组患者血清中的表达水平明显高于正常健康人对照组。CCK-8体外实验结果表明,下调hsa-miR-199a-5p的表达水平后,血管内皮细胞（HUVECs）的体外增殖能力明显増强,表明hsa-miR-199a-5p具有抑制血管内皮细胞（HUVECs）増殖的能力。通过流式细胞术检测HUVECs的细胞周期发现,与NC组相比,Rescue组的HUVECs出现了G1/S期转换加快,表明体外过表达hsa-miR-199a-5p水平能够调控HUVECs G1/S期的转换,抑制HUVECs的増殖,进而抑制血管内皮细胞的修复能力。流式细胞术检测结果表明,转染hsa-miR-199a-5p inhibitor后,人脐静脉内皮细胞的凋亡率明显降低（p>0.05）,说明在原发性髙血压发生及发展过程中,降低hsa-miR-199a-5p的表达水平,能够抑制HUVECs的细胞调亡进程。与NC组比较,共转染pre-miR-199a-5p mimics和pMIR-REPORTTM Luciferace-AMPK-WT-UTR荧光素酶野生型报告质粒后,荧光值明显降低（p<0.05）;pre-miR-199a-5p mimics与pMIR-REPORTTM Luciferace-AMPK-MUT-UTR共转染后,荧光值并无明显差异（p>0.05）,表明has-miR-199a-5p能与鞭基因AMPK mRNA的3,-UTR CDS结合。Western blot免疫印迹结果显示,下调has-miR-199a-5p表达水平后,HUVECs中AMPK蛋白及信号通路中ULK1蛋白表达水平均出现明显上升（p<0.05）;提示has-miR-199a-5p的生物学作用可能与AMPK-ULK1表达相关。结论:miR-199a-5p在高血压患者外周血中表达显着升高,且与高血压临床分级呈正相关;过表达hsa-miR-199a-5p能够通过信号通路AMPK-ULK1的表达变化抑制HUVECs的细胞増殖能力,促进HUVECs的调亡,进而促进血管内皮的损伤。
王启龙[10]（2019）在《微囊藻毒素—LR对血管发育的影响及其作用机制》文中提出水体富营养化引起的有害藻华日益频发,对生态环境和人类的生产生活造成严重影响。微囊藻毒素（microcystins,MCs）是有害藻华中最常见且毒害性最大的一类次生代谢产物。在200余种MCs中,MC-LR的毒性最强,最具代表性,研究也最为深入。血管是生物体内分布范围最广且功能极其重要的组织。然而,MC-LR对血管的毒性还不清楚。本文以斑马鱼、静脉内皮细胞和血管平滑肌细胞为模型,研究了MC-LR对血管的生物学毒性及机理。主要结果及结论如下:（1）通过MC-LR在受精后2小时（2 hours post fertilization,2 hpf）、24 hpf暴露野生型（Tuebingen）和Tg（flk1:GFP、fli1N:GFP×flk1:mcherry）背景的斑马鱼发现:MC-LR抑制斑马鱼孵化,降低斑马鱼的心率,引起斑马鱼胚胎死亡、发育畸形。MC-LR可抑制斑马鱼血管发生和血管生成,引起血管生成缺失和血管畸形,损伤血管结构,从而降低血管通畅性以及导致斑马鱼脑部出血。活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除剂APO（Apocynin,APO）能够部分回救MC-LR的血管生成毒性。原位杂交及qPCR的分子水平检测结果表明:MC-LR能够诱导血管生成相关基因klf2a、ephrinB2和nos2b的表达上调,抑制vegf受体flt4和flk1的表达。体外血管发生和血管生成模型验证,MC-LR对血管毒性是特异性毒性,而非MC-LR对其他组织器官毒害后的二次毒性。（2）HUVECs（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）暴露实验表明:MC-LR抑制HUVECs的增殖、迁移,MC-LR能够破坏HUVECs的细胞骨架,损伤HUVECS的DNA,减缓细胞周期。MC-LR通过ROS途径引发HUVECs内的脂质过氧化,损伤HUVECs内部抗氧化系统功能,造成线粒体内ROS上升、膜电位下降,诱发p53激活和提高Caspase9/3酶活性,引发HUVECs凋亡。WB实验结果揭示MC-LR对HUVECs的毒性可能通过其抑制增殖相关蛋白PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、迁移相关蛋白Rho-ROCK（Rho-associated kinase,ROCK）和迁移相关蛋白FAK（focal adhesion kinase）表达,以及诱导凋亡相关蛋白p53表达,促进Caspase3切割激活实现的。（3）VSMCs（Vascular smooth muscle cells）暴露实验表明:MC-LR抑制VSMCs的增殖、迁移,破坏VSMCs的细胞骨架,减缓细胞周期。MC-LR通过ROS途径引发VSMCs内的脂质过氧化,损伤VSMCs抗氧化系统功能,造成线粒体内ROS上升、膜电位下降,p53激活和提高Caspase9/3酶活性,引发VSMCs凋亡。WB实验结果揭示MC-LR对VSMCs的毒性可能通过抑制整合素β1、Rho-ROCK及其底物MLC（myosin light chain）的表达实现的。
二、NO、NOS与血管平滑肌细胞周期调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NO、NOS与血管平滑肌细胞周期调控（论文提纲范文）
（1）基于多组学分析AEE抗血管内皮细胞氧化损伤的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血管内皮功能 |
| 1.1.1 血管内皮细胞 |
| 1.1.2 血管内皮细胞的合成物质 |
| 1.2 动脉粥样硬化 |
| 1.2.1 动脉粥样硬化的生物标志物 |
| 1.2.2 动脉粥样硬化的治疗药物 |
| 1.3 阿司匹林丁香酚酯的研究 |
| 1.4 组学概述 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 翻译后修饰 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 第二章 AEE抗内皮细胞氧化损伤的转录组学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 2.1.4 细胞凋亡检测 |
| 2.1.5 Hoechst33342 染色 |
| 2.1.6 RNA提取及质控 |
| 2.1.7 转录组文库的建立与质检 |
| 2.1.8 基因组对比和基因表达分析 |
| 2.1.9 差异表达基因及其生物信息分析 |
| 2.1.10 实时荧光定量PCR对差异表达基因验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 AEE对 H_2O_2诱导的HUVECs凋亡的保护作用 |
| 2.2.2 RNA含量与质量等级 |
| 2.2.3 Reads过滤 |
| 2.2.4 Reads比对 |
| 2.2.5 样品相关性 |
| 2.2.6 样品表达量分布 |
| 2.2.7 差异表达基因统计 |
| 2.2.8 差异表达基因的聚类分析 |
| 2.2.9 差异表达基因的火山图分析 |
| 2.2.10 差异表达基因的维恩图分析 |
| 2.2.11 差异表达基因的GO功能显着性富集分析与分类 |
| 2.2.12 差异表达基因的KEGG显着性富集分析与分类 |
| 2.2.13 RT-PCR对差异表达基因验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 AEE抗内皮细胞氧化损伤的蛋白质组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 3.1.4 细胞凋亡检测 |
| 3.1.5 蛋白质提取与准备 |
| 3.1.6 胰酶酶解 |
| 3.1.7 蛋白TMT标记 |
| 3.1.8 HPLC分级 |
| 3.1.9 液相色谱-质谱联用分析 |
| 3.1.10 数据库搜索 |
| 3.1.11 生物信息学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 HUVECs凋亡率及细胞核的变化 |
| 3.2.2 蛋白样品浓度检测 |
| 3.2.3 鉴定质量评估 |
| 3.2.4 样品重复性检验结果 |
| 3.2.5 TMT质谱与蛋白鉴定结果 |
| 3.2.6 TMT质谱鉴定各组细胞蛋白的特征分析结果 |
| 3.2.7 差异表达蛋白统计 |
| 3.2.8 差异表达蛋白的功能分类 |
| 3.2.9 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 3.2.10 KEGG通路富集 |
| 3.2.11 蛋白结构域富集 |
| 3.2.12 蛋白互作网络 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 AEE抗内皮细胞氧化损伤的乙酰化修饰定量蛋白质组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 4.1.4 细胞凋亡检测 |
| 4.1.5 蛋白质提取与准备 |
| 4.1.6 胰酶酶解 |
| 4.1.7 蛋白TMT标记 |
| 4.1.8 HPLC分级 |
| 4.1.9 修饰富集 |
| 4.1.10 液相色谱-质谱联用分析 |
| 4.1.11 数据库搜索 |
| 4.1.12 生物信息学分析 |
| 4.1.13 修饰位点基序分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HUVECs凋亡率及细胞核的变化 |
| 4.2.2 蛋白样品浓度检测 |
| 4.2.3 鉴定质量评估 |
| 4.2.4 样品重复性检验结果 |
| 4.2.5 TMT质谱与蛋白鉴定结果 |
| 4.2.6 TMT质谱鉴定各组细胞蛋白的特征分析结果 |
| 4.2.7 差异表达蛋白统计 |
| 4.2.8 蛋白修饰的基序(motif)分析 |
| 4.2.9 差异表达蛋白的功能分类 |
| 4.2.10 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 4.2.11 KEGG通路富集 |
| 4.2.12 蛋白结构域富集 |
| 4.2.13 蛋白互作网络 |
| 4.2.14 基于转录组学、蛋白质组学与乙酰化修饰定量蛋白质组学联合分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 AEE通过AMPK/MTOR信号通路介导自噬保护内皮细胞免受氧化损伤 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 仪器设备 |
| 5.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 5.1.4 细胞凋亡检测 |
| 5.1.5 细胞内活性氧检测 |
| 5.1.6 细胞内超氧阴离子检测 |
| 5.1.7 细胞内谷胱甘肽过氧化物酶与超氧化物岐化酶活性检测 |
| 5.1.8 细胞内自噬通量检测 |
| 5.1.9 透射电镜检测细胞内自噬小体 |
| 5.1.10 相关蛋白的表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 AEE抑制H_2O_2诱导的细胞凋亡 |
| 5.2.2 AEE介导ROS依赖的AMPK信号通路抑制细胞凋亡 |
| 5.2.3 AEE通过介导自噬通量减轻H_2O_2诱导的HUVECs损伤 |
| 5.2.4 阻断自噬通量使AEE的抗凋亡作用失效 |
| 5.2.5 激活自噬通量使AEE的抗凋亡作用增强 |
| 5.2.6 AEE介导AMPK/m TOR信号通路减轻细胞凋亡 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 AEE通过介导PI3K/AKT信号通路保护内皮细胞免受氧化损伤 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料与试剂 |
| 6.1.2 仪器设备 |
| 6.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 6.1.4 细胞活力检测 |
| 6.1.5 TUNEL染色 |
| 6.1.6 流式细胞仪检测 |
| 6.1.7 细胞转染 |
| 6.1.8 相关蛋白的表达分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 AEE对 H_2O_2诱导的HUVECs活力的下降起到保护作用 |
| 6.2.2 AEE对 H_2O_2诱导的HUVECs凋亡起到保护作用 |
| 6.2.3 AEE通过PI3K/AKT通路对H_2O_2诱导的细胞凋亡的影响 |
| 6.2.4 AEE对 H_2O_2诱导的FOXO3a转位及凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.2.5 阻断PI3K/AKT通路减弱AEE的保护作用 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 AEE通过ASK1 信号通路保护内皮细胞免受氧化损伤 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料与试剂 |
| 7.1.2 仪器设备 |
| 7.1.3 内皮细胞培养与处理 |
| 7.1.4 细胞凋亡检测 |
| 7.1.5 细胞内活性氧与线粒体膜电位检测 |
| 7.1.6 细胞内ASK1 水平检测 |
| 7.1.7 ASK1 和细胞核的免疫荧光染色 |
| 7.1.8 相关蛋白的表达分析 |
| 7.1.9 ASK1和ERK1/2 信号通路的干预 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 AEE减轻H_2O_2诱导的活性氧和线粒体膜电位功能障碍 |
| 7.2.2 AEE改善H_2O_2对MAPK家族相关蛋白的刺激作用 |
| 7.2.3 ASK1与ERK1/2 抑制剂干预降低AEE对细胞凋亡的保护作用 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 综述1 胰岛素抵抗与内皮功能障碍 |
| 1.1 胰岛素信号通路 |
| 1.2 炎症与IR |
| 1.2.1 炎症信号 |
| 1.2.2 炎症介导IR的机制 |
| 1.3 内皮功能障碍 |
| 1.3.1 内皮分泌的主要血管活性物质 |
| 1.3.2 内皮功能障碍的发生机制 |
| 1.3.3 血管内皮的胰岛素信号通路 |
| 1.3.4 IR与内皮功能障碍的相互关系 |
| 1.4 结语 |
| 综述2 经典RAS在糖尿病及其并发症中的作用与ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴的生物学功能 |
| 1.1 经典RAS在糖尿病及其并发症中的作用 |
| 1.1.1 经典RAS的构成 |
| 1.1.2 经典RAS与糖尿病及其并发症 |
| 1.2 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴的构成 |
| 1.2.1 ACE2 的生物学特性及其激动剂和抑制剂 |
| 1.2.2 Ang-(1-7)的生物学特性 |
| 1.2.3 Mas的生物学特性及其激动剂和拮抗剂 |
| 1.3 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴在几种常见疾病中的作用 |
| 1.3.1 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与高血压 |
| 1.3.2 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与动脉粥样硬化 |
| 1.3.3 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与心衰 |
| 1.3.4 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与中风 |
| 1.3.5 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与糖尿病 |
| 1.4 结语 |
| 第2章 ACE2 在高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗中的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HG对HUVECs存活率的影响 |
| 2.3.2 HG对HUVECs形态的影响 |
| 2.3.3 HG对HUVECs NO分泌含量及ET-1 mRNA水平的影响 |
| 2.3.4 HG对HUVECs胰岛素信号通路IRS1 蛋白表达的影响 |
| 2.3.5 HG对HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 2.3.6 HG对HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 人参皂苷RC改善高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人参皂苷Rc对HUVECs细胞存活率的影响 |
| 3.3.2 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs NO分泌含量及ET-1mRNA水平的影响 |
| 3.3.3 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ROS产生的影响 |
| 3.3.4 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs培养液上清MDA含量及SOD活性的影响 |
| 3.3.5 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs促炎因子mRNA水平的影响 |
| 3.3.6 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs培养液上清Ang Ⅱ及Ang-(1-7)含量的影响 |
| 3.3.7 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 3.3.8 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ACE2及Mas mRNA水平的影响 |
| 3.3.9 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs胰岛素信号通路IRS1蛋白表达的影响 |
| 3.3.10 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 3.3.11 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs NADPH氧化酶蛋白表达的影响 |
| 3.3.12 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs IR相关炎症信号通路的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 基于ACE2 探究人参皂苷RC改善高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs NO分泌含量及ET-1 mRNA水平的影响 |
| 4.3.2 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ROS产生的影响 |
| 4.3.3 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs培养液上清MDA含量及SOD活性的影响 |
| 4.3.4 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs促炎因子mRNA水平的影响 |
| 4.3.5 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs培养液上清Ang Ⅱ及 Ang-(1-7)含量的影响 |
| 4.3.6 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 4.3.7 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ACE2及Mas mRNA水平的影响 |
| 4.3.8 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs胰岛素信号通路IRS1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.9 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 4.3.10 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs NOX2蛋白表达的影响 |
| 4.3.11 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs IR相关炎症信号通路的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 基于ACE2 探究人参皂苷RC改善DB/DB小鼠内皮功能障碍的作用及机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠体重和空腹血糖的影响 |
| 5.3.2 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清脂质及胰岛素含量的影响 |
| 5.3.3 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清促炎因子含量的影响 |
| 5.3.4 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清和主动脉Ang Ⅱ及 Ang-(1-7)含量的影响 |
| 5.3.5 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠主动脉ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 5.3.6 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠胸主动脉内皮和非内皮依赖性舒张的影响 |
| 5.3.7 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠Akt/eNOS信号通路的影响 |
| 5.3.8 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠主动脉NADPH氧化酶蛋白表达的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 第7章 结论及展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 本论文创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于靶点预测和高通量测序的丹蒌片干预稳定型心绞痛作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 丹蒌片干预冠心病的药理作用研究 |
| 1 心肌缺血损伤的保护作用 |
| 2 降低血清炎症因子水平 |
| 3 改善脂质代谢紊乱 |
| 4 改善血管内皮功能 |
| 5 稳定动脉粥样硬化斑块 |
| 6 促进或抑制细胞凋亡 |
| 7 改善心室重构 |
| 8 调节心率失常 |
| 9 总结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二章 丹蒌片干预稳定型心绞痛的“成分-靶点”网络预测 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 TCMSP数据库检索丹蒌片活性成分 |
| 2 系统文献检索补充丹蒌片活性成分 |
| 3 资料提取与数据统一 |
| 4 丹蒌片成分对应靶点检索 |
| 5 稳定型心绞痛疾病靶点检索 |
| 6 构建丹蒌片干预稳定型心绞痛“成分-靶点”网络 |
| 7 丹蒌片干预稳定型心绞痛的PPI网络 |
| 第二节 结果 |
| 1 丹蒌片主要活性成分获取 |
| 2 丹蒌片主要成分对应靶点获取 |
| 3 稳定型心绞痛疾病靶点获取 |
| 4 丹蒌片干预稳定型心绞痛的“成分-靶点” |
| 5 丹蒌片干预稳定型心绞痛的PPI网络 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 丹蒌片中药四性的分类功能富集 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 丹蒌片组方的四性分类 |
| 2 丹蒌片中药四性的功能富集 |
| 第二节 结果 |
| 1 丹蒌片寒药的功能富集 |
| 2 丹蒌片凉药的功能富集 |
| 3 丹蒌片温药的功能富集 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 丹蒌片干预稳定型心绞痛痰瘀互结证的差异基因检测 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 病例采集 |
| 2 诊断标准 |
| 3 纳排标准 |
| 4 样本量估算 |
| 5 治疗方案 |
| 6 疗效判定标准 |
| 7 样本采集与分析 |
| 第二节 结果 |
| 1 干预前患者基本资料比较 |
| 2 干预后患者中医疗效评价分析 |
| 3 干预前后基因表达谱测序结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 结语 |
| 研究成果 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）胰高血糖素样肽1及其受体在心血管中保护作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 概述 |
| 1 血管重构、心肌肥厚与血管紧张素Ⅱ |
| 1.1 血管重构 |
| 1.1.1 血管平滑肌细胞增殖和迁移 |
| 1.1.2 细胞外基质重构 |
| 1.1.3 内皮功能障碍 |
| 1.2 心肌肥厚 |
| 1.3 血管紧张素Ⅱ |
| 2 胰高血糖素样肽1 及受体研究进展 |
| 2.1 胰高血糖素样肽1 |
| 2.1.1 胰高血糖素样肽1 的发现 |
| 2.1.2 胰高血糖素样肽1 的代谢 |
| 2.1.3 胰高血糖素样肽1 在糖尿病中的研究概况 |
| 2.2 胰高血糖素样肽1 受体 |
| 2.2.1 胰高血糖素样肽1 受体的分布 |
| 2.2.2 胰高血糖素样肽1 受体的结构 |
| 2.2.3 胰高血糖素样肽1 受体的脱敏和复敏 |
| 3.胰高血糖素样肽1 在心血管疾病中的研究进展 |
| 3.1 胰高血糖素样肽1 对心脏的保护作用 |
| 3.2 胰高血糖素样肽1 对血管的保护作用 |
| 3.2.1 胰高血糖素样肽1 改善血管内皮功能障碍 |
| 3.2.2 胰高血糖素样肽1 抑制血管中VSMCs增殖和迁移 |
| 4 本课题研究意义及研究内容 |
| 第二章 胰高血糖素样肽1 改善心肌肥厚的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂及配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物 |
| 2.3.2 细胞培养及处理 |
| 2.3.3 苏木精-伊红染色 |
| 2.3.4 马松染色 |
| 2.3.5 透射电镜观察心脏超微结构 |
| 2.3.6 蛋白质印迹法 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR |
| 2.3.8 免疫荧光检测细胞形态分析 |
| 2.3.9 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 Liraglutide和 Alogliptin改善SHR大鼠心肌肥厚 |
| 3.2 GLP-1 改善Ang Ⅱ诱导的H9C2 心肌细胞肥厚 |
| 3.3 GLP-1 在改善心肌肥厚过程中降低Rho A/ROCK2 的活性 |
| 3.4 GLP-1 通过激活c AMP/PKA抑制Rho A/ROCK2 信号通路改善心肌肥厚 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 胰高血糖素样肽1 改善血管重构的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂及配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物 |
| 2.3.2 细胞培养及处理 |
| 2.3.3 HE染色 |
| 2.3.4 Masson染色 |
| 2.3.5 蛋白质印迹法 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 免疫荧光 |
| 2.3.8 MTT |
| 2.3.9 划痕实验 |
| 2.3.10 流式细胞检测细胞周期 |
| 2.3.11 ELISA检测细胞内c AMP水平 |
| 2.3.12 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 Liraglutide和 Alogliptin改善SHR血管重构 |
| 3.2 GLP-1 改善Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞的血管重构 |
| 3.2.1 GLP-1对RASMC细胞增殖和迁移没有影响 |
| 3.2.2 GLP-1 抑制病理性的RASMC细胞增殖和迁移 |
| 3.2.3 GLP-1 抑制细胞外基质失衡 |
| 3.3 GLP-1 改善血管重构的作用分子机制 |
| 3.3.1 GLP-1 通过降低MMP1 的表达抑制Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞增殖和迁移 |
| 3.3.2 GLP-1 通过抑制ERK1/2-NF-κB信号通路降低RASMC细胞内MMP的表达 |
| 3.3.3 MMP1、ERK1/2-NF-κB在 Liraglutide和 Alogliptin改善血管重构过程中的作用 |
| 3.3.4 GLP-1 通过激活GLP-1R改善血管重构 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 Ang Ⅱ诱导GLP-1R核输出的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂及配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物 |
| 2.3.2 细胞培养及处理 |
| 2.3.3 蛋白质印迹法 |
| 2.3.4 免疫荧光 |
| 2.3.5 MTT |
| 2.3.6 划痕实验 |
| 2.3.7 免疫共沉定 |
| 2.3.8 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 GLP-1R对 RASMC细胞增殖和迁移的影响 |
| 3.2 血管重构伴随着GLP-1R的核输出 |
| 3.3 GLP-1R中的核输出信号序列介导了GLP-1R的核输出 |
| 3.4 Ang Ⅱ激活PI3K/PDK1/Akt促进GLP-1R核输出 |
| 3.5 Ang Ⅱ通过Akt激活PKC促进GLP-1R核输出 |
| 3.6 PKCθ在Ang Ⅱ诱导GLP-1R核输出过程中发挥重要作用 |
| 3.7 Ang Ⅱ通过激活PKCθ促进GLP-1R Ser416 磷酸化诱导GLP-1R核输出 |
| 3.8 GLP-1R的核输出促进RASMC细胞增殖和迁移 |
| 3.9 Ang Ⅱ诱导GLP-1R核输出引起RASMC细胞增殖和迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 GLP-1R核输出调控RASMC细胞增殖和迁移的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂及配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及处理 |
| 2.3.2 蛋白质印迹法 |
| 2.3.3 免疫荧光 |
| 2.3.4 MTT |
| 2.3.5 划痕实验 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 免疫共沉定 |
| 2.3.8 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 C14orf166对RASMC细胞增殖和迁移的影响 |
| 3.2 C14orf166在Ang Ⅱ诱导的RASMC细胞增殖和迁移过程中具有重要作用.. |
| 3.3 Ang Ⅱ诱导GLP-1R核输出促进C14orf166与GLP-1R复合物解离 |
| 3.4 GLP-1R核定位是C14orf166 促进RASMC细胞增殖和迁移的抑制因素 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1 部分 人体AAA组织的病理学研究 |
| 1 引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 人AAA组织HE及 VG染色 |
| 3.2 免疫组化检测组织SIRT1、CD40、NF-κBp65、MMP-2及MMP-9的表达 |
| 3.3 免疫组化检测组织CD31 及CD68 的表达 |
| 4.讨论 |
| 5 结论 |
| 第2 部分 咖啡酸苯乙酯对大鼠AAA形成早期保护作用的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CAPE对大鼠AAA直径的影响 |
| 3.2 CAPE对大鼠AAA形成早期血管管壁病理结构的影响 |
| 3.3 CAPE对大鼠AAA形成早期平滑肌细胞的影响 |
| 3.4 CAPE对大鼠AAA形成早期组织ROS含量的影响 |
| 3.5 CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织CD31 表达的影响 |
| 3.6 CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织巨噬细胞浸润表达的影响 |
| 3.7 免疫组化检测CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织MMP-2 和MMP-9 表达的影响 |
| 3.8 Westernblot法检测CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织IL-6、SIRT1、NF-κBp65、单核细胞趋化蛋白1(Monocytechemoattractant protein-1,MCP-1)、MMP-2、MMP-9、CD40 蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CAPE对 AAA形成早期新生血管形成的影响。 |
| 4.2 CAPE对 AAA形成早期氧化应激的影响 |
| 4.3 CAPE对 AAA形成早期VSMC的影响 |
| 4.4 CAPE对 AAA形成早期管壁炎症反应的影响 |
| 4.5 CAPE对 AAA形成早期管壁浸润的巨噬细胞表型变化的影响 |
| 4.6 CAPE对 AAA形成早期CD40、SIRT1、NF-κB表达的影响 |
| 5 结论 |
| 第3 部分 CAPE抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代HUVECs鉴定 |
| 3.2 不同浓度TNF-α刺激对HUVECs表达IL-6及MCP-1 的影响 |
| 3.3 不同剂量CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达IL-6及MCP-1 的影响 |
| 3.4 CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达SIRT1 的影响 |
| 3.5 CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达CD40 的影响 |
| 3.6 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 NF-κB通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CAPE减轻TNF-α刺激HUVECs后细胞的炎症反应水平 |
| 4.2 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 SIRT1及CD40 蛋白表达的影响 |
| 4.3 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 SIRT1及CD40 的影响与NF-κB通路相关性 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 腹主动脉瘤的发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
（6）17β-雌二醇上调METTL3促进PFKFB3 mRNA甲基化促进MCT诱导的肺动脉高压发展的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 雌激素促进MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型的发展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 第二部分 E2 增加肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 蛋白表达的作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 第三部分 METTL3 介导E2 对肺血管平滑肌细胞中PFKFB3 蛋白表达的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）LNK在高血压血管重构中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 主要试剂与仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验细胞 |
| 2 内容与方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养基本操作方法 |
| 2.3 VSMC高血压细胞模型构建条件摸索 |
| 2.4 VSMC高血压细胞模型过表达质粒干预 |
| 2.5 SH2B3过表达效果验证 |
| 2.6 相关指标的检测 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（8）内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 低氧对MAMs形成的影响及其在平滑肌细胞增殖中的作用 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 低氧时MAMs界面的蛋白组学表征及其在平滑肌细胞内钙转移调控中的作用分析 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Nogo-B/Nogo-B receptor对平滑肌细胞MAMs形成和内质网-线粒体钙转移通路的调控作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 低氧对血管内皮细胞MAMs形成的影响及其在内皮细胞损伤中的作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 内质网-线粒体相关膜在肺动脉高压中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）hsa-miR-199a-5p在原发性高血压中的表达及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 原发性高血压患者外周血Micro-RNAs表达谱的变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 hsa-miR-199a-5p在原发性高血压血管内皮损伤中的作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 hsa-miR-199a-5p调控血管内皮细胞损伤机制的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）微囊藻毒素—LR对血管发育的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩写词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 微囊藻毒素研究进展 |
| 1.1.1 微囊藻毒素的来源、爆发和分布 |
| 1.1.2 微囊藻毒素的结构及理化特性 |
| 1.1.3 MCs在生物体内的合成、分解和代谢 |
| 1.1.4 MCs的生物毒性 |
| 1.1.5 MC-LR的生物毒性机理 |
| 1.1.6 应对MC-LR污染和毒害的策略 |
| 1.2 血管发育与健康 |
| 1.2.1 血管发生和血管生成 |
| 1.2.2 血管与健康 |
| 1.3 斑马鱼及斑马鱼血管 |
| 1.3.1 斑马鱼模型 |
| 1.3.2 斑马鱼的血管 |
| 1.3.3 斑马鱼血管发育时序与形成机制 |
| 1.3.4 血管生成的分子调控 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 技术路线 |
| 1.6 创新点 |
| 2 MC-LR对血管发育毒性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器、耗材和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 MC-LR对斑马鱼孵化率、畸形率、死亡率及心律的影响 |
| 2.3.2 MC-LR对斑马鱼血管发生的影响 |
| 2.3.3 MC-LR对斑马鱼血管生成的影响 |
| 2.3.4 MC-LR对斑马鱼血管功能损伤的研究 |
| 2.3.5 斑马鱼组织切片及电镜观察 |
| 2.3.6 内皮细胞成环实验 |
| 2.3.7 大鼠血管环实验 |
| 2.3.8 斑马鱼基因荧光定量实验 |
| 2.3.9 原位杂交实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MC-LR降低斑马鱼孵化率、心律提高了斑马鱼畸形率及死亡率 |
| 2.4.2 MC-LR抑制斑马鱼血管发生 |
| 2.4.3 MC-LR抑制斑马鱼血管生成 |
| 2.4.4 MC-LR损伤斑马鱼血管功能 |
| 2.4.5 MC-LR在体外抑制HUVECs形成血管环腔 |
| 2.4.6 MC-LR抑制血管生成 |
| 2.4.7 定量PCR分析表明MC-LR抑制klf2a、nos2b和 ephrinB2 的表达 |
| 2.4.8 原位杂交表明MC-LR抑制flt4和flk1 在尾部和头部的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 MC-LR对血管内皮细胞的毒性效应及其作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器、耗材及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HUVECs增殖实验 |
| 3.3.2 HUVECs迁移实验 |
| 3.3.3 HUVECs凋亡实验 |
| 3.3.4 HUVECs周期实验 |
| 3.3.5 HUVECs骨架观察 |
| 3.3.6 HUVECsMDA含量的测定 |
| 3.3.7 HUVECs抗氧化酶活性的测定 |
| 3.3.8 HUVECs线粒体活性氧测定 |
| 3.3.9 HUVECs线粒体膜电位测定 |
| 3.3.10 HUVECsDNA损伤测定 |
| 3.3.11 细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.12 BCA法检测蛋白浓度 |
| 3.3.13 蛋白印记实验(Western Blot) |
| 3.3.14 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MC-LR抑制HUVECs增殖 |
| 3.4.2 MC-LR抑制HUVECs迁移 |
| 3.4.3 MC-LR诱导HUVECs凋亡 |
| 3.4.4 MC-LR减缓HUVECs周期 |
| 3.4.5 MC-LR破坏HUVECs骨架 |
| 3.4.6 MC-LR引起HUVECs抗氧化酶活性降低、MDA含量升高 |
| 3.4.7 MC-LR引起HUVECs线粒体活性氧和Caspase3/9 酶活性增高 |
| 3.4.8 MC-LR降低HUVECs线粒体膜电位 |
| 3.4.9 MC-LR引起HUVECs的 DNA损伤 |
| 3.4.10 MC-LR对 HUVECs增殖、迁移、周期和凋亡的分子机制 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 MC-LR对血管平滑肌细胞的毒性效应及其作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 血管平滑肌细胞的培养 |
| 4.3.2血管平滑肌细胞增殖实验 |
| 4.3.3血管平滑肌细胞迁移实验 |
| 4.3.4血管平滑肌细胞凋亡实验 |
| 4.3.5血管平滑肌细胞周期实验 |
| 4.3.6 血管平滑肌细胞骨架观察 |
| 4.3.7 VSMCs MDA含量的测定 |
| 4.3.8 VSMCs抗氧化酶活的测定 |
| 4.3.9 VSMCs线粒体活性氧的测定 |
| 4.3.10 VSMCs线粒体膜电位的测定 |
| 4.3.11蛋白印记实验 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 MC-LR抑制VSMCs增殖 |
| 4.4.2 MC-LR抑制VSMCs迁移 |
| 4.4.3 MC-LR促进VSMCs凋亡 |
| 4.4.4 MC-LR抑制VSMCs周期 |
| 4.4.5 MC-LR破坏VSMCs细胞骨架 |
| 4.4.6 MC-LR引起VSMCs抗氧化酶活性降低、MDA含量升高 |
| 4.4.7 MC-LR引起VSMCs线粒体活性氧和Caspase3/9 酶活性增高 |
| 4.4.8 MC-LR降低VSMCs线粒体膜电位 |
| 4.4.9 MC-LR对 VSMCs作用的分子机制 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 存在的不足和后续研究工作的建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B 作者在攻读学位期间参与的课题 |
| C 学位论文数据集 |
| 致谢 |
四、NO、NOS与血管平滑肌细胞周期调控（论文参考文献）
- [1]基于多组学分析AEE抗血管内皮细胞氧化损伤的分子机制[D]. 张振东. 中国农业科学院, 2021(01)
- [2]基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制[D]. 王耀振. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于靶点预测和高通量测序的丹蒌片干预稳定型心绞痛作用机制研究[D]. 谌子诺. 北京中医药大学, 2021(08)
- [4]胰高血糖素样肽1及其受体在心血管中保护作用的分子机制研究[D]. 范韶华. 山西大学, 2021
- [5]咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究[D]. 占钻. 南昌大学, 2021(01)
- [6]17β-雌二醇上调METTL3促进PFKFB3 mRNA甲基化促进MCT诱导的肺动脉高压发展的机制研究[D]. 文豪. 广州医科大学, 2020(01)
- [7]LNK在高血压血管重构中的作用研究[D]. 邵明明. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究[D]. 阳一栋. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]hsa-miR-199a-5p在原发性高血压中的表达及其机制的研究[D]. 田新涛. 青岛大学, 2019(07)
- [10]微囊藻毒素—LR对血管发育的影响及其作用机制[D]. 王启龙. 重庆大学, 2019(01)