一、我国法定饲用抗菌药物的生物学特性(续)（论文文献综述）
梁泽毅[1]（2021）在《高寒植物缩合单宁季节变化及其在抑制牦牛瘤胃甲烷排放中的应用》文中认为高寒草地是青藏高原重要的畜牧业生产的基地,在维持地区生态系统稳定及国家生态安全方面发挥着至关重要作用。然而,天然草地牧草季节间供给失衡已成为制约放牧家畜生产潜力发挥的关键因素。因此,系统评价高寒植物营养价值以及高寒灌木酚类物质对家畜的影响,可为合理开发利用其他草地资源提供理论参考。本试验对东祁连山金强河流域高寒草甸的21种典型高寒植物（主要为灌木）中营养成分和酚类物质含量季节动态变化规律进行研究。通过体外发酵技术,系统评定富含缩合单宁（CT）高寒灌木叶片对牦牛瘤胃发酵特性、甲烷产量及其微生物变化的影响。主要试验结果如下:1.21种优势高寒植物分属于杜鹃花科、蔷薇科、豆科以及杨柳科等12个科,其干物质（DM）含量随植物成熟呈“V”型变化,除蔷薇科外,其他植物DM含量均在8月最低。粗蛋白（CP）含量随季节显着降低（P<0.05）,而中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）含量呈显着增加（P<0.05）。2.酚类物质含量具有明显的季节和种属特性,同科植物总酚（TP）含量季节变化较为趋同,但灌木植物中酚类物质含量显着高于草本植物（P<0.05）。TP、单宁（TT）和CT随季节呈逐渐降低和倒“V”型变化,且不同的植物间差异显着（P<0.05）。综合分析表明,灌木植物藏沙棘（Hippophae tibetica）和杯腺柳（Salix cupularis）CT含量季节间显着高于其他植物（P<0.05）,平均分别为42.29 g/kg DM与36.96 g/kg DM,从CT的生物学特性方面可作为潜在的优势灌木进行后续体外发酵特性研究。3.体外发酵结果表明,植物中CT含量对体外产气量及甲烷产量具有显着影响（P<0.05）,杯腺柳体外总产气量高于藏沙棘（P<0.05）;同时,两种灌木均显着降低了甲烷产量,植物中CT含量与甲烷产量呈负相关（P<0.05）,与对照组相比,杯腺柳和藏沙棘分别降低了甲烷产量的22.0%和27.53%。杯腺柳的体外干物质消化率（IVDMD）和体外氮消化率（IVND）显着高于藏沙棘（P<0.05）,并且发酵24 h的体外产气量（IVGP）、IVND与CT含量呈显着负相关（P<0.05）。pH和NH3-N随植物中CT含量增加而逐渐降低。乙酸、丁酸和乙/丙酸随植物中CT含量的增加而逐渐降低,但丙酸含量则逐渐增加。4.通过对体外发酵系统中微生物16S rRNA高通量测序分析,不同季节在以杯腺柳和藏沙棘为底物的瘤胃发酵样品中拟杆菌门（Bacteroidetes）占比最高,维持在48.20%～63.70%,其次是厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Protebacteria）。在不同季节样品中,7月份两种植物细菌Shannon指数显着降低（P<0.05）,但Chao1指数没有显着变化（P>0.05）;古菌中优势菌为广古菌门（Euryarchaeota）和奇古菌门（Thaumarchaeota）。古菌的Shannon指数随植物中CT含量的增加而逐渐降低（P<0.05）,Chao1指数没有显着变化（P>0.05）。相关性分析进一步表明,甲烷球形菌属（Methanosphaera）的相对丰度与体外CH4产量呈极显着正相关（P<0.01）,说明Methanosphaera在瘤胃产甲烷中可能发挥重要作用。
张丽娜[2]（2020）在《盐酸小檗碱对AGEs介导下人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究》文中提出研究背景及研究目的牙周病是一种发病率较高的慢性细菌感染性疾病,常引发牙周软硬组织的破坏,如不治疗会导致牙齿松动、脱落,严重影响患者的咀嚼功能和身心健康。洁治、刮治、根面平整等传统的牙周治疗方法只能消除病因,无法使丧失的牙周组织获得理想的再生。牙周组织再生才是治疗牙周病的有效措施,是口腔医学多学科领域研究的共同目标。近年来,虽然引导组织再生术、牙周骨移植术在临床上的应用在一定程度上提高了牙周组织的再生能力,但是这些治疗方法的成效依赖于剩余间充质干细胞的数量及功能,因此有其局限性。随着干细胞及组织工程技术日新月异的发展,以牙齿干细胞为主导的牙周组织工程技术为牙周病的治疗提供了更为科学、有效的方法。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）是Seo等学者在2004年利用单细胞克隆技术成功分离和培养出来的一类来源于牙周韧带组织的间充质干细胞。因其在口腔临床工作中易于取材、易于体外扩增,且自身具有自我复制、自我更新和多向分化潜能的生物学优势,被认为是具有牙周组织再生治疗前景的、可以实现组织生物学修复的种子细胞。hPDLSCs的改善牙周组织再生的能力,为口腔临床各专业,如牙周病学、修复、正畸及颌面外科学的牙周改建提供了重要的临床应用价值,hPDLSCs也因此备受口腔医学各领域研究者的广泛关注。众所周知,牙周病和糖尿病是危害人类身体健康的发病率较高的两大疾病。同时,两者互相关联,它们的关系是口腔及相关领域研究者非常关注的热点问题。糖尿病人群中牙周病的发病率高且病损严重,糖尿病作为牙周病的主要危险因素已经被证实,而完善的牙周治疗又会在一定程度上改善糖尿病的病情。在糖尿病患者体内持续高血糖刺激下,蛋白质等大分子物质会自发的与葡萄糖或其他还原单糖发生非酶糖基化反应,形成一种不可逆的蛋白——晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）。AGEs 在糖尿病患者体内累积水平明显升高,其已被证实在许多炎症反应中发挥重要作用。鉴于hPDLSCs的生物学性能会受到不同环境因素的影响,因此我们猜测AGEs可能通过影响hPDLSCs的成骨分化潜能加重糖尿病患者牙周组织的损伤程度。当hPDLSCs的成骨分化潜能受到抑制时,促进细胞的成骨分化,进而促进受损牙周组织的修复再生是本课题研究的重点。目前,中药在医学界各领域的应用越来越受到重视,盐酸小檗碱（berberine hydrochloride,BBR）凭借其两千多年的药用历史成为本课题的研究用药。BBR具有抗菌消炎、降血脂及抗糖尿病的生物学活性。近年来,国内外学者对BBR促进和改善骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stem cells,BMSCs）等的成骨分化能力方面进行了大量研究,但是对于BBR在AGEs环境下对hPDLSCs成骨分化潜能的作用及分子调控机制尚未见报道。细胞的多向分化会受到不同信号通路的影响。由于Runx2等细胞成骨相关基因是经典Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因,经典Wnt/β-catenin信号通路已被证实在骨形成过程和调节骨生物学中发挥着至关重要的作用。因此我们推测在糖尿病患者中,经典Wnt/β-catenin信号通路可能参与了 BBR对hPDLSCs成骨分化潜能的促进作用,最终促进受损牙周组织的修复。本研究以体外培养的hPDLSCs为基础,首先对hPDLSCs进行成骨诱导及成骨分化能力的鉴定,证实该细胞具备可以分化为成骨细胞的能力;然后通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、ALP活性检测、茜素红染色、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）以及Western blot等多个技术手段对细胞成骨分化相关指标进行检测,观察AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的影响,以及在此基础上BBR的应用对hPDLSCs成骨分化潜能的影响;最后为了深入探究其相关分子调控机制,通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光技术检测各组细胞经典Wnt/β-catenin信号通路相关指标的表达情况,以及应用通路小分子抑制剂XAV-939和小分子激活剂CHIR-99021后各组细胞成骨分化相关指标的表达情况。通过本研究有望阐明BBR对于AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的作用及相关分子调控机制,为深入理解hPDLSCs成骨分化及如何促进牙周组织再生提供重要的理论依据和实验指导,并且为利用BBR促进糖尿病患者受损牙周组织的修复再生提供了新思路和新的治疗方法。研究方法1.人牙周膜干细胞的培养和成骨鉴定本研究使用北京泰盛生物科技有限公司口腔干细胞库捐赠的hPDLSCs,为确保细胞的纯度及生物学性能的稳定性,本部分实验对hPDLSCs进行了传代培养及初步的鉴定,包括观察细胞的生长状况和绘制生长曲线;利用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD34、CK-19、波形丝蛋白Vimentin的表达情况,对获得的细胞进行干细胞特性鉴定;应用传统、成熟的成骨诱导方法对hPDLSCs进行成骨诱导;并通过ALP染色和茜素红染色对细胞进行成骨分化能力的鉴定,以证实细胞的成骨分化潜能。2.观察AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的影响本部分实验首先选取生长状态良好的第3代hPDLSCs,应用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测不同浓度（100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL）AGEs对hPDLSCs刺激不同时间（0d、1d、3d、5d和7d）后细胞增殖的变化,筛选出AGEs的最适浓度（200μg/mL）。在探讨AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的影响时,实验分为两组:①成骨诱导液培养组（OSTEO,即对照组）和②成骨诱导液+AGEs（200μg/mL）培养组（OSTEO+AGEs）。根据不同的检测技术要求,对各组细胞进行不同时间的成骨诱导。采用ALP染色和ALP活性检测来评价各组细胞早期成骨分化指标ALP的变化（成骨诱导14d）;选用茜素红染色来评价各组细胞钙基质的矿化程度（成骨诱导21d）;利用ELISA技术检测各组细胞成骨分化过程中Ⅰ 型胶原（collagen type Ⅰ,Collagen Ⅰ）的表达水平（成骨诱导14d）;利用qRT-PCR技术检测各组细胞成骨基因Runt相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2,Runx2）、Osterix、ALP、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、Collagen Ⅰ 和骨钙素（osteocalcin,OCN）的 mRNA表达水平（成骨诱导7d）;利用Western blot技术检测各组细胞成骨分化相关蛋白Runx2、OPN、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）和OCN的表达水平（成骨诱导7d）。从而进一步分析AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的影响。3.观察BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的作用本部分实验首先选取生长状态良好的第3代hPDLSCs,应用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测不同浓度（0.1μmol/L、1μmol/L、3μmol/L和10μmol/L）的BBR在AGEs干扰下对hPDLSCs刺激不同时间（0d、1d、3d、5d和7d）后细胞增殖的变化,筛选出BBR的最适浓度（1μmol/L）。在探讨BBR的应用对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的影响时,实验分为三组:①成骨诱导液培养组（OSTEO）,②成骨诱导液+AGEs（200μg/mL）培养组（OSTEO+AGEs）,③成骨诱导液+AGEs（200μg/mL）+BBR（1μmol/L）培养组（OSTEO+AGEs+BBR）。根据不同的检测技术要求,对各组细胞进行不同时间的成骨诱导。采用同第二部分相同的技术手段检测各组细胞成骨分化相关指标的表达情况。ALP染色和ALP活性检测来评价各组细胞早期成骨分化指标ALP的变化（成骨诱导14d）;选用茜素红染色来评价各组细胞钙基质的矿化程度（成骨诱导21d）;利用ELISA技术检测各组细胞成骨分化过程中Collagen Ⅰ的表达水平（成骨诱导14d）;利用qRT-PCR技术检测各组细胞成骨基因Runx2、Osterix、ALP、OPN、Collagen Ⅰ和OCN的mRNA表达水平（成骨诱导7d）;利用Western blot技术检测各组细胞成骨分化相关蛋白Runx2、OPN、BSP和OCN的表达水平（成骨诱导7d）。从而进一步分析BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的作用。4.探究经典Wnt/β-catenin信号通路调控BBR促进AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的分子机制本部分实验首先选取生长状态良好的第3代hPDLSCs,在检测AGEs作用下及在此基础上应用BBR后细胞中经典Wnt/β-catenin信号通路相关指标的表达情况时,实验分为三组:①成骨诱导液培养组（OSTEO）,②成骨诱导液+AGEs（200μg/mL）培养组（OSTEO+AGEs）,③成骨诱导液+AGEs（200μg/mL）+BBR（1μmol/L）培养组（OSTEO+AGEs+BBR）。采用qRT-PCR技术检测各组细胞中该信号通路相关基因β-catenin、LRP5、GSK-3β和DKK-1的mRNA表达水平（成骨诱导7d）;利用Western blot技术检测各组细胞中该信号通路相关蛋白β-catenin、wnt3a和GSK-3β的表达水平（成骨诱导7d）;利用免疫荧光技术检测该通路的核心成分β-catenin在各组细胞内的分布（成骨诱导7d）。从而进一步探讨经典Wnt/β-catenin信号通路在BBR促进AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化过程中的分子调控机制。为了进一步验证该信号通路参与了 AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的抑制作用及BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化的促进作用,在细胞培养时分别加入了经CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测出来的合适浓度的Wnt信号通路小分子抑制剂XAV-939（1μmol/L）和小分子激活剂CHIR-99021（1μmol/L）,其中抑制剂和激活剂添加组需首先加入抑制剂或激活剂预处理细胞30min,之后更换为相应的成骨诱导培养液培养细胞7d、14d或21d,利用与第二部分和第三部分相同的检测技术完成各组细胞各项成骨分化相关指标的检测。进一步明确经典Wnt/β-catenin信号通路在BBR促进AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化过程中的调控机制。结果1.细胞经过常规体外培养后,在倒置相差显微镜下均呈现出长梭形或纺锤状、胞体饱满的成纤维细胞样,细胞单层生长,细胞在最初的6～8代增殖生长旺盛,约3～5天就可以铺满培养瓶底的90%,进入下一个传代周期。第3代hPDLSCs的生长曲线整体呈现“S”形,能见到明显的潜伏期、指数生长期、平台期和衰亡期四个时期。细胞通过流式细胞术鉴定发现,其阳性表达间充质干细胞表面标志物 CD73（99.21%）、CD90（99.96%）、CD105（95.6%）和波形丝蛋白Vimentin（99.12%）;而阴性表达内皮细胞标记物CD34（6.33%）和细胞角蛋白CK-19（2.82%）。细胞经成骨诱导培养后,发生明显的类似成骨细胞的形态学改变:细胞明显增厚,局部聚集成片,细胞形态多样且不规则,呈短梭形、多角形或不规则三角形,胞质内细胞颗粒样物增多,密度增高。ALP染色显示诱导组细胞胞质内出现蓝色颗粒状或片状沉淀物,对照组染色阴性。茜素红染色显示诱导组细胞可见大小不一的桔红色矿化结节,对照组染色阴性。以上结果表明本研究所用的hPDLSCs经成骨诱导培养后,具有可以分化为成骨细胞的能力。2.在探究AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能影响的实验中,我们发现成骨诱导14d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的ALP染色和ALP活性明显弱于对照组（P<0.01）;成骨诱导21d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞形成的矿化结节与对照组相比个头较小、颜色较浅、数量较少且呈散在分布;成骨诱导14d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的Collagen Ⅰ的表达水平与对照组相比明显减弱（P<0.01）;成骨诱导7d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的Runx2、Osterix、ALP、OPN、Collagen Ⅰ 和OCN这些成骨相关基因的mRNA表达水平与对照组相比明显降低（P<0.01）;成骨诱导7d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的Runx2、OPN、BSP和OCN这些成骨相关蛋白的表达水平与对照组相比均减弱。综合上述结果,反映了 AGEs可以减弱hPDLSCs的ALP活性、抑制hPDLSCs矿化结节的形成、抑制hPDLSCs合成Collagen Ⅰ、抑制hPDLSCs成骨相关基因和蛋白的表达,表明AGEs可以部分抑制hPDLSCs的成骨分化潜能。3.在探讨BBR的应用对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能影响的实验中,我们发现在AGEs环境下加入BBR后,hPDLSCs的各项成骨分化相关指标的表达均得到了改善,具体表现为:成骨诱导14d后,在BBR作用下,OSTEO+AGEs+BBR组的ALP染色和ALP活性均较OSTEO+AGEs组有所改善（P<0.01）,但仍不及OSTEO组;成骨诱导21d后,在BBR作用下,OSTEO+AGEs+BBR组细胞形成的矿化结节大小、数量及颜色均较OSTEO+AGEs组有所改善,但仍不及OSTEO组;成骨诱导14d后,在BBR作用下,OSTEO+AGEs+BBR组细胞Collagen Ⅰ的表达量明显高于OSTEO+AGEs组（P<0.01）,但仍低于OSTEO组;成骨诱导7d后,在BBR作用下,OSTEO+AGEs+BBR组细胞上述各项成骨相关基因的mRNA表达水平均较OSTEO+AGEs组升高（P<0.05,P<0.01）,但各基因的表达水平仍低于OSTEO组;成骨诱导7d后,在BBR作用下,OSTEO+AGEs+BBR组细胞上述各项成骨相关蛋白的表达水平均较OSTEO+AGEs组增强,但仍不及OSTEO组。上述全部实验结果反映出BBR可以在一定程度上改善AGEs导致的hPDLSCs ALP活性的降低、增强hPDLSCs矿化结节的形成程度、改善AGEs导致的细胞Collagen Ⅰ表达水平降低、改善AGEs导致的细胞成骨相关基因mRNA和蛋白表达水平降低,表明BBR的应用可以部分促进AGEs干扰下hPDLSCs的成骨分化潜能。4.在研究AGEs及其BBR的应用对hPDLSCs中经典Wnt/β-catenin信号通路相关指标表达情况影响的实验中,我们发现成骨诱导7d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的β-catenin和LRP5的mRNA表达较OSTEO组显着增高（P<0.01）,GSK-3β和DKK-1 的mRNA表达较OSTEO组显着下降（P<0.05,P<0.01）,而加入BBR后,OSTEO+AGEs+BBR组细胞β-catenin和LRP5的mRNA表达较OSTEO+AGEs组明显下调（P<0.01）,但仍高于OSTEO组,GSK-3β的mRNA表达较OSTEO+AGEs组明显上调（P<0.05）,但仍低于OSTEO组;成骨诱导7d后,在AGEs作用下,OSTEO+AGEs组细胞的β-catenin和wnt3a的表达水平较OSTEO组增高,而GSK-3β的表达水平较OSTEO组下降,而加入BBR后,OSTEO+AGEs+BBR组细胞β-catenin和wnt3a的表达水平较OSTEO+AGEs组均下调,GSK-3β的表达水平较OSTEO+AGEs组上调;成骨诱导7d后,OSTEO组β-catenin主要位于hPDLSCs的细胞质中,OSTEO+AGEs组细胞质和细胞核内都出现了 β-catenin的积累,特别是细胞核内β-catenin积累更加明显,OSTEO+AGEs+BBR组β-catenin在细胞质和细胞核内都有积累,但相对于OSTEO+AGEs组,β-catenin在细胞质和细胞核内的分布差距不明显。综合上述结果提示AGEs能促进hPDLSCs中β-catenin向细胞核的转移和分布,从而激活经典Wnt/β-catenin信号通路;BBR能够抑制AGEs干扰下hPDLSCs中β-catenin向细胞核的转移和分布,从而抑制经典Wnt/β-catenin信号通路。另一方面,为了进一步明确AGEs导致的hPDLSCs成骨分化能力下降与AGEs对经典Wnt/β-catenin信号通路的激活有关,我们在细胞培养时加入了经典Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂XAV-939,培养细胞7d、14d、21d,然后完成各项成骨分化相关指标的检测。结果显示,与OSTEO+AGEs组相比较,成骨诱导14d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组细胞ALP染色深,染色范围大,但仍不及OSTEO组;成骨诱导14d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组细胞的ALP活性增强（P<0.01）,但仍低于OSTEO组;成骨诱导21d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组细胞形成的矿化结节较大、颜色深、数量多,但仍不及OSTEO组;成骨诱导14d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组细胞Collagen Ⅰ的表达水平明显增强（P<0.01）,但仍低于OSTEO组;成骨诱导7d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组大部分成骨相关基因（Runx2、Osterix、ALP、Collagen Ⅰ和OCN）的mRNA表达均较OSTEO+AGEs组明显增强（P<0.05,P<0.01）,但仍低于OSTEO组,值得注意的是XAV-939的应用未对AGEs干扰下细胞OPN的基因表达产生有意义的影响;成骨诱导7d后,OSTEO+AGEs+XAV-939组hPDLSCs成骨相关蛋白Runx2、OPN、BSP和OCN的表达水平均较OSTEO+AGEs组增强,但仍低于OSTEO组。同时,为了进一步明确BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化能力下降的改善作用与它对经典Wnt/β-catenin信号通路的抑制有关,我们在hPDLSCs成骨诱导过程中加入了经典Wnt/β-catenin信号通路的小分子激活剂CHIR-99021,培养细胞7d、14d、21d,然后完成各项成骨分化相关指标的检测。结果显示,成骨诱导14d后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021组细胞ALP染色程度及范围均较OSTEO+AGEs+BBR组小,但仍高于OSTEO+AGEs组;成骨诱导14d后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021 组 细 胞 的 ALP 活 性 明 显低 于OSTEO+AGEs+BBR组（P<0.01）,但仍高于OSTEO+AGEs组（P<0.01）;成骨诱导21d后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021组细胞形成的矿化结节较OSTEO+AGEs+BBR组小、数量少,但矿化结节的数量和大小仍高于OSTEO+AGEs 组;成骨诱导 14d 后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021 组细胞Collagen Ⅰ的表达水平较OSTEO+AGEs+BBR组明显下降（P<0.01）,但仍高于OSTEO+AGEs组（P<0.01）;成骨诱导7d后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021组成骨相关基因（Runx2、Osterix、ALP、OPN、Collagen Ⅰ 和OCN）的mRNA表达均较OSTEO+AGEs+BBR组明显减弱（P<0.05,P<0.01）,但部分成骨基因mRNA的表达水平仍高于OSTEO+AGEs组（P<0.01）;成骨诱导7d后,OSTEO+AGEs+BBR+CHIR-99021 组细胞成骨相关蛋白Runx2、OPN、BSP和OCN的表达水平均较OSTEO+AGEs+BBR组下降,但仍高于OSTEO+AGEs组。综合上述各指标的结果表明AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的抑制作用部分是通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路调控的,BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能下降的积极改善作用部分是通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路调控的。结论1.在糖尿病患者中,AGEs的存在可以抑制hPDLSCs的成骨分化潜能。2.BBR的应用可以部分逆转AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的抑制作用,促进hPDLSCs的成骨分化。3.AGEs通过促进hPDLSCs的经典Wnt/β-catenin信号通路中Wnt配体wnt3a的表达;抑制DKK-1的表达,从而抑制DKK-1与Wnt共同受体LRP5的特异结合,促进LRP5与Wnt配体-Frizzled受体复合物的结合;同时促进LRP5的mRNA表达,促进Wnt信号的传导;抑制GSK-3β的活性,继而抑制GSK-3β/Axin/APC降解复合物的活性,促进β-catenin的积累和入核,随后与TCF/LEF结合,调控下游靶基因的转录,进而激活经典Wnt/β-catenin信号通路来抑制hPDLSCs的成骨分化潜能。XAV-939阻断经典Wnt/β-catenin信号通路后,hPDLSCs能部分恢复其成骨分化能力。BBR通过抑制AGEs干扰下hPDLSCs的Wnt配体wnt3a的表达;抑制LRP5的mRNA表达,抑制Wnt信号的传导;增强GSK-3β的活性,继而增强GSK-3β/Axin/APC降解复合物的活性,促进β-catenin的降解,抑制β-catenin向细胞核的转移,进而抑制下游靶基因的转录,抑制经典Wnt/β-catenin信号通路来促进AGEs干扰下hPDLSCs的成骨分化潜能。CHIR-99021激活经典Wnt/β-catenin信号通路后,BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的改善作用受到部分抑制。
屈谦伟[3]（2020）在《以IGPD为靶标探究异甘草素对木糖葡萄球菌抗菌作用的研究》文中研究说明奶牛乳房炎是全世界公认的影响奶牛健康最常见的疾病,其中由凝固酶阴性葡萄球菌感染导致的奶牛乳房炎正呈逐年上升趋势,而木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus,S.xylosus）是凝固酶阴性葡萄球菌感染中重要的临床分离菌,当其形成生物被膜后,其耐药性显着增强,且会导致宿主的持续性感染,造成乳房炎久治不愈。在2017～2018年我国农业农村部相继印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017～2020年）》和《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案》的通知,通知中明文规定了退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。因此,从奶牛乳房炎发病的流行趋势和我国减抗、限抗等政策出发,研发以中药为主体的具有新型抗菌机制的药物,在临床奶牛乳房炎的治疗中具有重要意义。咪唑甘油磷酸酯脱水酶（IGPD）作为L-组氨酸生物合成途径中的关键酶之一,其只在细菌和植物中存在,而在哺乳动物的细胞中不存在。目前在除草剂和抗菌剂的生物学靶标数量有限的情况下,IGPD被认为是一个待开发的优质靶标。异甘草素作为甘草中黄酮类化合物的一种,具有良好的抗菌活性和成药性,虽然异甘草素能够抑制金黄色葡萄球菌的生长并抑制其生物被膜的形成,但目前尚未见异甘草素对木糖葡萄球菌生长和生物被膜作用的研究。因此,本研究通过探究异甘草素以IGPD为靶点揭示异甘草素对木糖葡萄球菌的作用,并在动物乳房炎模型中评估异甘草素的治疗作用。具体研究结果如下:（1）利用微量稀释法测量异甘草素对木糖葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）,同时利用时间-杀菌曲线以评估异甘草素对木糖葡萄球菌生长的影响,结果显示MIC值为80μg·m L-1,并且异甘草素浓度为2倍MIC以上时,木糖葡萄球菌的生长被完全抑制。（2）利用结晶紫染色法和扫描电子显微镜观察的方法分析异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用,结果显示:1/2倍MIC（40μg·m L-1）、1/4倍MIC（20μg·m L-1）和1/8倍MIC（10μg·m L-1）的异甘草素能显着干预木糖葡萄球菌野生株生物被膜的形成,破坏生物被膜的完整性;而异甘草素无法干预木糖葡萄球菌his B基因缺失株生物被膜的形成。（3）利用实时荧光定量PCR、Westren blot以及L-组氨酸含量的测定揭示异甘草素对IGPD的调控作用,结果发现异甘草素能够通过显着下调his B基因的转录水平及IGPD的表达而影响L-组氨酸的合成。（4）利用生物膜层反射光干涉技术、酶活性分析和分子对接技术印证异甘草素与IGPD的直接结合作用,结果表明异甘草素能够与IGPD直接结合并抑制IGPD活性。（5）利用小鼠乳房炎模型评估异甘草素对木糖葡萄球菌造成感染的治疗作用,结果发现异甘草素可以降低乳腺组织中炎性细胞因子的含量,并有效地减轻小鼠乳腺组织损伤,同时还可以防止乳腺内炎性症状的发生。综上所述,本研究基于IGPD靶标出发,从调控和直接结合两个方面揭示异甘草素对木糖葡萄球菌生长和生物被膜形成的影响,同时构建了小鼠乳房炎模型,评估异甘草素对木糖葡萄球菌造成感染的治疗作用。本研究将为今后研发靶向IGPD药物和治疗由木糖葡萄球菌引起的奶牛乳房炎提供科学依据。
舒慧萍[4]（2019）在《猪源产生物被膜乳酸菌的筛选及生物学特性研究》文中研究指明目前,随着我国养猪业集约化、规模化的空前发展,细菌病的频发造成了抗生素的滥用,导致动物机体病原菌耐药性增强和畜产品中药物残留等问题,影响着养猪业的生产发展和人类健康,益生菌作为抗生素的替代品由此应运而生,其中乳酸菌是一类主要的益生菌,能够抑制有害菌生长、调节动物胃肠道功能以及促进动物机体生长,逐步成为当前研究的热点。此外,细菌生物被膜作为细菌自身的一种保护性生长方式,能够增强对外界环境的抵抗力,有报道称生物被膜态下益生菌制备的饲料添加剂具有更强的耐热性、耐酸性以及抗冷冻和干燥能力,但国内外关于益生菌生物被膜的研究相当匮乏,尚处于起步阶段。本研究采用平板涂布法分离猪粪便中的乳酸菌,经形态学观察和生理生化鉴定初步筛选出108株革兰阳性、触酶阴性的疑似乳酸菌,分别采用牛津杯法和结晶紫染色法测定抑菌特性和生物被膜形成能力,结果显示,有5株分离株同时具有抑菌特性和生物被膜形成能力,经16S rDNA分子生物学鉴定,其中4株为约氏乳杆菌（L-8、L-11、L-18、L-76）,1株为嗜淀粉乳杆菌（L-102）。为获得益生性乳酸菌,分别检测其产酸能力,对pH、胆盐、胰蛋白酶、高温的耐受性,细胞黏附性,广谱抑菌性,药物敏感性,生长活性以及安全性等生物学特性,结果显示,培养24h后各菌株上清液pH值均在4.104.40之间;在pH 2.0环境下,随时间的延长,L-8、L-11和L-18菌液中活菌数下降,L-76和L-102菌液中活菌数基本无变化;经0.4%胆盐处理后,L-76和L-102菌液中活菌数分别可达103 CFU/ml和104CFU/ml,而L-8、L-11、L-18几乎不能存活;经胰蛋白酶处理后,各菌株均生长正常;经测试,5株乳酸菌对猪小肠上皮细胞的黏附率均在77.04%79.76%之间,且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和维氏气单胞菌等病原菌均有抑制性;于60℃下作用15min后,L-8菌液中活菌数下降至104CFU/ml,L-11、L-18、L-76和L-102菌液中活菌数仍可达到107CFU/ml;在药物敏感性试验中,L-76和L-102对8种药物表现为耐药,耐药性相对于L-8、L-11、L-18较强;在生长曲线测试中,L-76于培养5h后进入对数期,生长速度相对略快。综上研究表明,上述5株乳酸菌均具有一定的产酸性、胰蛋白酶耐受性、细胞黏附性、广谱抑菌性以及生长活性,其中L-76和L-102生物学特性相对良好;通过模拟动物急性中毒实验,结果显示,分别灌胃和腹腔注射108 CFU/ml L-76和L-102菌液后,小鼠生长状态正常,表明L-76和L-102均具有一定安全性。本试验进一步研究被膜态和浮游态下乳酸菌L-76和L-102上清液对病原菌的抑菌活性,结果显示,被膜态和浮游态乳酸菌上清液分别与病原菌共培养后,病原菌的生长均被抑制;经不同pH（3.0、5.0、7.0、9.0）、酶（过氧化氢酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）以及温度（40、50、60、70、80℃）处理两种状态下乳酸菌上清液,检测对病原菌的抑制作用,结果显示,随pH值增大,被膜态和浮游态乳酸菌L-76、L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径均减小,表明其抑菌活性下降,且当pH为7.0和9.0时,均无抑菌活性;经过氧化氢酶和不同温度作用后,被膜态和浮游态乳酸菌L-76、L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径变化差异不显着,表明过氧化氢酶和温度对两种状态下乳酸菌上清液的抑菌活性影响较小;经蛋白酶作用后,两种状态下L-76和L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径均明显减小,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液对指示菌的抑菌圈直径更小,表明蛋白酶对被膜态乳酸菌上清液的抑菌活性影响较大。综上可见,两种状态下乳酸菌上清液具有pH依赖性、温度和过氧化氢酶稳定性以及蛋白酶敏感性,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液的抑菌活性对蛋白酶更敏感,分析被膜态和浮游态乳酸菌上清液的抑菌成分中可能含有有机酸、蛋白、多肽等物质,且被膜态乳酸菌上清液中的抑菌物质活性或含量高于浮游态。经扫描电镜观察研究两种状态下乳酸菌L-76和L-102上清液对病原菌的抑制作用,结果表明,共培养后病原菌形态发生改变甚至裂解死亡,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液对指示菌形态影响更大,证明两种状态下乳酸菌上清液中均含有抑菌物质,且被膜态乳酸菌上清液中的抑菌物质活性略高或含量略多。
谢思露[5]（2020）在《临床鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药能力的相关性研究》文中研究指明目的:1. 探讨临床鲍曼不动杆菌的耐药性特征及感染特征,多重耐药鲍曼不动杆菌感染的相关危险因素,为临床防控和治疗鲍曼不动杆菌感染提供依据。2.摸索鲍曼不动杆菌生物膜形成实验条件,为进一步探究临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力奠定实验条件基础。3.探讨临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药能力的关系,为深入理解细菌生物膜感染、耐药机制及感染防控与治疗提供理论基础。4.探讨临床鲍曼不动杆菌耐药能力、生物形成能力、生物膜相关基因和耐药相关基因之间的相互关系,为有效防控细菌的感染与流行、提高清除效率与疗效以及开发新型抗菌药物提供依据。方法:1.收集成都中医药大学附属医院2018年5月-2019年4月临床分离的鲍曼不动杆菌,用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定和药敏分析系统进行菌株鉴定和药物敏感性检测,结果判读按CLSI2019标准;2. 收集临床鲍曼不动杆菌感染者临床信息:年龄、住院科室、住院天数、基础疾病、抗菌素使用情况、接受侵入性操作、合并其他细菌感染等。3. 在微孔内营养肉汤、脑心浸液肉汤、MH肉汤、LB肉汤和TSB肉汤中37℃静置培养鲍曼不动杆菌ATCC19606构建生物膜,分别培养0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h,用结晶紫染色法对各培养基中生物膜形成量进行测定,绘制生物膜生长曲线,激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜。4.用结晶紫染色法和筛选出的实验条件对所有临床鲍曼不动杆菌生物膜量进行测定,判断临床鲍曼不动杆菌菌株的生物膜形成能力。5.用微量肉汤稀释法测定亚胺培南、左氧氟沙星、头孢他啶对临床鲍曼不动杆菌的MIC和MBIC。判断临床鲍曼不动杆菌菌株的耐药能力（耐药率、多重耐药性、MIC、MBIC）。6.对临床鲍曼不动杆菌的耐药相关基因β-内酰胺酶基因(包括ESBLs基因(blaPER、blaVEB、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV)、blaAmp C基因、碳青霉烯酶基因(A类:blaKPC、blaGES、blaIMI,B类:blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaGIM、blaSIM,D类:blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like)、氨基糖苷类修饰酶基因（aac（3）-Ⅰa、aac（6’）-Ⅰb、aph（3’）-Ⅰa、ant（3’’）-Ⅰa）、16S r RNA甲基化酶基因arm A、喹诺酮类耐药相关基因（gyr A、par C）、外膜孔蛋白基因（car O、omp A）及主动外排泵基因（ade B、ade J、ade G、ade S、ade R、abe M）)和生物膜相关基因（aba I、bap、bfm S、bfm R、csu A、csu AB、csu C、csu D、csu E）进行PCR扩增和扩增产物电泳,产物测序后序列BLAST比对,确定基因型和亚型。结果:1.收集到130株临床鲍曼不动杆菌,非MDR菌株51株（39.2%）,MDR菌株79株（60.8%）,其中XDR菌有21株（16.2%）。临床鲍曼不动杆菌主要来自ICU病人,大多分离自痰液标本。≥60岁的老龄感染者占84%（105/130）。对亚胺培南和头孢吡肟的耐药率最高（61.5%）,对头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率>60%,对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明的耐药率均>50%,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为16.9%,对替加环素中介5株（3.8%）,未检出对替加环素耐药菌株。2.单因素分析结果显示气管切开/插管、尿道置管、入住ICU、住院时间超过30天、使用两联及两联以上抗菌素、使用碳青霉烯类抗菌药物是多重耐药鲍曼不动杆菌感染的危险因素（P<0.05）。多因素logistic回归分析结果显示住院天数超过30天、气管切开/插管是引起多重耐药鲍曼不动杆菌感染的独立危险因素（P<0.05）。3.在5种培养基中鲍曼不动杆菌均能形成生物膜,在不同培养基中生物膜形成量差异明显。鲍曼不动杆菌在LB肉汤和BHI肉汤中生物膜形成量差异无统计学意义（P>0.05）,在MH肉汤、TSB肉汤和NB肉汤中生物膜形成量差异无统计学意义（P>0.05）,在前两种培养基中生物膜形成量显着高于后三种培养基（P<0.05）。在不同的培养时间点,生物膜形成量各异,培养48 h形成的生物膜量显着高于培养36 h形成的生物膜量（P<0.05）,与培养60 h形成的生物膜量差异无统计学意义（P>0.05）。鲍曼不动杆菌在LB肉汤和BHI肉汤中培养48 h的生物膜结构更紧密厚实。4.130株临床鲍曼不动杆菌菌株的生物膜量总体呈正偏态分布。130株临床鲍曼不动杆菌中,生物膜阴性菌株有14株（10.8%）,有116株（89.2%）能形成不同程度的生物膜,其中生物膜弱阳性47株（36.2%）、中阳性51株（39.2%）、强阳性18株（13.8%）。5. 临床鲍曼不动杆菌MDR菌株和XDR菌株生物膜形成能力都以中阳性（43.1%,47.6%）为主,非MDR菌株以弱阳性（37.3%）为主。MDR菌株和XDR菌株的生物膜阳性率显着高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株与XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。MDR菌株和XDR菌株的生物膜形成能力显着强于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株与XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。生物膜阴性菌在MDR菌株和XDR菌株中所占比例显着低于非MDR菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株在非MDR、MDR和XDR菌株中所占比例差异均无统计学意义（P>0.05）。6. 临床鲍曼不动杆菌生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株中非MDR菌株所占比例均显着低于生物膜阴性菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株所占比例无差异（P>0.05）。生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株中非MDR菌株、MDR菌株和XDR菌株构成比无差异（P>0.05）,临床鲍曼不动杆菌生物膜形成量A值与菌株耐抗菌素数目呈正相关（rs=0.237,P=0.007）。7. 临床鲍曼不动杆菌生物膜阳性菌株对12种临床常用抗菌素的耐药率均显着高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株对11种临床常用抗菌素的耐药率均显着高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,随生物膜形成能力增强（弱阳性、中阳性、强阳性）,临床鲍曼不动杆菌对12种临床常用抗菌素的耐药率上升,但仅对复方新诺明的耐药率上升差异具有统计学意义（P<0.05）。8. 左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对临床鲍曼不动杆菌的MBIC值与MIC值均呈正相关,这三种抗菌素对菌株的MBIC/MIC比值均≥1,其中以2和4为主（>70%）,最高达128。生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株的MIC值均显着高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性、强阳性菌株之间的MIC值无差异（P>0.05）。菌株生物膜形成量A值与左氧氟沙星和亚胺培南对其的MIC值均无相关性,与头孢他啶对其的MIC值呈弱正相关（rs=0.184,P<0.05）。随着鲍曼不动杆菌生物膜形成能力（弱阳性、中阳性和强阳性）增强,左氧氟沙星和头孢他啶对菌株的MBIC值增加（P<0.05）,生物膜形成量A值与MBIC值呈正相关（LEV:rs=0.276,P=0.003;TAZ:rs=0.201,P=0.04）。亚胺培南对生物膜形成能力不同的菌株的MBIC值差异无统计学意义（P>0.05）,生物膜形成量A值与MBIC值没有相关性。随着生物膜形成能力增强,左氧氟沙星和亚胺培南对菌株的MBIC/MIC比值增加（P<0.05）,生物膜形成量A值与MBIC/MIC比值呈正相关（LEV:rs=0.353,P<0.001;IPM:rs=0.290,P=0.002）。头孢他啶对生物膜形成能力不同的菌株的MBIC/MIC比值差异无统计学意义（P>0.05）,生物膜形成量A值与MBIC/MIC比值没有相关性。9. 临床鲍曼不动杆菌生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、bfm R、csu A、csu AB、csu C、csu D、csu E的检出率分别为81.5%、85.4%、83.8%、98.5%、80.8%、83.8%、90.0%、90.8%、90.0%。生物膜阳性菌株除bfm S外的其余生物膜相关基因检出率均高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜阳性菌株的生物膜相关基因检出数目显着高于阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株之间各生物膜相关基因检出率和检出数目差异均无统计学意义（P>0.05）。10.130株临床鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因blaPER、blaTEM、blaNDM、blaAmp C、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like检出率分别为3.8%、24.6%、3.1%、87.7%、55.4%、0.8%、80.8%、3.8%,未检出blaKPC、blaSHV、blaGES、blaVEB、bla IMI、bla CTX-M、bla VIM、bla IMP、bla SPM、bla GIM、bla SIM。bla TEM-1、bla Amp C、bla OXA-23-like和blaOXA-51-like基因在XDR菌株和MDR菌株中的检出率均显着高于非MDR菌株（P<0.05）,在MDR菌株与XDR菌株间检出率差异无统计学意义（P>0.05）;blaNDM-1基因阳性菌株均为MDR,头孢他啶对其MIC均>1024μg/m L;blaTEM-1、blaAmp C、blaOXA-23-like和blaOXA-51-like基因阳性菌株对内酰胺类抗菌素的耐药率显着高于阴性菌株（P<0.05）,携带blaTEM-1或blaOXA-23-like基因的菌株对头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南的耐药率达100%;头孢他啶对blaTEM-1基因阳性菌株的MIC、MBIC值显着高于基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC/MIC比值无差异（P>0.05）,对blaAmp C基因阳性菌株与阴性菌株的MIC、MBIC、MBIC/MIC比值无差异（P>0.05）;头孢他啶和亚胺培南对blaOXA-23基因阳性菌株的MIC和MBIC值显着高于阴性菌株,MBIC/MIC比值均显着低于基因阴性菌株（P<0.05）;头孢他啶和亚胺培南对blaOXA-51-like基因阳性菌株的MIC值显着高于基因阴性菌株,MBIC/MIC比值均显着低于基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC值无差异（P>0.05）。11.临床鲍曼不动杆菌主动外排泵基因ade B、ade G、ade J、ade R、ade S检出率分别为76.9%、68.5%、97.7%、3.8%、73.8%。未检出abe M基因。MDR菌株和XDR菌株的ade B、ade G、ade R、ade S、ade B+ade R+ade S和ade B+ade G+ade J检出率显着高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株之间无差异。ade B、ade G和ade R+ade S基因阳性菌株对13种临床常用抗菌素的耐药率显着高于相应基因阴性菌株（P<0.05）。左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对ade B、ade R+ade S基因阳性菌株的MIC和MBIC显着高于相应基因阴性菌株,左氧氟沙星和亚胺培南对ade B、ade R+ade S基因阳性菌株的MBIC/MIC比值显着低于相应基因阴性菌株（P<0.05）,头孢他啶对ade R+ade S基因阳性菌的MBIC/MIC比值显着低于基因阴性菌株（P<0.05）,头孢他啶对ade B基因阳性和基因阴性菌株的MBIC/MIC比值无差异。左氧氟沙星和亚胺培南对ade G阳性菌株的MIC和MBIC值显着高于基因阴性菌株,左氧氟沙星对ade G阳性菌株的MBIC/MIC比值显着低于基因阴性菌株（P<0.05）,亚胺培南的MBIC/MIC比值无差异。头孢他啶对ade G阳性菌株的MIC、MBIC和MBIC/MIC比值与阴性菌株相比差异均无统计学意义（P>0.05）。12.临床鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ia、aac（6′）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3′）-Ia和arm A基因检出率分别为3.8%、16.9%、15.4%、43.8%和52.3%。MDR菌株和XDR菌株的aac（6′）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3）-Ia和arm A基因检出率均显着高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株间差异无统计学意义。aac（3）-Ia基因阳性和基因阴性菌株间,对阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素的耐药率无差异（P>0.05）,aac（6’）-Ib、aph（3’）-Ia和arm A基因阳性菌株对阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素的耐药率显着高于相应基因阴性菌株（P<0.05）,ant（3"）-Ia基因阳性菌株对妥布霉素、庆大霉素的耐药率都高于基因阴性菌株（P<0.05）,对阿米卡星的耐药率无差异（P>0.05）。ant+aph+aac基因阳性菌株对庆大霉素和妥布霉素的耐药率显着高于未携带这三种修饰酶基因或携带基因≤2种的菌株（P<0.05）,对阿米卡星的耐药率无差异（P>0.05）。13.临床鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药相关基因gyr A和par C的检出率分别为86.2%和97.7%,gyr A和par C基因的突变率均≥99%,74株菌存在gyr A基因第83位氨基酸Ser→Leu突变,69株菌存在par C基因第80位氨基酸Ser→Leu突变。gyr A基因Ser83→Leu83突变菌株和par C基因Ser80→Leu80突变菌株对喹诺酮类抗菌素的耐药率均显着高于相应基因未突变菌株（P<0.05）,gyr A基因Ser83→Leu83和par C基因Ser80→Leu80双位点突变菌株对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为100%。MDR菌株和XDR菌株的gyr A基因Ser83→Leu83突变、par C基因Ser80→Leu80突变以及双位点突变检出率均显着高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。左氧氟沙星对gyr A基因Ser83→Leu83突变菌株和par C基因Ser80→Leu80突变菌株的MIC和MBIC值均显着高于相应基因未突变菌株,MBIC/MIC比值均显着低于相应基因未突变菌株（P<0.05）。14.临床鲍曼不动杆菌外膜孔蛋白基因omp A和car O检出率分别为100%和70.8%。MDR菌株和XDR菌株的car O基因检出率显着高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株间差异无统计学意义;car O基因阳性菌株对13种临床常用抗菌素的耐药率显着高于car O基因阴性菌株（P<0.05）;左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对car O基因阳性菌株的MIC、MBIC值显着高于car O基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC/MIC比值显着低于car O基因阴性菌株（P<0.05）。15.临床鲍曼不动杆菌XDR菌株和MDR菌株生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB和csu E检出率均显着高于非MDR菌株（P<0.05）,XDR菌株csu C和csu D的检出率均显着高于非MDR菌株（P<0.05）,XDR菌株与MDR菌株间差异无统计学意义。aba I阳性菌株和csu A阳性菌株对这13种常用抗菌素的耐药率均显着高于相应基因阴性菌株,bap阳性菌株、bfm S阳性菌株、csu AB阳性菌株和csu C+csu D+csu E阳性菌株对除头孢哌酮/舒巴坦外的12种常用抗菌素的耐药率均显着高于相应基因阴性菌。左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对生物膜相关基因阳性菌株的MIC和MBIC值几乎都显着高于生物膜相关基因阴性菌株,MBIC/MIC比值显着低于生物膜相关基因阴性菌株或无差异。16.临床鲍曼不动杆菌耐药相关基因blaTEM、blaOXA-23、ade B、arm A、aph（3’）-Ⅰa和gyr A-ser→leu80阳性菌株的生物膜形成能力显着强于相应基因阴性菌株（P<0.05）。在130株临床鲍曼不动杆菌中,随着生物膜形成能力增强,blaOXA-23、arm A、aph（3’）-Ⅰa和gyr A-ser→leu80基因的检出率显着升高（P<0.05）。在79株多重耐药鲍曼不动杆菌中aph（3′）-Ⅰa基因的检出率随生物膜形成能力增强而升高,在生物膜中阳性和强阳性菌株中aph（3’）-Ⅰa基因的检出率显着高于生物膜弱阳性和阴性菌株（P<0.05）。结论:1.鲍曼不动杆菌耐药情况严重,住院天数超过30天、气管切开/插管是引起MDR-AB感染的独立危险因素。2.鲍曼不动杆菌ATCC19606在LB肉汤培养基中37℃微孔内培养48h形成的生物膜量最大,可作为临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力测定的实验条件。3.绝大多数临床鲍曼不动杆菌都能形成生物膜,鲍曼不动杆菌生物膜问题值得重视。同一菌株的生物膜态菌比浮游态菌的耐药能力更强。4.多重耐药鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力更强,生物膜阳性鲍曼不动杆菌耐药能力（多重耐药性、耐药率、MIC、MBIC、MBIC/MIC比值）比生物膜阴性菌株强,生物膜形成能力强弱与耐药能力（耐抗菌素数目、对复方新诺明耐药率、MBIC、MBIC/MIC比值）强弱呈正相关。头孢哌酮/舒巴坦是治疗生物膜阳性鲍曼不动杆菌感染的有效药物。5.生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB、csu C、csu D和csu E与鲍曼不动杆菌生物膜形成密切相关,但与细菌生物膜形成能力强弱无关。aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB、csu C+csu D+csu E基因与鲍曼不动杆菌耐药能力（耐药率、MIC和MBIC）强弱呈正相关,与多重耐药性相关,但与多重耐药性能力强弱无关。6.耐药相关基因blaTEM-1、blaAmp C、blaOXA-23-like、blaOXA-51-like、blaNDM-1、ade B、ade G、ade R、ade S、aac（6’）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3’）-Ia、arm A、car O、gyr A-Ser83→Leu83突变和par C-Ser80→Leu80突变与鲍曼不动杆菌的耐药能力（耐药率、MIC和MBIC）呈正相关,与菌株的多重耐药性有关,但与多重耐药能力强弱无关。blaOXA-23、arm A、aph（3’）-Ⅰa、gyr A-ser→leu80与鲍曼不动杆菌生物膜形成能力呈正相关,aph（3’）-Ⅰa与生物膜形成能力正相关性强。
罗理[6]（2017）在《氟苯尼考和恶喹酸在鳜体内的药动学研究》文中研究指明鳜（Siniperca chuatsi）,俗称桂花鱼等,是中国特产的一种名贵的淡水经济鱼类,通常被誉为―淡水石斑‖,而在实际生产上,常见的各种细菌性疾病往往严重影响了该品种养殖业的发展。氟苯尼考和恶喹酸作为重要的渔用药物被广泛使用,但现时国内外均暂未发现氟苯尼考和恶喹酸对鳜的药动学和残留规律等相关研究,本实验以鳜为主要实验动物,使用高效液相色谱检测的方法进行氟苯尼考和恶喹酸在鳜体内的吸收、分布及消除规律的研究,为在鳜的病害防控中合理使用药物和降低残留风险等提供科学依据。在（28±2）℃水温下以12 mg/kg的给药剂量对鳜进行氟苯尼考单剂量口灌给药和连续3 d每天两次的连续口灌给药,以20 mg/kg的给药剂量对鳜进行恶喹酸单剂量口灌给药和连续3 d每天一次的连续口灌给药,给药后分别采集鳜的血浆、肌肉、肝脏和肾脏,通过HPLC方法进行检测,使用DAS3.2软件中非房室模型进行分析。结果显示,鳜单次口服氟苯尼考药后吸收和分布良好,曲线出现―双峰‖现象,Tmax均为4 h;血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的峰浓度Cmax分别为10.42、7.62、5.55和3.18 mg/L（kg）;药时曲线下面积AUC0-t分别为166.57、121.56、107.38和84.30 mg·h/L。鳜多次口服氟苯尼考后,药物在血液中消除速率最快肝脏最慢,在肌肉中代谢消除良好,血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的消除半衰期t1/2z分别为10.55、22.95、25.09和11.36 h,肝脏>肌肉>肾脏>血浆。建议在生产养殖中可以按12 mg/kg剂量的氟苯尼考对鳜进行给药,每隔12 h给药一次,连续35 d。鳜单次口服恶喹酸后在各组织中分布良好,在血液中能维持较高的药物水平,在各组织中药时曲线趋势一致,Tmax均为12 h;Cmax分别为9.29、1.15、3.54和7.82 mg/L;AUC0-t分别为316.77、18.00、89.83和224.42 mg·h/L。鳜多次口服恶喹酸后,血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的消除半衰期t1/2z分别为6.53、12.03、9.68和17.47 mg/L（kg）,肾脏>肌肉>肝脏>血浆,肾脏是鳜对恶喹酸代谢的主要器官。建议生产养殖中可以按20 mg/kg剂量的恶喹酸对鳜进行给药,首次给药后每隔2d给药一次,连续6d以上。研究结果综合说明,氟苯尼考对鳜给药具有吸收分布均匀、代谢消除快、用药量较低和休药时间短等特点,非常适合应用于养殖中鳜鱼的细菌性病害的防控;而恶喹酸对鳜给药吸收分布良好,代谢消除强、残留风险较低等特点,同样比较适合用来防治鳜出现的细菌性疾病。
彭志锋[7]（2017）在《鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建》文中进行了进一步梳理鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis,G.amatis）是一种革兰氏阴性菌,为巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种。鸭源鸡杆菌感染蛋鸡后往往造成以腹膜炎和输卵管炎为主的病理变化,导致蛋鸡产蛋量下降、死亡率升高。该菌的多重耐药性使得抗生素治疗鸭源鸡杆菌病的效果不甚理想。用目前部分已知致病因子作为抗原的传统疫苗均无法提供理想的保护效果。新型疫苗的研制是当前鸭源鸡杆菌病防控研究的重点,而鸭源鸡杆菌致病因子及致病机理的研究和鉴定是迫切需要解决的关键问题。外膜蛋白W（Outer membrane protein W,OmpW）在革兰氏阴性菌生物被膜形成、黏附、耐应激中发挥重要作用;菌毛通常在细菌黏附宿细中发挥关键作用。但这两个因子在鸭源鸡杆菌的具体作用还未被阐明。为了解OmpW及菌毛在鸭源鸡杆菌各种生物学功能中的作用,进一步阐明该菌的致病机理,本研究进行了以下几个方面的研究。主要研究结果报告如下:1.鸭源鸡杆菌ompW缺失菌株ΔompW的构建及生物学特性研究鉴于外膜蛋白在革兰氏阴性细菌的黏附、抗应激、耐药等各种生物学功能中发挥重要作用,本研究利用M-IV培养基制备鸭源鸡杆菌感受态细胞,用自然转化法将上下游同源臂和氯霉素抗性基因组构成的线性打靶序列转化鸭源鸡杆菌感受态细胞,PCR和Western Blotting鉴定表明成功构建了owpW缺失菌株AompW。然后比较了鸭源鸡杆菌RZ和AompW的生长性能及溶血活性,发现ompW缺失对鸭源鸡杆菌的生长速度、菌落形态大小及溶血活性没有影响,表明OmpW不参与鸭源鸡杆菌的这些生物学特性。最后应用微量稀释法测定了 12种抗菌药物对鸭源鸡杆菌RZ和AompW的MIC,结果显示相比鸭源鸡杆菌亲本菌株,AompW对土霉素和四环素的敏感性显着提高（p<0.01）,二者的MIC值分别降低了 8（128/16）和32（128/4）倍,表明OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用。2.RZ和AompW的抗应激研究在构建AompW的基础上,分析了鸭源鸡杆菌RZ和AompW在不同NaCl浓度培养基中的生长情况,并用SDS-PAGE和Western Blotting分析鸭源鸡杆菌外膜蛋白的表达水平,最后用RT-qPCR分析了不同盐度下鸭源鸡杆菌OmpW mRNA的转录水平的差异。结果显示在高盐培养基（3%NaCl）中两者的对数期推迟,生长均受到影响,但RZ的生长速度高于AompW的生长速度;随着培养时间时间增加,AompW的生长受到的影响更大。表明RZ比AompW更耐受高渗透环境,AompW的生长受高渗透环境影响更大。与正常BHI培养时相比,RZ在高NaCl含量BHI培养时OmpW的表达被上调,与此对应的是鸭源鸡杆菌也上调了 OmpW mRNA的转录水平,提示OmpW可能在鸭源鸡杆菌抵抗渗透应激中发挥一定作用。在热应激、渗透压力及氧化应激环境下,AompW均低于RZ对应激的抵抗率,表明OmpW与抗应激能力有一定的相关性。3.RZ和AompW抗血清杀菌机制研究本研究分析了 RZ和AompW在血清含量不同的培养基中的生存率,随后用Western Blotting和RT-qPCR分别分析了两者在不同血清浓度下的OmpW表达水平及其mRNA转录水平。结果表明RZ和ΔompW在低浓度血清中的生存率差别不显着（p>0.05）,随着血清含量增加,ΔompW的生存能力逐渐低于RZ的生存能力;该结果提示OmpW可能在鸭源鸡杆菌抗血清杀菌活性中发挥重要作用。为进一步阐明鸭源鸡杆菌OmpW在抵抗补体杀菌活性中的作用,笔者将RZ与鸡正常血清或热灭活血清一起孵育,用Western Blotting方法分析了 OmpW的变化。与对照组相比（灭活血清处理）,细菌用鸡正常血清处理后其OmpW的表达及其mRNA的转录升高;上述结果表明OmpW与该菌抵抗补体介导的杀菌活性有关。为初步探索鸭源鸡杆菌抵抗补体杀菌的通路,将RZ和AompW分别与鸡血清+EDTA（抑制所有补体通路）或血清+EGTA-Mg2+（仅允许补体旁路通路激活）。结果显示EDTA存在时,两株细菌的生存率几乎没有差异,而且与对照组细菌的生存率相似;血清中加入EGTA-Mg2+时,两株细菌的生存率均降低,说明补体旁路通路介导了补体杀菌活性;血清中加入EGTA-Mg2+时,ΔompW的生存率明显低于RZ的生存率（p<0.05）。这些结果提示OmpW通过抑制旁路通路发挥抗补体杀菌活性。4.RZ和ΔompW致病性的研究分析了 RZ和ΔompW对小鼠的半数致死量（Median lethal dose,LDso）及小鼠感染后的生存能力。结果显示RZ和AompW对小鼠LD50分别为2.93 ×108CFU和4.08×108CFU;相对于RZ,ompW缺失使ΔompW对小鼠的LD50提高;ΔompW感染组小鼠的生存率高于RZ感染组小鼠的生存率,两组小鼠在临床症状上没有眼观差异;小鼠的病理变化主要包括肠道肠壁变薄且透明,肠、肺脏、肝脏和脾脏出血,但两组小鼠的病理变化无肉眼可见差异。上述结果表明ompW缺失导致鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力有降低,但差异很小。随后测定了 RZ和AompW生物被膜形成能力和对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附性能,结果显示二者形成生物被膜能力均较弱,无显着差异（p>0.05）;两者黏附鸡原代输卵管上皮细胞的数量随着孵育时间增加而增加,ΔompW的黏附数量低于RZ的黏附数量,但差异不显着（p>0.05）。上述结果表明OmpW参与了鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附,对生物被膜形成影响很小。5.鸭源鸡杆菌菌毛结构蛋白缺失菌株ΔflfA的构建及生物学特性研究利用上述自然转化法,用上下游同源臂和氯霉素抗性基因构成的线性打靶片段转化鸭源鸡杆菌感受态细胞,PCR和Western Blotting鉴定阳性转化子,结果显示突变菌株不表达菌毛结构蛋白,成功构建了菌毛结构蛋白缺失菌株ΔflfA;随后分析了鸭源鸡杆菌RZ和ΔflfA的生长性能和鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能。结果显示FlfA的缺失没有影响鸭源鸡杆菌的生长性能和菌落形态;RZ和ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附数量随孵育时间的增加而增多,而FlfA的缺失使ΔflfA的黏附数量显着低于RZ的黏附数量（p<0.05）。表明F17样菌毛蛋白在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥关键作用。综上所述,作者用自然转化法成功构建了鸭源鸡杆菌突变菌株ΔompW和ΔflfA,不仅为OmpW和FlfA功能研究奠定了良好的基础,而且为该菌其它基因的研究将提供了可靠的技术平台。OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用;OmpW在鸭源鸡杆菌适应不同钠离子浓度中发挥重要作用,且与鸭源鸡杆菌耐受热应激和氧化应激有一定相关性;OmpW通过抑制补体旁路通路发挥抗血清杀菌活性;OmpW与鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力及对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能下降有一定的相关性;F17菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥关键作用。
李波[8]（2015）在《天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究》文中认为为了给消费者提供优质绿色的动物产品,同时提高我国畜产品的国际竞争力,研制抗生素或化学类生长促进剂的替代物是中国饲料添加剂工业面临的一个重大课题。目前认为抗生素替代品有很多,如植物提取物、微生态制剂、酶制剂以及抗菌肽等,抗菌肽的生物学特性:（1）生物学活性范围广;（2）作用迅速、效果稳定;（3）不易产生耐药性;（4）对包膜病毒、真菌、癌细胞等均有作用;（5）没有药物残留。天蚕素是从蚕蛹中分离的,属于首例发现的动物抗菌肽,在1980年,瑞典科学家G.Boman等人发现的,定名为cecropins。本论文主要筛选得到高效分泌表达天蚕素的枯草芽孢杆菌宿主菌及其中试发酵工艺优化、天蚕素的发酵液分离纯化和初步应用试验。论文的主要结果如下:（1）天蚕素在不同枯草芽孢杆菌的表达含量的比较。将表达载体分别转化入三株宿主菌株后,实现重组天蚕素异源表达,然后用SDS-PAGE和高效液相法比较三株菌株cecropin AD表达量。经SDS-PAGE和高效液相法分析,三株菌株都能产生分子量为3.8 k Da的小肽,但经过比较发现重组cecropin AD在宿主菌WB800表达效率最高,含量达到826.72μg/ml。（2）将从实验室筛选得到的宿主菌WB800进行中试发酵工艺优化。本文以枯草芽孢杆菌WB800为供试菌株,依托实验室前期工作基础以Design-Expert响应面分析软件为基础,通过其Box-Behnken Design（BBD）来设计实验方法,通过p H值、通风量、转速三个因变量的分析比较,以最终天蚕素产量为唯一响应值,通过设计实验方案,找出最佳发酵工艺条件,为CAD的工业化生产提供数据支持。通过实验我们可以得出,当发酵液的p H值达到7.60,转速达到230 r/min,其通风量达到5.00L/h的时候,天蚕素表达量会达到一个理论最高值,即979.98μg/ml,通过三次验证实际含量能达到961.52μg/ml,可以进行产业化生产。（3）以从第一章获得的能高表达量天蚕素菌种WB800为宿主菌,以第二章优化后的发酵工艺进行发酵,获得待纯化的发酵液;根据天蚕素的理化性质首先设计了纯化路线;其次是在纯化的每个步骤进行纯化填料的摸索、条件优化;最后将整个纯化工艺进行贯通,纯化出天蚕素的纯品进行检测、鉴定。研究表明:发酵液经过离子交换层析后收集到的样品用反相色谱的方法检测纯度为69.5%,疏水层析后纯度为87.4%,最终检测天蚕素纯品的纯度为100%;纯品对于G-与G+均有一定的抑制与杀灭作用。（4）将天蚕素饲料添加剂产品加到猪日粮中,观察其对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响。选取体重为8.46±0.12 kg的杜×大×长三元杂交猪360头,采用单因子完全随机设计,分为4个处理,每个处理6个重复（栏）,每个重复（栏）15头猪,对照组:基础日粮（无药物,玉米-豆粕型）;药物组:基础日粮+25 mg/kg维吉尼亚霉素+100 mg/kg土霉素+60 mg/kg硫酸抗敌素（药物以有效含量计）;天蚕素组:基础日粮+400 mg/kg天蚕素;配伍组:基础日粮+250 mg/kg天蚕素+50 mg/kg土霉素+20 mg/kg硫酸抗敌素（药物以有效含量计）,研究天蚕素对断奶仔猪生产性能和免疫功能的影响。结果表明,天蚕素组及配伍组较抗生素组及对照组在仔猪饲料转化率方面均差异显着（P<0.05）,在日增重及日采食量方面均有改善的趋势;在腹泻率及猪瘟抗体水平方面,试验各组均显着优于对照组（P<0.05）,其中对于天蚕素组平均抗体阻断率显着优于其余三个组（P<0.05）;天蚕素组在血清生化指标BUN、GLU、TP及Ig G、Ig A方面有显着改善作用（P<0.05）。（5）在北京、河北、河南等规模化猪场推广应用中,在仔猪饲料转化率方面、成活率和腹泻率均取得良好应用效果,每头猪给养殖户增加经济效益达13-16元。因此,天蚕素添加到保育猪饲料中可以部分替代吉他霉素、维吉尼亚霉素等抗G+饲用抗生素使用量和降低硫酸粘杆菌素使用量。综上所述,通过对三株枯草芽孢杆菌筛选获得了能高效表达天蚕素的菌株WB800,同时通过优化发酵工艺获得了能产业化生产的工艺条件,根据天蚕素特点摸索得到最适分离纯化工艺,并获取到100%纯品。对断奶仔猪的应用表明,能有效减少或完全取代抗生素的使用。
王静慧[9]（2012）在《血根碱对细菌生物被膜的作用研究》文中指出抗生素作为饲料添加剂,对畜禽有保健促长作用。但是它在杀灭细菌的同时,起到筛选耐药菌株的作用,抗生素滥用进一步促使细菌不断的突变,甚至形成细菌生物被膜（bacterial biofilm,BBF）,影响动物源性的食品安全。发达国家对于抗生素管理越来越严格,北欧甚至禁用抗生素,将兽药残留作为农畜禽产品在国际贸易中的技术壁垒,大大限制了我国畜牧产品国际化进程。在我国,有46.1%的抗生素用于畜牧养殖,迫切需要开发新的无药物残留、无污染、不易产生耐药性并能有效清除生物被膜的绿色抗生素替代物。血根碱（Sanguinarine）在我国资源丰富,而且使用后易降解,对环境污染小,杀菌能力强,并且有可能对生物被膜有效,欧盟已有将血根碱作为饲用抗菌物质的许多探索。因此,血根碱作为饲用添加剂的研制与开发具有非常重要的意义和广阔的市场前景。本文分析血根碱的体外抑菌作用,构建甲型副伤寒沙门氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌生物被膜,重点研究其对致病菌生物被膜的影响及作用,为血根碱成为绿色的饲用抗生素替代物打下基础。本研究的主要内容和结果如下：（1）血根碱体外抑菌试验。通过试管二倍稀释法测定不同浓度的血根碱对致病菌（金黄色葡萄球菌、侵袭性大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌）,非致病菌（枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌）的最低抑菌浓度：采用管碟法,研究血根碱对菌的抑制能力,并与国家允许添加的饲用抗生素盐酸霉素比较,结果表明：随着血根碱浓度提高,其抑菌效果逐步增加,0.32g/L的血根碱抑菌效果明显;与盐酸金霉素抑菌效果对比发现,对于致病菌（金黄色葡萄球菌、侵袭性大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌）优于盐酸金霉素,而对益生菌抑制作用较小。（2）细菌生物被膜构建。采用刚果红平板法、银染法定性结合结晶紫染色法对致病菌金黄色葡萄球菌、侵袭性大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌生物被膜鉴定和表征。结果说明成功构建了这三种菌的生物被膜。（3）血根碱对细菌生物被膜的影响。研究血根碱对金黄色葡萄球菌、侵袭性大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌生物被膜影响及作用。结果表明：刚果红平板法定性观察发现血根碱对沙门氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌生物被膜影响大于盐酸金霉素；菌落计数法定量研究,得到0.16g/L的血根碱作用后三种生物被膜上的细菌数明显减少；血根碱作用后大大减少了甲型副伤寒沙门氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌生物被膜上多糖含量；化学鉴定沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生物被膜,发现主要含有藻酸盐；分光光度法测定得到血根碱作用后,藻酸盐量减少。说明血根碱具有影响沙门氏菌、大肠杆菌生物被膜及胞外多糖的作用；采用原子力显微镜和扫描电子显微镜观测,发现血根碱还可以改变这两种生物被膜结构形态。
刘晓强[10]（2012）在《宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究》文中研究指明致病性大肠杆菌是引起人和宠物尿道感染的主要病原菌之一，氟喹诺酮类药物，特别是恩诺沙星常用于犬、猫尿道感染的治疗。然而随着氟喹诺酮类药物的广泛应用，耐药性也随之增加。大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性的发生通常呈逐步演变并常常表现为多药耐药。多药耐药性的流行会危害人和动物健康，再者，由于人类经常与小动物亲密频繁地接触，犬、猫等身上的耐药菌因此可传给人类，又可引起严重的公共卫生问题。为了进一步探讨大肠杆菌对氟喹诺酮类药物产生多药耐药性的机制，本研究分析探讨了不同代的氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性，并系统研究了细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，旨在为临床控制大肠杆菌多药耐药性提供理论依据。具体获得以下结果：1.喹诺酮类药物对犬、猫尿道大肠杆菌的体外抗菌活性。体外抗菌活性试验研究了11种喹诺酮类药物（分别代表四代：萘啶酸为第一代；恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星为第二代；奥比沙星和麻保沙星为第三代；加替沙星、普拉多沙星和莫西沙星为第四代）对犬、猫尿道大肠杆菌的体外效能和效力。效能评价指标包括最小抑菌浓度（MIC）和最小防突变浓度（MPC，不包括对喹诺酮类耐药的菌株）。效力评价指标包括相对敏感性，即每个药物的敏感性折点（MICBP-S）与每个药物的MIC的比值（MICBP-S﹕MIC），相对耐药性，即MIC与耐药性折点的比值（MIC﹕MICBP-R）以及突变选择窗（MSW），即MPC与MIC的比值（MPC﹕MIC）。以恩诺沙星作为参照菌，对于恩诺沙星敏感菌，第四代氟喹诺酮类药物和环丙沙星的MIC50和MIC90最小，而萘啶酸、恩诺沙星和奥比沙星的MIC50和MIC90最大（P=0.006）。普拉多沙星的MPC最小（0.29±0.16μg/mL）而氧氟沙星的MPC浓度最大（1.56±0.53μg/mL）（P=0.006）。MSW对于普拉多沙星最小（54.79±30.45）而环丙沙星的最大（152.29±76.04）（P=0.0024）。相对敏感性（MICBP-S﹕MIC）对于普拉多沙星最高（190.1±0.61）而对萘啶酸的敏感性最低（5.33±0.52）（P=0.025）。对于氟喹诺酮类敏感菌，相对耐药性（MIC﹕MICBP-R）可以替代MPC来评估药物的耐药性。此外，本研究98.76%的菌株对于受试喹诺酮类药物具有交叉耐药性。对氟喹诺酮类药物的体外杀菌曲线特点的研究表明，受试的氟喹诺酮类药物均呈现了浓度依赖的特征。2.不同耐药表型大肠杆菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV的基因突变及质粒流行情况。以恩诺沙星为参照药物，可以发现，DNA促旋酶和拓扑异构酶IV突变数量能够以渐近的方式与MICs水平联系起来。没有gyrB基因突变被发现。且在NDR或SDR菌株未检测到gyrA、parC和parE基因突变。gyrA基因的单个突变（Ser83Leu）会降低细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性，此后，随着突变数目的增加，大肠杆菌开始出现耐药性，耐药水平从低水平（恩诺沙星MICs4-16μg/ml）到高水平（恩诺沙星MICs≥128μg/ml）。这些发现证实DNA促旋酶的突变是氟喹诺酮类引起犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药菌发生耐药的必要步骤。qnrS和aac（6’）-Ib-cr在泛耐药（PDR）菌株普遍出现（62%），表明这两种质粒介导的耐药基因在多药耐药菌和高水平耐药菌的形成过程中发挥了作用。进化分析研究表明52株细菌中的31株属于系统进化群D群物，15株属于B1群，3株属于B2群，3株属于A群。未发现系统进化群与耐药机制之间的规律性关系。由于受试菌株样本数的数量有限，本次研究未发现ST131克隆株的存在。3.不同耐药表型大肠杆菌的外排泵基因acrB及调节因子的表达大肠杆菌的主要外排泵acrB在不同耐药表型中的表达结果显示，acrB基因在所有受试菌株均有表达，其中在ENRR-MDR菌株中的表达量最大，接下来依次为ENRS-MDR、SDR和NDR菌株。acrB基因在NDR和SDR菌株未出现过量表达，而在20/27株ENRR-MDR菌株以及6/11株ENRS-MDR菌株过量表达。NDR或SDR菌株中的acrB基因表达水平无显着性差异（P＞0.05），而差异在ENRS-MDR菌株开始增加（P=0.073），其表达量在所有的恩诺沙星敏感菌和ENRR-MDR有极显着差异（P<0.001）。此外，acrB基因表达量在高水平、中度、低水平耐药菌和氟喹诺酮类敏感菌之间具有显着性差异（P=0.014）。对于大多数多药耐药菌（MDR），acrB基因的表达随着耐药表型的严重性而增加，换句话说，MDR表型越严重，即耐药的种类越多，则acrB基因表达量会更高。对于marA基因，其在6株ENRR-MDR菌株和3株ENRS-MDR菌株中表达增加，包括两株acrB表达增加和1株SoxS表达量提高的ENRS-MDR菌株。此外，SoxS在3株ENRR-MDR菌过量表达，且与acrB的过量表达相关。膜孔蛋白ompF基因在8株细菌中表达量增加，而在44株中的表达量下降，包括24株ENRR-MDR菌株和20株ENRS-MDR菌株。4.不同氟喹诺酮类药物对外排泵表达的影响qRT-PCR结果显示四种外排泵在ENRS-MDR菌株和ENRR-MDR菌株中均有表达，其中以emrE和acrB的表达相对明显。各外排泵在ENRR-MDR菌株中的表达量高于ENRS-MDR菌株。细菌在氟喹诺酮类药物压力下，四种外排泵的表达量显着升高。在ENRS-MDR菌株，emrE外排泵表达量增加了1.12-5.4倍，acrB外排泵基因表达量提高了1.23-3.60倍，macB基因表达提高了1.40-6.58倍，cmr基因表达量增加了1.52-5.91倍。对于ENRR-MDR菌株，四种相应的外排泵基因表达量分别增加1.22-5.87倍、1.04-2.94倍、1.34-6.29倍和1.47-5.77倍。不同的氟喹诺酮类药物压力对外排泵基因表达的影响也有差异，其中以恩诺沙星最为明显，接下来依次为环丙沙星、奥比沙星、麻保沙星、莫西沙星、加替沙星和普拉多沙星。这种规律基本和这几种氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性的强弱相一致。另外，四种外排泵基因在大肠杆菌中的表达也有差异，其中以emrE的表达最为显着，其次为acrB基因表达> macB基因表达> cmr基因表达。我们的研究首次证明，和其它几个受试外排泵相比较，emrE基因的表量增加最多。细菌和低剂量的氟喹诺酮类药物接触会引起外排泵的迅速而明显地升高。表明日常使用氟喹诺酮类药物治疗犬、猫尿道感染应慎重。5.体外诱导宠物源大肠杆菌对普拉多沙星的耐药性及机制采用体外浓度递增法可诱导犬、猫尿道大肠杆菌对普拉多沙星、环丙沙星和麻保沙星产生耐药性，耐药性产生的快慢依次为环丙沙星、麻保沙星和普拉多沙星。和环丙沙星和麻保沙星一样，普拉多沙星诱导的耐药菌首先在gyrA基因发生突变，此后随着MIC的升高，靶基因突变的数目也逐渐在增多。另外，分别有4个由环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药突变株的SoxS发生Ala12Ser突变，而该突变在普拉多沙星诱导的耐药株中未检测到。acrB基因在所有诱导的耐药菌株均有不同程度的过量表达，且在环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药株中的表达高于普拉多沙星所诱导的耐药株中的表达。另外，acrB基因的表达随MIC的升高和多药耐药的程度的增加而增加。结论：普拉多沙星所引起的犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药性主要由靶基因点突变和外排泵过量表达组合所导致。
二、我国法定饲用抗菌药物的生物学特性(续)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国法定饲用抗菌药物的生物学特性(续)（论文提纲范文）
（1）高寒植物缩合单宁季节变化及其在抑制牦牛瘤胃甲烷排放中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 单宁的结构分类和特性 |
| 1.2 单宁的生物学功能 |
| 1.2.1 抗氧化性 |
| 1.2.2 抗菌作用 |
| 1.3 对反刍动物瘤胃微生物及发酵特性的影响 |
| 1.3.1 单宁对反刍动物瘤胃微生物区系的影响 |
| 1.3.2 对反刍动物瘤胃甲烷排放的影响 |
| 1.3.3 对反刍动物过瘤胃蛋白的影响 |
| 1.4 对反刍动物健康和生长的影响 |
| 1.5 研究思路 |
| 1.5.1 研究意义和目的 |
| 1.5.2 研究技术路线 |
| 第二章 不同月份高寒植物中营养物质含量变化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 营养物质的测定 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 高寒植物中干物质动态变化 |
| 2.2.2 高寒植物中粗蛋白动态变化 |
| 2.2.3 高寒植物中中性洗涤纤维动态变化 |
| 2.2.4 高寒植物中酸性洗涤纤维动态变化 |
| 2.2.5 高寒植物中粗灰分动态变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 高寒植物中粗蛋白动态变化 |
| 2.3.2 高寒植物中NDF和 ADF动态变化 |
| 2.3.3 高寒植物中干物质和粗灰分的动态变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 不同月份高寒植物中酚类物质含量变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验样品的采集和处理 |
| 3.1.3 实验仪器与主要试剂 |
| 3.1.4 标准曲线的绘制 |
| 3.1.5 单宁提取液的制备 |
| 3.1.6 总酚含量的测定 |
| 3.1.7 简单酚和单宁的测定 |
| 3.1.8 缩合单宁的测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高寒植物中总酚含量的动态变化 |
| 3.2.2 高寒植物中简单酚含量的动态变化 |
| 3.2.3 高寒植物中单宁含量动态变化 |
| 3.2.4 高寒植物中缩合单宁含量的动态变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 高寒植物中总酚含量的动态变化 |
| 3.3.2 高寒植物中简单酚和单宁含量的动态变化 |
| 3.3.3 高寒植物中缩合单宁含量的动态变化 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 两种富含缩合单宁的高寒灌木对体外发酵指标的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 高原植物样品采集及处理 |
| 4.1.2 瘤胃液的采集 |
| 4.1.3 体外发酵的试验装置 |
| 4.1.4 人工瘤胃培养液的制备 |
| 4.1.5 人工培养液分装步骤 |
| 4.1.6 气体样品的采集及甲烷测定 |
| 4.1.7 体外发酵参数及干物质消化率测定 |
| 4.1.8 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 体外产气量及甲烷产量 |
| 4.2.2 体外DM和N消化率 |
| 4.2.3 发酵液中pH、挥发性脂肪酸和NH_3-N含量 |
| 4.2.4 酚类化合物、体外产气与消化率的相关性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 两种植物对体外发酵过程中产气量的影响 |
| 4.3.2 两种植物体外发酵的干物质消化率 |
| 4.3.3 两种植物体外发酵的氮消化率 |
| 4.3.4 两种植物对体外发酵中pH、NH_3-N和 VFA的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 两种富含缩合单宁的高寒灌木对瘤胃微生物影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 基因组DNA提取 |
| 5.1.2 PCR扩增与建库 |
| 5.1.3 16S rRNA基因测序及分析 |
| 5.1.4 细菌和古菌群落多样性分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 测序读取和扩增序列 |
| 5.2.2 体外发酵中细菌16S rRNA测序数据分析 |
| 5.2.3 体外发酵产甲烷的古菌16S rRNA测序数据分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 体外发酵对细菌的影响 |
| 5.3.2 体外发酵对甲烷菌的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 瘤胃液VFA测定方法 |
| 附录 B 瘤胃液氨态氮测定方法 |
| 附录 C pH测定方法 |
| 附录 D 瘤胃液微生物DNA的PCR扩增方法 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）盐酸小檗碱对AGEs介导下人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人牙周膜干细胞的培养和成骨鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 AGEs对hPDLSCs成骨分化潜能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化潜能的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 BBR对AGEs干扰下hPDLSCs成骨分化影响的相关机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 文献综述 盐酸小檗碱生物学功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）以IGPD为靶标探究异甘草素对木糖葡萄球菌抗菌作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 凝固酶阴性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎 |
| 1.1.1 凝固酶阴性葡萄球菌 |
| 1.1.2 凝固酶阴性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎 |
| 1.1.3 木糖葡萄球菌引起的奶牛乳房炎 |
| 1.1.4 奶牛乳房炎的治疗以及面临的问题 |
| 1.2 咪唑甘油磷酸酯脱水酶的研究进展 |
| 1.2.1 L-组氨酸的生物合成 |
| 1.2.2 咪唑甘油磷酸酯脱水酶 |
| 1.2.3 IGPD的分子结构 |
| 1.2.4 IGPD抑制剂 |
| 1.3 异甘草素的药理作用研究进展 |
| 1.3.1 异甘草素的抗炎作用 |
| 1.3.2 异甘草素的抗氧化作用 |
| 1.3.3 异甘草素的抗病原微生物作用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 受试菌株 |
| 2.1.2 药品 |
| 2.1.3 试剂及培养基 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 异甘草素对木糖葡萄球菌体外最小抑菌浓度测定 |
| 2.2.2 异甘草素对木糖葡萄球菌时间-杀菌曲线测定 |
| 2.2.3 异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的作用 |
| 2.2.4 异甘草素对木糖葡萄球菌IGPD的调控 |
| 2.2.5 异甘草素与IGPD的相互作用验证 |
| 2.2.6 异甘草素对木糖葡萄球菌野生株及hisB基因缺失株L-组氨酸含量的影响 |
| 2.2.7 异甘草素对小鼠乳房炎的治疗 |
| 2.2.8 数据计算及统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 异甘草素对木糖葡萄球菌的抗菌活性 |
| 3.1.1 异甘草素对木糖葡萄球菌MIC值的测定 |
| 3.1.2 异甘草素对木糖葡萄球菌生长的影响 |
| 3.2 异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的作用 |
| 3.2.1 异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用 |
| 3.2.2 异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜形态的影响 |
| 3.3 异甘草素对木糖葡萄球菌IGPD的调控作用 |
| 3.3.1 异甘草素对木糖葡萄球菌hisB基因的影响 |
| 3.3.2 异甘草素对木糖葡萄球菌IGPD蛋白表达的影响 |
| 3.4 异甘草素与IGPD的直接作用 |
| 3.4.1 异甘草素与IGPD的直接结合验证 |
| 3.4.2 异甘草素对木糖葡萄球菌IGPD活性的影响 |
| 3.4.3 异甘草素与IGPD结合靶位的验证 |
| 3.5 异甘草素对木糖葡萄球菌野生株及hisB基因缺失株L-组氨酸含量的影响 |
| 3.6 异甘草素对小鼠乳房炎的治疗 |
| 3.6.1 小鼠病理剖检观察 |
| 3.6.2 小鼠乳腺病理组织学观察 |
| 3.6.3 小鼠乳腺组织中木糖葡萄球菌计数 |
| 3.6.4 小鼠乳腺组织炎性因子水平检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 异甘草素对木糖葡萄球菌的抑菌作用 |
| 4.2 异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用 |
| 4.3 异甘草素和IGPD的相互作用 |
| 4.3.1 异甘草素对IGPD的调控作用 |
| 4.3.2 异甘草素与IGPD相互作用的验证 |
| 4.4 异甘草素对小鼠乳房炎模型的治疗作用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）猪源产生物被膜乳酸菌的筛选及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 益生菌研究进展 |
| 1.1 益生菌的概述 |
| 1.2 乳酸菌的概述 |
| 1.3 乳酸菌的主要分类 |
| 1.4 乳酸菌的生物学特性 |
| 1.5 乳酸菌的益生作用 |
| 第二章 细菌生物被膜研究进展 |
| 2.1 生物被膜的概述 |
| 2.2 被膜态与浮游态细菌的差异性比较 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪源产生物被膜乳酸菌的筛选 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 益生乳酸菌部分生物学特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 被膜态和浮游态乳酸菌上清液抑菌活性比较分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）临床鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药能力的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语对照表 |
| 引言 |
| 第一章 鲍曼不动杆菌耐药性及感染者临床特征分析 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第二章 鲍曼不动杆菌生物膜形成实验条件摸索 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第三章 临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药能力的关系研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 临床鲍曼不动杆菌生物膜相关基因、耐药相关基因与生物膜形成能力、耐药能力的关系研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 综述 鲍曼不动杆菌耐药能力与生物膜形成能力关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（6）氟苯尼考和恶喹酸在鳜体内的药动学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 氯霉素类与喹诺酮类药物的性质 |
| 1.1.1 氯霉素类主要药物介绍 |
| 1.1.2 喹诺酮类主要药物介绍 |
| 1.2 药动学研究现状 |
| 1.2.1 氟苯尼考在水产动物中的药动学研究 |
| 1.2.2 恶喹酸在水产动物中的药动学研究 |
| 1.3 抗菌活性与药效学 |
| 1.3.1 氟苯尼考的抗菌活性与药效学 |
| 1.3.2 恶喹酸的抗菌活性与药效学 |
| 1.4 研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 2.4 色谱条件及测定方法 |
| 2.4.1 氟苯尼考的色谱条件及测定方法 |
| 2.4.2 恶喹酸的色谱条件及测定方法 |
| 2.5 实验设计 |
| 2.5.1 氟苯尼考实验设计 |
| 2.5.2 恶喹酸实验设计 |
| 2.6 样品处理方法 |
| 2.6.1 氟苯尼考样品处理方法 |
| 2.6.2 恶喹酸样品处理方法 |
| 2.7 回收率测定 |
| 2.7.1 氟苯尼考回收率测定 |
| 2.7.2 恶喹酸回收率测定 |
| 2.8 精密度的确定 |
| 2.8.1 氟苯尼考精密度的确定 |
| 2.8.2 恶喹酸精密度的确定 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 标准曲线、相关系数、回收率及最低检测线 |
| 3.1.1 氟苯尼考标准曲线、相关系数、回收率及最低检测线 |
| 3.1.2 恶喹酸标准曲线、相关系数、回收率及最低检测线 |
| 3.2 氟苯尼考在鳜体内药动学结果与分析 |
| 3.2.1 单次给药下氟苯尼考在鳜体内药动学的药-时曲线 |
| 3.2.2 单次给药下氟苯尼考在鳜体内的药动学参数 |
| 3.2.3 多次给药下氟苯尼考在鳜体内药动学药-时曲线 |
| 3.2.4 多次给药下氟苯尼考在鳜体内的药动学参数 |
| 3.3 恶喹酸在鳜体内药动学结果与分析 |
| 3.3.1 单次给药下恶喹酸在鳜体内药动学药-时曲线 |
| 3.3.2 单次给药下恶喹酸在鳜体内的药动学参数 |
| 3.3.3 多次给药下恶喹酸在鳜体内药动学的药-时曲线 |
| 3.3.4 多次给药下恶喹酸在鳜体内的药动学参数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 氟苯尼考在鳜体内药动学研究 |
| 4.1.1 氟苯尼考在鳜体内的吸收和分布 |
| 4.1.2 氟苯尼考在鳜体内的代谢和消除 |
| 4.1.3 氟苯尼考临床用药建议 |
| 4.2 恶喹酸在鳜体内的药动学研究 |
| 4.2.1 恶喹酸在鳜体内的吸收和分布 |
| 4.2.2 恶喹酸在鳜体内的代谢和消除 |
| 4.2.3 恶喹酸临床用药建议 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间所获科研成果 |
（7）鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 鸭源鸡杆菌 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.2 禽类鸭源鸡杆菌感染现状 |
| 1.3 鸭源鸡杆菌种群演化动态 |
| 1.4 鸭源鸡杆菌的传播途径 |
| 1.5 鸭源鸡杆菌的致病性 |
| 1.6 临床症状及病理变化 |
| 1.7 分子生物学检测诊断方法 |
| 1.7.1 聚合酶链式反应 |
| 1.7.2 荧光原位杂交 |
| 1.7.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 |
| 2 鸭源鸡杆菌毒力因子及其致病机理研究进展 |
| 2.1 菌毛 |
| 2.2 荚膜 |
| 2.3 生物被膜 |
| 2.4 外膜囊泡 |
| 2.5 RTX样毒素GtxA |
| 2.6 金属蛋白酶 |
| 2.7 血凝素 |
| 2.8 耐药因子 |
| 3 细菌外膜蛋白W的研究进展 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 增强细菌环境适应能力 |
| 3.3 参与耐药性的形成 |
| 3.4 具有免疫原性 |
| 3.5 与细菌致病性相关 |
| 3.6 抵抗宿主天然免疫防御 |
| 本研究目的和意义 |
| 第一部分 鸭源鸡杆菌ompW基因缺失株的构建及 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 培养基及主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要培养基及溶液的配制 |
| 2.4.1 M-IV液体培养基 |
| 2.4.2 SDS-PAGE缓冲液 |
| 2.4.3 Western Blotting缓冲液 |
| 2.5 方法 |
| 2.5.1 菌种复苏及细菌基因组DNA提取 |
| 2.5.2 质粒提取 |
| 2.5.3 鸭源鸡杆菌ompW突变菌株的构建 |
| 2.5.4 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW鉴定 |
| 2.5.5 菌株的生长特性研究 |
| 2.5.6 菌株溶血活性及生长形态观察 |
| 2.5.7 自身凝集测定 |
| 2.5.8 MIC测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 扩增出ompW基因上下游同源臂及Cmp抗性基因 |
| 3.2 成功构建出质粒pUC18-ompW-U-C-D |
| 3.3 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW的鉴定 |
| 3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及ompW基因的两端片段 |
| 3.3.2 细菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.3.3 Western Blotting检测证明ΔompW不表达OmpW |
| 3.4 ΔompW与其亲本株生长性能相似 |
| 3.5 RZ和ΔompW菌株溶血活性及生长形态未变 |
| 3.6 ΔompW自身凝集能力下降 |
| 3.7 ΔompW对四环素类药物敏感性显着升高 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 应用自然转化法成功构建出鸭源鸡杆菌突变株△ompW |
| 4.2 OmpW在鸭源鸡杆菌抵抗四环素中发挥重要作用 |
| 第二部分 RZ与ΔompW的抗应激研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 培养基及主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 菌种复苏与培养 |
| 2.4.2 不同盐度下的生长特性 |
| 2.4.3 不同盐度下OMPs的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.4 不同盐度下OmpW的Western Blotting分析 |
| 2.4.5 Real-time PCR分析不同盐度下细菌OmpW mRNA转录水平 |
| 2.4.6 细菌的应激抵抗力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ΔompW的生长受高渗透环境影响更大 |
| 3.2 高渗透压下G.anatis OmpW表达上调 |
| 3.3 鸭源鸡杆菌OmpW mRNA相对转录水平分析 |
| 3.4 ompW缺失降低了应激抵抗力 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 OmpW是鸭源鸡杆菌调节NaCl所必需的 |
| 4.2 OmpW与鸭源鸡杆菌耐氧化及热应激有一定相关性 |
| 第三部分 RZ与ΔompW的血清杀菌机制的初步探究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 主要试剂和培养基 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 菌种复苏 |
| 2.4.2 血清的制备 |
| 2.4.3 不同浓度血清中的生存率比较 |
| 2.4.4 不同浓度血清条件下OmpW的Western Blotting分析 |
| 2.4.6 不同浓度血清中鸭源鸡杆菌OmpW mRNA转录水平的变化 |
| 2.4.7 血清杀菌通路的初步探究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 OmpW缺失使血清杀菌能力下降 |
| 3.2 抵抗血清杀菌时OmpW表达上调 |
| 3.3 抵抗血清杀菌时OmpW mRNA转录上调 |
| 3.4 鸭源鸡杆菌通过旁路通路激活补体系统 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 OmpW在鸭源鸡杆菌血清杀菌中发挥重要作用 |
| 4.2 OmpW抑制补体旁路通路发挥耐血清杀菌活性 |
| 第四部分 RZ与ΔompW致病力的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和试验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 细菌培养 |
| 2.4 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定 |
| 2.5 对小鼠致病力分析 |
| 2.6 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性定 |
| 2.6.1 鸡输卵管原代细胞的制备与培养 |
| 2.6.2 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞体黏附测定 |
| 2.7 生物被膜形成测定 |
| 2.7.1 生物被膜的培养 |
| 2.7.2 结晶紫染色法定量测定生物被膜形成量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 OmpW缺失使G.anatis对小鼠的LD_(50)提高 |
| 3.2 RZ与ΔompW对小鼠的致病性无显着差异 |
| 3.3 RZ和ΔompW对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力相似 |
| 3.4 RZ和ΔompW生物被膜形成能力相似 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 OmpW缺失后不影响鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力 |
| 4.2 OmpW参与鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附 |
| 4.3 OmpW对鸭源鸡杆菌生物被膜形成影响很小 |
| 第五部分 鸭源鸡杆菌flfA缺失菌株的构建及其生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 培养基及主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要溶液的配制 |
| 2.5 方法 |
| 2.5.1 菌种复苏及鸭源鸡杆菌基因组的提取 |
| 2.5.2 质粒提取 |
| 2.5.3 鸭源鸡杆菌flfA突变菌株的构建 |
| 2.5.3 Cmp抗性盒子的扩增及鉴定 |
| 2.5.4 PCR扩增flfA基因上下游同源臂 |
| 2.5.5 PCR产物的酶切及其产物的纯化 |
| 2.5.6 重组质粒pUC18-U-C-D的构建 |
| 2.5.7 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.5.8 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.5.9 线性DNA打靶片段的扩增 |
| 2.5.10 鸭源鸡杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.5.11 线性DNA打靶片段转化 |
| 2.5.12 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA鉴定 |
| 2.5.13 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA生物学特性研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 扩增出flfA基因上下游同源臂及Cmp抗性基因 |
| 3.2 成功构建出质粒pUC18-flfA-U-C-D |
| 3.3 鸭源鸡杆菌突变株AflfA的鉴定 |
| 3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及flfA基因的两端片段 |
| 3.3.2 Western Blotting鉴定出ΔflfA不表达FlfA |
| 3.4 RZ和ΔflfA生长性能及菌落形态相似 |
| 3.5 ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力下降 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 成功构建了鸭源鸡杆菌flfA缺失突变菌株 |
| 4.2 菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥主导作用 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录1:英文缩写词表 |
| 附录2:作者简介 |
（8）天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 多肽物质的分离分析方法 |
| 1 多肽 |
| 2 多肽的分离方法 |
| 3 多肽的分析方法 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗菌肽的免疫调节作用及其在畜牧生产中的应用 |
| 1 抗菌肽概念 |
| 2 抗菌肽的免疫调节 |
| 3 抗菌肽在养殖与饲料中的应用 |
| 4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达天蚕素枯草芽孢杆菌工程菌的构建与高效表达菌株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 高效表达天蚕素枯草芽孢杆菌中试发酵工艺的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 天蚕素的分离纯化工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 断奶仔猪日粮添加天蚕素对其生长性能及免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 天蚕素在规模化猪场的推广应用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表论文及研究成果 |
| 致谢 |
（9）血根碱对细菌生物被膜的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 细菌生物被膜 |
| 1.1.1 生物被膜的结构与特征 |
| 1.1.2 细菌生物被膜形成机制 |
| 1.1.3 影响细菌生物被膜形成的因素 |
| 1.1.4 细菌生物被膜的危害 |
| 1.1.5 细菌生物被膜的控制 |
| 1.2 血根碱及其药理作用 |
| 1.3 课题研究的目的、意义及内容 |
| 1.3.1 研究目的和意义 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 第2章 血根碱体外抑菌试验 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 吸光度值(OD)与菌落数(CFU)的标准曲线 |
| 2.2.2 试管二倍稀释法血根碱抑菌效果 |
| 2.2.3 管碟法血根碱抑菌效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细菌耐药性 |
| 2.3.2 抗生素对正常菌群的影响 |
| 第3章 细菌生物被膜构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 沙门氏菌生物被膜 |
| 3.3.2 大肠埃希氏菌生物被膜 |
| 3.3.3 金黄色葡萄球菌生物被膜 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细菌生物被膜的构建 |
| 3.4.2 细菌生物被膜鉴定方法 |
| 第4章 血根碱对细菌生物被膜的影响及作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 血根碱对细菌生物被膜形成的影响 |
| 4.2.2 血根碱对细菌生物被膜上细菌数量的影响 |
| 4.2.3 血根碱对细菌生物被膜上多糖的影响 |
| 4.2.4 血根碱对细菌生物被膜形态的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 血根碱与生物被膜 |
| 4.3.2 血根碱与生物被膜上胞外多糖 |
| 4.3.3 血根碱与藻酸盐 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 需要进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表文章 |
（10）宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大肠杆菌流行性及耐药现状 |
| 1.1.1 大肠杆菌的流行性 |
| 1.1.2 大肠杆菌的耐药现状 |
| 1.2 抗菌药物的作用机制及病原微生物对抗菌药物的耐药机制 |
| 1.2.1 抗菌药物作用机制 |
| 1.2.2 细菌对抗菌药物耐药机制 |
| 1.3 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药现状及耐药机制 |
| 1.3.1 氟喹诺酮类药物的发展概况 |
| 1.3.2 宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展 |
| 试验研究部分 |
| 第二章 喹诺酮类药物对宠源大肠杆菌的体外抗菌活性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不同耐药谱大肠杆菌对不同代的喹诺酮类药物敏感性 |
| 2.3.2 各喹诺酮类药物对大肠杆菌的最小防突变浓度 |
| 2.3.3 各喹诺酮类药物对体外效力比较 |
| 2.3.4 氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的体外杀菌曲线测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同耐药表型大肠杆菌的 DNA 回旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因突变及质粒流行情况研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 体外抗菌活性分析及外排泵抑制剂对其的影响 |
| 3.3.2 大肠杆菌系统进化群分析 |
| 3.3.3 大肠杆菌 ST131 克隆株的筛选结果 |
| 3.3.4 质粒的 PCR 扩增结果 |
| 3.3.5 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因 PCR 扩增结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 不同耐药表型大肠杆菌的外排泵基因及调节因子的表达，以及不同氟喹诺酮类药物对外排泵表达的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 外排泵基因相关调节因子的表达 |
| 4.3.2 氟喹诺酮类药物压力下四种外排泵表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 体外诱导宠物源大肠杆菌对普拉多沙星的耐药性及机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 环丙沙星、麻保沙星和普拉多沙星诱导的大肠杆菌耐药菌株 |
| 5.3.2 耐药菌株的靶基因 gyrA、parC 和多药耐药性调控基因 SoxS 突变分析 |
| 5.3.3 耐药菌株的 acrB 外排泵基因表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、我国法定饲用抗菌药物的生物学特性(续)（论文参考文献）
- [1]高寒植物缩合单宁季节变化及其在抑制牦牛瘤胃甲烷排放中的应用[D]. 梁泽毅. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]盐酸小檗碱对AGEs介导下人牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究[D]. 张丽娜. 山东大学, 2020
- [3]以IGPD为靶标探究异甘草素对木糖葡萄球菌抗菌作用的研究[D]. 屈谦伟. 东北农业大学, 2020
- [4]猪源产生物被膜乳酸菌的筛选及生物学特性研究[D]. 舒慧萍. 吉林农业大学, 2019(03)
- [5]临床鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药能力的相关性研究[D]. 谢思露. 成都中医药大学, 2020(02)
- [6]氟苯尼考和恶喹酸在鳜体内的药动学研究[D]. 罗理. 华南农业大学, 2017(08)
- [7]鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建[D]. 彭志锋. 河南农业大学, 2017(06)
- [8]天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究[D]. 李波. 吉林大学, 2015(06)
- [9]血根碱对细菌生物被膜的作用研究[D]. 王静慧. 浙江工商大学, 2012(01)
- [10]宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究[D]. 刘晓强. 西北农林科技大学, 2012(06)