一、Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro（论文文献综述）
李文杰[1]（2021）在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中提出鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
汪铭锐[2]（2021）在《鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备》文中提出鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）引起,以雏鸡再生障碍性贫血以及全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制病。该病分布于全球,是阻碍禽类养殖业发展的重要免疫抑制病之一。CIAV的基因组只有约2.3kb,共编码三个蛋白。VP1作为其唯一的衣壳蛋白,在CIAV诱导宿主产生中和抗体的过程中具有关键性作用。VP2被认为是VP1的一种辅助蛋白或者支架蛋白,帮助VP1蛋白正确折叠,具有双特异性磷酸酶活性,在CIAV的感染中具有重要的作用。VP3则作为一种凋亡素具有诱导细胞凋亡的功能,在医疗领域被广泛研究。本论文就CIAV VP1、VP2蛋白在杆状病毒系统中的表达、CIAV VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备、CIAVVP2蛋白抗原表位的鉴定三个方面进行研究。研究结果对CIAV重组亚单位疫苗的研发、检测方法的建立、CIAV的防控以及VP2蛋白相关功能的深入研究都具有重要意义。1.鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白在杆状病毒中的表达为探究不同表达方式下VP1与VP2蛋白在杆状病毒中表达情况,本研究利用PCR技术扩增出CIAV的VP1、VP2基因,并在VP1与VP2基因之间加入柔性肽序列作为linker,连接到 pFastBacHTA 载体,分别构建 pFastBacHTA-VP1、pFastBacHTA-VP2、pFastBacHTA-VP 1-linker-VP2三种重组供体质粒;将重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒,并分别转染至Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2、rBac-VP1-linker-VP2。IFA 和Western-blot 结果证明,以 rBac-VP1 或 rBac-VP2 单独感染的Sf9中,VP1或VP2蛋白成功表达;以rBac-VP1和rBac-VP2共感染的Sf9细胞中,VP1和VP2蛋白均成功表达;以rBac-VP1-linker-VP2感染的Sf9细胞中,融合蛋白VP1-linker-VP2成功表达。该结果为CIAV亚单位的疫苗研发以及CIAV的防控提供物质基础。2.鸡传染性贫血病毒VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备为制备针对VP2蛋白的单克隆抗体,本研究将CIAV VP2的基因克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2。将重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞,阳性转化菌在0.1mM的IPTG浓度下,37℃诱导4h重组蛋白获得表达;将获得表达的样品超声波破碎后进行SDS-PAGE分析,结果得到大小约50kDa的重组蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,四次免疫后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,以rBac-VP2感染的Sf9细胞以及转染pCAGGS-VP2-Flag的DF1细胞进行IFA筛选,结果成功获得了两株稳定分泌针对CIAV VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名CIAV-VP2-4A12和CIAV-VP2-6B5。Western-blot结果显示两株单抗与不同系统表达的VP2蛋白均反应良好,为研究VP2蛋白的新型抗原表位提供了材料。3.鸡传染性贫血病毒VP2蛋白抗原表位的鉴定以研究内容二中所制备的IFA效价较高的单克隆抗体CIAV-VP2-4A12为研究对象,利用pET-32a作为表达载体将VP2蛋白逐步截短表达,以Western-blot验证不同截短蛋白与单抗CIAV-VP2-4A12的反应情况。结果表明,单克隆抗体CIAV-VP2-4A12识别的最短抗原表位为155KTVRW159。选取GenBank中23株国内外CIAV毒株进行保守性分析,发现该表位在不同毒株间高度保守,为VP2蛋白功能的研究以及CIAV的监测奠定基础。
崔英丽[3]（2021）在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究表明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒（CAV）的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶（h TERT）的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶（h TERT）基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素（apoptin）蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a（Ad-VT）,该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。
马珍[4]（2020）在《鸡贫血病毒体外诱导淋巴细胞中NLRC5/MHCI类分子的表达》文中提出鸡贫血病毒（Chicken anemia virus,CAV）是以免疫抑制为主要特征的鸡传染性贫血病的病原。天然免疫受体NLRs（Nucleotide-binding domain,leucine rich repeat receptors）家族中NLRC5（NLR family,CARD domain containing protein 5）为近年来发现调控MHCI（Major histocompatibility complex I）转录的关键因子。鸡MHCI又名B复合体（B complex class I,BF）,包括主基因座（BF2）和次基因座（BF1）。目前,有关CAV感染是否影响鸡NLRC5调控BF及其调控机理尚未清楚,本研究首先克隆表达、制备NLRC5抗体,其次应用真核细胞转染、荧光定量以及构建双荧光素酶检测系统等方法,检测CAV感染时淋巴细胞中NLRC5/MHCI及其相关分子的转录水平变化,进而分析该病毒的活性蛋白VP1、VP2和VP3对NLRC5以及NLRC5对MHCI（BF1和BF2）基因的调控,从而为揭示CAV感染调控NLRC5/MHCI从而影响宿主免疫应答的分子机制奠定基础。（1）NLRC5基因克隆、原核表达与抗体制备以鸡肝组织c DNA为模板通过设计的引物扩增其N端1-663bp（DD结构域）基因片段,经Nde I和Xba I双酶切连接至p Cold载体转化E.coli中获得NLRC5重组菌,以IPTG低温诱导后经镍亲和柱纯化融合蛋白作为免疫原经皮下多点注射新西兰兔,制备兔源抗NLRC5多克隆抗体（anti-NLRC5）。经western blot方法检测结果显示,制备的anti-NLRC5多克隆抗体能有效识别35k Da重组蛋白NLRC5-DD。（2）NLRC5在真核细胞中表达与定位应用PCR以鸡肝组织c DNA为模板克隆NLRC5最长编码区基因序列,连接p EGFP-C1真核表达载体,构建p EGFP-C1-NLRC5重组质粒,以脂质体介导分别转染HEK293T和鸡DF-1细胞,观察GFP-NLRC5的表达,以anti-NLRC5抗体和对照抗体anti-GFP对细胞表达蛋白进行Western blot检测。结果显示,与对照细胞相比,NLRC5过表达主要分布于细胞核,通过Western blot方法可检测过表达的NLRC5蛋白。（3）CAV感染诱导鸡淋巴细胞MDCC-MSB1（简称MSB1）中相关基因的转录表达以100 TCID50/m L CAV病毒液感染MSB1细胞,通过RT-q PCR检测病毒孵育0～48h细胞内病毒增殖情况（衣壳蛋白VP1）以及NLRC5、MHCI和MHCII基因的m RNA水平。结果显示,NLRC5在病毒感染后6h显着下调,之后持续上调,在检测时间段内以48h转录水平上调最为明显,而在36-48h时病毒的增殖较为显着,与此对应,MHCI表达在36-48h与初始12h相比上调显着,MHCII则在24h显着上调并达峰值,而在病毒增殖明显时（36-48h时）显着下降。由此说明,CAV在感染不同进程中能引起细胞中NLRC5及相关基因MHCI的转录变化。（4）通过双荧光素酶报告基因系统检测病毒蛋白与NLRC5/MHCI的调控关系以100 TCID50/m L CAV病毒液感染MSB1细胞,提取细胞DNA为模板扩增CAV-VP1、VP2、VP3基因连接至p CMV-myc载体。设计扩增启动子引物,以上述DNA为模板分别扩增NLRC5、BF1、BF2启动子区域连接至PGL3-basic载体。以重组质粒p EGFP-C1-NLRC5为模板扩增NLRC5基因序列连接至p CMV-myc载体。合成鸡干扰素IFN-γ序列并连接至p CMV-myc载体。将上述载体转染DF-1细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测NLRC5对BF1、BF2启动子活性影响。结果显示,鸡NLRC5启动BF2而不是BF1的表达;IFN-γ可正向调控NLRC5和BF2的表达;VP1、VP2、VP3均可正向调控NLRC5表达,其中,VP2蛋白调控作用最显着,且发现VP2虽然可以直接激活NLRC5,但是其对BF2的调控必须依赖IFN-γ的存在。综上所述,本研究首先克隆鸡NLRC5基因,通过原核表达制备兔源抗NLRC5多克隆抗体,应用该抗体可以检测NLRC5过表达蛋白。以CAV感染淋巴细胞MSB1时,发现其能够诱导NLRC5与MHCI相应变化。继而建立双荧光素酶报告基因系统,明确CAV活性蛋白VP1、VP2、VP3（尤其是VP2）能显着调控NLRC5表达,且NLRC5可以主要启动BF2。因而说明CAV感染以VP2为关键蛋白,通过调控NLRC5/MHCI的表达从而影响鸡免疫系统的应答反应。
史静柯[5]（2020）在《鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制》文中提出鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）感染引起的一种危害严重的禽类免疫抑制性疾病,给全球范围内的家禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而目前对CIAV感染及其诱导的免疫抑制的致病分子机理知之甚少,在CIAV基因组编码的三个蛋白VP1、VP2及VP3中,衣壳结构蛋白VP1被认为在介导CIAV感染宿主细胞及诱导产生中和抗体中具有极其重要作用,VP2编码双功能型磷酸酶活性,而VP3则编码凋亡素。CIAV的VP1是如何与易感细胞表面受体结合启动病毒感染及其分子基础尚需进一步探究。本研究在成功分离鉴定到一株CIAV毒株及进行全基因测定分析的基础上,对CIAV的VP1基因进行了克隆表达及稳定表达细胞系构建,且以合成多肽表位为免疫原研制出了 5株抗CIAV的VP1蛋白特异性单克隆抗体。研究结果为进一步开展CIAV分子流行病学调查、创制CIAV诊断技术、鉴定CIAV感染细胞受体及解析VP1介导的CIAV感染分子机制等提供了材料,打下了基础。1.鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ株的分离鉴定及其遗传演化分析为对江苏某地区疑似鸡传染性贫血病例进行病原检测与鉴定,将病料进行了PCR检测以及MDCC-MSB1细胞接种与盲传。PCR结果表明病料以及MDCC-MSB1细胞盲传物中均能扩增出CIAV特异性条带。证明已成功分离到一株CIAV,将其命名为CIAV-JS-CZ。通过设计3对引物对CIAV-JS-CZ分离株进行全基因测序,并借助生物学软件对基因组序列和生物信息学进行分析。结果表明,CIAV-JS-CZ分离株全基因组大小为2298bp;CIAV-JS-CZ分离株与23株国内外的CIAV分离株核苷酸的同源性在96.1%-99%之间,其中与日本分离株（AH9410）同源性高达99%,与我国广东分离株（GD-K-12）同源性最低,为96.1%;CIAV-JS-CZ分离株VP1的第394位氨基酸为谷氨酰胺（Q）,提示该分离株可能具有较强致病性。鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ毒株的分离鉴定丰富了 CIAV毒株数据库,为进一步开展CIAV研究打下了基础。2.鸡传染性贫血病毒VP1基因克隆及其表达细胞系初步构建为探究VP1在CIAV介导感染中作用及鉴定其潜在宿主互作蛋白,本研究以CIAV-JS-CZ的基因组为模板,首先PCR扩增出CIAV的VP1全基因ORF,并经酶切连接后克隆进真核表达载体pcDNA3.1-Hygromycin。重组质粒经测序验证后,命名为pcDNA3.1-Hygromycin-VP1。利用抗CIAV的VP1特异性多克隆抗体进行的间接免疫荧光试验证明,转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1的293T细胞可见特异性亮绿色荧光,而转染对照载体pcDNA3.1-Hygromycin的293T细胞中未见特异性亮绿色荧光。由于课题组观察到LMH细胞可作为CIAV潜在感染靶细胞,将pcDNA3.1-Hygromycin-VP1重组质粒转染LMH,通过药物潮霉素B筛选及有限稀释克隆法,初步获得表达CIAV的VP1的LMH细胞系。CIAV的VP1基因真核表达载体获得及其表达细胞系的初步构建为鉴定VP1介导CIAV感染分子基础及其细胞受体打下了基础。3.抗鸡传染性贫血病毒VP1单克隆抗体的研制为研制抗CIAV的VP1单克隆抗体,本研究在分析VP1的亲水性及抗原性基础上,以设计合成的两段多肽Peptides-1和Peptides-2为免疫原免疫Balb/c小鼠,以合成多肽和转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1真核表达质粒的293T细胞作为筛选原。通过常规方法将小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合、ELISA与IFA筛选鉴定及亚克隆,最终获得5株分泌抗CIAV的VP1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。其中一株是针对表位多肽Peptides-1,命名为CIAV-VP1-1C5;其余4株针对表位多肽 Peptides-2,分别命名为 CIAV-VP1-2E3、CIAV-VP1-2B3、CIAV-VP1-3F4及CIAV-VP1-3C10。5株抗VP1单克隆抗体不仅与包被表位多肽Peptides-1或Peptides-2具有良好的ELISA反应性,而且能通过IFA识别在LMH细胞中表达的VP1蛋白。抗VP1单克隆抗体的研制不仅为进一步构建基于VP1蛋白的CIAV的诊断技术开发提供了试剂,而且为鉴定VP1介导的CIAV感染细胞受体打下了基础。
陈爽[6]（2019）在《携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用及蛋白质组学相关研究》文中研究表明研究背景:乳腺癌作为世界上常见恶性肿瘤其发病率呈逐年上升[1]。手术是乳腺癌最常见的治疗方法,其次为术后辅助化疗。然而手术创伤大,化疗副作用多,部分癌细胞还具有显着耐药性[2,3]。因此,开发毒性低、副作用少的新型抗肿瘤药物尤为重要。肿瘤的发生与发展不仅体现为细胞增殖失控、分化异常,也与肿瘤细胞凋亡失衡密切相关。伴随分子生物学的不断发展进步,科学家发现凋亡并非是决定细胞死亡的唯一命运。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡,不同情况下,自噬可能抑制或是促进凋亡。Apoptin是一种具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡作用的新型抗肿瘤生物蛋白。虽然其诱导某些肿瘤细胞凋亡得以肯定,但对其具体机制仍不明确,并且与凋亡密切的相关的另一种死亡形式——自噬,是否也与apoptin相关至今未有人提出。本实验旨在发现apoptin对肿瘤细胞MCF-7的抗肿瘤作用及其发生的相应分子机制。研究目的:利用本课题组已构建的人5型腺病毒为载体三种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK,研究表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-VT和Ad-VP3对肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用参与方式,是否为自噬或凋亡,是否为是二者均有,它们之间是否又存在联系及可能参与的信号通路,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:MTS细胞活性检测,分析三种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞MCF-10A的杀伤抑制作用。利用自噬抑制剂3-MA的Annexin V-FITC/PI.流式实验,qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的定量定性实验,鉴定自噬的多种染色实验（MDC、IFA、p EGFP-LC3）及透射电镜实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的自噬作用。通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜等实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的凋亡作用。通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质组学实验分析携带apoptin的重组腺病毒Ad-VT和Ad-VP3作用MCF-7细胞后,产生的差异蛋白的功能和可能参与的信号通路。检测已构建含萤火虫荧光素酶的MCF-7细胞通过荧光素酶活性、稳定性,体外成像筛选出最稳定表达荧光素酶的MCF-7-luc。进行MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期等生物学特性的比对检测。通过细胞抑制率MTS实验、细胞膜AnnexinV-FITC/PI流式实验、细胞核Hoechst染色实验验证Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果。建立小鼠皮下荷瘤模型后,通过活体成像实验、游标卡尺测量肿瘤体积及生存期观察,研究Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。研究结果:1.体外MTS实验发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3对人乳腺癌MCF-7细胞具有杀伤作用,对人乳腺上皮细胞MCF-10A无显着杀伤作用。Ad-MOCK对MCF-7细胞和MCF-10A无杀伤作用。2.流式细胞术、Western Blot、qPCR、MDC染色、IFA和透射电镜实验提示携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3在细胞作用早期（6h和12h）促进肿瘤细胞MCF-7自噬增强。3.通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3促进人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。4.通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3能够抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。5.蛋白质组学实验对差异蛋白进行GO和KEGG分析提示:携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3作用能够促发人乳腺癌细胞MCF-7的自噬和凋亡。FOXO1和FOX03a蛋白参与apoptin引起细胞死亡的机制,特别是AMPK信号通路。6.选择活性最高、稳定性最好且与发光强度呈正相关的线性关系（R2=0.9903）的Clone 15株进行实验;通过MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞生物学特性鉴定,证明了构建过程对细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期未产生显着的影响。体外MTS实验、AnnexinV-FITC/PI流式实验和Hoechst染色实验证实重组腺病毒对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果无显着差别,可使用MCF-7-luc细胞进行小鼠荷瘤实验。7.体内实验裸鼠活体成像提示:携带apoptin的Ad-VP3和Ad-VT治疗组与对照组相比肿瘤平均生物发光强度较低,肿瘤体积变小,荷瘤小鼠的生存期延长。研究结论:携带apoptin的重组腺病毒可显着抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,而对人乳腺正常上皮细胞MCF-10A无抑制作用。携带apoptin的重组腺病毒主要以细胞凋亡方式引起MCF-7细胞的死亡,同时会对细胞自噬产生显着的影响,在作用的早期,自噬对癌细胞起到保护性作用,而在凋亡水平逐渐占据主导时,凋亡作用已经超过自噬所起到的保护作用的阈值,自噬开始逐渐降低,而后至48h左右自噬再一次升高和凋亡共同作用促进MCF-7细胞死亡。FOXO1蛋白和FOX03a蛋白参与了 apoptin引发的MCF-7细胞的自噬和凋亡,特别是与FOXO蛋白相关的AMPK信号通路,因此本研究认为AMPK可能将细胞自噬和细胞凋亡联系起来作为apoptin引起肿瘤细胞死亡的调控通路。
王春晖[7]（2012）在《携带凋亡素基因的重组腺相关病毒抑制膀胱癌作用的研究》文中认为研究目的1.制备携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3,并鉴定其在体外能否发挥生物学活性。2.探讨制备与纯化凋亡素蛋白多克隆抗体的方法,并对纯化后抗体的有效性和特异性进行免疫学评价。3.探讨并分析重组腺相关病毒rAAV-VP3对人膀胱癌细胞的感染特点、体外抑制膀胱癌效应及其可能的作用机理。4.评价携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗作用与效果,并对其作用机理进行探讨。研究方法1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析：将VP3基因通过基因重组的方法克隆至pAAV-MCS载体中,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后将其与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-VP3。收获病毒后采用氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠沉淀-氯仿抽提3个步骤进行病毒的分离、浓缩和纯化；PCR扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒的包装是否成功。病毒液负染后透射电镜观察病毒颗粒,并用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV-VP3的物理滴度；利用RT-PCR检测感染重组病毒后VP3基因在Vero细胞中的转录,免疫荧光检测VP3蛋白在Vero细胞中的表达。2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价：用真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经Nde I/BamH I双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72h后行免疫荧光.Western blot检测,对抗体的特异性进行免疫学评价。3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用：利用MTT法检测凋亡素重组腺相关病毒对T24、EJ细胞的MOI值及其对膀胱癌细胞增殖的影响；RT-PCR检测凋亡素在T24、EJ细胞中的转录,Western Blot检测凋亡素蛋白在膀胱癌细胞中的表达；透射电镜、DNA Ladder法观察和判定膀胱癌细胞凋亡；流式细胞术PI法检测重组病毒对膀胱癌细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI双染法检测感染重组病毒后T24、EJ细胞的凋亡；Western Blot检测凋亡素对膀胱癌细胞中的Survivin表达的影响；Elisa检测凋亡素对膀胱癌细胞凋亡通路中caspase-3的激活作用。4.凋亡素重组腺相关病毒对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗评价：建立荷人膀胱癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,将动物随机分为未治疗组、对照病毒rAAV-EGFP组、丝裂霉素C（MMC）治疗组、rAAV-VP3治疗组共4组,病毒组注射剂量为1×1010v.g./50μl/只,MMC用量1mg/kg,均采用瘤周及瘤内多点注射法。通过绘制皮下移植瘤生长曲线、计算平均瘤重和抑制率、大体观察和病理组织学检查观察凋亡素重组腺相关病毒对Balb/c裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,通过观察各组裸鼠治疗过程中一般情况、各组裸鼠存活率的比较评价治疗效果。免疫组化染色观察注射重组病毒后VP3蛋白在瘤内的表达时效性,免疫组化法计数阳性细胞所占百分比观察rAAV-VP3治疗组与对照病毒rAAV-EGFP组Ki.67、C-erbB-2、Rb、nm23的表达差异。实验结果1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析：重组质粒pAAV-VP3经酶切鉴定和基因测序正确,三质粒共转染AAV-293细胞72小时后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,收获的重组病毒纯化后滴度为5.1×1011v.g./ml,电镜下可见病毒颗粒。感染Vero细胞后,可检测到VP3基因的转录和蛋白表达。2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价：原核表达载体pET8a-VP3的构建成功并经PCR鉴定和基因测序正确；原核表达菌株pET8a-VP3/BL21经终浓度为0.4mM的IPTG诱导4小时后在14.4kDa与20kDa之间出现目的条带,其大小与预期结果相符合,外源蛋白成功表达；收集洗脱峰,SDS-PAGE检测VP3蛋白纯度良好,无明显杂带。用纯化后的VP3蛋白免疫新西兰大耳白兔后抗血清效价可达1：243000,采用Protein A纯化总IgG, SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体纯度较高,无明显杂带,间接ELISA法检测抗体灵敏度为5.4ng/ml;将rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72小时后行免疫荧光检测,可见特异性内源性表达的VP3蛋白以及核定位效应。在EJ和T24细胞中凋亡素主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质,行Western blot检测,于接近14kDa处可见特异性的目的条带。3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用：MTT法显示以MOI值2.0×104v.g./cell、1.0×105v.g./cell、2.0×105v.g./cell、5.0×105v.g./cell、1.0×106v.g./cell分别感染T24细胞和EJ细胞后72h, MOI=5.0×105v.g./cell时rAAV-VP3对T24细胞和EJ细胞的杀伤效应最为明显,增加感染复数不能进一步增强rAAV-VP3对膀胱癌细胞的杀伤效应；感染重组腺相关病毒rAAV-VP3的T24、EJ细胞增殖活性均明显下降,且随时间的推移效果更明显,而细胞对照组和rAAV-eGFP的OD490值都逐渐小幅上升,60h以后则逐渐下降（P<0.01）。透射电镜观察膀胱癌细胞出现核固缩、凋亡小体等典型的凋亡形态学改变,DNA Ladder法显示在100bp左右形成断裂的DNA片段；通过RT-PCR和Western Blot可检测到重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后能在T24、EJ细胞中转录与表达；流式细胞术PI法检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后与对照组比较S期细胞比例降低和G2M期细胞比例增多（P<0.01）。Annexin V-FITC/PI双染法检测到感染rAAV-VP3后T24、EJ细胞发生凋亡的比例明显升高。Western Blot检测腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,而对照病毒rAAV-LacZ作用的T24、EJ细胞内源性Survivin为高表达状态。Elisa法检测感染第3d、4d、5d后T24和EJ细胞中激活型caspase-3的含量明显增高,与对照病毒组和细胞对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,有较高的肿瘤抑制率并能提高裸鼠的存活率,生存中位数时间为55天,瘤内注射重组腺相关病毒rAAV-VP3后,可以观察到VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,于21天左右达到顶峰,以后一直维持强阳性表达；免疫组化检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3可抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并能上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达。结论1.包装的重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性。2.制备的凋亡素蛋白多克隆抗体具有较强的灵敏度和特异性,证实了凋亡素在正常细胞中定位于细胞质,而在肿瘤细胞中则定位于细胞核。3.重组腺相关病毒rAAV-VP3对T24、EJ细胞的最适感染复数为5.0×105v.g./cell,感染rAAV-VP3后膀胱癌细胞的增殖受到抑制,主要作用于肿瘤细胞的S期和G2/M期,发生G2/M期阻滞,引起细胞DNA合成受阻和降解。腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,提示VP3与Survivin的存在拮抗性,可能是凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一；caspase-3的激活是凋亡素诱导的细胞凋亡通路中的关键分子信号之一4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,并能减少肿瘤对周围组织的侵犯与瘤栓形成。基因治疗后能提高裸鼠的存活率,与MMC治疗组相比具有一定的优越性。其介导的VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,凋亡素体内抑制膀胱癌的作用机制可能与其抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达有关。5.利用腺相关病毒介导凋亡素基因的表达治疗膀胱癌的策略可行,为下一步运用该重组腺相关病毒进行临床前研究奠定了基础。
孙芬芬[8]（2010）在《鸡贫血病毒蛋白相互作用域定位研究》文中提出鸡传染性贫血病（Chicken Infectious Anemia, CIA）是由鸡贫血病毒（Chicken anemia virus, CAV）引起的危害23周龄雏鸡的一种免疫抑制病。临床症状表现为病鸡再生障碍性贫血,该病造成的免疫抑制使感染鸡对IBD、MD、ND等疾病的易感性增强。CAV编码3种蛋白,VP1蛋白为病毒的结构蛋白,VP2和VP3蛋白为病毒的非结构蛋白。蛋白质之间的相互作用,以及其中复杂的网络联系成为研究病毒复制以及致病力的关键因素。因此,深入开展鸡贫血病毒自身蛋白相互作用研究将有利于进一步了解病毒蛋白的生物学功能和病毒复制过程。本研究利用酵母双杂交系统、免疫共沉淀、激光共聚焦等技术,研究了贫血病毒3个蛋白之间的相互作用,取得了如下成果:免疫共沉淀和激光共聚焦试验需要用到不同种属的抗体,所以本试验首先制备了病毒蛋白相应兔源多克隆抗体。以CAV M9905株基因组DNA为模板,分别以VP1的小片段（962bp）以及全长VP2和VP3引物进行PCR扩增,扩增产物经双酶切后克隆到原核表达载体pET28a或pET30a上,得到pET28a-VP1（962bp）、pET28a-VP2和pET30a-VP3重组子。经诱导表达、纯化、复性后,免疫新西兰白兔,制备了抗3种蛋白的兔源抗血清。间接ELISA、IFA及Western blot分析结果表明,制备的多克隆抗体具有良好反应性和特异性。为研究鸡贫血病毒VP1、VP2和VP3蛋白之间的相互作用,本研究首先利用Proqest GAL4启动子的酵母双杂交系统对病毒3个蛋白间的相互作用进行了检测。构建诱饵载体pDEST-32-VP1/VP2/VP3和捕获载体pDEST-22-VP1/VP2/VP3,经醋酸锂法分别共转化酵母菌株MaV203,通过对报告基因His、LacZ及URA的检测,筛选到2组阳性重组子,分别为pDEST32-VP2+pDEST22-VP1和pDEST32-VP22+pDEST22-VP3,酵母双杂交检测结果初步证明CAV VP1与VP2蛋白存在相互作用,并首次发现了VP2与VP3蛋白之间存在相互作用。为了进一步验证它们的相互作用,本研究进一步利用免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验,对酵母双杂交试验结果进行了验证,从而得出VP1与VP2蛋白,以及VP2与VP3蛋白之间存在相互作用。为了进一步确定蛋白相互作用域,本研究在证明了CAV VP1与VP2蛋白、VP2与VP3蛋白相互作用的基础上,又对蛋白相互作用域进行了精确定位,根据对病毒的3个蛋白的亲水性、抗原性、表面可及性等分析,通过缺失突变的方法设计构建了相应缺失片段的酵母双杂交载体,根据报告基因表型进行筛选,筛选结果为:VP1-VP2蛋白:VP1 N端分别缺失59、86、117、167个氨基酸,或C端缺失36和95个氨基酸后仍能与VP2反应,初步确定相互作用域位于VP1蛋白的168354位氨基酸。VP2 N端缺失30个氨基酸后,仍与VP1蛋白相作用,说明VP2 N端不影响这两个蛋白的相互作用,VP2的C端为蛋白相互作用的主要区域,相互作用域位于VP2蛋白的31217位氨基酸。VP2-VP3蛋白:VP2 N端缺失30个氨基酸后不能够与VP3蛋白相作用,但C端缺失17个氨基酸后,仍与VP3蛋白相作用,初步确定相互作用域位于VP2蛋白的1199位氨基酸。VP3 N端缺失45个氨基酸,仍能与VP2反应。VP3蛋白通过C端与VP2蛋白相互作用,相互作用域位于VP3蛋白的46122位氨基酸。
李璐,李琬,喻江[9]（2009）在《鸡贫血病毒VP3基因的克隆及诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究》文中认为为了观察鸡贫血病毒VP3基因在人肺癌A549细胞中的凋亡诱导情况,试验用PCR方法扩增了鸡贫血病毒的VP3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3.1上,构建含VP3基因的重组体,在体外利用LipofectamineTM2000介导的基因转染法将pcDNA-VP3转入人肺癌A549细胞中,用RT-PCR法检测VP3基因在细胞中的表达状况,同时利用流式细胞术检测验证VP3基因诱导凋亡的方式。结果表明:试验获得了VP3基因正确插入的真核表达载体;转染后VP3基因在细胞中得到了表达;鸡贫血病毒的VP3基因确以凋亡的方式诱导了肺癌细胞A549凋亡。
宋修庆[10]（2009）在《VP3对鸡贫血病毒复制的影响及核定位信号的作用》文中研究表明本研究建立了鸡贫血病毒TaqMan探针荧光定量PCR的检测方法。首先根据本试验要求的特异性,选取鸡贫血病毒基因组中跨越VP1与VP2基因的高度保守的一段片段为目的检测基因,以达到能广泛的检测绝大部分毒株,然后以PCR的方式扩增出该基因,并将其连入到pMD18-T载体中,提取质粒,以分光光度计定量后作为标准品。将标准品以10倍倍比稀释后做荧光定量PCR,作成标准曲线,并对标准曲线的各项指标进行检测。结果表明,本试验建立的方法特异性强,敏感性高,重复性好。其检测范围在101-1010copy/uL可用于后续试验。为了研究VP3基因的功能,本试验根据GenBank上Cux-1株的基因序列,利用Oligo6.0分子生物学软件设计引物,以本试验室构建的pBluemCAV重组质粒为模板,以点突变的方式将CAV VP3基因进行逐步缺失,然后将扩增的重组质粒进行不完全酶切,得到一条载体与CAV基因组片段及CAV全基因组片段,二者连接,并通过酶切鉴定出CAV双基因组顺向连入载体的重组突变体质粒。将构建好的质粒分别转化MDCC-MSB1细胞,经PCR、测序、IFA等试验鉴定突变体病毒在细胞内的复制。并检测了缺失核定位信号的病毒在细胞内的定位情况,及突变体病毒rCAV-VP3N88,rCAV-VP3N80,rCAV-VP3N65在细胞上的复制动力学及诱导细胞凋亡能力。结果表明:本试验构建的突变体病毒都能在细胞上复制。利用荧光定量PCR方法,动态的检测了病毒不同时期在细胞内的复制情况。其中rCAV-VP3N88与rCAV-VP3N80复制能力与野毒株相比稍微降低,而rCAV-VP3N65复制能力变化较大,rCAV-VP3N45与rCAV-VP3N25因为复制能力更低,本试验未做。通过IFA,激光共聚焦显微镜发现,缺失了核定位信号的突变体病毒主要定位在细胞质内,与野毒主要定位在细胞核不同,说明核定位信号对病毒在细胞核的定位起重要作用。流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,接毒后96h阳性对照组引起细胞凋亡百分数为85.39±2.18%, rCAV-VP3N88与rCAV-VP3N80引起细胞凋亡百分数分别为63.08±4.78%与62.56±7.35%,rCAV-VP3N65引起细胞凋亡百分数只有31.46±2.55%。将突变体病毒（rCAV-VP3N88,rCAV-VP3N80,rCAV-VP3N65）及野毒株分别腿肌及颈部多点注射1日龄CAV阴性SPF雏鸡,分别于攻毒后5、9、11、14、21、28d时剖检。病理学检测表明阳性对照组胸腺小叶体积缩小,淋巴细胞显着减少,出血、淤血,髓质部萎缩;接种rCAV-VP3N88,rCAV-VP3N80组髓质及皮质出血,淤血,血管有淤血;接种rCAV-VP3N65胸腺皮质与髓质均有轻度出血及淤血,有散在出血;阴性对照组胸腺无明显病理变化。荧光定量PCR检测发现,病毒体内复制曲线与体外相符合。说明这几株缺失病毒的毒力与复制能力下降。
二、Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro（论文提纲范文）
（1）鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凋亡素 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3 癌症干细胞研究进展 |
| 1.3.1 癌症干细胞的概念 |
| 1.3.2 CSCs的鉴定 |
| 1.3.3 CSCs的特征 |
| 1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
| 1.3.5 CSCs与癌症转移 |
| 1.3.6 CSC与临床治疗 |
| 1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
| 第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂和材料 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
| 2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
| 2.2.3 细胞克隆形成能力 |
| 2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
| 2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
| 2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
| 2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
| 2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
| 2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
| 3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
| 3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株和动物 |
| 4.1.2 试剂和材料 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
| 4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
| 4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株和动物 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 CIAV病原学特征 |
| 1.1 CIAV的发现 |
| 1.2 CIAV的分类 |
| 1.3 CIAV的特性以及培养方式 |
| 1.4 CIAV的基因组结构 |
| 1.5 CIAV的蛋白结构和功能 |
| 2 CIAV的流行病学特征 |
| 3 CIAV的临床症状以及病理变化 |
| 4 CIAV的致病机理 |
| 5 CIAV的诊断方法 |
| 5.1 病原分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学方法 |
| 6 CIAV的防治 |
| 7 疫苗研发 |
| 7.1 亚单位疫苗 |
| 7.2 DNA疫苗 |
| 7.3 弱毒疫苗以及灭活苗 |
| 8 CIAV单克隆抗体的研究 |
| 9 研究目的及意义 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白在杆状病毒中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 重组供体质粒的构建 |
| 2.3 重组杆粒的构建及鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的获得与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 CIAV VP1、VP2基因的扩增结果 |
| 3.2 重组供体质粒构建正确 |
| 3.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病毒VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 重组质粒pET-32a-VP2的构建 |
| 2.3 表达菌株的构建以及蛋白表达 |
| 2.4 小鼠免疫 |
| 2.5 筛选方法的构建 |
| 2.6 细胞融合 |
| 2.7 阳性杂交瘤筛选 |
| 2.8 细胞的亚克隆 |
| 2.9 单克隆抗体Western-blot鉴定 |
| 2.10 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.12 腹水的制备以及效价测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 CIAV VP2基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒pET-32a-VP2的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白His-VP2的表达 |
| 3.4 筛选方法的建立 |
| 3.5 免疫小鼠血清的IFA鉴定 |
| 3.6 杂交瘤上清的IFA鉴定 |
| 3.7 单克隆抗体的Western-blot鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.9 单克隆抗体的特异性分析 |
| 3.10 腹水效价测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡传染性贫血病毒VP2蛋白抗原表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 截短表达引物设计 |
| 2.2 截短表达菌株的构建 |
| 2.3 截短蛋白的表达 |
| 2.4 抗原表位的定位 |
| 2.5 保守性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 各个截短菌株菌液PCR结果 |
| 3.2 抗原表位的定位 |
| 3.3 保守性分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录: 试剂配制 |
| 致谢 |
（3）双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.卵巢癌概述 |
| 2.溶瘤腺病毒 |
| 2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性 |
| 2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状 |
| 2.3 溶瘤腺病毒的临床发展 |
| 2.4 改造溶瘤腺病毒 |
| 3 凋亡素 |
| 3.1 凋亡素的序列和结构 |
| 3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用 |
| 3.3 凋亡素与DNA的相互作用 |
| 3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性 |
| 3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态 |
| 3.6 细胞是如何死亡的 |
| 3.7 凋亡素的传递方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）鸡贫血病毒体外诱导淋巴细胞中NLRC5/MHCI类分子的表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用中英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物与细胞系的来源 |
| 1.1.2 相关毒株与质粒的来源 |
| 1.1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.1.4 相关试剂与缓冲液的配制 |
| 1.1.4.1 细菌培养试剂配制 |
| 1.1.4.2 凝胶电泳所需试剂的配制 |
| 1.1.4.3 蛋白的诱导表达与提取纯化所需试剂的配制 |
| 1.1.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制 |
| 1.1.4.5 蛋白免疫印迹试验所需试剂的配制 |
| 1.1.4.6 抗体纯化所需试剂的配制 |
| 1.1.4.7 细胞转染和培养所需溶液 |
| 1.1.5 主要实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 RT-PCR克隆鸡NLRC5 基因 |
| 1.2.2.1 引物设计 |
| 1.2.2.2 鸡组织RNA提取与反转录 |
| 1.2.2.3 NLRC5编码区的扩增 |
| 1.2.3 NLRC5截短表达与抗体制备 |
| 1.2.3.1 构建NLRC5-DD重组质粒 |
| 1.2.3.2 原核蛋白诱导条件优化及抗体制备 |
| 1.2.3.3 抗体纯化 |
| 1.2.3.4 抗体效价检测 |
| 1.2.3.5 Western blot检测 |
| 1.2.4 细胞转染与Western blot检测 |
| 1.2.4.1 pEGFP-C1-NLRC5 真核表达重组质粒的构建 |
| 1.2.4.2 准备细胞与细胞转染 |
| 1.2.4.3 NLRC5在细胞内的表达定位 |
| 1.2.4.4 Western blot检测NLRC5 融合蛋白的表达 |
| 1.2.5 RT-qPCR检测CAV感染诱导鸡淋巴细胞中的基因表达 |
| 1.2.5.1 RT-qPCR引物设计 |
| 1.2.5.2 CAV病毒TCID_(50) 检测 |
| 1.2.5.3 CAV刺激MSB1 细胞 |
| 1.2.5.4 待检样品的制备 |
| 1.2.5.5 qPCR检测 |
| 1.2.5.6 数据处理与分析 |
| 1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.2.6.1 真核表达质粒引物设计 |
| 1.2.6.2 构建真核表达质粒 |
| 1.2.6.3 启动子活性检测 |
| 1.2.6.4 NLRC5对BF1、BF2 启动子活性影响 |
| 1.2.6.5 IFN-γ对NLRC5、BF2 启动子活性的影响 |
| 1.2.6.6 VP1、VP2、VP3对NLRC5 启动子活性影响 |
| 1.2.6.7 在NLRC5、IFN-γ诱导下VP2对BF2 启动子活性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR克隆鸡NLRC5 基因 |
| 2.2 NLRC5截短表达与抗体制备 |
| 2.3 NLRC5真核表达重组质粒的构建 |
| 2.4 NLRC5真核转染与亚细胞定位 |
| 2.5 NLRC5 融合蛋白Western blot检测 |
| 2.6 CAV感染诱导鸡淋巴细胞中NLRC5 基因的转录表达 |
| 2.7 构建双荧光素酶报告系统真核表达质粒 |
| 2.8 双荧光素酶报告系统启动子活性检测 |
| 2.9 NLRC5对BF1、BF2 启动子活化的作用 |
| 2.10 IFN-γ对NLRC5、BF2 启动子活化的作用 |
| 2.11 CAV活性蛋白对NLRC5 启动子活化的作用 |
| 2.12 VP2在NLRC5、IFN-γ诱导下对BF2 启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 CIAV的病原学研究 |
| 1.1 CIAV的发现和命名 |
| 1.2 CIAV的病毒学分类 |
| 1.3 CIAV的基因组结构 |
| 1.4 CIAV的复制方式和培养特性 |
| 2 CIAV编码的蛋白及功能 |
| 2.1 ORF3编码的VP1 |
| 2.2 ORF1编码的VP2 |
| 2.3 ORF2编码的VP3 |
| 3 CIAV的流行病学 |
| 4 CIAV的致病机理 |
| 5 CIAV的临床表现 |
| 5.1 CIAV的临床症状 |
| 5.2 CIAV的病理变化 |
| 6 CIAV的混合感染 |
| 7 CIAV的诊断方法 |
| 7.1 血清学诊断 |
| 7.2 分子生物学检测方法 |
| 8 CIAV的防治 |
| 8.1 加强饲养管理 |
| 8.2 免疫接种 |
| 9 研究目的和意义 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ株的分离鉴定及其遗传演化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2 病毒的全基因测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料PCR检测结果 |
| 3.2 MDCC-MSB1细胞上分离病毒结果 |
| 3.3 全基因扩增结果 |
| 3.4 酶切鉴定结果 |
| 3.5 同源性比较和遗传进化分析 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病毒VP1基因克隆及其表达细胞系的初步构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CIAV-VP1真核表达载体构建和表达 |
| 2.2 表达CIAV-VP1细胞系的初步构建 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CIAV真核表达载体构建结果 |
| 3.2 表达CIAV-VP1细胞系初步构建结果 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 抗鸡传染性贫血病毒VP1单克隆抗体的研制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 CIAV-VP1单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆及建株 |
| 2.7 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 2.8 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.9 腹水的制备与纯化 |
| 2.10 腹水效价测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 免疫原的选择 |
| 3.2 CIAV-VP1单克隆抗体筛选方法建立的结果 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体的特异性鉴定结果 |
| 3.6 腹水效价测定结果 |
| 3.7 单克隆抗体纯化效果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用及蛋白质组学相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 乳腺癌的发展现状和临床治疗概况 |
| 1.2 凋亡素的结构及对肿瘤细胞的作用 |
| 1.2.1 凋亡素的结构 |
| 1.2.2 凋亡素与细胞凋亡 |
| 1.2.3 凋亡素与细胞自噬 |
| 1.3 凋亡素与蛋白组学通路研究 |
| 1.3.1 蛋白组学概述 |
| 1.3.2 FOXO蛋白介导肿瘤细胞死亡的作用 |
| 1.4 携带apoptin的重组腺病毒对荧光素酶标记的人乳腺癌细胞MCF-7的体内抑制作用 |
| 第二章 携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7体外自噬作用的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 实验抗体 |
| 2.1.4 实验细胞 |
| 2.1.5 实验重组溶瘤腺病毒 |
| 2.1.6 宿主菌和质粒 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 重组腺病毒结构与扩增纯化 |
| 2.2.3 早期早期细胞活力测定(MTS实验) |
| 2.2.4 早期细胞凋亡流式检测 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR检测自噬相关基因表达水平变化 |
| 2.2.6 免疫印记法(Western Blot,WB)检测自噬相关蛋白表达水平 |
| 2.2.7 MDC染色检测MCF-7细胞自噬水平 |
| 2.2.8 间接免疫荧光检测凋亡素影响MCF-7细胞对LC3蛋白的表达 |
| 2.2.9 pEGFP-LC3质粒转染MCF-7细胞示踪自噬小体形成 |
| 2.2.10 透射电镜观察自噬小体 |
| 2.2.11 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK病毒滴度测定结果 |
| 2.3.2 重组腺病毒对MCF-7细胞和MCF-10A细胞增殖抑制作用的影响 |
| 2.3.3 PCR实验检测自噬相关蛋白mRNA表达结果 |
| 2.3.4 免疫印迹检测自噬相关蛋白表达变化水平 |
| 2.3.5 荧光显微镜直观自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ的表达增加结果 |
| 2.3.6 MDC染色检测MCF-7细胞自噬水平增加结果 |
| 2.3.7 透射电镜观察自噬形成结果 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三章 携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7体外凋亡作用的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 重组腺病毒 |
| 3.1.4 细胞 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒对MCF-7和MCF-10A细胞活性抑制实验(MTS) |
| 3.2.2 细胞周期分析 |
| 3.2.3 Annexin V-FITC/PI检测 |
| 3.2.4 JC-1染色——线粒体膜电位检测 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF-7细胞迁移功能的影响 |
| 3.2.6 BioCoat小室观察重组腺病毒对MCF-7细胞侵袭作用 |
| 3.2.7 透射电镜观察凋亡小体 |
| 3.2.8 Hoechst染色 |
| 3.2.9 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF-7和MCF-10A细胞活性抑制实验结果(MTS) |
| 3.3.2 细胞周期阻滞结果 |
| 3.3.3 Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果 |
| 3.3.4 线粒体膜电位检测促进凋亡结果 |
| 3.3.5 细胞迁移和侵袭功能抑制结果 |
| 3.3.6 透射电镜观察凋亡小体产生结果 |
| 3.3.7 Hoechst染色证明凋亡结果 |
| 3.4 实验小结 |
| 第四章 携带apoptin的重组腺病毒对MCF-7细胞作用的蛋白质组学初步研究 |
| 4.1 实验设计 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 实验抗体 |
| 4.2.4 实验细胞 |
| 4.2.5 实验重组腺病毒 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 待检细胞收集 |
| 4.3.2 label-free样品处理流程 |
| 4.3.3 Termo ScientificTM Orbitrap FusionTM 进行蛋白质分析 |
| 4.3.4 数据检索分析 |
| 4.3.5 Western Blot实验验证蛋白组学可信性 |
| 4.3.6 统计学处理 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 蛋白样品浓度定量结果 |
| 4.4.2 检测蛋白数量统计 |
| 4.4.3 接毒后相近样本聚类情况分析 |
| 4.4.4 差异蛋白(全蛋白部分)的生物信息学分析 |
| 4.4.5 差异蛋白(磷酸化蛋白部分)的生物信息学分析 |
| 4.4.6 Apoptin引发MCF-7细胞自噬和凋亡的差异蛋白鉴定 |
| 4.4.7 Western Blot验证 |
| 4.5 实验小结 |
| 第五章 携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7体内抑制作用研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要实验试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 实验细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 重组腺病毒的准备 |
| 5.2.2 构建荧光素酶标记人乳腺癌细胞的鉴定 |
| 5.2.3 MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞生物学特性的鉴定 |
| 5.2.4 重组腺病毒对MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞体外抑制作用比对 |
| 5.2.5 动物实验 |
| 5.2.6 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 重组腺病毒滴度的测定结果 |
| 5.3.2 荧光素酶活性和稳定性检测结果 |
| 5.3.3 MCF-7-luc细胞体外活体成像检测结果 |
| 5.3.4 MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞生长曲线比对 |
| 5.3.5 MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞细胞周期比对结果 |
| 5.3.6 MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞侵袭能力比对结果 |
| 5.3.7 重组腺病毒对MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞活性抑制实验(MTS)结果比对 |
| 5.3.8 重组腺病毒对MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞Annexin V-FITC/PI检测比对结果 |
| 5.3.9 重组腺病毒对MCF-7细胞和MCF-7-luc细胞Hoechst染色结果比对 |
| 5.3.10 荷瘤BLAB/c裸鼠活体成像检测 |
| 5.3.11 荷瘤BLAB/c裸鼠肿瘤生长情况 |
| 5.3.12 荷瘤BLAB/c裸鼠接毒后生存曲线 |
| 5.4 实验小结 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 携带apoptin的重组腺病毒早期(6h和12h)促进MCF-7细胞保护性自噬作用 |
| 6.2 携带apoptin的重组腺病毒能够引发MCF-7细胞凋亡作用 |
| 6.3 蛋白质组学研究发现携带apoptin的重组腺病毒引起MCF-7细胞自噬和凋亡,且与FOXO1蛋白和FOXO3a蛋白参与通路有关 |
| 6.4 体内实验发现携带apoptin的重组腺病毒对乳腺癌MCF-7细胞肿瘤生长有显着抑制作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）携带凋亡素基因的重组腺相关病毒抑制膀胱癌作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鸡贫血病毒VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 凋亡素重组腺相关病毒对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗评价 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）鸡贫血病毒蛋白相互作用域定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 CIA 概况 |
| 1.2 CAV 病原学 |
| 1.2.1 CAV 病毒学分类与结构特性 |
| 1.2.2 CAV 理化特性 |
| 1.2.3 CAV 培养、复制及转录 |
| 1.2.4 CAV 基因编码蛋白及功能研究 |
| 1.3 蛋白与蛋白相互作用研究的相关技术 |
| 1.3.1 噬菌体表面呈现技术 |
| 1.3.2 串联亲和纯化技术 |
| 1.3.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.3.4 GST 融合蛋白沉降技术 |
| 1.3.5 酵母双杂交系统 |
| 1.3.6 蛋白质芯片技术 |
| 1.4 鸡贫血病毒蛋白与蛋白相互作用研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 鸡贫血病毒蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂与药品 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.1.6 CAV VP1、VP2 和VP3 基因的克隆与表达 |
| 2.1.7 融合蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1.8 融合蛋白多克隆抗体的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因克隆及鉴定结果 |
| 2.2.2 蛋白的融合表达及鉴定 |
| 2.2.3 兔抗VP1、VP2 和VP3 多克隆抗体的效价测定 |
| 2.2.4 制备的多克隆抗体与真核表达的VP1、VP2 和VP3 蛋白反应原性检测 |
| 2.2.5 制备的多克隆抗体Western blot 分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 2.3.2 鸡贫血病毒VP1 蛋白的原核表达 |
| 2.3.3 鸡贫血病毒非结构蛋白的原核表达 |
| 第三章 鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 蛋白之间的相互作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、菌株、质粒、抗体、细胞 |
| 3.1.2 试剂与药品 |
| 3.1.3 相关试剂配制方法 |
| 3.1.4 鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 基因酵母双杂交载体的构建 |
| 3.1.5 酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活性的检测 |
| 3.1.6 酵母双杂交载体共转化Mav203 酵母感受态细胞 |
| 3.1.7 VP1、VP2 和VP3 真核表达及IFA、Western blot 分析 |
| 3.1.8 免疫共沉淀试验（Co-IP） |
| 3.1.9 激光共聚焦试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 基因酵母双杂交载体的构建 |
| 3.2.2 构建的诱饵载体自激活作用的鉴定 |
| 3.2.3 酵母双杂交筛选结果 |
| 3.2.4 免疫共沉淀试验结果 |
| 3.2.5 激光共聚焦试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 鸡贫血病毒蛋白之间相互作用 |
| 3.3.2 酵母双杂交系统 |
| 3.3.3 互作蛋白的进一步验证 |
| 第四章 鸡贫血病毒蛋白相互作用域的定位研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株、细胞、质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 VP1、VP2 和VP3 缺失片段酵母双杂交载体构建 |
| 4.1.4 酵母双杂交载体共转化Mav203 感受态及阳性重组子筛选 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 酵母双杂交载体构建 |
| 4.2.2 截短片段酵母双杂交试验筛选结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 VP1-VP2 蛋白相互作用域定位研究 |
| 4.3.2 VP2-VP3 蛋白相互作用域定位研究 |
| 4.3.3 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）鸡贫血病毒VP3基因的克隆及诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 试剂 Sma |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒DNA的分离 |
| 1.2.2 VP3基因克隆、测序 |
| 1.2.3 VP3真核表达载体的构建 |
| 1.2.4 细胞培养及基因转染人肺癌细胞A549 |
| 1.2.5 RT-PCR检测 |
| 1.2.6 流式细胞术检测转染后基因诱导凋亡的细胞 |
| 1.2.7 MTT法检测不同处理组A549细胞增殖情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pUC-VP3的鉴定结果 (见图1、图2) |
| 2.2 测序结果 |
| 2.3 重组质粒pcDNA-VP3的酶切鉴定结果 (见图3) |
| 2.4 RT-PCR检测结果 (见图4) |
| 2.5 流式细胞术检测结果 (见图5) |
| 2.6 MTT法检测结果 (见图6) |
| 3 讨论 |
（10）VP3对鸡贫血病毒复制的影响及核定位信号的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 CIA 的基本情况 |
| 2 CAV 分子生物学研究进展 |
| 2.1 CAV 的基因组结构及其转录 |
| 2.1.1 CAV 的基因组结构 |
| 2.1.2 CAV 基因组的复制 |
| 2.1.3 CAV 基因组的转录 |
| 2.2 CAV 基因组编码蛋白及功能 |
| 2.2.1 VP1 蛋白 |
| 2.2.2 VP2 蛋白 |
| 2.2.3 VP3 蛋白(凋亡素) |
| 2.3 CAV 感染性分子克隆研究进展 |
| 3 VP3 蛋白研究进展 |
| 3.1 VP3 蛋白的结构 |
| 3.2 VP3 蛋白的功能 |
| 3.3 VP3 蛋白诱导细胞凋亡的作用机制 |
| 3.3.1 VP3 的蛋白结构与其诱导凋亡作用的关系 |
| 3.3.2 VP3 的核定位信号与其诱导凋亡作用的关系 |
| 3.3.3 VP3 蛋白的108 位氨基酸的磷酸化与其诱导凋亡的关系 |
| 4 CAV 的致病机理 |
| 5 CIA 的诊断 |
| 5.1 病毒的分离与鉴定 |
| 5.2 血清学检测 |
| 5.3 分子生物学方法 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 荧光定量PCR 方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒株和细胞 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 引物/探针 |
| 1.4 病毒培养与病毒DNA 提取 |
| 1.5 常规PCR |
| 1.6 阳性标准模板的制备 |
| 1.7 Real Time PCR 反应条件优化 |
| 1.8 标准曲线的建立 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 特异性试验 |
| 1.11 重复性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 Real Time PCR 反应条件的确立 |
| 2.2 标准曲线的建立 |
| 2.3 敏感性评价 |
| 2.4 特异性评价 |
| 2.5 重复性评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鸡贫血病毒VP3 对病毒复制的影响及核定位信号的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株、载体和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 重组突变体质粒的构建与鉴定 |
| 1.3.1 引物设计与合成 |
| 1.3.2 突变的引入 |
| 1.3.3 重组质粒pBluem2CAV-VP3NX 的构建与鉴定 |
| 1.4 病毒拯救及鉴定 |
| 1.4.1 病毒拯救 |
| 1.4.2 间接免疫荧光检测 |
| 1.4.3 PCR 检测 |
| 1.5 rCAV-VP3NX 在 MDCC-MSB1 细胞上的复制能力比较 |
| 1.6 rCAV-VP3NX 在 MDCC-MSB1 细胞上的定位 |
| 1.7 诱导细胞凋亡作用检测 |
| 1.8 动物试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pBluem2CAV-VP3NX 的构建与鉴定 |
| 2.1.1 突变的引入 |
| 2.1.2 重组质粒pBluem2CAV-VP3NX 的构建与鉴定 |
| 2.2 pBluem2CAV-VP3NX 转染MDCC-MSB1 细胞后的检测 |
| 2.2.1 间接免疫荧光检测 |
| 2.2.2 PCR 与测序检测 |
| 2.3 rCAV-VP3NX 在 MDCC-MSB1 细胞上的复制能力比较 |
| 2.4 rCAV-VP3NX 在 MDCC-MSB1 细胞上定位的检测 |
| 2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.6 动物试验 |
| 2.6.1 病理学检测 |
| 2.6.2 PCR 与测序检测 |
| 2.6.3 体内复制能力检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结 论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro（论文参考文献）
- [1]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)
- [2]鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备[D]. 汪铭锐. 扬州大学, 2021
- [3]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究[D]. 崔英丽. 吉林大学, 2021(01)
- [4]鸡贫血病毒体外诱导淋巴细胞中NLRC5/MHCI类分子的表达[D]. 马珍. 安徽农业大学, 2020(03)
- [5]鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制[D]. 史静柯. 扬州大学, 2020
- [6]携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用及蛋白质组学相关研究[D]. 陈爽. 延边大学, 2019(01)
- [7]携带凋亡素基因的重组腺相关病毒抑制膀胱癌作用的研究[D]. 王春晖. 昆明医科大学, 2012(10)
- [8]鸡贫血病毒蛋白相互作用域定位研究[D]. 孙芬芬. 中国农业科学院, 2010(02)
- [9]鸡贫血病毒VP3基因的克隆及诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究[J]. 李璐,李琬,喻江. 黑龙江畜牧兽医, 2009(13)
- [10]VP3对鸡贫血病毒复制的影响及核定位信号的作用[D]. 宋修庆. 中国农业科学院, 2009(10)