一、SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡（论文文献综述）
胡原[1]（2014）在《小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析》文中认为小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus, PlxyGV）属杆状病毒科β-杆状病毒属,是小菜蛾种群的重要天然控制因子。虽然PlxyGV已开发为商品化生物杀虫剂,但由于缺少支持PlxyGV离体复制的稳定受纳细胞系,PlxyGV分子生物学有关的研究工作相对滞后。本研究利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）构建了多个PlxyGV bacmids,试图建立PlxyGV基因操作和功能分析研究技术平台；在此基础上进一步开展了PlxyGV离体复制和基因表达分析。（1）通过直接克隆和λ-Red重组,在PlxyGV gran位点导入含F复制子、卡那霉素抗性基因（Kan）、lacZa基因和Tn7转座结合位点的细菌人工染色体载体片段构成PlxyGV bacmid vPxG。借助Bac-to-Bac系统,分别构建了由PlxyGV iel、vp39、gran或AcMNPV iel启动子控制egfp的PlxyGV荧光报告bacmid,依次为vPxGPiel-gfp、vPxGPvp39-gfp、vPxGPgran-gfp和vPxGPaciel-gfp。在vPxGPaciel-gfp转染的PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿以及vPxGPiel-gfp转染的Hi5培养皿中可见荧光细胞。vPxGPgran-gfp和vPxGPvp39-gfp分别转染的细胞培养皿中都未见荧光细胞。用四种PlxyGV荧光报告bacmids分别转染三种细胞系的上清液转接的新鲜细胞培养中均未见荧光细胞,表明在被转染细胞中未产生感染性病毒粒子。（2）通过基因克隆,构成含PlxyGV启动子控制egfp或luc的报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV早期基因iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105启动子,晚期基因vp39启动子以及极晚期基因gran启动子在三种细胞中表达活性分析。荧光观察结果显示,在pPiel-gfp或pPdnapol-gfp转染Hi5细胞培养皿以及报告质粒和bMON14272共转染PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿中可见荧光细胞。定量结果显示,iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105等PlxyGV早期基因启动子在Hi5细胞中均有高水平的转录。结果表明,这些PlxyGV早期基因启动子在三种昆虫细胞系中能够不依赖其它病毒基因产物启动报告基因表达。（3）构成含PlxyGV hr的早期启动子报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV hr序列的增强功能分析。结果显示,在PxE2细胞中,hrl、hr2、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子（Piel、Pdnapol、Plefl和Plef9）具有增强作用。在Sf9细胞中,对早期启动子具有增强作用的是hrl、hr4和AcMNPV hr5。在Hi5细胞中,hrl、hr3、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子具有增强作用,hr2对部分早期启动子（Piel、Pdnapol和Plefl）具有增强作用。结果表明,PlxyGV hr对早期基因表达具有增强作用。（4）通过瞬时表达实验,分析PlxyGV和AcMNPV iel蛋白对PlxyGV早期基因表达的调控作用。结果显示,PlxyGV iel抑制早期启动子控制报告基因表达；当PlxyGV hrl存在时这种抑制作用没有改变。AcMNPV iel对大多数PlxyGV早期启动子具有激活作用,而且当PlxyGVhr1存在时激活作用得到进一步加强。（5）利用AcMNPV bacmid系统分别完成了PlxyGV iap和f基因对AcMNPV p35和gp64基因的功能替代分析,发现PlxyGV iap不能功能性替代AcMNPV p35基因；证实PlxyGV f不能替代AcMNPV gp64。（6）构建了多个包含AcMNPV p35, iel和gp64基因单个或成对或全数的PlxyGV bacmids重组体。通过用所构建的PlxyGV bacmids重组体对三种昆虫细胞系的转染-感染实验发现AcMNPV p35无论是单独或其它两种基因一起插入PlxyGV基因组都能激活PlxyGV晚期基因vp39启动子控制的报告基因表达；AcMNPV iel增强p35的激活作用。AcMNPV p35、iel和gp64组合可以进一步增强报告基因表达；含AcMNPV p35、iel和gp64的PlxyGV bacmid转染Sf9和Hi5细胞可能产生了少量感染性病毒。
余倩[2]（2011）在《斜纹夜蛾核多角体病毒感染甜菜夜蛾细胞的研究》文中指出研究发现斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV）不能成功感染同属甜菜夜蛾（S.exigua,Se）昆虫,为深入研究SpltNPV在离体Se301细胞中的感染进程以及病毒感染失败的原因,对感染后Se301细胞进行DNA复制、病毒基因转录以及病毒蛋白表达等检测。结果显示被感染的Se301细胞中病毒完成了DNA的复制和病毒早、晚期基因转录,但检测不到极晚期基因多角体基因（polyhedrin）的表达,病毒的蛋白表达受阻从而影响了病毒完成复制周期。研究发现病毒蛋白表达受阻是SpltNPV在Se301细胞中无法形成子代病毒,完成整个病毒复制的主要原因,这为深入研究其感染失败机理奠定了坚实基础。
余倩[3]（2008）在《斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究》文中认为杆状病毒感染昆虫细胞可诱导细胞凋亡（apoptosis）,细胞凋亡作为一种宿主范围决定因子限制了杆状病毒的杀虫范围,影响杆状病毒杀虫剂在生物防治中的应用;然而,在长期进化过程中,杆状病毒获得了抗凋亡基因以阻止细胞凋亡,使其能够正常复制。在已测序的杆状病毒中绝大部分都包含两个或两个以上的抗凋亡基因,但是部分体外实验结果表明,并不是所有抗凋亡基因都具有抗细胞凋亡活性。本研究首次利用RNAi技术对斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus, SpltNPV）中两个抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受纳宿主中的抗凋亡功能进行研究,通过瞬时表达检测探讨两个基因在SpltNPV非受纳宿主中的抗凋亡功能,同时对抗凋亡基因与其宿主的进化关系进行了初步探讨。主要结果如下:PCR扩增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因,分别将其连接到含有两个反向T7启动子的质粒载体上,体外转录得到大片段的双链RNA （double strain RNA, dsRNA）,将dsRNA分别或同时转染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221细胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49,或者同时沉默Splt-iap4和Splt-p49的转录。经光学显微镜观察、DNA ladder检测、细胞存活率计算以及病毒滴度测定,结果说明SpltNPV感染SpLi-221细胞时,Splt-P49具有抗凋亡功能,而Splt-IAP不具有这种功能。但实验中发现,SpltNPV感染SpLi-221细胞在48 h之前细胞会聚集成团,而Splt-iap4 dsRNA处理细胞未出现此现象,大部分依然是独立的单个细胞,推断Splt-iap4基因在病毒感染期间起到了某种作用使得细胞的聚集受阻,但Splt-iap4的功能与病毒产生可感染性的子代病毒无关。在vAcAnh感染Sf9系统中,分别瞬时表达Splt-iap4和Splt-p49两基因,经光学显微镜和细胞存活率计算方法检测,结果同样显示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能,且Splt-IAP无辅助抗凋亡功能或延迟细胞凋亡功能。最后对杆状病毒中的抗凋亡基因与其来源宿主进行进化分析,结果显示亲缘关系相近的杆状病毒所含的抗凋亡类型也相近,说明抗凋亡基因与杆状病毒进化有着密切的关系,也可能发挥着重要作用。斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和甜菜夜蛾（S. exigua）同属夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾属的昆虫,亲缘关系很近,且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）基因组相似性很高,但这两种病毒并不能交叉感染各自宿主。本文从细胞水平和亚显微水平对SpltNPV感染非受纳宿主离体细胞Se301的过程进行了描述,并对感染失败的原因进行了初步的生化分析。光学显微镜显示,被SpltNPV感染的Se301细胞在感染后24 h至120 h期间细胞出现了明显的病理现象,包括细胞空泡,细胞聚集等,且随着时间的延长病理症状越来越严重,但感染细胞中始终没有病毒多角体。DAPI染色荧光观察和电镜观察结果,都表明从24 h至120 h各样品中均显示细胞出现了早期凋亡的特征,但未形成晚期凋亡特征的凋亡小体。TCID50检测表明病毒没有产生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting显示,在被感染的Se301细胞中可完成病毒DNA的复制; RT-PCR分析也显示,感染细胞72 h时,SpltNPV的早、晚期基因都有转录;Western blotting没有检测到被感染细胞中有极晚期基因polyhedrin的表达。以上结果表明,SpltNPV的感染可导致Se301细胞出现明显的早期凋亡症状,但不能进行到凋亡的最后阶段;虽然病毒可完成DNA的复制且早、晚期基因均有转录,但病毒的感染不能发展至极晚期,说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。
曾宪东[4]（2007）在《杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究》文中研究指明细胞凋亡是宿主细胞防御病毒入侵的重要策略，同时进化过程中病毒也获得了相应的调节细胞凋亡的机制。杆状病毒是最早发现参与调节宿主细胞凋亡的病毒之一，对于杆状病毒的凋亡调节基因的研究大大加深了对病毒与宿主细胞相互作用以及细胞凋亡的分子机制的认识。杆状病毒编码的凋亡抑制基因主要有三类，即p35、p49和iap（inhibitor of apoptosis）。P35蛋白作为多种caspase的底物自杀性抑制剂是一个广谱的强而有效的凋亡抑制因子，P49是P35的同源体，而分布广泛的iap基因家族已经成为了新的研究热点，但仅有少数几个杆状病毒iap基因的功能得到鉴定。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa california nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是杆状病毒的模式种，它编码一个p35基因以及两个功能尚未证实的iap基因。缺失p35 AcMNPV能诱导其AcMNPV敏感的草地贪夜蛾（Spodoperta frugiperda）Sf细胞凋亡，利用该系统鉴定了多个凋亡抑制基因，如Cp-iap和Op-iap。在本实验室的研究发现缺失p35的AcMNPV与野生型病毒一样能完全抑制棉铃虫核多角体病毒（Helicoverpa armigera NPV，HearNPV）诱导的Tn-Hi5细胞凋亡，推测iap1与iap2是功能性的凋亡抑制基因。瞬时表达分析研究证实了AcMNPV IAP1与IAP2均功具有抑制细胞凋亡的功能。由于AcMNPV与HearNPV共感染不仅抑制了HearNPV诱导的Tn-Hi5细胞的凋亡，而且能拯救HearNPV在Tn-Hi5中的复制，为此构建了分别表达AcMNPV p35、iap1与iap2的重组HearNPV，感染试验发现重组病毒诱导的凋亡显着下降且极晚期启动的egfp基因获得表达，而且用电镜观测到了重组病毒在Tn-Hi5细胞均产生的病毒粒子。为了进一步探讨AcMNPV IAPs在Tn-Hi5细胞中起作用的机制，我们表达了IAP2以及两个源自昆虫细胞的效应caspase，即Bm-caspase-1和Tn-caspase-1，体外活性分析表明了原核表达的Bm-caspase-1能够自我激活并可以激活酶原形式的Tn-caspase-1，而且IAP2可抑制Bm-caspase-1的蛋白酶活性。本研究首次证实了AcMNPV的IAP1／2作为功能性的凋亡抑制蛋白发挥作用，也进一步揭示了凋亡抑制子IAP家族蛋白功能和作用机制的细胞特异性。
李祥[5]（2007）在《杆状病毒感染的分子机理研究》文中研究表明杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，作为生物杀虫剂广泛应用于害虫防治，其区别于其他病毒的显着性特征是它具有双相复制周期，在复制过程中产生两种结构与功能不同的病毒粒子类型：出芽病毒（BV）和包涵体病毒（ODV）。虽然对BV和ODV感染的机理进行了大量研究，但仍有许多问题有待进一步解决。本论文研究了棉铃虫核多角体病毒（Heilicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus, HearNPV）编码的成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, fgf）的同源基因vfgf的结构与功能，发现vFGF不仅具有FGF保守的生物学活性如细胞趋化功能，而且还参与HearNPV BV感染过程，是BV感染的必需基因。论文还研究了ODV感染的分子机制，揭示口服感染相关蛋白PIF-3的N端疏水区是PIF-3行使功能所必需的。本研究丰富了杆状病毒感染分子机制的理论。论文第一章首先综述了杆状病毒的研究现状，主要病毒感染的机制研究进展，较为深入的分析了杆状病毒的膜融合蛋白的特点和感染机理，及病毒口服感染相关基因的结构与功能研究的主要进展。介绍了脊椎动物和无脊椎动物中FGF研究现状及其存在的问题和发展趋势。最后，结合对研究进展的分析提出了本论文的目的意义。第二章研究了HearNPV vFGF基本特性及其在BV感染中的作用。转录和翻译结果显示vfgf是一个晚期表达基因。HearNPV编码一36 kDa的vFGF，能特异地趋化HearNPV敏感的细胞Hz-AM1，而对其它非敏感的昆虫细胞如Sf9和Se-UCR及哺乳动物细胞如293和HepG2都没有趋化能力。HearNPV vFGF能与肝素进行特异结合，利用这一特性我们在病毒感染细胞的上清中检测到了vHaFGF的存在，表明vHaFGF是一个分泌蛋白，暗示了它作为胞外的配体能跟肝素结合在信号传导过程中起作用。此外，Western blot和免疫胶体金技术结果证明vFGF是BV的结构蛋白且定位于BV的囊膜，而ODV上没有vFGF存在，这种定位进一步为趋化实验和抗体中和所证实。缺失vfgf的重组HearNPV进行转染和感染试验发现该重组病毒不能进行二次感染，而恢复vfgf后能正常感染。这些结果表明HearNPV vfgf是HearNPV BV感染的必需基因。论文进一步讨论了vFGF在病毒的感染和致病过程中的作用。第三章对AcMNPV PIF-3的基本特征和N端疏水区的功能进行了研究。RT-PCR和Western blot结果表明pif-3是一个晚期表达基因，编码25 kDa的蛋白，Western blot分析证明其为ODV的结构蛋白。亚细胞定位研究结果证明PIF-3 N端富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的疏水区行使核定位信号的作用，在蛋白运输到细胞核中发挥作用。通过red重组系统我们构建了PIF-3的缺失重组病毒，经口服感染和注射实验表明缺失pif-3使AcMNPV失去了口服感染能力但对BV的感染性没有影响，而恢复完整的PIF-3拯救了病毒的口服感染能力，但是恢复缺失N端23个氨基酸的疏水区的pif-3则不能拯救病毒的口服感染能力。一步生长曲线结果显示PIF-3或其跨膜区的缺失对病毒的复制、包装和出芽等过程没有明显的影响。论文首次揭示HearNPV编码的vFGF参与BV的感染过程，是除杆状病毒BV膜蛋白（GP64或F蛋白）之外发现的又一个由病毒编码的结构蛋白，为进一步研究杆状病毒感染的分子机制提供了新的途径；同时还发现PIF-3的N端疏水序列作为核定位信号引导蛋白进入细胞核并在AcMNPV初级感染过程中起决定性作用，为进一步揭示ODV感染的机理提供了一个新的思路。
王慧媛[6]（2006）在《杆状病毒感染属性的研究&共表达AcMNPV gp64和p35基因的重组病毒HaSNPV的构建》文中研究说明本论文主要探讨了杆状病毒的感染力与病毒的粒子数之间的对应关系,并初步阐明了外源的病毒囊膜糖蛋白以及病毒的抗细胞凋亡活性因子能够显着的提高病毒的感染力。第一章:文献综述。简要介绍了杆状病毒的分支分类、病毒粒子的形态结构以及病毒的感染及复制机理。介绍了杆状病毒中与病毒感染的宿主域或是与病毒感染力有关的囊膜糖蛋白GP64和F以及具有抗细胞凋亡活性的P35和IAP基因的作用机理。最后对本研究中用于进行病毒绝对拷贝数定量的实时荧光定量PCR的技术原理和应用前景进行了简要介绍。第二章:中国棉铃虫核多角体病毒的感染力与病毒粒子数间的对应关系研究。本研究中,我们通过荧光定量PCR的技术为HaSNPV出芽病毒粒子的感染力进行测定。作为一种灵敏并且准确的定量方法,我们使用荧光定量PCR技术测定病毒滴度。通过和终点稀释法的比较,发现这种方法更加快捷而且准确。在测定共表达AcMNPV GP64的重组病毒vHa+gp64+egfp在HzAM1细胞中的生长曲线时我们发现,vHa+gp64+egfp产生的子代病毒的滴度是对照病毒vHa +egfp的近10倍。为了解释造成这种感染力差异的原因,我们建立了一种基于荧光定量PCR技术的方法直观地反应出病毒粒子数和感染效率的关系。结果发现,vHa+gp64+egfp形成一次有效感染需要的病毒粒子数仅为vHa +egfp的1/10,推测是由于GP64的表达提高了vHa+gp64+egfp吸附并进入细胞的效率,从而提高其侵染效率。我们进一步比较了这两种HaSNPV在感染过程中吸附到细胞表面及进入到细胞内的病毒粒子数的情况,发现在用相同感染复数的病毒来感染细胞的情况下,虽然vHa+gp64+egfp的病毒粒子数仅为vHa +egfp的1/10,但在HzAM1细胞中能够检测到相同拷贝的病毒数。第三章:杆状病毒对非敏感细胞的感染特性研究及共表达GP64和P35基因的重组HaSNPV病毒的构建。用第二章中建立的方法我们作了vHa+gp64+egfp和vHa+egfp感染SeUCR细胞后产生的子代病毒及其感染性的分析,发现所产生的子代病毒的感染力较低,推测可能是由于病毒感染引起细胞凋亡导致产生的子代病毒有缺陷的缘故。因此我们构建了一株共表达AcMNPV的囊膜蛋白
梁昌镛[7]（2005）在《杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的研究》文中研究表明杆状病毒作为异源病毒进入哺乳动物细胞是近年来发现的一个新现象。虽然有一些研究组在这个领域已经做了许多卓越的工作,但是对杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的机制还没有完全阐明。另外,杆状病毒是一个非常大的家族,不同杆状病毒之间也存在较大的差别,因此具有不同膜蛋白的杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的机制可能也是不一样的。本文旨在通过对不同类型的杆状病毒侵入哺乳动物细胞的特性以及引起的细胞反应的研究,揭示杆状病毒侵入哺乳动物细胞的效率,哺乳动物细胞对杆状病毒入侵的反应,以及杆状病毒膜蛋白在病毒侵入中的功能,为进一步将杆状病毒开发成基因治疗载体打下基础。第一章以综述的形式描述了杆状病毒的病毒学特点,病毒侵入昆虫细胞的机制,膜蛋白的结构与功能,同时介绍了基因治疗的基本概念和常用的基因治疗载体系统。最后,介绍了目前杆状病毒作为基因治疗载体的研究现状。杆状病毒AcMNPV 已经显示能高效地进入许多类型的哺乳动物细胞系,而且还表现出对肝细胞系的偏好。第二章阐明了AcMNPV 也表现出对转导哺乳动物肾细胞的偏好。AcMNPV 介导报告基因-绿色荧光蛋白基因在多种传代的哺乳动物（小鼠、仓鼠、猴、猪和人）肾细胞系和原代的小鼠肾细胞中高效表达。但是报告基因必须由哺乳动物启动子启动。报告基因的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关,而且,丁酸钠的添加能显着提高报告基因的表达水平,由于丁酸盐是去乙酰化酶的抑制剂,可以促进沉默基因的表达,说明杆状病毒的实际转导率比正常情况下表达报告基因的细胞比率更高。另外,杆状病毒介导的报告基因能在肾细胞中表达一段较长的时期,而且杆状病毒的转导对细胞没有明显的毒性。这表明AcMNPV 具有作为基因治疗载体的优良特性。另外,还发现杆状病毒AcMNPV 能刺激哺乳动物细胞SMMC-7721 细胞产生抗病毒的活性,而使SMMC-7721 细胞获得抵抗水疱口膜炎病毒（Vesicular Stomatitis virus VSV）感染的能力。杆状病毒AcMNPV 诱导SMMC-7721 细胞产生抗病毒状态的主要成分为干扰素α/β。然而,重组杆状病毒AcMNPV 并不能介导哺乳动物启动子控制的报告基因在SMMC-7721 细胞中表达。该病毒在WISH 细胞中则既能诱导抗病毒状态又能介导转基因的表达。而在BHK 细胞和
南方[8]（2004）在《AcMNPV抑制HaSNPV诱导的Tn-Hi5细胞凋亡机制及其分子机理研究》文中提出杆状病毒是一类寄生于节肢动物的杆状的病原微生物，宿主大多为昆虫和某些甲壳类动物。由于其对人体无害，又是一种高效的真核表达载体，作为一种高效的生物杀虫剂及真核表达载体而得到广泛的应用。自从在杆状病毒中首次发现P35，一种广谱的凋亡抑制蛋白，并且其后又发现IAP，一种进化上高度保守的凋亡抑制蛋白的发现，杆状病毒为研究宿主对病毒入侵的凋亡反应提供了一个理想的系统。杆状病毒感染非敏感细胞常常可以导致细胞凋亡，棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（Helicoverpa armigera Nucleopoly－hedrovirus，HaSNPV）能够诱导粉纹夜蛾Tn-Hi5细胞发生凋亡，这种凋亡能够被野生型和缺失了凋亡抑制基因p35的苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）所抑制，并且在AcMNPV的辅助下，HaSNPV能够在Tn-Hi5细胞中复制，产生具有感染能力的子代病毒。对于AcMNPV基因组中属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的两个基因：Aciap1和Aciap2的研究发现：瞬时表达实验证明，在Tn-Hi5细胞中，Aciap2能部分拯救由HaSNPV所诱导的细胞凋亡， Aciap1则没有表现抑制细胞凋亡功能；，p35作为阳性对照具有明显抑制凋亡的能力。进一步通过Bac-to-Bac系统构建分别超表达p35，Aciap1和Aciap2基因的重组HaSNPV病毒，以进一步研究AcMNPV IAP的功能，并希望获得宿主范围扩大了的重组病毒。结果发现含有p35和iap2基因的重组病毒可以抑制Tn-Hi5细胞凋亡，电镜观察发现感染重组病毒的部分细胞中存在单粒包埋的病毒粒子（ODV），但不能产生具有感染性的BV。首次证明Aciap2具有抑制细胞凋亡的功能, 能部分拯救HaSNPV在Tn-Hi5细胞中复制。而含有Aciap1的重组HaSNPV仍然诱导Tn-Hi5细胞凋亡，Aciap1基因没有表现抗细胞凋亡的功能。
程睿,梁昌镛,南方,胡志红,J.M.Vlak,陈新文[9]（2003）在《SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡》文中认为在采用共感染和共转染的方法构建扩大杀虫范围的重组病毒的研究过程中发现棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV）能诱导甜菜夜蛾细胞Se-UCR发生典型凋亡,但不能诱导另一株甜菜夜蛾细胞Se-301产生凋亡。以5 MOI的HaSNPV感染Se-UCR,在12h左右可以观测到少量细胞凋亡,24h能观察到明显的凋亡,凋亡细胞数量随时间不断增加,到72h基本上所有的细胞均发生凋亡,成为凋亡小体,基因组DNA片段化。同时发现HaSNPV诱导的甜菜夜蛾Se-UCR细胞凋亡能够被甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒（Spodoptera exigua multicapsid nucleoplyhedrovirus,SeMNPV）所抑制,进一步点杂交试验发现SeMNPV和HaSNPV共同感染Se-UCR获得了HaSNPV在该细胞中的复制。
程睿,梁昌镛,南方,胡志红,J.M. Vlak,陈新文[10]（2003）在《SeMNPV抑制Hasnpv诱导的Se-UCR细胞凋亡》文中研究表明在采用共感染和共转染的方法构建扩大杀虫范围的重组病毒的研究过程中发现棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV）能诱导甜菜夜蛾细胞Se-UCR发生典型凋亡,但不能诱导另一株甜菜夜蛾细胞Se-301产生凋亡。以5 MOI的HaSNPV感染Se-UCR,12小时左右可以观测到少量细胞凋亡,24小时能观察到明显的凋亡,凋亡细胞数量随时间不断增加,到72小时基本上所有的细胞均发生凋亡,成为凋亡小体,基因组DNA片段化。同时发现HaSNPV诱导的甜菜夜蛾Se-UCR细胞凋亡能够被甜菜野蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multicapsid nucleoplyhedrovirus,SeMMPV）所抑制。实验过程中如果我们使用含GFP的HaSNPV重组病毒与SeMNPV共感染Se-UCR,发现有GFP基因的表达。进一步点杂交试验证实SeMNPV和HaSNPV共感染获得了HaSNPV DNA在Se-UCR的复制,但并不能拯救HaSNPV基因组在Se-301细胞中的复制。本研究结果显示凋亡的诱导具有明显的细胞特异性。
二、SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 本文缩写符号 |
| 目录 |
| 1. 绪论 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 两相复制周期 |
| 1.1.2 基因表达调控 |
| 1.1.3 同源重复区和IE1 |
| 1.1.4 抗细胞凋亡基因 |
| 1.1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.2.1 β-杆状病毒 |
| 1.2.2 β-杆状病毒的离体复制 |
| 1.3 杆状病毒基因操作 |
| 1.3.1 早期研究使用的方法 |
| 1.3.2 bacmid构建方法与Bac-to-Bac系统 |
| 1.3.3 λ-Red重组技术 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2. 小菜蛾颗粒体病毒荧光报告Bacmid的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 2.2.2 细胞系和病毒株 |
| 2.2.3 常用质粒 |
| 2.2.4 培养基和抗生素 |
| 2.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 2.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 2.2.7 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 2.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 2.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 2.3.4 细菌菌株构建 |
| 2.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PlxyGV bacmid vPxG的构建 |
| 2.4.2 荧光报告PlxyGV bacmids的构建 |
| 2.4.3 PlxyGV bacmid对三种昆虫细胞系的转染-感染实验分析 |
| 2.5 讨论 |
| 3. 小菜蛾颗粒体病毒在三种昆虫细胞系中的基因表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 3.2.2 细胞系和病毒株 |
| 3.2.3 常用质粒 |
| 3.2.4 培养基和抗生素 |
| 3.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 3.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 3.2.7 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 3.3.2 瞬时表达质粒构建 |
| 3.3.3 瞬时表达实验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PlxyGV早、晚期启动子和hr序列的转录因子结合位点 |
| 3.4.2 PlxyGV早、晚期启动子在三种昆虫细胞系中转录活性分析 |
| 3.4.3 PlxyGV hrs对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.4.4 iel蛋白对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 4. AcMNPV p35、iel和gp64基因对PlxyGV重组体的功能拯救 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 4.2.2 细胞系和病毒株 |
| 4.2.3 常用质粒 |
| 4.2.4 培养基和抗生素 |
| 4.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 4.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 4.2.7 引物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 4.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 4.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 4.3.4 细菌菌株构建 |
| 4.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 4.3.6 透射电子显微镜分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 PlxyGVf不能功能性替代AcMNPV gp64 |
| 4.4.2 PlxyGV iap1和iap2不能功能性替代AcMNPVp35 |
| 4.4.3 AcMNPV p35和ie1基因对PlxyGV离体复制的拯救 |
| 4.5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 为本论文提供支持的国家自然科学基金项目 |
| 致谢 |
（2）斜纹夜蛾核多角体病毒感染甜菜夜蛾细胞的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 昆虫细胞与病毒 |
| 1.1.2 供试昆虫 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒多角体扩增 |
| 1.2.2 病虫血淋巴制备 |
| 1.2.3 在离体培养细胞中增殖病毒 |
| 1.2.4 SpltNPV 病毒感染细胞 |
| 1.2.5 Dot Blotting |
| 1.2.6 RT-PCR |
| 1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) |
| 1.2.8 Western blotting |
| 2 结 果 |
| 2.1 SpltNPV感染Se301细胞后DNA复制情况 |
| 2.2 SpltNPV在Se301细胞中的转录时相 |
| 2.3 SpltNPV在Se301细胞中的蛋白表达 |
| 3 讨 论 |
（3）斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 杆状病毒诱导的细胞凋亡及 RNAi 技术(文献综述) |
| 1.1 核多角体病毒 |
| 1.2 杆状病毒感染与宿主的关系 |
| 1.3 杆状病毒宿主专一性 |
| 1.4 细胞凋亡概念及其形态学特征 |
| 1.5 细胞凋亡与细胞坏死区别 |
| 1.6 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.7 杆状病毒感染引起的细胞凋亡研究 |
| 1.8 抗凋亡基因 |
| 1.8.1 p35基因 |
| 1.8.2 p49基因 |
| 1.8.3 iap 基因 |
| 1.9 RNAi 技术 |
| 1.9.1 RNAi 的发现与发展 |
| 1.9.2 RNAi 作用机制 |
| 1.9.3 RNAi 机制中的主要成员 |
| 1.9.4 用RNAi 方法研究特定基因功能的技术路线 |
| 第二章 Splt-iap4 和 Splt-p49 基因转录和翻译研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Splt-iap4转录时相 |
| 2.2.2 Splt-p49转录时相 |
| 2.2.3 Splt-iap4表达时相 |
| 2.2.4 Splt-p49表达时相 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 应用RNAi技术研究Splt-iap4和Splt-p49基因功能 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Splt-iap4和Splt-p49基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.2 对照cat基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.3 重组质粒p28i-p49和p28i-iap的酶切鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒p28i-cat的酶切鉴定 |
| 3.2.5 Splt-P49和Splt-IAP4凋亡功能检测 |
| 3.2.6 Splt-IAP4蛋白没有协同抗凋亡作用 |
| 3.2.7 Splt-IAP4对细胞有聚集作用 |
| 3.2.8 Splt-iap4 dsRNA处理对产生感染性病毒粒子的影响 |
| 3.2.9 RNAi对SpltNPV感染SpLi-221细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Splt- iap4 和 Splt-p49 瞬时表达及抗细胞凋亡活性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 瞬时表达载体的构建 |
| 4.2.2 瞬时表达蛋白检测 |
| 4.2.3 Splt-Iap4和Splt-P49抗凋亡活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 杆状病毒与抗凋亡基因的进化关系研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 43株杆状病毒全基因组特征 |
| 5.2.2 43株杆状病毒全基因组中的抗凋亡基因 |
| 5.2.3 iap的序列比对和进化分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 SpltNPV感染诱导Se301细胞凋亡的检测与分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 光学显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.2 电子显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.3 DAPI染色 |
| 6.2.4 trypan blue染色 |
| 6.2.5 DNA ladder |
| 6.2.6 滴度测定 |
| 6.2.7 Dot blotting |
| 6.2.8 RT-PCR |
| 6.2.9 SDS-PAGE和Western blotting分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 国内外会议论文摘要 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（4）杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 细胞凋亡与杆状病毒 |
| 3 本研究的内容及意义 |
| 第二章 p35基因缺失型AcMNPV抑制HearNPV诱导Tn-Hi5细胞凋亡 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 AcMNPViap1和iap2基因功能的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Ac-IAP2与昆虫细胞caspase功能的体外分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 撰写发表文章 |
| 致谢 |
（5）杆状病毒感染的分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.杆状病毒简介 |
| 2.杆状病毒的分类 |
| 3.杆状病毒的形态结构 |
| 4.杆状病毒的感染周期 |
| 5.杆状病毒口服感染相关基因 |
| 6.ODV囊膜蛋白N端疏水区的功能 |
| 7.杆状病毒的膜融合蛋白 |
| 8.杆状病毒的应用 |
| 9.成纤维细胞生长因子 |
| 本论文的研究内容和意义: |
| 第二章 棉铃虫单核衣壳多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)fgf基因功能研究 |
| 摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三章 苜蓿斜纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)PIF-3 N端疏水序列功能研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（6）杆状病毒感染属性的研究&共表达AcMNPV gp64和p35基因的重组病毒HaSNPV的构建（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 中国棉铃虫核型多角体病毒的感染力与病毒粒子绝对拷贝数间的对应关系研究 |
| 第三章 杆状病毒感染非敏感细胞的生物学属性及共表达 AcMNPV gp64 和 p35 基因的重组 HaSNPV 病毒的构建 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（7）杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的研究（论文提纲范文）
| 第一章 引言 |
| 1. 杆状病毒简介 |
| 2. 基因治疗简介 |
| 3. 杆状病毒作为基因治疗载体的研究概况 |
| 4. 本论文的研究内容和意义 |
| 第二章 杆状病毒高效转导哺乳动物肾细胞 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 核多角体病毒组I 诱导哺乳动物细胞抗病毒效果,而组II 则不具此功能 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 GP64 拯救 HaSNPV 转导哺乳动物细胞 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 1. AcMNPV 侵入哺乳动物细胞的可能机制 |
| 2. AcMNPV 诱导哺乳动物细胞的抗病毒反应 |
| 3. 含有 F 膜蛋白的组 II 杆状病毒与哺乳动物细胞的关系 |
| 4. 受体结合和宿主范围 |
| 5. 杆状病毒膜融合蛋白的进化 |
| 6. 杆状病毒作为基因治疗载体的发展方向 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（8）AcMNPV抑制HaSNPV诱导的Tn-Hi5细胞凋亡机制及其分子机理研究（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述l |
| 第二章 AcMNPV／AcMNPV(△p35)抑制HaSPNV诱导In-HiS细胞凋亡 |
| 第三章 AcMNPV两个iaD基因Ac-iapl和Ac-iap2基因功能研究 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
四、SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析[D]. 胡原. 华中师范大学, 2014(07)
- [2]斜纹夜蛾核多角体病毒感染甜菜夜蛾细胞的研究[J]. 余倩. 中山大学学报(自然科学版), 2011(03)
- [3]斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究[D]. 余倩. 中山大学, 2008(06)
- [4]杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究[D]. 曾宪东. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(06)
- [5]杆状病毒感染的分子机理研究[D]. 李祥. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(02)
- [6]杆状病毒感染属性的研究&共表达AcMNPV gp64和p35基因的重组病毒HaSNPV的构建[D]. 王慧媛. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2006(11)
- [7]杆状病毒与哺乳动物细胞相互作用的研究[D]. 梁昌镛. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2005(01)
- [8]AcMNPV抑制HaSNPV诱导的Tn-Hi5细胞凋亡机制及其分子机理研究[D]. 南方. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2004(04)
- [9]SeMNPV抑制HaSNPV诱导的Se-UCR细胞凋亡[J]. 程睿,梁昌镛,南方,胡志红,J.M.Vlak,陈新文. 中国病毒学, 2003(06)
- [10]SeMNPV抑制Hasnpv诱导的Se-UCR细胞凋亡[A]. 程睿,梁昌镛,南方,胡志红,J.M. Vlak,陈新文. 湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集, 2003