一、丹参对成纤维细胞成骨的扫描电镜观察（论文文献综述）
顾芯铭[1]（2021）在《3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的制备及成骨作用研究》文中指出研究背景:随着人口老龄化的加剧,由肿瘤、炎症、创伤和退行性病变等原因导致的骨缺损成为了临床上的常见问题。目前常采用的治疗方法是将生物材料植入骨缺损部位,实现对骨组织结构和功能的修复。钛及其合金作为传统的骨植入材料,具有良好的生物相容性,但钛的弹性模量约为110GPa,与人体皮质骨的弹性模量（16-23GPa）差距过大,容易引起应力屏蔽效应,导致植体周围的骨吸收。聚醚醚酮（Polyetheretherketone,PEEK）作为一种半结晶型聚芳醚酮（Polyaryletherketone,PAEK）,具有与骨组织相近的弹性模量和良好的生物相容性,在口腔科和骨科领域中发展前景广阔。近年来,3D打印技术与临床治疗联系紧密,它能快速、精准地打印出特定形状的植入材料,完成对骨缺损的个性化修复,但PEEK由于其结晶性,分子链呈规则的刚性,在3D打印后存在力学性能不理想、层间作用力不强、制品易分层翘曲以及与无机填料相容性差等缺点。无定形聚芳醚酮（PEK-CN）含有极性基团腈基（-CNs）,能通过增强分子间的范德华力提高层间强度,在3D打印后保持良好的力学性能和层间结合力。为提高PEK-CN的生物活性,可通过3D打印技术构建出多孔结构促进材料与骨组织的结合,提高骨整合效果。另外,纳米羟基磷灰石（Nanohydroxyapatite,nHA）与骨组织中的羟基磷灰石在组成、结构和尺寸上高度相似,可有效促进骨再生,而且能与PEK-CN的极性基团相互作用提高二者的相容性,可作为3D打印PEK-CN的生物活性填料。研究目的:通过熔融沉积3D打印技术制备出PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEKCN支架,并对材料性能、生物相容性和体内外成骨作用展开研究,为PEK-CN的临床应用提供科学依据。研究方法:1.通过流变性能测试,确定挤出机的最佳工作温度和转速,制备PEK-CN的3D打印专用丝材。采用溶液法将不同质量分数的nHA与PEK-CN共混,通过扫描电镜观察二者的相容性,并进行力学性能分析,选择合适质量分数的nHA用于3D打印。接下来对3D打印的PEK-CN和nHA/PEK-CN复合材料进行表面形貌观察、元素分析和力学性能分析。2.采用L929细胞活死染色、细胞毒性实验、RAW264.7巨噬细胞的炎症相关基因表达检测、溶血实验、蛋白吸附实验和模拟体液（Simulated body fluid,SBF）实验评价3D打印PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架的生物相容性。3.分离并培养兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs）,利用流式细胞仪进行细胞表型鉴定。采用细胞凋亡实验探究3D打印PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架对细胞活性的影响,并通过对细胞粘附形态观察、细胞增殖实验、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）分析、细胞矿化分析和成骨相关基因表达分析研究各组材料对BMSCs粘附、增殖和成骨分化的作用。4.建立兔股骨远端骨缺损模型,将3D打印PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架植入骨缺损,通过Micro-CT检测、硬组织Van Gieson染色和生物力学推出实验分析各组材料植入体内12周后的骨整合效果。研究结果:1.通过熔融沉积3D打印技术制备了具有良好力学性能的PEK-CN、共混10wt%nHA的PEK-CN复合材料以及孔隙率为70%的多孔nHA/PEK-CN支架,其中多孔nHA/PEK-CN支架的力学性能与人松质骨相近。2.3D打印PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架具有良好的生物相容性和血液相容性,不会产生炎症反应。nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架能明显促进蛋白质在材料表面的吸附以及在SBF中的磷灰石沉积。3.3D打印PEK-CN、nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架均不会引起BMSCs的细胞凋亡。nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架能明显促进BMSCs的粘附和增殖、ALP活性、细胞矿化作用和成骨相关基因ALP、RUNX2、BMP-2、COL-1、OCN和OPN的表达。4.3D打印nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架能明显提高材料周围和内部的新骨形成以及骨-植入材料界面的结合强度。结论:3D打印PEK-CN及其复合材料具有良好的力学性能和生物相容性,其中nHA/PEK-CN和多孔nHA/PEK-CN支架还具有促进成骨分化和骨整合作用,为临床骨缺损的个性化修复提供了新方法。
刘鹏[2]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中进行了进一步梳理由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
贾婷婷[3]（2021）在《Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus,T2DM）是一种临床上常见的代谢性疾病,以血糖升高、血脂紊乱为主要特征,常伴有多种严重并发症,已成为损害居民健康的重大公共难题。研究指出2型糖尿病与牙周病变的发生发展密切相关,易导致患者牙齿脱落,造成牙列缺损或缺失。口腔种植技术作为现阶段修复缺失牙最理想的手段,逐渐成为众多失牙患者的首选治疗方式。2型糖尿病患者虽然有较大的种植修复需求,但由于该病会对骨代谢产生不利影响,损害成骨细胞功能,抑制种植体周围新骨再生,对种植体骨结合产生不利影响,被认为是口腔种植牙的相对禁忌症。近年来,对2型糖尿病所致种植体骨结合不良的病理机制的探索一直是科研的难点和热点之一,因此阐明其致病机制并开发有效的治疗药物将会对临床上提高2型糖尿病患者的种植义齿成功率具有重要意义。cGMP 依赖性蛋白激酶 G2（cGMP-dependent protein kinase G2,PKG2）作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,位于真核细胞内,研究表明其能够发挥对骨骼生长的调控作用,不仅调节软骨细胞的分化,也参与调节成骨细胞功能,被认为是骨骼内稳态和骨重建的关键调节器。除此之外,cGMP/PKG2通路在维持糖代谢的稳定方面也起着重要作用,多种组织中该通路的受损被认为与糖尿病并发症的发生发展有关,而特异性激活PKG2能够有效改善这种情况。基于PKG2同时在骨代谢与糖代谢过程中起重要作用,我们推测其可能为2型糖尿病致种植体骨结合不良的关键靶点,激活其表达能够对改善糖尿病环境下成骨细胞功能障碍产生积极作用。Cinaciguat作为一种新型的药物激活剂,能够不依赖于NO直接激活被氧化的鸟苷酸环化酶,从而高效地产生cGMP,增强PKG2的活性,对于改善心脏病、肾病具有确切疗效,更被誉为治疗骨质疏松疾病最有潜力的药物。同时,cinaciguat对于糖尿病相关疾病也有较好的治疗效果,能够在糖毒性环境中对心肌细胞起保护作用,并能够增加1型糖尿病小鼠的骨小梁和密质骨。然而,cinaciguat能否作为PKG2的激活剂,缓解2型糖尿病环境下成骨细胞的功能障碍,改善种植体骨结合,及其背后的分子学作用机制尚无人报道。因此,本研究首先建立体内2型糖尿病及体外高糖高脂模型,探究PKG2的表达与2型糖尿病致种植体骨结合不良的相关性,确定其作为治疗靶点的可靠性;其次,通过慢病毒转染过表达PKG2,验证增加其表达能够改善体外糖尿病模拟环境诱导的成骨细胞功能障碍;最后探究体内外合理应用cinaciguat是否能够通过逆转糖尿病条件下PKG2的表达降低,保护成骨细胞功能,改善2型糖尿病所致的种植体骨结合不良,并通过高通量蛋白组学的方式挖掘其背后的效应分子及作用机制。本课题旨在揭示2型糖尿病影响种植体骨结合这一重要临床现象的分子基础,从而找寻出新的关键靶点PKG2及治疗药物cinaciguat来提高2型糖尿病患者种植义齿治疗的成功率。材料与方法1.2型糖尿病对大鼠种植体骨结合、成骨细胞生物学功能及PKG2表达水平的影响在体内实验中,利用喂养高脂高糖饲料联合注射低剂量链脲佐菌素的方法构建2型糖尿病大鼠模型,并实施外科手术在大鼠股骨植入人工种植体。处死大鼠后进行取材,采用Micro-CT扫描重建、硬组织切片染色、苏木素-伊红染色、改良Masson三色染色等多种手段评价2型糖尿病对于体内种植体骨结合的影响,并利用免疫组织化学染色检测PKG2在种植体周围骨区的表达情况。在体外实验中,通过酶消化乳鼠颅骨组织块的方法提取大鼠原代成骨细胞,并对分离纯化的成骨细胞进行鉴定。联合应用25mM葡萄糖和200μM棕榈酸钠模拟体外2型糖尿病高糖高脂（high-sugar and high-fat,HGHL）环境,并定义为HGHL培养基组,以正常培养基组、溶剂组作为对照组,观察各组干预下成骨细胞生物学功能的改变。主要包括利用乙炔基脱氧尿苷（5’-ethyny1-2’-deoxyuridine,EDU）荧光染色比较三组细胞的增殖能力;利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色检测细胞在钛片上的黏附情况;并通过碱性磷酸酶染色及活性定量分析实验、茜素红检测矿化结节形成实验、western blot检测成骨相关蛋白的表达反映三组细胞的成骨分化能力;最后利用细胞免疫荧光及western blot检测不同组别成骨细胞内PKG2的表达情况。2.过表达PKG2对体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤的影响通过慢病毒转染方式使成骨细胞中PKG2过表达,并利用qRT-PCR及western blot检测过表达效率。确定PKG2能够在成骨细胞中稳定过表达后,加入HGHL培养基干预,建立HGHL+OEPKG2组,并与正常培养基组、HGHL培养基组、HGHL+OENC组（过表达对照组）进行成骨细胞生物学功能方面的比较。主要包括运用EDU荧光标记比较细胞的增殖能力;采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色检测细胞的黏附情况;采用碱性磷酸酶染色及活性定量分析、茜素红染色、western blot检测成骨相关蛋白表达水平反映细胞的成骨分化能力,验证过表达PKG2对体外2型糖尿病高糖高脂环境下成骨细胞功能损伤的保护效果。3.应用cinaciguat对2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍及种植体骨结合不良的改善作用研究在体外实验中,将cinaciguat外源性加入HGHL培养基中干预成骨细胞,并以溶剂DMSO作为对照组,通过细胞免疫荧光及western blot观察cinaciguat对于PKG2的激活作用。同时继续采用EDU荧光标记术、流式细胞术、罗丹明-鬼笔环肽荧光染色、碱性磷酸酶染色与活性定量分析、茜素红染色及western blot技术分别检测了加入cinaciguat后对于细胞增殖、凋亡、黏附及成骨分化等功能的改善效果。并利用小干扰RNA技术敲减成骨细胞内PKG2,验证cinaciguat发挥的有利作用是通过PKG2所介导。在体内实验中,构建2型糖尿病及正常大鼠种植体植入模型,并通过腹腔注射cinaciguat、皮下注射胰岛素及两者联合应用三种方法治疗糖尿病大鼠,运用钙黄绿素染色、Micro-CT重建、环境扫描电镜、硬组织切片染色、苏木素-伊红及改良Masson三色染色等多种手段评价不同治疗方法对于种植体骨结合的改善作用。4.Cinaciguat逆转2型糖尿病环境对成骨细胞损害作用的蛋白组学分析对体外HGHL培养基中加入或不加入cinaciguat干预的两组成骨细胞进行收样,且每组设立3个重复组。样本收集完毕后,进行蛋白组学检测分析,包括蛋白质的定量及质量评估、串联质谱标签标记、分级、质谱分析、数据库对比等操作。获得组学分析的蛋白表达水平的原始数据后,根据设定标准,确定两组间上下调的差异蛋白,并通过对差异蛋白进行基因本体论（gene ontology,GO）和信号通路的分析,确定蛋白的功能富集情况与参与的生物通路信息。同时构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,预测关键蛋白PKG2与某个差异蛋白之间的潜在关系,探讨相关的效应机制。5.Cinaciguat通过PKG2改善2型糖尿病所致成骨细胞功能障碍的作用机制研究首先通过western blot验证蛋白质组学结果,确定蛋白质-蛋白质相互作用网络预测的关键蛋白PKG2与差异蛋白PLCβ1之间的相互作用;其次利用Ca2+荧光技术检测成骨细胞内钙超载的情况;再次,采用透射电镜和western blot检测内质网应激标志物的蛋白表达来评估成骨细胞的内质网应激反应;最后通过EDU荧光染色、流式细胞术、罗丹明-鬼笔环肽荧光染色、碱性磷酸酶染色与活性定量分析及western blot技术检测激活或抑制内质网应激效应对于细胞增殖、凋亡、黏附及成骨等生物学功能的影响。结果1.2型糖尿病损害大鼠种植体骨结合及成骨细胞功能,并导致PKG2表达下调体内实验成功构建2型糖尿病大鼠模型,模型大鼠的空腹血糖均高于11.1 mmol/L且稳定大于一周,完成大鼠股骨种植体植入术12周后安乐处死大鼠,收集样本,对不同组别大鼠股骨种植体的骨结合情况进行检测。Micro-CT重建分析和硬组织切片染色结果均显示与正常大鼠相比,2型糖尿病大鼠组骨结合率明显降低,骨相关的指标参数也相应下降;苏木素-伊红染色、改良Masson三色染色显示2型糖尿病大鼠种植体周围大部分为不成熟的纤维组织,骨组织较少,而正常大鼠种植体周围包绕大量成熟骨组织;免疫组织化学染色结果表明,与正常大鼠相比,糖尿病大鼠种植体周骨组织的PKG2表达明显降低。体外实验中成功分离了大鼠原代成骨细胞,并进行鉴定,其特征符合成骨细胞标准。在进行三组成骨细胞间多项生物学功能检测时,结果提示HGHL培养基能够显着降低细胞的增殖能力,且提高了细胞的凋亡比率,同时细胞在钛片上的接触面积减小,附着状态变差,成骨功能也受损严重。免疫荧光及western blot结果表明与正常组相比,HGHL组成骨细胞内PKG2表达明显降低。2.过表达PKG2改善体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤体外实验通过慢病毒转染成功构建了成骨细胞过表达PKG2模型,转染效率良好。对各组细胞的生物学功能进行检测时发现,过表达PKG2能够促进HGHL条件下成骨细胞增殖,改善HGHL环境下成骨细胞的黏附,同时促进HGHL培养基中细胞的成骨分化。3.应用cinaciguat能够改善2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍,促进种植体骨结合体外实验中细胞免疫荧光和western blot检测表明在HGHL培养基环境下外源性加入cinaciguat能够上调成骨细胞中PKG2的表达,并能够在PKG2的介导下,提升模拟糖尿病环境下成骨细胞增殖能力,抑制细胞的凋亡情况,逆转细胞的黏附不利,并能够改善成骨分化。体内实验中免疫组化染色结果提示cinaciguat能够上调2型糖尿病大鼠种植体周围骨组织中PKG2的表达;与皮下注射胰岛素或腹腔注射cinaciguat单一治疗方法相比,cinaciguat作为辅助药剂联合应用胰岛素的治疗方法能够显着改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合不良情况,具体表现为钙黄绿素双荧光标记间距的平均距离更大、种植体骨结合率明显升高、种植体表面的骨超微结构质量更高及种植体周围的骨组织数量更多,且更为成熟。4.Cinaciguat逆转成骨细胞在2型糖尿病环境中损害作用的蛋白组学分析通过高通量蛋白组学技术比较HGHL培养基中加入或不加入cinaciguat干预的两组成骨细胞之间蛋白组分的差异,并根据p值<0.05和绝对倍数变化≥1.2两个基本原则对蛋白进行筛选,共得到221个差异蛋白。生物信息学分析结果提示差异蛋白在GO功能上主要富集在细胞外基质,在信号通路上主要富集在糖尿病的病理代谢及骨代谢等相关生物过程。更为重要的是,当以PKG2作为关键节点蛋白,进行蛋白-蛋白互作网络的分析时,我们预测出PLCβ1可能为其下游的效应蛋白。5.Cinaciguat通过PKG2抑制PLCβ1,减轻成骨细胞内钙超载和内质网应激发挥骨保护作用Western blot验证结果显示,PLCβ1蛋白的表达水平与蛋白质组学分析结果一致,且cinaciguat抑制PLCβ1的作用是通过PKG2介导的,进一步明确PKG2对于PLCβ1的调控作用。除此之外,钙离子荧光及透射电镜的结果显示cinaciguat能够通过PKG2减轻成骨细胞内由于糖尿病模拟环境下PLCβ1表达升高所引发的钙超载与内质网应激现象;而cinaciguat通过抑制内质网应激反应能够提升2型糖尿病高糖高脂环境下成骨细胞增殖能力,抑制细胞的过度凋亡,改善细胞的黏附不利,并能够促进细胞的成骨分化。结论1.2型糖尿病大鼠股骨的种植体骨结合情况较差,且高糖高脂环境下原代成骨细胞的增殖、凋亡、黏附及成骨能力受损明显。同时,在体内外模拟2型糖尿病条件下细胞中PKG2的表达均降低。2.通过慢病毒转染过表达PKG2能够改善体外2型糖尿病高糖高脂环境对成骨细胞的功能损伤,证实了PKG2在糖尿病环境下调控成骨细胞生物学行为的积极作用。3.外源性添加cinaciguat对体外2型糖尿病高糖高脂条件所造成的成骨细胞功能损伤具有保护作用,并能够作为辅助用药联合应用胰岛素显着改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合不良情况。4.通过高通量蛋白组学技术及生物信息学分析,以PKG2作为关键节点蛋白,预测出PLCβ1可能为其下游的效应蛋白。5.Cinaciguat能够通过上调PKG2抑制PLCβ1的激活,减轻细胞内Ca2+超载-内质网应激反应,从而保护成骨细胞免受2型糖尿病的损伤,进而改善种植体骨结合。
张珊[4]（2021）在《微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控研究》文中提出组织工程是一门细胞生物学和材料科学相结合的学科,对修复组织和器官损伤具有重要的意义。一般认为其包括三个要素:种子细胞、支架材料和生长信息。基于以上三个要素,组织工程的主要研究内容包括:对细胞进行有效的体外扩增以获得充足的细胞尤其是干细胞,设计和构建合理的细胞培养支架,提供有效的生长信息指导干细胞的增殖和分化等行为。组织重建是一个复杂的动态的生理过程,以骨组织工程为例,骨重建包括骨、神经、血管等组织的再生,在细胞层面要求干细胞向骨细胞、神经细胞等功能细胞的分化。在细胞生物学研究中,生物和化学分子多被用来调控干细胞的增殖和分化等行为,但是存在定域性不强、易扩散和价格昂贵等缺点。而微纳米材料介导的结构信号和电信号等不同的物理信号,对干细胞命运的调控具有定域性强和安全高效等显着优点,因此使用支架材料对负载的干细胞实现不同功能细胞分化将是组织工程的有效途径。本论文根据组织工程研究中对不同物理信号的需求,制备了不同结构及性质的细胞培养支架用于干细胞扩增及干细胞分化的调控,对微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控作用进行了研究。本论文的研究主要从以下几个方面展开:1.纳米微结构复合材料对干细胞扩增和表型维持性的研究:干细胞是用组织工程手段修复各种组织和器官的基本要素。然而,缺乏充足的干细胞源仍是限制组织工程和临床医学进一步发展亟待解决的重要问题。传统的使用细胞培养皿的二维培养方法存在培养环境与体内微环境相差较大以及细胞取用不方便等缺点。基于支架材料的三维培养可以为细胞提供与体内相近的微环境,有利于细胞的体外扩增和细胞表型的维持。本论文设计了一种简单、低成本且可批量化的方法,制备了京尼平交联的壳聚糖/氧化石墨烯复合微球。该复合微球具有良好的物理强度,能够保证细胞在培养过程中的长期稳定性。间充质干细胞能够在微球表面铺展和扩增,同时可以维持干细胞表型。此外,京尼平交联产生的自发荧光便于观察干细胞在微球支架表面的铺展和分布。因此,该部分研究提出了一种可批量化生产的壳聚糖/氧化石墨烯复合微球干细胞三维扩增体系,为本论文后续干细胞分化的相关研究提供了干细胞表型维持性良好的干细胞扩增方法。2.有序纳米阵列介导的结构信号对干细胞成骨分化的调控:在对干细胞进行有效扩增的基础上,对干细胞分化的调控是组织工程研究最重要的内容。相比于生物化学因子,纳米结构对干细胞分化的调控被证实具有更好的生物稳定性和安全性。作为一种典型的纳米阵列,纳米柱阵列结构介导的结构信号对干细胞行为的影响多被研究,但纳米柱直径对干细胞分化的影响还少有报道。因此,该部分探究了不同纳米柱直径的聚乳酸纳米柱阵列介导的结构信号对干细胞成骨分化的调控作用。论文中以阳极氧化铝纳米孔衬底（AAO）为模板,用纳米压印的方法制备了不同纳米柱直径的聚乳酸纳米柱阵列,并将人脂肪间充质干细胞（hADSCs）接种于表面,探究在不含成骨诱导因子的条件下,不同纳米柱直径对hADSCs成骨分化的调控作用,并利用定量聚合酶链反应（q-PCR）和免疫染色等方法对干细胞的成骨分化进行检测。此外,本论文还测试了纳米柱阵列在动物体内诱导成骨分化的效果。因此,本论文为纳米阵列调控干细胞分化在组织再生领域的应用提供了重要的结构参数并证实了结构信号在体内应用的安全性和有效性。3.光驱动表面等离激元纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控:在验证纳米结构对干细胞分化调控的有效性之后,本论文进一步探究了微纳米结构介导的其他物理信号是否对干细胞分化具有增强的调控效果。研究表明,神经的重建对骨组织等的组织修复具有促进作用,然而干细胞的神经定向分化较为困难,因此神经的有效再生对组织重建意义重大。基于以往的研究,电刺激是与神经分化密切相关的重要物理信号。因此,为了对间充质干细胞的神经分化实现更加有效的调控,在结构信号的基础上,该部分研究进一步引入了纳米结构介导的电信号等其他物理信号,探究了远程近红外光照射下表面等离激元纳米结构对hADSCs神经分化的影响,以期对神经分化调控产生增强的作用效果。将hADSCs培养在表面等离激元硫化铜（CuS）纳米结构表面并每天用近红外光（808nm）进行照射,用q-PCR和神经标志物免疫荧光染色检测hADSCs的神经分化。实验结果表明,CuS衬底的纳米结构、等离子体热效应和强局域电场具有协同增强细胞神经相关基因表达的作用效果。因此,该部分研究利用表面等离激元纳米结构,通过施加远程近红外光对干细胞的神经分化进行了调控,证实了结构信号和电信号等物理信号对干细胞神经分化的调控作用。4.超声驱动压电纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控:为发掘更多利用远程电信号对间充质干细胞神经分化进行调控的方式,并进一步提高间充质干细胞的神经分化效率,除了上述借助于近红外光的方式以外,本论文进一步探究了超声驱动压电材料介导的电信号对干细胞神经分化的调控作用。表面等离激元材料大多仅局限于金属和半导体等材料,而压电材料的选择范围则更为广泛,其中包括生物相容性更好的高分子材料。据报道,柔性基质更容易诱导干细胞的神经向分化,因此,该部分研究利用超声驱动的柔性压电纳米纤维素水凝胶介导的电信号等物理信号对hADSCs进行调控,并研究该过程对hADSCs神经分化的影响。在无任何神经分化诱导成分的条件下,培养在纳米纤维素水凝胶上的hADSCs已呈现出神经样的形态。对hADSCs的神经分化在基因和蛋白水平进行检测的结果表明,未经过超声处理的纳米纤维素水凝胶表面的hADSCs有向星形胶质细胞分化的趋势,而经过超声处理的hADSCs同时具有向星形胶质细胞和神经元分化的趋势,这在神经组织修复上将具有重要的应用前景。该部分研究证实,微纳米结构材料介导的结构信号、基质硬度信号、尤其是电信号等物理信号对干细胞的神经分化具有显着的调控作用效果,进一步印证了本论文的主题。综上所述,本论文在纳米微结构复合材料微环境、纳米结构介导的结构信号、外场驱动纳米结构介导的电信号等方面,研究和讨论了材料表面微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控作用,这些研究和探索将进一步促进生物材料介导的物理信号在组织工程领域的应用和发展,为干细胞命运的调控提供新的思路和方法。
曲宏懿[5]（2021）在《血管活性肠肽通过调控RANK/RANKL/OPG促进先天性胫骨假关节形成的机制研究》文中研究指明研究背景先天性胫骨假关节（congenital pseudarthrosis of tibia,CPT）是小儿外科领域相对少见的一种骨骼发育异常性疾病,其以胫骨中下1/3部位反复骨折并且不愈合为特点,而导致这一现象的原因及发病机制尚不清楚。关于先天性胫骨假关节的病因曾有许多学者提出过许多种假说,例如胎儿期宫内损伤、代谢障碍、局部血管畸形等,但都已被否定了。后来有学者发现部分先天性假关节患者合并神经纤维瘤病,并以此来推断其与神经纤维瘤病相关,但并非所有患儿都可见神经纤维瘤病样的牛奶咖啡斑,其假关节病理组织内也未见典型的神经纤维瘤样组织侵犯,而可见嵌入假关节的是异常增生的骨膜组织。因此,又有学者认为先天性胫骨假关节是由于局部骨膜异常增厚形成了缩窄环,并且可以侵袭性生长,导致胫骨局部血运受损、骨质萎缩、骨折,进而促成了假关节的形成。虽有众多病因学假说,但目前仍尚无定论,先天性胫骨假关节的病因仍不明确。我课题组前期研究发现,假关节部位不仅骨膜存在增厚、异常增生等病理改变,骨组织也存在骨代谢异常,血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide,VIP）在假关节部位的破骨细胞中较正常对照组存在异常高表达,而这一现象提示了神经肽类物质很可能参与了先天性胫骨假关节的形成过程。20世纪末,“神经骨学”的概念第一次被提出来,其将人体的骨代谢过程同神经递质的调控联系起来,各国学者越来越重视骨骼生长的神经支配作用,而肽能神经纤维成为了研究的热点。在骨骺、骨髓、骨膜等骨代谢活跃的组织中通常可见肽能神经纤维分布,并且其可通过释放的神经肽类物质参与局部骨组织代谢。而这些神经肽物质不仅对正常骨组织起调节作用,在骨折愈合的过程中也同样发挥着重要的作用,其可以参与组织细胞增殖、分化的调控。降钙素基因相关肽（calcitoningene rel ated peptide,CGRP）、神经肽 Y（neusopeptide Y,NPY）、VIP、P 物质（substance P,SP）等神经肽是目前在骨组织中已经找到的,研究相对较多的神经肽类物质。VIP是由28个氨基酸组成的,最早是由学者从猪肠组织中分离提取出来的,此后相继在中枢和周围神经系统中也发现了分泌VIP的肽能神经纤维,主要由肠神经元释放,而其在骨骼内主要分布于骨髓和骨骺中。VIP具有扩张血管的作用,其可以通过扩张骨膜中的血管增加局部血流量进而参与骨代谢的调节。除此之外,在破骨细胞和成骨细胞表面存在VIP-1,2受体,其与VIP结合后可发挥调节破骨细胞的活性的作用,能够促进破骨细胞的分化和增殖,增强其活性,进而增加骨吸收。基于以上既往研究成果,我们推断,VIP在CPT的破骨细胞中的异常高表达可能促进了局部的骨吸收作用,破坏了骨形成与骨吸收的平衡,导致骨折的反复不愈合,进而形成了假关节。那么,VIP对于破骨细胞的骨吸收的增强作用是如何实现的呢?RANK/RANKL/OPG系统对骨代谢的调控是近些年来的研究热点,其在骨折的愈合和一些骨代谢性疾病中均有着重要的意义。核因子κβ受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κβ,RANK）是 TNF 超家族的一员,在破骨细胞前体细胞（osteoclast precursor cell,OPC）、成熟破骨细胞和软骨细胞都存在其配体,二者结合可发挥生物学作用。RANK和其配体,核因子κβ受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κβ ligand,RANKL）,在OPC细胞膜集合后,激活这些细胞使其分化为成熟的破骨细胞。而骨保护素（osteoprotegerin,OPG）是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）家族成员,其由骨基质细胞和成骨细胞表达,作为RANKL的另一受体,其与RANKL的结合力更强,其可以与RANK竞争结合RANKL,从而起到了阻断了破骨细胞分化和成熟的启动条件。由此可见,RANK/RANKL/OPG系统的动态变化可以影响破骨细胞的分化成熟以及骨吸收活性的表达。我们由此推断,VIP在CPT中可能通过RANK/RANKL/OPG系统来调节破骨细胞活性,于是我们通过体外实验研究进一步探究其机制。研究目的在前期研究发现的基础上,拟通过实验进一步明确以下几点问题:VIP在体外对破骨细胞分化增殖及活性表达的影响如何?VIP作用于骨代谢细胞后RANK/RANKL/OPG系统的表达是否发生变化,其下游的信号通路的表达是如何变化的,这种变化对骨代谢有着怎样的影响?在CPT病变组织中RANK/RANKL/OPG系统表达有何差异?通过实验明确上述问题以明确VIP异常表达在CPT致病机制中的作用。研究方法第一部分,利用大鼠长骨骨髓在诱导剂集落刺激因子（macrophage-stimul ating factor,M-CSF）和RANKL共同作用下,诱导分化出成熟破骨细胞。HE染色后可见多核巨细胞（2个及2个以上细胞核）即为破骨细胞（osteoclast,O C）,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）作为破骨细胞的活性标记物,经TRAP染色后包浆变成成酒红色即为阳性显色,证实其具有骨吸收活性。再经噬骨实验、甲苯胺蓝染色实验及扫描电镜观察,可看到骨磨片上经破骨细胞作用后残留的骨陷窝,进一步证实诱导培养得到的是具有骨吸收活性的成熟破骨细胞。对其加以不同浓度VIP,通过噻唑蓝比色法（T hiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT 法）观察分析 VIP 对破骨细胞增殖的影响,通过噬骨实验骨陷窝数量的变化分析VIP对破骨细胞活性的影响。第二部分,分别对破骨细胞系、成骨细胞系、二者共培养细胞系加以VIP,利用qRT-PCR技术及Western-Blot技术分别检测三种细胞系中RANK/RANKL/OPG系统及其下游信号通路蛋白表达的差异。采用不同浓度的VIP分别作用于三种细胞系,作用时间48h,另外设置VIP（-）作为对照组,采用qRT-PCR定量分析RANK、RANKL和OPG的mRNA表达差异。核因子κβ（nuclear factor kappa-β,NF-κβ）信号通路、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）信号通路在骨代谢中发挥重要作用,其效应因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydraseII,CAII）是参与骨吸收的重要物质。接下来再采用Western-Blot检测三种细胞系中VIP作用后RANK、RANKL和OPG以及NF-κβ信号通路、ERK信号通路的表达变化。第三部分,检测CPT病变组织中RANK/RANKL/OPG系统及其下游信号通路蛋白表达差异。选取5例CPT患儿病变部位骨组织作为实验组,其同侧正常腓骨作为对照组,病理组织蜡块制作切片,通过免疫组化技术观察RANK/RANKL/OPG系统的表达情况,利用Image-Pro Plus 6.0软件采集阳性表达结果数据,计算阳性区域的平均光密度值（mean optical density,MOD）,并进行统计学分析,比较RANK、RANKL、OPG、NF-κβ、ERK表达差异。经过三部分实验,从细胞学实验及病理组织实验分别验证VIP作用下RANK/RANKL/OPG系统及其下游信号通路蛋白表达的变化。研究结果大鼠骨髓可在M-CSF与RANKL诱导下分化出成熟的破骨细胞。根据MTT检测结果分析,同样的VIP处理时间,各浓度组OC的增殖能力无明显变化;同时,在任一 VIP浓度下,随着时间延长（6h-48h）,OC的增殖能力也无明显差异。根据甲苯胺蓝染色和扫描电镜结果分析,同样的VIP处理时间,高浓度VIP（1 0-6mol/L）、VIP（1 0-7mol/L）相比低浓度 VIP（10-8mol/L）、（1 0-9mol/L）组,OC细胞的骨吸收活性受到抑制,形成的陷窝数减少;同样的VIP浓度,随着时间延长（6h-48h）,OC细胞的骨吸收活性也逐渐降低。在破骨细胞系中,RANKL、RANK的mRNA水平和蛋白表达水平均随VIP浓度增加而降低,而OPG表达升高,同时NF-κβ和ERK信号通路也表达减低;在成骨细胞系中,RANKL和IL-6的表达均随VIP浓度增加而升高,而OPG的表达下降;在破骨细胞与成骨细胞共培养体系中,RANKL和RANK表达随VIP浓度增加而升高,OPG呈下降趋势,而NF-κβ、IL-6、ERK和CAII均呈升高趋势。在CPT病变组织中,RANKL、RANK,以及NF-κβ、ERK均较正常骨组织表达增强,而OPG减弱,此表达趋势与体外细胞系实验结果相吻合。研究结论骨髓细胞诱导法可有效诱导分化出成熟的破骨细胞,且具有骨吸收活性,其具有纯度高、数量大的优点。VIP在单纯破骨细胞系中其对破骨细胞的分化增殖能力无影响,对破骨细胞骨吸收活性呈现抑制作用。从噬骨实验中可见,随着VIP浓度增加,骨陷窝数量减少,后续的qRT-PCR及Western-Blot检测发现VIP使得RANKL及RANK表达下降,NF-κβ和ERK信号通路也表达减低,而OPG升高,RANKL/OPG蛋白表达的比率以剂量依赖性的方式降低,破骨细胞的活性受到抑制。在成骨细胞系实验中我们发现,VIP上调RANKL的表达,而降低了 OPG的表达。VIP在破骨细胞与成骨细胞共培养体系中,能增强破骨细胞骨吸收活性。RANKL、RANK及NF-κβ、IL-6、ERK和CAII均在VIP的作用下表达增强,而OPG表达受到抑制。当破骨细胞与成骨细胞共存环境中,成骨细胞对破骨细胞分化成熟发挥了协同作用,而VIP通过增强RANK和RANKL的表达,抑制了 OPG表达,使得RANKL/OPG蛋白表达的比率升高,破骨细胞活性得到激活放大。在CPT病变组织中,VIP表达增强,同时RANK/RANKL/OPG系统及其下游信号通路的变化趋势与VIP作用下的破骨细胞与成骨细胞共培养体系中表达趋势相同。而且上述表达差异经统计学分析均具有显着性差异（P<0.05）。由此可见,VIP对破骨细胞活性的影响,是通过RANK/RANKL/OPG系统来实现的,其通过调控RANK/RANKL/OPG表达进而参与CPT骨代谢病理过程。
夏琰[6]（2021）在《人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究》文中研究表明研究背景随着现代交通及工业的迅速发展,高能量损伤越来越多。在高能量创伤患者中,严重四肢创伤的比例大量增加,且往往合并大段骨缺损,其治疗一直是临床医生面临的巨大挑战。骨组织工程学的出现和迅速发展,为大段骨缺损的修复开辟了新途径。然而目前临床所使用的各类骨移植材料,对于大段骨缺损修复的临床疗效并不令人满意,关键原因在于移植材料的促血管化能力较弱。在体外及动物实验中,人们已经发现利用干细胞联合骨移植材料可以有效提高骨移植材料的成血管能力,但这类治疗方式仍存在着干细胞来源有限、诱导增殖效率低、免疫排斥反应、潜在致瘤性、伦理争议等问题,临床应用受到极大限制。近年来,随着对干细胞促进组织修复研究的不断深入,人们发现干细胞所产生的外泌体可能在其中扮演了重要的角色,并有望为大段骨缺损的治疗带来新的希望。研究目的本次课题研究拟从人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,uMSCs）中分离、提取外泌体(uMSCs-Exosomes,uMSCEXOs),并对其进行鉴定。同时利用微流控技术构建出透明质酸（hyaluronic acid,HA）水凝胶（Hydrogel,Gel）缓释系统,并将外泌体包裹于其中,以期实现对外泌体的有效负载与长效释放。通过动物体内骨折及临界性骨缺损模型,验证uMSCEXOs通过加速血管新生从而促进骨修复的作用;再通过体外细胞实验,进一步验证uMSCEXOs对血管内皮祖细胞成血管分化的影响;最后,通过分子生物学、生物信息学等手段,筛选出uMSCEXOs中的关键性物质,并探索其促进血管新生的内在分子机制,为今后外泌体在大段骨缺损治疗中的应用提供了新的理论依据和研究方向。研究方法1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备（1）利用超速离心法,从uMSCs和人胚胎肾细胞293（HEK293）中分离、提取外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blotting技术对其进行观察及鉴定。（2）利用微流控技术,以HA为原料,合成制备出HA-Gel,并将上述所提取的外泌体包裹于其中,形成外泌体/水凝胶复合体(uMSCEXOs/Gel或HEK293EXOs/Gel)通过模拟体液浸泡及纳米颗粒跟踪分析技术,检测HA-Gel对外泌体的的负载和缓释性能。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验（1）构建大鼠股骨干横断骨折的动物模型,按照分组(uMSCEXOs/Gel组、HEK293EXOs/Gel组、Gel组),将不同成分的的物质注射至骨折端,术后通过X线、Micro-CT及组织学检查,评价各组的骨折修复情况及骨痂内的血管新生情况;（2）构建大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架（nano HA/PCL scaffolds,n HP）。而后根据分组(uMSCEXOs/Gel/n HP组、HEK293EXOs/Gel/n HP组、Gel/n HP组、空白组),将不同成分的的外泌体/水凝胶复合体联合多孔人工骨支架并固化后植入骨缺损区域,术后通过Micro-CT及组织学检查,分析评价各组骨缺损的修复情况及植入区域内的组织成份变化情况;（3）通过上述两部分动物实验,明确uMSCEXOs在本次研究中对骨修复的作用。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验实验分组:uMSCEXOs组、HEK293EXOs组、Gel组、空白组选择内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）作为本次课题研究中体外细胞实验部分的研究对象。通过将uMSCEXOs与EPCs共培养来观察外泌体进入细胞的情况;通过CCK-8实验,检测各组细胞增殖的情况;通过Transwell实验、划痕实验来检测各组细胞迁移的情况;通过成管实验,检测各组中细胞血管形成的情况;最后通过RT-PCR技术,检测经干预后,各组EPCs内成血管相关基因的表达变化情况;最终明确uMSCEXOs对EPCs成血管分化的作用。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索首先采用高通量测序技术,分别对uMSCEXOs和HEK293EXOs中的mi RNAs含量进行测定,并于网上已公布的uMSC的mi RNA含量进行对比,筛选出含量最高的mi RNA,并作为下一步的研究目标;接着构建出不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs,通过透射电镜和Western blotting的方法对其进行鉴定;再将其作用于EPCs,通过体外成管实验,观察对EPCs血管形成能力的影响;通过鸡胚绒毛尿囊膜实验评价经不同mi RNA-21水平的uMSCEXOs干预后对体内血管生成的影响;最后通过RT-PCR、Western blotting技术检测EPCs内相关基因及蛋白的表达变化,推测潜在的分子机制。研究结果1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备本部分实验中,使用超速离心技术,从uMSCs及HEK293细胞中分离并提取了外泌体,透射电镜及纳米颗粒跟踪分析显示uMSCEXOs粒径大小约为60-130mm;另外,纳米颗粒跟踪分析结果还显示本研究所分离、提取的uMSCEXOs的浓度为4.2×105个/ml;Western blotting的结果显示,分离出的外泌体其表面特异蛋白CD81、CD63和CD9均显示为阳性。以上实验结果表明我们成功的对外泌体进行了分离和提取。核磁共振氢谱结果显示甲基丙烯酸酐修饰HA成功。所构建的HA-Gel缓释系统被注射在不同形状的模具中后,经紫外线照射,可被固化、塑形为多种形状。接下来的模拟体液浸泡实验,结果显示,将HA-Gel置于模拟体液中浸泡后,其所负载的外泌体会随着水凝胶的降解缓慢释放出来,当浸泡达到20天时,仍有约40%的uMSCEXOs存留于HA-Gel内。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验我们首先成功建立了大鼠股骨干横断骨折模型,按照实验分组,分别在大鼠骨折端处注射含不同成分的物质,术后所有动物切口愈合良好;术后2-4周的X线显示,uMSCEXOs/Gel组的骨痂宽度明显大于对照组;术后2周对骨折端的Micro-CT扫描显示,uMSCEXOs/Gel组骨折端骨痂的骨密度、新生骨体积均高于对照组,同时血管成像也显示uMSCEXOs/Gel组新生血管数量和体积都明显高于对照组;组织学结果显示,uMSCEXO/Gel组中成血管相关蛋白CD31的表达,同样明显高于对照组。接下来,我们又成功建立了大鼠颅骨双侧临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术成功制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架（nano HA/PCL scaffolds,n HP）。按照实验分组,将不同的复合材料植入骨缺损区域内。术后所有动物切口愈合良好;术后4、8周的Micro-CT结果显示,uMSCEXOs/Gel组的骨修复明显优于其余对照组,定量分析同样显示,uMSCEXOs/Gel组的骨密度、新生骨体积、骨小梁密度及厚度值,均明显高于对照各组;术后8周的组织学结果显示,uMSCEXOs/Gel组中可见大量类骨基质及胶原组织长入了材料内部,而对照组则较少新生组织长入,免疫组化的结果进一步显示,在uMSCEXOs/Gel组中,材料内部组织中的成骨及成血管相关蛋白的表达明显强于对照各组。上述体内实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,骨折及骨缺损的修复效果明显得到了增强。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验本部分实验中,首先将uMSCEXOs与EPCs染色并共培养24小时后,荧光显微镜下可见uMSCEXOs成功进入EPCs内。而后根据实验分组,分别将不同物质EXOs/Gel与EPCs共培养,细胞增殖实验结果显示,相较于对照各组,uMSCEXOs明显促进了EPCs的增殖;Transwell实验和划痕实验的结果显示,uMSCEXOs明显提高了EPCs的迁移能力;成管实验的结果显示,uMSCEXOs/Gel明显提高了EPCs的成管能力;RT-PCR实验结果显示,经uMSCEXOs干预后,EPCs的成血管相关基因（VEGFA、CD31、HIF-1α）的表达相较于对照各组均明显提高,而各对照组之间却未见明显差异。上述体外细胞实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,EPCs的增殖、迁移及成血管化能力得到了显着增强。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索在本部分实验中,高通量测序的结果显示,uMSCEXOs、HEK293EXOs及uMSCs所包含的mi RNAs特异性显着,仅有mi RNA-21的在uMSCEXOs及uMSCs中都是表达最高的。结合文献报道,我们推测,mi RNA-21很可能是uMSCEXOs产生明显促成血管作用的关键性物质。我们构建了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs并对其进行了鉴定。接下来,我们通过体外成管实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验、RT-PCR及Western blotting检测,验证了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs对EPCs的作用。实验结果显示,当uMSCEXOs中mi RNA-21表达受到抑制时,EPCs的成管能力（成管实验中的新生血管长度及数量、鸡胚绒毛尿囊膜内的新生血管长度及数量）及相关成血管基因、蛋白（VEGFA、HIF-1α）的表达都明显降低,而NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路中NOTCH1及DLL4的表达却明显升高。上述实验结果表明,mi RNA-21在uMSCEXOs促EPCs成血管分化的过程中扮演了关键角色,且可能是通过抑制NOTCH1/DLL4/信号通路并促进VEGFA和HIF-1α的表达发挥作用。研究结论1.通过超速离心技术分离并提取了uMSCs中的外泌体,并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting技术对其进行了鉴定,验证了uMSCEXOs的正确性,表明超速离心技术是一种安全、可靠、高效的外泌体提取方法;2.通过微流控技术所制备的HA-Gel缓释系统,在模拟体液中浸泡20天后,仍有约40%的外泌体存留于该水凝胶缓释系统内。表明该HA-Gel缓释系统可以实现对外泌体的有效负载与长效释放;3.我们成功建立了大鼠股骨干骨折模型及大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并将不同成分的外泌体/水凝胶复合物注射或联合支架移植于骨修复处,术后通过影像学及组织学手段,对比各组的骨修复效果、血管新生情况及手术区域组织内的成分变化,结果显示,在2组动物模型中,含有uMSCEXO组的骨修复效果及血管新生情况均明显优于其余各组,同时含有uMSCEXO的组手术区域内的成血管相关蛋白的表达亦明显高于其余各组。表明uMSCEXO在动物体内,有效的促进了骨折及临界性骨缺损的修复并增强了血管新生的效果。4.通过体外细胞实验（细胞增殖、细胞迁移、小管形成等）,验证了uMSCEXOs能有效地促进内皮祖细胞的增殖、迁移与成血管分化。5.通过高通量测序技术,我们筛选确认mi RNA-21是uMSCEXOs中含量最高的微小非编码核糖核酸。同时,进一步验证了mi RNA-21在uMSCEXOs促进内皮祖细胞有效成血管分化中所起的重要作用,且推测可能是通过调节NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路发挥了作用。
彭敏[7]（2021）在《载银高透氧化锆种植基台材料的制备及其性能和机理研究》文中指出研究目的:高透氧化锆具有优良的机械性能、生物相容性及良好的半透光性成为前牙美学种植基台的理想材料,但并不具有抗菌能力。在口腔环境中,基台材料表面易受微生物粘附形成生物膜,进而引发感染或种植体周围炎,甚至导致种植失败。本研究旨在通过对高透氧化锆表面进行改性,利用铝硅酸盐多孔结构的承载能力及银纳米粒子的广谱抗菌作用和良好的抗炎能力,构建具有良好抗菌、抗炎和生物相容性的载银高透氧化锆种植基台材料,促进种植体-软组织结合界面生物封闭形成,防止种植体周围细菌感染和炎症发生,提髙种植成功率和延长种植体使用时间。首先在高透氧化锆表面分别构建光滑和多孔载银涂层,比较两种材料的抗菌性能,进一步对抗菌性能较好的载银材料的生物相容性和抗炎能力及机制进行研究,并探讨氧化锆表面改性对其半透性能的影响,为种植美学基台材料选择提供理论和数据支持。研究方法:（1）采用铝硅酸盐真空及非真空烧结的方法,分别在高透氧化锆表面构建光滑和多孔涂层形貌,然后浸渍于不同浓度的硝酸银溶液并二次烧结,将硝酸银溶液中的银离子在铝硅酸盐涂层原位还原。利用扫描电镜（SEM）、X射线能量色散谱仪（EDS）和X射线光电子能谱（XPS）对制备的载银高透氧化锆材料表面涂层的微观形貌特征及结构进行表征分析。（2）利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP-AES）比较光滑和多孔载银高透氧化锆材料表面涂层的银离子释放能力;并通过抑菌圈、平板活菌计数、活/死菌荧光染色及SEM等技术观察不同改性涂层对大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）的体外抑菌能力。（3）分别将成骨细胞（MC3T3-E1）和牙龈成纤维细胞（HGFs）与载银高透氧化锆材料共培养后,利用CCK-8、细胞粘附、ALP染色、RT-q PCR和Western blot技术检测改性涂层对细胞增殖、粘附和成骨分化的影响及细胞毒性;并将人单核巨噬细胞（TPH-1）与载银高透氧化锆材料共培养,分别在加入和不加脂多糖（LPS）情况下,用RT-q PCR实验检测各组细胞中炎症因子IL-4、IL-10、TGF-β、IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA表达,用Western blot检测各组细胞中TLR4/NF-κB通路关键蛋白表达,以分析改性涂层的抗炎作用及作用机制。（4）以超透和传统氧化锆材料作为对照,对三种氧化锆材料表面制备改性涂层并比较不同氧化锆材料改性前后的半透明度及抗弯强度等性能变化,通过FE-SEM、EDS对三种材料性能差异的原因进行微观结构分析。研究结果:（1）FE-SEM、EDS、XPS结果显示硝酸银溶液的浸渍浓度影响铝硅酸盐辅助沉积银粒子涂层的制备,高浓度硝酸银环境（5 mol/l）相对于低浓度（1mol/l）更利于银纳米粒子的沉积,获得的银纳米颗粒数量更多、尺寸更小,但其分布并不均匀。铝硅酸盐非真空烧结后在高透氧化锆表面能形成开放型微纳米多孔结构,与光滑铝硅酸盐涂层相比,多孔铝硅酸盐涂层获得数目更多、尺寸更小,形状更均匀的纳米银粒子,且能在涂层深部沉积。（2）ICP-AES结果显示光滑载银涂层与多孔载银涂层初期银离子释放均较明显,往后逐渐趋于平缓,且多孔载银涂层释放的银离子浓度高于光滑载银涂层的银离子释放浓度。光滑和多孔载银涂层对E.coli、S.aureus和L.acidophilus均有抗菌效果,且多孔载银涂层抗菌性能更显着。（3）生物相容性实验表明,表面多孔结构的载银高透氧化锆能促进MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性提高,并上调成骨分化基因Coll A1、BSP、OC和OPN的表达,也能促进HGFs增殖和粘附,表面载银对涂层的生物相容性无显着影响;载银涂层中的纳米银粒子能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活,从而分别抑制和促进促炎因子和抗炎因子释放,发挥抗炎作用。（4）三种氧化锆材料改性前后的性能比较显示,经载银涂层改性后三种氧化锆的半透明度和强度不同程度下降,载银高透氧化锆与载银传统氧化锆材料的抗折裂强度与半透明度无差异,能满足临床需要。研究结论:本研究通过铝硅酸盐烧结和硝酸银溶液浸渍法,在高透氧化锆种植基台材料表面成功构建银粒子涂层,发现非真空烧结多孔涂层能够获得数目更多、尺寸更小的纳米银粒子;表面多孔的高透氧化锆载银涂层具有更好的抗菌性能,也具有良好的生物相容性,有利于种植体周围软组织界面封闭形成,并能通过调控TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用,且改性材料半透明度和强度性能良好。提示载银高透氧化锆种植基台材料不仅能够提高种植基台的成功率,也具有良好的美学性能。
纪琦[8]（2021）在《TC4多孔支架对小鼠成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞毒性研究》文中认为目的:研究利用选择性激光熔化（Selective laser melting,SLM）技术制备的不同孔径多孔TC4（Ti-6Al-4V）支架对小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞毒性研究。方法:1.体外培养小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞原代细胞,选择分化良好的第3代细胞,采用免疫细胞荧光（Immunofluorescence,IFC）染色进行细胞表型鉴定。2.TC4金属支架的制备,并进行三维结构及表面形貌的分析:1)利用SLM制备孔径分别为0.6mm（φ0.6）、0.8mm（φ0.8）、1.0mm（φ1.0）方形多孔正方体支架;2)利用微计算机断层扫描技术（Micro Computed-Tomography,Micro-CT）量化分析TC4支架材料三维结构参数,包括孔径、孔隙率、体表面积等;3)扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察三组不同孔径支架表面形貌。3.TC4多孔支架体外细胞活性实验分别将第3代小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞接种于不同孔径TC4支架表面:1)利用扫描电镜观察支架接种细胞48h后附着细胞的形态以及黏附情况2)利用活/死细胞染色试剂盒染色,激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）观察支架接种细胞48h后支架上细胞粘附情况;3)利用采用CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞与支架共培养1天、3天、5天和7天OD值,分析不同孔径TC4支架对细胞毒性作用;4)利用荧光实时定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR）检测与支架共培养7天,两种纤维细胞中III型胶原α1（Type III Collagenα1,Co LIIIa1）、纤维黏连蛋白（Fibronection,FN）m RNA的相对表达;5)利用电感耦合等离子体质谱仪（Inductively Coupled Plasma Massspectrometry,ICPMS）和电感耦合等离子体发射光谱仪（Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry,ICP-OES）检测两组细胞与支架共培养1、3、5、7天的完全培养基中钛（Ti）、铝（Al）、钒（V）金属元素的离子析出含量。结果:1.IFC结果显示:提取的原代细胞经IFC染色后,DAPI复染核对视野中总细胞计数,经计算Vimentin、FPS1阳性表达细胞率接近100%,说明本实验提取的成纤维细胞纯度好。2.TC4支架三维结构、表面形貌的分析结果:1)Micro-CT结果显示:经数据分析,支架孔径分析结果与理论设计参数相符,三组支架比表面积φ0.8>φ1.0>φ0.6支架;φ0.6、φ0.8、φ1.0支架孔隙率分别73.67%、84.47%、87.29%;2)SEM结果显示:镜下可见三组支架孔径分布均匀;支架表面均可见大量球形粉末凝固组织,粉末球形度高,且粒径均匀,未见明显的针状凝固组织,满足多孔支架对表面形貌的要求。3.TC4支架体外细胞实验1)SEM结果显示:三组支架具有细胞粘附,其中以φ0.6细胞粘附状态好,细胞形态更为延伸,并有伪足伸出,说明较小的孔径更有利于细胞的粘附;且细胞更倾向于在支架的微小孔和沟壑之间桥接的表现出细胞迁移行为;2)CLSM显示细胞附着结果:三组支架上均有细胞粘附,且φ0.6细胞密度最大,显示出较为明显的细胞粘附能力,φ0.8支架次之,说明在本实验分组内随着孔径的减小,多孔支架显示出更优越的细胞粘附能力;3)CCK-8法检测结果显示:三组支架均有促进细胞增殖的作用;第1、3天三组相比,φ0.6支架OD值显着性的增高,但5天、7天时,φ0.6的OD值增长不明显,相比之下φ0.8的OD值增长表现出极显着性差异（P<0.01）;说明在本实验分组内,小孔径支架在细胞定值早期显示出较为优越的细胞粘附能力,但随着时间推移,φ0.6OD值增长减慢,而比表面最大的φ0.8,在第五天后,细胞的增殖仍较为明显;4)q RT-PCR结果显示:孔径的不同可以影响小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞Co LIIIa1、FN m RNA的相对表达。在本实验支架分组内,两种细胞结果均为φ0.6支架显示出了最高的m RNA表达水平（P<0.01）;5)ICP-MS、ICP-OES结果显示:1、3、5、7天内Ti、Al、V离子析出量无明显变化,均低于仪器检测最低值。说明本实验中设计多孔TC4支架,1周时间内,随着孔径的不同,表面积变化,并没有表现出明显的金属离子溶解及释放的变化。结论:1)本实验采用SLM工艺制备的不同孔径TC4多孔支架对小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞具无细胞毒性,其中孔径为0.8mm的TC4多孔支架材料有利于细胞增殖。孔径为0.6mm的TC4多孔支架材料有利于细胞粘附、聚集,促进Co LIIIa1、FN m RNA的相对表达。2)在1周的时间内,随着孔径的不同,表面积变化,并没有表现出明显的金属离子溶解及释放的变化。
刘仪[9]（2020）在《硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究》文中进行了进一步梳理硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是高硫酸化结构的线型阴离子多糖,可以通过共价连接于核心蛋白上,组成位于细胞膜表面和细胞基底膜的HS蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）。尽管已有研究表明HSPGs可以与骨折愈合相关的生长因子结合,直接介入生长因子信号转导和骨细胞功能的调节,但目前HS成骨作用的构效关系和机制尚未明确,且HS应用于3D打印的多孔复合支架的研究亦未见报道。为此,本论文通过分离纯化制备了HS,进一步选择性去硫酸化制备了系列衍生物,通过体外实验对其成骨活性、构效关系及相关通路进行了研究,并通过3D打印技术制备新型支架材料用于骨缺损修复的治疗。主要结果如下:（1）通过离子交换色谱技术,从粗品肝素钠中分离和纯化了硫酸乙酰肝素。经过验证其分子量为16.52 k Da,分散度为1.56。采用电导滴定计算HS硫酸根与羧酸根摩尔比为1.35。其次,通过化学修饰法对原料粗品肝素钠进行选择性去硫酸修饰,得到三种选择性去硫酸化肝素,即2-O-DS、6-O-DS和N-DS,分子量分别为87.68 k Da、33.93k Da和9.61 k Da。1H-NMR图谱与标准品一致。（2）成骨增殖方面,HS/DS均具有一定的抑制成骨细胞增殖的作用,并且6-O-DS与N-DS对成骨细胞增殖能力的抑制作用稍强于2-O-DS与HS。HS/DS干预72小时后,成骨细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性与对照组相比有明显的升高,其中HS组较其余去硫酸肝素组ALP的活性更高。ALP活性的升高表明HS/DS在促成骨分化方面有的积极作用,其中HS能够更为明显的促进成骨细胞的分化,作用的适宜浓度为50μg/m L。（3）采用计算机模拟对接的方法和表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）技术进行了虚拟和现实结合力的分析,表明HS可以与雌激素受体β（estrogen receptor-β,ER-β）紧密结合。随后,构建短干扰RNA（short interfering RNAs,si RNAs）下调MC3T3-E1成骨细胞的ER-β蛋白表达水平,并对转染和未转染的成骨细胞进行特定浓度的HS处理。结果表明,ER-β是调控RANKL表达的关键生物标志物,对破骨细胞的生成有一定作用。HS可作为ER-β介导的破骨细胞生成抑制的功能成分,通过影响RANKL/RANK/OPG通路,在调节骨量中起着生理作用,且这种作用很可能通过HS与ER-β的直接结合产生。（4）采用3D打印技术制备的聚己内酯-羟基磷灰石（Polycaprolactone-Hydroxylapatite,PCL-HA）支架具有良好的孔隙率和较高的生物相容性,保证了支架骨界面的稳定生物愈合。此外,所制备的支架具有较高的抗压强度和良好的延展性,能够满足不同骨缺损修复要求。在体外研究中,低浓度HS的PCL-HA支架在促进成骨细胞成熟和促进骨缺损修复方面效果最好;高浓度HS的PCL-HA支架对体外成骨细胞增殖有抑制作用,但在动物体内这种作用不明显。动物实验结果表明,各组支架均未显示出明显的生物毒性,且可以与骨组织形成紧密的生物结合。PCL-HA支架较空白组有一定的促进骨缺损修复作用,负载了两种不同浓度HS的支架促进骨缺损修复的作用均明显高于单纯PCL-HA支架,但两种浓度HS支架间的差异不显着。
闫欢欢[10]（2020）在《贻贝仿生导电性苯胺齐聚物生物材料的制备及在组织工程中的应用》文中研究指明随着生物医用高分子材料的发展,导电高分子以其独特的物理和化学性质在生物医学领域被广泛研究和应用探索。导电高分子,如聚苯胺、聚噻吩等在提供导电性的同时,本身表现出良好的氧化还原活性即电活性,能够诱导细胞生长和分化。但这些导电聚合物用于组织工程时,不可降解性、不可吸收性和加工性差等成为限制它们应用的主要因素,因此多种类型的可降解导电性和电活性高分子被设计和合成。苯胺齐聚物（如苯胺三聚体、四聚体等低聚体）具有规整的分子结构、可逆的氧化还原性和较好的生物相容性,且可在生理环境中通过肾脏清除并排出体外。因此,开发基于苯胺齐聚物的可降解功能支架材料用于组织工程修复具有重要的意义。外加电刺激被报道可以有效的调控细胞行为和促进组织再生,而包含苯胺齐聚物的导电生物材料可以实现局部定位电刺激,提高电刺激效率,从而更好的调控细胞粘附、迁移、增殖和分化。然而,简单有效地合成出生物相容、成型方便的导电性和电活性聚合物依然是组织工程中的难点和挑战,有待进一步设计和挖掘。因此,我们设计并合成了一系列新颖的导电性和电活性聚合物,进一步通过静电纺丝和静电滴球技术等分别制备了图案化导电性纳米纤维毡和电活性微球等不同应用形式的材料,然后通过体内和体外实验,系统地评价了它们潜在的生物医用前景,全文主要包括以下四部分的内容。（1）我们以苯胺四聚体、多巴胺和聚乙二醇为原料,通过自由基加成反应合成了具有粘附性的导电无规共聚物poly（ATMA-co-DOPAMA-co-PEGMA）（PAT）。该材料不仅保持一定的导电性和电活性,还具有良好的亲水性和血液相容性,结合电刺激具有协同提高MC3T3-E1细胞增殖、碱性磷酸酶活性、细胞外基质钙沉积和成骨基因表达的特性。贻贝来源多巴胺分子的引入赋予材料良好的粘附性和生物相容性,使其应用形式更灵活、更广泛。（2）在高碘酸钠作用下,将上述电活性共聚物（PAT）通过其多巴胺段的氧化还原反应修饰于可降解PLGA/HA微球上,制备出电活性微球（PAT@HA/PLGA）。进一步地将含YKYKY的胰岛素样生长因子（IGF-1）在酪氨酸酶作用下转变为DOPA-IGF-1并固定于微球表面,制备出具有电活性和生物活性的可降解微球。体外细胞培养表明,所制备的微球具有良好的生物相容性,显着提高成骨细胞增殖效率和分化的特性。将不同功能性微球注射到5 mm尺寸的大鼠颅骨临界缺损处,植入8周后的修复结果表明,电活性和生物活性微球可显着促进缺损处新骨的生成和骨愈合效果。（3）将PAT共聚物和聚己内酯（PCL）复合,通过静电纺丝方法制备出生物降解的图案化导电性纳米纤维毡,利用PAT内的DOPA分子将神经生长因子（NGF）修饰于纤维表面,进而应用于神经组织工程。获得的导电纤维毡具有连续交替的谷和脊图案化结构。在电刺激下,具有特定形貌的的导电性纤维毡固定有NGF后,对神经干细胞（NSCs）的增殖和分化具有正向协同作用,促进NSCs向神经元方向分化,并抑制向星形胶质细胞方向的分化,表明有利于神经的再生与修复。（4）将苯胺三聚体和PCL通过逐步加成反应合成了导电聚合物（PCL-IPDI-AT）,以高温溶剂蒸发法制备了形状记忆性的导电弹性体薄膜,并初步探索了其体外生物相容性和应用性。该共聚物薄膜具有尺寸均一的多孔结构、优异的可拉伸性和形状记忆性。这种具有导电性、一定粗糙度和多孔结构的导电弹性体材料在电刺激下促进了成骨细胞的生长和成骨分化。综上所述,我们制备的多种应用形式的导电性和电活性功能支架材料不仅加快细胞间电信号的传导,而且在外加电刺激的作用下可调控植入材料表面的细胞行为,进而有效的促进了细胞的功能性分化以及体内缺损组织的修复和再生。
二、丹参对成纤维细胞成骨的扫描电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丹参对成纤维细胞成骨的扫描电镜观察（论文提纲范文）
（1）3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的制备及成骨作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨的结构、组成与功能 |
| 1.2 聚芳醚酮生物材料 |
| 1.2.1 聚芳醚酮简介 |
| 1.2.2 聚芳醚酮性能 |
| 1.3 聚芳醚酮改性方法 |
| 1.3.1 添加生物活性成分 |
| 1.3.2 表面形貌改性 |
| 1.4 聚芳醚酮在口腔医学中的应用 |
| 1.5 无定形聚芳醚酮 |
| 1.5.1 无定形聚芳醚酮的特点 |
| 1.5.2 无定形聚芳醚酮的化学改性 |
| 1.5.3 无定形聚芳醚酮用于3D打印的优势 |
| 1.6 3D打印及聚芳醚酮3D打印的研究进展 |
| 1.6.1 3D打印技术 |
| 1.6.2 聚芳醚酮3D打印的研究进展 |
| 1.7 本课题的提出及主要研究内容 |
| 第2章 3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的制备与表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PEK-CN的制备与流变性能 |
| 2.3.2 PEK-CN粒料与丝材的制备 |
| 2.3.3 溶液法共混nHA/PEK-CN的制备与表征 |
| 2.3.4 3D打印nHA/PEK-CN的制备与表征 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PEK-CN的流变性能 |
| 2.4.2 nHA/PEK-CN的断层形貌 |
| 2.4.3 nHA/PEK-CN的造粒结果 |
| 2.4.4 nHA/PEK-CN的力学性能 |
| 2.4.5 3D打印nHA/PEK-CN的表面形貌和力学性能 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的生物相容性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养与接种 |
| 3.3.2 材料消毒与浸提液制备 |
| 3.3.3 细胞毒性实验 |
| 3.3.4 炎症相关基因检测 |
| 3.3.5 溶血实验 |
| 3.3.6 蛋白吸附实验 |
| 3.3.7 模拟体液实验 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 细胞毒性实验 |
| 3.4.2 炎症相关基因表达 |
| 3.4.3 溶血实验 |
| 3.4.4 蛋白吸附实验 |
| 3.4.5 模拟体液实验 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的体外成骨分化研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 兔BMSCs细胞分离、培养与鉴定 |
| 4.3.2 细胞凋亡实验 |
| 4.3.3 细胞粘附及伸展观察 |
| 4.3.4 细胞增殖实验 |
| 4.3.5 碱性磷酸酶分析 |
| 4.3.6 细胞矿化分析 |
| 4.3.7 成骨相关基因表达分析 |
| 4.3.8 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 BMSCs鉴定 |
| 4.4.2 细胞凋亡实验 |
| 4.4.3 细胞粘附及伸展观察 |
| 4.4.4 细胞增殖实验 |
| 4.4.5 碱性磷酸酶分析 |
| 4.4.6 细胞矿化分析 |
| 4.4.7 成骨相关基因表达分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的体内骨整合研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 材料准备与实验分组 |
| 5.3.2 骨缺损模型建立 |
| 5.3.3 Micro-CT检测 |
| 5.3.4 组织学分析 |
| 5.3.5 生物力学推出试验 |
| 5.3.6 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 动物术后观察 |
| 5.4.2 大体样本观察 |
| 5.4.3 影像学分析 |
| 5.4.4 组织学分析 |
| 5.4.5 生物力学推出试验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 全文结论与创新性 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（3）Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 2型糖尿病对大鼠种植体骨结合、成骨细胞生物学功能及PKG2表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 过表达PKG2对体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 应用Cinaciguat对2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍及种植体骨结合不良的改善作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 Cinaciguat逆转2型糖尿病环境对成骨细胞损害作用的蛋白组学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分 Cinaciguat通过PKG2改善2型糖尿病所致成骨细胞功能障碍的具体机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 组织工程概述 |
| 1.1.1 组织工程的发展 |
| 1.1.2 组织工程三要素 |
| 1.2 干细胞扩增 |
| 1.2.1 干细胞的自我更新 |
| 1.2.2 干细胞的三维扩增 |
| 1.3 干细胞分化 |
| 1.3.1 可溶性生长因子对干细胞分化的调控 |
| 1.3.2 微纳米结构对干细胞分化的调控 |
| 1.3.3 物理信号对干细胞分化的调控 |
| 1.4 研究目的和内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 纳米微结构复合材料对干细胞扩增和表型维持性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 材料制备 |
| 2.2.3 材料测试与表征 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞贴壁与增殖检测 |
| 2.2.6 细胞表型维持性检测 |
| 2.2.7 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 壳聚糖/氧化石墨烯复合微球的表征 |
| 2.3.2 HUMSCs在壳聚糖/氧化石墨烯复合微球上的培养 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 有序纳米阵列介导的结构信号对干细胞成骨分化的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 材料制备 |
| 3.2.3 材料表征 |
| 3.2.4 细胞培养 |
| 3.2.5 细胞贴壁与增殖检测 |
| 3.2.6 细胞成骨分化检测 |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 聚乳酸纳米柱阵列的表征 |
| 3.3.2 hADSCs在聚乳酸纳米柱阵列表面的铺展、活性和增殖 |
| 3.3.3 不同纳米柱直径对hADSCs成骨分化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 光驱动表面等离激元纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 CuS纳米结构的制备 |
| 4.2.3 CuS纳米结构的表征 |
| 4.2.4 细胞培养 |
| 4.2.5 hADSCs在CuS纳米结构表面的活性和铺展 |
| 4.2.6 hADSCs在CuS纳米结构表面的神经分化 |
| 4.2.7 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 CuS纳米结构的结构和成分表征 |
| 4.3.2 hADSCs在CuS纳米结构衬底上的细胞活性 |
| 4.3.3 hADSCs在CuS纳米结构衬底上的粘附和铺展 |
| 4.3.4 hADSCs在CuS纳米结构上神经分化的q-PCR检测 |
| 4.3.5 hADSCs在CuS纳米结构上神经分化的免疫荧光染色 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 超声驱动压电纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 材料制备 |
| 5.2.3 材料表征 |
| 5.2.4 细胞培养 |
| 5.2.5 hADSCs在纳米纤维素水凝胶表面的活性、增殖和铺展 |
| 5.2.6 hADSCs在纳米纤维素水凝胶表面的神经分化 |
| 5.2.7 纳米纤维素水凝胶多层神经导管的构建 |
| 5.2.8 数据统计 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 纳米纤维素水凝胶的表征 |
| 5.3.2 hADSCs在纳米纤维素水凝胶上的粘附和铺展 |
| 5.3.3 hADSCs在纳米纤维素水凝胶上的活性和增殖 |
| 5.3.4 hADSCs在纳米纤维素水凝胶上的神经分化 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 未来需解决的问题 |
| 攻读博士期间取得的科研成果及参与的科研项目 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）血管活性肠肽通过调控RANK/RANKL/OPG促进先天性胫骨假关节形成的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 先天性胫骨假关节的病因病理学研究进展 |
| 第二节 血管活性肠肽参与骨代谢调节的研究进展 |
| 第三节 RANK/RANKL/OPG在骨代谢中的作用 |
| 第四节 本课题研究的目的意义和主要内容 |
| 第二章 血管活性肠肽对体外培养破骨细胞活性的影响 |
| 第一节 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 2.2.1 大鼠原代骨髓细胞经诱导分化出破骨细胞 |
| 2.2.2 血管活性肠肽对体外培养破骨细胞增殖能力无影响 |
| 2.2.3 血管活性肠肽抑制体外培养的破骨细胞骨吸收活性 |
| 第三节 实验讨论 |
| 第三章 血管活性肠肽在体外对RANK/RANKL/OPG表达的调控 |
| 第一节 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 3.2.1 RANK、RANKL和OPG的qRT-PCR检测结果及蛋白表达水平Western Blot结果 |
| 3.2.2 RANK/RANKL/OPG下游信号通路因子的qRT-PCR检测结果及蛋白表达水平Western Blot结果 |
| 第三节 实验讨论 |
| 第四章 血管活性肠肽对先天性胫骨假关节病变组织中RANK/RANKL/OPG的调控 |
| 第一节 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 4.2.1 先天性胫骨假关节病变组织中,RANK/RANKL/OPG及NF-κβ和ERK信号通路的表达 |
| 4.2.2 在CPT病变组织中，Ⅱ型、Ⅲ型患者之间RANK、RANKL、OPG、NF-κβ及ERK表达无显着差异 |
| 第三节 实验讨论 |
| 结论 |
| 附录、附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（6）人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 课题设计 |
| 第一部分 外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第二部分 ~(uMSC)EXOs促进骨修复的动物体内实验 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第三部分 ~(uMSC)EXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第四部分 ~(uMSC)EXOs促进血管新生的机制探索 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论及意义 |
| 综述一:干细胞衍生外泌体:一种促进骨折愈合的有效策略 |
| 综述二:基于水凝胶的支架在组织工程应用中的生物相容性 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）载银高透氧化锆种植基台材料的制备及其性能和机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 种植修复结构 |
| 1.2 种植修复评价 |
| 1.3 氧化锆基台材料简介 |
| 1.4 氧化锆基台抗菌性研究进展 |
| 1.5 研究背景与研究内容 |
| 1.6 本文的主要贡献与创新 |
| 第二章 载银高透氧化锆基台材料的制备及表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与设备 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 载银高透氧化锆基台材料的体外抗菌性能评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 银离子释放检测 |
| 3.2.2.2 菌种的活化和菌悬液制备 |
| 3.2.2.3 抗菌性能实验 |
| 3.2.2.4 样品表面荧光染色实验 |
| 3.2.2.5 扫描电镜观察细菌形态 |
| 3.2.2.6 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 银释放检测 |
| 3.3.2 体外抗菌性能评价 |
| 3.3.2.1 不同样品与细菌共培养的涂板结果 |
| 3.3.2.2 不同样品与细菌共培养后的平板活菌计数结果 |
| 3.3.2.3 活/死细菌荧光染色结果 |
| 3.3.2.4 扫描电镜观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 载银高透氧化锆基台材料的生物相容性和抗炎性评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与设备 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2.2 细胞增殖实验 |
| 4.2.2.3 细胞粘附实验 |
| 4.2.2.4 成骨细胞内ALP活性检测 |
| 4.2.2.5 成骨细胞中LDH含量检测 |
| 4.2.2.6 荧光定量RT-q PCR实验 |
| 4.2.2.7 Western blot实验 |
| 4.2.2.8 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 生物相容性评价 |
| 4.3.1.1 材料对成骨细胞乳酸脱氢酶LDH释放的影响 |
| 4.3.1.2 材料对成骨细胞增殖的影响 |
| 4.3.1.3 材料对成骨细胞中碱性磷酸酶ALP活性的影响 |
| 4.3.1.4 材料对成骨细胞中成骨相关基因表达的影响 |
| 4.3.1.5 材料对牙龈成纤维细胞增殖的影响 |
| 4.3.1.6 材料对牙龈成纤维细胞粘附作用的影响 |
| 4.3.2 抗炎性评价 |
| 4.3.2.1 材料对 LPS诱导的单核巨噬细胞炎性因子的影响 |
| 4.3.2.2 材料对 LPS 诱导的单核巨噬细胞 TLR4/NF-κB 通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 材料的生物相容性 |
| 4.4.2 材料对巨噬细胞炎性反应的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 载银氧化锆基台材料的半透明性能比较 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与设备 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 样件制备 |
| 5.2.2.2 性能测试 |
| 5.2.2.3 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 性能分析 |
| 5.3.2 裂纹分析 |
| 5.3.3 SEM分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 综述抗种植体周围炎的生物材料和抗生素应用研究 |
| 6.1 种植体周围疾病 |
| 6.2 临床和实验室策略 |
| 6.3 局限和前景 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）TC4多孔支架对小鼠成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞毒性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5.下一步的研究方向 |
| 参考文献 |
| 综述 3D打印金属基生物材料的应用及发展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 病例 |
（9）硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstact |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HS的结构特点与生物合成方式 |
| 1.1.1 HS的结构特点 |
| 1.1.2 HS的生物合成方式 |
| 1.2 HS的生理功能 |
| 1.2.1 胞外基质HS的生理功能 |
| 1.2.2 细胞膜表面HS的生理功能 |
| 1.2.3 细胞内HS的生理功能 |
| 1.3 HS对骨代谢的作用 |
| 1.3.1 HS对成骨细胞系的作用 |
| 1.3.2 HS对破骨细胞系的作用 |
| 1.3.3 HS在成骨支架中的应用 |
| 1.4 HS在成骨信号通路方面的干预 |
| 1.4.1 TGF-β信号通路 |
| 1.4.2 FGF信号通路 |
| 1.4.3 Wnt信号通路 |
| 1.4.4 OPG/RANKL/RANK信号通路 |
| 1.4.5 HH信号通路 |
| 1.4.6 BMP信号通路 |
| 1.5 HS与疾病 |
| 1.5.1 肿瘤性疾病 |
| 1.5.2 炎症和感染性疾病 |
| 1.5.3 自身免疫性疾病 |
| 1.5.4 淀粉样蛋白病 |
| 1.5.5 骨科相关疾病 |
| 1.6 骨缺损相关研究进展 |
| 1.7 本论文的研究思路与内容 |
| 1.7.1 立项背景与研究思路 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 硫酸乙酰肝素/选择性去硫酸肝素的制备及其对成骨细胞作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 硫酸乙酰肝素的制备 |
| 2.3.2 硫酸乙酰肝素的表征 |
| 2.3.3 去硫酸肝素的制备 |
| 2.3.4 去硫酸肝素的表征 |
| 2.3.5 成骨细胞分离培养及鉴定 |
| 2.3.6 成骨细胞的复苏及传代 |
| 2.3.7 成骨细胞增殖实验 |
| 2.3.8 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 硫酸乙酰肝素分子量的测定 |
| 2.4.2 硫酸乙酰肝素硫酸根与羧酸根摩尔比 |
| 2.4.3 去硫酸肝素分子量的测定 |
| 2.4.4 去硫酸肝素核磁共振分析 |
| 2.4.5 原代成骨细胞的形态学分析及化学染色鉴定 |
| 2.4.6 成骨细胞复苏后形态观察 |
| 2.4.7 硫酸乙酰肝素/去硫酸肝素对成骨细胞增殖情况影响比较 |
| 2.4.8 硫酸乙酰肝素/去硫酸肝素对成骨细胞碱性磷酸酶活性影响比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞活性影响的比较研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 成骨细胞增殖实验 |
| 3.3.2 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测实验 |
| 3.3.3 茜素红染色法检测矿化能力 |
| 3.3.4 成骨细胞相关功能蛋白表达 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞分化的影响 |
| 3.4.3 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨细胞矿化能力的影响 |
| 3.4.4 不同浓度硫酸乙酰肝素对成骨相关功能蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 硫酸乙酰肝素通过结合小鼠成骨细胞雌激素受体β选择性调控OPG/RANK/RANKL通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HS与ER-β计算机模拟对接 |
| 4.3.2 SPR实验分析结合亲和力 |
| 4.3.3 成骨细胞分离和培养 |
| 4.3.4 siRNA转染 |
| 4.3.5 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 4.3.6 Western Blot检测相关蛋白 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 HS和ER-β的模拟对接分析 |
| 4.4.2 结合亲和力的SPR实验分析 |
| 4.4.3 siRNAs转染MC3T3-E1细胞ERβ的表达 |
| 4.4.4 HS对OPG和RANKL表达的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 3D打印HA-PCL支架负载HS修复兔股骨缺损研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 PCL-HA材料的制备及性能检测 |
| 5.3.2 PCL-HA材料体外生物相容性的测定 |
| 5.3.3 兔股骨髁缺损修复实验 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 3D打印PCL-HA支架结构及其物理特性分析 |
| 5.4.2 体外细胞实验分析 |
| 5.4.3 动物实验分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）贻贝仿生导电性苯胺齐聚物生物材料的制备及在组织工程中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 导电高分子材料 |
| 1.2.1 导电高分子概述 |
| 1.2.2 导电高分子的合成、结构和掺杂 |
| 1.2.3 导电高分子复合材料 |
| 1.2.4 导电高分子存在的不足 |
| 1.3 含导电高分子齐聚物的生物材料 |
| 1.3.1 含导电高分子齐聚物生物材料概述 |
| 1.3.2 含苯胺齐聚物的生物材料 |
| 1.4 导电性生物材料的应用形式 |
| 1.4.1 导电性薄膜 |
| 1.4.2 导电性纳米纤维 |
| 1.4.3 导电性水凝胶 |
| 1.4.4 导电性复合材料3D支架 |
| 1.5 导电性生物材料的组织工程应用 |
| 1.5.1 骨组织工程 |
| 1.5.2 骨骼肌组织工程 |
| 1.5.3 神经组织工程 |
| 1.5.4 心脏组织工程 |
| 1.5.5 皮肤组织工程 |
| 1.6 电刺激的生物学反应 |
| 1.6.1 电刺激对蛋白质行为的影响 |
| 1.6.2 电刺激对细胞行为的影响 |
| 1.6.3 导电生物材料结合电刺激在组织工程中的应用 |
| 1.7 论文的设计思路和研究内容 |
| 第2章 贻贝仿生的导电性生物粘合剂的制备及在体外成骨诱导方面的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 苯胺四聚体甲基丙烯酰胺(ATMA)单体的合成 |
| 2.2.3 多巴胺甲基丙烯酰胺(DOPAMA)单体的合成 |
| 2.2.4 电活性无规共聚物的合成 |
| 2.2.5 材料的基本表征 |
| 2.2.6 血液相容性测试 |
| 2.2.7 体外生物学实验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 材料的合成和表征 |
| 2.3.2 共聚物的电化学性质及电导率 |
| 2.3.3 共聚物表面的亲水性 |
| 2.3.4 共聚物的粘结强度 |
| 2.3.5 PAT共聚物体外生物相容性评估 |
| 2.3.6 电刺激下PAT共聚物上MC3T3-E1细胞成骨分化评估 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 电活性和生物活性微球的制备及在大鼠颅骨缺损修复中的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 材料的合成 |
| 3.2.3 PLGA/HA微球的制备 |
| 3.2.4 PLGA/HA微球的功能化 |
| 3.2.5 材料的基本表征 |
| 3.2.6 QCM-D测定微球对DOPA-IGF-1生长因子的吸附能力 |
| 3.2.7 体外生物学实验 |
| 3.2.8 大鼠颅骨缺损修复研究 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 电活性微球的制备与表征 |
| 3.3.2 DOPA-IGF-1在微球上的粘附性表征 |
| 3.3.3 电活性生物活性微球的体外生物学性质研究 |
| 3.3.4 电活性生物活性微球的体内生物学评估(大鼠颅骨缺损修复) |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 图案化导电性静电纺丝纤维毡的制备及在体外神经分化方面的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 材料的合成 |
| 4.2.3 PAT/PCL复合材料无序和图案化纤维毡的制备 |
| 4.2.4 静电纺丝材料的掺杂 |
| 4.2.5 材料的基本表征 |
| 4.2.6 ELISA法测定静电纺丝材料对NGF的吸附能力 |
| 4.2.7 体外生物学研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PCAT纳米纤维的制备 |
| 4.3.2 PCAT纳米纤维的电化学性质和电导率 |
| 4.3.3 PCAT纳米纤维的亲水性 |
| 4.3.4 静电纺丝纳米纤维毡的形貌 |
| 4.3.5 纺丝纤维对NGF蛋白的粘附能力 |
| 4.3.6 无序纺丝纤维的生物相容性评价 |
| 4.3.7 电刺激下PCAT纤维毡对神经细胞生物活性和分化的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 导电性形状记忆弹性体的制备及在体外成骨诱导方面的应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 端氨基苯胺三聚体(ACAT)的合成 |
| 5.2.3 PCL的合成 |
| 5.2.4 导电弹性体的合成 |
| 5.2.5 材料的基本表征 |
| 5.2.6 弹性体的宏观记忆性评估 |
| 5.2.7 体外生物学实验 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 导电性聚氨酯弹性体的合成与表征 |
| 5.3.2 导电性弹性体的热力学性质 |
| 5.3.3 导电性弹性体的形状记忆性 |
| 5.3.4 导电性弹性体的表面形貌 |
| 5.3.5 导电性弹性体的细胞相容性评价 |
| 5.3.6 ALP活性和钙沉积 |
| 5.3.7 成骨基因表达 |
| 5.3.8 成骨蛋白免疫荧光染色和western blotting分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、丹参对成纤维细胞成骨的扫描电镜观察（论文参考文献）
- [1]3D打印多孔无定形聚芳醚酮复合支架的制备及成骨作用研究[D]. 顾芯铭. 吉林大学, 2021(01)
- [2]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [3]Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究[D]. 贾婷婷. 山东大学, 2021
- [4]微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控研究[D]. 张珊. 山东大学, 2021(11)
- [5]血管活性肠肽通过调控RANK/RANKL/OPG促进先天性胫骨假关节形成的机制研究[D]. 曲宏懿. 山东大学, 2021(11)
- [6]人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究[D]. 夏琰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [7]载银高透氧化锆种植基台材料的制备及其性能和机理研究[D]. 彭敏. 电子科技大学, 2021(01)
- [8]TC4多孔支架对小鼠成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞毒性研究[D]. 纪琦. 遵义医科大学, 2021
- [9]硫酸乙酰肝素对骨缺损修复的研究[D]. 刘仪. 江南大学, 2020(06)
- [10]贻贝仿生导电性苯胺齐聚物生物材料的制备及在组织工程中的应用[D]. 闫欢欢. 中国科学技术大学, 2020(01)