一、金属硫蛋白在人脑胶质瘤中的表达及生物学意义（论文文献综述）
司曼飞[1]（2020）在《高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究》文中研究表明第一部分 鉴定高级别浆液性卵巢癌诊断及预后评估的生物标志物目的由于缺乏有效的早期诊断和治疗策略,卵巢癌致死率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌发病隐匿,进展迅速,多数患者就诊时已进展至临床晚期,而早期诊断卵巢癌可以显着改善患者的预后。因此鉴定可用于卵巢癌早期诊断和预后评估的生物标志物有着重要意义。由于高级别浆液性卵巢癌是卵巢癌中最常见且恶性程度最高的类型,占死亡病例的大部分,因此本部分研究以高级别浆液性卵巢癌为研究对象,旨在筛选可能用于高级别浆液性卵巢癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。方法下载GEO数据库中符合纳入标准的6个数据集（GSE14001、GSE18520、GSE26712、GSE27651、GSE40595、GSE54388）,整合分析筛选出高级别浆液性卵巢癌和正常卵巢表面上皮之间的差异表达基因。通过DAVID对共有的差异表达基因进行功能富集分析,包括GO功能注释和KEGG通路富集分析。使用STRING在线构建蛋白质相互作用（PPI）网络,通过Cytoscape对PPI网络进行可视化分析并鉴别hub基因,同时识别PPI网络中的功能模块,并对关键模块1进行了功能富集分析。应用Kaplan-Meier Plotter数据库评估10个hub基因在高级别浆液性卵巢癌中的预后价值。hub基因的表达水平不仅通过Oncomine数据库进行了确认,也通过qRT-PCR和Western Blot进行了临床样本验证。结果1.本研究成功筛选出103个共有差异表达基因,包括28个表达上调的基因和75个表达下调的基因;2.富集分析结果显示,上调的差异基因主要与细胞增殖和细胞分裂等生物学过程相关,而下调的差异基因主要富集于Wnt信号通路及多个与代谢相关的通路;3.构建PPI网络后,鉴定出10个hub基因—EPCAM、ALDH1A1、ZWINT、BUB1B、NEK2、DLGAP5、MELK、CEP55、CKS2、KDR,其中 ALDH1A1 和 KDR在高级别浆液性卵巢癌中表达下调;4.7个hub基因被分配到关键模块1中,该模块显着富集于DNA复制和细胞周期通路;5.生存分析结果显示,MELK、CEP55和KDR的表达与高级别浆液性卵巢癌患者的总生存期显着相关。结论基于生物信息学分析的结果,MELK、CEP55和KDR可能成为高级别浆液性卵巢癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。第二部分 MT1G通过PI3K/AKT通路促进浆液性卵巢癌发生发展的机制研究目的卵巢癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。浆液性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白,在维持金属离子稳态、重金属解毒、抗氧化应激等方面发挥着重要作用。MT家族包含至少11个有功能的成员,可分为4个亚型:MT1（MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M 及 MT1X）、MT2（MT2A）、MT3 及 MT4。越来越多的研究表明,MT与肿瘤的发生发展、耐药及预后密切相关。本研究旨在确定MT各亚型在浆液性卵巢癌中的表达水平及预后价值,探讨MT1G在浆液性卵巢癌发生发展中所发挥的生物学功能及相关分子机制,为卵巢癌的靶向治疗提供新的思路。方法使用qRT-PCR检测MT各亚型在浆液性卵巢癌与正常卵巢组织中的mRNA表达水平;通过Western Blot和免疫组化法检测MT在浆液性卵巢癌、正常卵巢组织及正常输卵管伞组织中的蛋白表达。分析本中心临床样本及TCGA数据库中浆液性卵巢癌的临床病理特征及与MT表达的相关性。使用Oncomine数据库分析MT各亚型在浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达差异,同时结合qRT-PCR结果,确定差异表达最为显着的MT1G亚型为课题研究对象。通过平板克隆形成实验、CCK-8细胞增殖检测以及EdU细胞增殖实验研究MT1G异常表达对浆液性卵巢癌细胞生长和增殖的影响;通过流式细胞术分析MT1G异常表达对浆液性卵巢癌细胞周期和凋亡的影响;通过细胞划痕实验和Transwell实验检测MT1G对浆液性卵巢癌细胞迁移能力的影响。通过Western Blot检测MT1G表达改变时PI3K/AKT通路下游靶基因的表达变化。通过体内实验验证MT1G对肿瘤生长的影响。应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析MT各亚型表达对浆液性卵巢癌总生存期和无进展生存期的影响。结果1.qRT-PCR结果表明MT1A、MT1F、MT1G及MT2A在浆液性卵巢癌组织中的mRNA表达水平显着高于正常卵巢组织;Oncomine数据库分析结果显示,MT1G在浆液性卵巢癌中的表达量最高且差异最显着;2.Western Blot结果显示MT蛋白在浆液性卵巢癌组织中的表达显着高于正常卵巢组织;免疫组化结果显示MT在浆液性卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢上皮组织及正常输卵管伞组织,且MT以细胞质表达为主;3.分析浆液性卵巢癌的临床病理特征发现:患者的诊断年龄中位数在50岁以上;绝大多数浆液性卵巢癌患者初次就诊时已为III期;超过90%的浆液性卵巢癌类型为高级别浆液性卵巢癌;浆液性卵巢癌的淋巴结转移率较高;多数浆液性卵巢癌患者初次手术不能达到R0切除;4.MT表达水平与浆液性卵巢癌的组织学分级显着相关,即MT在高级别浆液性卵巢癌组织中的表达明显高于低级别浆液性卵巢癌组织;5.细胞功能实验结果表明:过表达MT1G后卵巢癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力增强;相反,干扰MT1G表达后细胞的增殖、克隆形成及迁移能力明显减弱;流式细胞术结果显示MT1G过表达可能促进浆液性卵巢癌细胞由G1向S期转变以加快细胞周期进展,并抑制细胞的凋亡;6.MT1G过表达可能激活PI3K/AKT信号通路,而干扰MT1G表达后PI3K/AKT信号通路被抑制,表明了 MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路进而影响浆液性卵巢癌的发生发展;7.皮下成瘤实验中,MT1G过表达组的皮下肿瘤体积、重量明显大于对照组;同样MT1G过表达组的肿瘤生长速度也显着快于对照组;腹腔种植实验中,MT1G过表达组较对照组有明显更高的肿瘤负荷;8.生存分析结果显示,MT1M和MT2A高表达的浆液性卵巢癌患者的总生存期及无进展生存期均显着缩短;此外,MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT3及MT4的高表达显着缩短患者的无进展生存期。结论MT在浆液性卵巢癌中多呈现高表达;MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路促进浆液性卵巢癌的发生发展;MT的高表达可能预示着浆液性卵巢癌患者的不良预后;MT有望成为卵巢癌临床治疗的新靶点。本研究创新点1.本研究重点阐述了 MT在浆液性卵巢癌发生发展中的作用和机制。首次全面分析了 MT各亚型在浆液性卵巢癌中的表达及其与生存预后的相关性,并探讨了 MT1G对浆液性卵巢癌细胞生物学行为的影响;2.首次提出了 MT1G可能通过调控PI3K/AKT信号通路参与浆液性卵巢癌的进展,可能为卵巢癌的靶向治疗提供新的方向。不足之处1.MT各亚型在不同癌症类型中存在着不同的差异表达,如MT在肝细胞癌、甲状腺乳头状癌中的表达多是下调的,其机制可能是启动子甲基化,但本研究尚未阐明MT在浆液性卵巢癌中异常表达的机制;2.既往多个研究均显示MT与肿瘤化疗耐药性的产生密切相关。本研究缺乏对MT与化疗耐药关系的研究,需进一步探讨。
亓旭晨[2]（2016）在《DNMT1介导miRNA-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的机制研究》文中提出研究背景胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤,具有侵袭性强、恶性进展快、极易复发、预后差等特点。虽然以手术为主、结合放疗和化疗为辅的综合治疗方法使胶质瘤患者的生存期有所延长,但其总体的治疗效果仍然欠佳。化疗在恶性胶质瘤临床治疗中的作用越来越被重视,而替莫唑胺是目前我们临床治疗神经肢质瘤的一线化疗药物,但替莫唑胺耐药成为胶质瘤化疗失败的主要原因。肢质瘤对替莫唑胺耐药的机制尚不完全清楚,寻找预防和治疗胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的新型靶标,对进一步提高神经胶质瘤的治疗水平具有重大意义。近年来随着微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）研究的持续深入进行,发现miRNAs在各类恶性肿瘤的发生发展中经常扮演着非常重要的角色,根据不同的靶向基因可能拥有与类似癌基因或抑癌基因的作用,且在神经胶质瘤细胞化疗耐药中也发挥着重要作用。miRNAs是一类大小约19-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,普遍存在于真核生物细胞中。大部分miRNA主要通过与靶基因mRNA3’末端非翻译区（3’ UTR）完全或不完全互补的特异性结合使其降解,偶尔也与靶基因mRNA 5’末端非翻译区（5’ UTR）结合,在转录后水平上抑制靶基因翻译,从而实现基因表达的负性调控。miR-20a是miR-17-92基因簇的一员,该基因簇共包含7个miRNAs:miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和 miR-92a-16。目前的研究显示miR-20能促进肿瘤细胞生长增殖、侵袭迁移,抑制细胞凋亡,在肢质瘤中发挥着癌基因的作用。本课题前期实验研究证明miR-20a在肢质瘤细胞内高表达且负向调控靶基因LRIG1,与促进胶质瘤细胞替莫唑胺耐药相关;LRIG1可负性调节EGFR信号通路而发挥抑癌基因作用,增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。越来越多的研究发现DNA甲基化能够调控约50%miRNAs的表达,而这其中又有约近半数的miRNAs在大量人类恶性肿瘤中存在异常的甲基化修饰。miRNAs启动子区域CpG岛甲基化程度的改变可以影响miRNA表达和下游目标mRNAs的调节。甲基转移酶（DNAmethyltransferases,DNMTs）介导的DNA甲基化是表观遗传学基因调控的一个主要手段。DNA甲基化是在DNMTs（DNMT1,DNMT3a和DNMT3b等）催化下以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体,将甲基基团转移到CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上,使得5C位点上的氢被活性甲基基团取代而转变成5-mC（5-甲基胞嘧啶）的化学修饰过程。目前研究发现DNMTs与多种癌症化疗耐药相关,但DNMTs参与胶质瘤耐药的机制尚未清楚且研究较少。综上所述,本课题旨在通过对DNMT1表达与miR-20a启动子区CpG岛甲基化水平的研究,从而发现DNA甲基化异常与miR-20a表达之间的关系,研究DNMT1调节miR-20a表达及对其靶基因LRIG1和其下游信号通路的影响,进而明确DNMT1和miR-20a参与胶质瘤替莫唑胺耐药的潜在机制。本课题研究结果有望为克服神经肢质瘤替莫唑胺耐药提供新的有效方法。目的研究DNMT1通过miR-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的分子机制。方法采用替莫唑胺长期浓度梯度递增法建立人脑胶质瘤替莫唑胺耐药模型细胞株（U251/TMZ）,并检测耐药细胞株的相关耐药基因表达水平确定耐药性。在体外实验胶质瘤细胞（U251）水平和在体内实验模式动物（裸鼠）水平分别研究验证DNMT1通过调节miR-20a表达对其靶基因LRIG1和其下游信号通路的影响而参与肢质瘤替莫唑胺耐药的机制。结果（1）人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株（U251/TMZ）成功建立,具有稳定的耐药性。（2）U251/TMZ细胞株中DNMT1的表达水平明显低于正常U251细胞株,而miR-20a表达水平明显高于正常U251细胞株。（3）DNMT1通过调节miRNA-20a基因启动子甲基化水平来调节miR-20a和LRIG1的表达。（4）miR-20a-LRIG1轴是DNMT1参与肢质瘤细胞替莫唑胺耐药的下游信号靶点。（5）DNMT1-miR-20a-LRIG1 轴调控 EGFR/AKT/mTOR信号通路活性。结论:在体外和体内实验均证明DNMT1通过调节miRNA-20a基因启动子甲基化水平来调节miR-20a表达,继而调控LRIG1的表达,并且通过miR-20a/LRIG1调控下游EGFR/AKT/mTOR信号通路参与肢质瘤细胞替莫唑胺耐药的调节机制。
胡启平[3]（2016）在《OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为的分子机制初探》文中指出目的广西是恶性程度最高、最常见的恶性肿瘤——原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）高发区。目前外科手术仍然是肝癌治疗的首选方式,然而,手术后5年复发率高达35.4%～43.5%,HCC患者预后之差,促使我们要发展一些新的辅助治疗法,肿瘤生物学治疗为其中之一。开展肿瘤生物学治疗需要对肿瘤相关分子功能有深入地认识。癌-睾丸抗原（cancer-testis antigen,CTA）是一类在肿瘤组织广泛表达、在正常组织中仅表达于睾丸的抗原,由于这一表达特异性,CTA是肿瘤生物或免疫治疗的潜在靶标。OY-TES-1是CTA家族中的一个成员,已有研究证实OY-TES-1在HCC等多种癌组织中表达,其表达量与HCC病理分级有关;在部分HCC患者血清中出现OY-TES-1抗体;体外实验还发现下调OY-TES-1可改善肝癌细胞的恶性生物行为。上述这些结果提示肝癌细胞的恶性生物行为有可能涉及OY-TES-1参与,然而尚有许多问题不清楚,如（1）OY-TES-1是否影响正常肝细胞生物学行为?（2）OY-TES-1的结构域与肝癌的恶性生物学行为有关?哪些蛋白与OY-TES-1直接作用?（3）在肝癌中OY-TES-1蛋白表达形式如何?其亚细胞定位如何?（4）OY-TES-1下调后哪些基因发生差异表达?哪些又与肝癌相关?因此,本研究通过生物信息学分析及分子生物技术探究OY-TES-1的蛋白质结构及可能的相互作用蛋白;OY-TES-1蛋白在肝癌细胞中的定位;筛选OY-TES-1下调后影响肝癌恶性生物学行为的差异表达基因;初步分析OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为的分子机制,为将来开发OY-TES-1肿瘤生物治疗奠定基础。方法（1）构建慢病毒OY-TES-1过表达载体,感染OY-TES-1阴性的正常肝细胞,采用CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术细胞周期和和凋亡,Transwell迁移实验检测迁移细胞。（2）利用在线数据库进行生物信息学分析,了解OY-TES-1蛋白特性、亚细胞定位、结构域和结构域-结构域相互作用、肝癌中共表达基因及本体注释、生物学相互作用网络等。（3）分别用OY-TES-1全长蛋白、N端截短蛋白（1-272aa）和C端截短蛋白（273-543 aa）抗体进行IFC检测肝癌细胞的OY-TES-1的表达和亚细胞定位。（4）利用RNA干扰（RNA Interferring,RNAi）技术下调肝癌细胞OY-TES-1,进行表达谱芯片筛查,通过生物信息学（DAVID基因功能富集）分析与OY-TES-1相关癌细胞增殖、周期、侵袭和凋亡相关的基因的表达,为OY-TES-1的功能的进一步研究和其相互作用蛋白的发现提供基础;（5）通过Knockdown、Knockin、荧光定量PCR（q RT-PCR）、IFC、流式细胞术等分析在DAVID功能富集分析中获得了最高的富集值和最小的P值、上调最明显的MT1F与OY-TES-1在肝癌中的相互关系及其对肝癌恶性生物学行为的影响,为阐明OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为的分子机制提供依据。结果（1）成功建构慢病毒过表达载体,实现了对正常肝细胞的OY-TES-1上调感染。正常肝细胞经OY-TES-1过表达感染后,形态上、生长和增殖能力、细胞周期、细胞凋亡均无明显变化。（2）生物信息学分析推测OY-TES-1为细胞核蛋白;OY-TES-1中可鉴定到Kazal-1,Kazal-2,PBP-sp32、TFIIF-alpha、DDHD和Plasmodium＿Vir等6个结构域,其中只有Kazal结构域与多种癌症的发生、发展或药敏性相关。POU家族蛋白和NANOG可能是OY-TES-1的相互作用蛋白之一。（3）首次发现OY-TES-1在肝癌细胞和肝癌组织中可能是以全长蛋白的形式存在的,主要分布在细胞核中;OY-TES-1对肝癌恶性生物学行为的调节可能是通过其C端来进行的。（4）OY-TES-1下调后肝癌细胞中有1051个差异表达基因,金属硫蛋白、蛋白酶、跨膜蛋白、ATPase、蛋白激酶、组蛋白、锌指蛋白等12类功能基因参与了金属结合和螯合作用、ATPase活性、蛋白定位、跨膜运输、磷脂酶活性等10项功能调节;98个基因的表达特性与肝癌细胞中OY-TES-1下调后其恶性生物学行为下调相一致、14个基因与癌通路相关;77个差异表达基因参与了10条通路的调节,其中28个基因为细胞增殖、周期、迁移和细胞凋亡等生物学过程的调节基因;家族的各成员表达明显上调,其中MT1F获最高富集值和最小P值,提示MT1F与OY-TES-1可能参与影响肝癌细胞恶性生物学行为。（5）成功构建和制备了OY-TES-1干扰、MT1F干扰和MT1F过表达的慢病毒表达载体,感染肝癌细胞后构建了OY-TES-1下调、OY-TES-1+MT1F双下调、MT1F上调和OY-TES-1下调+MT1F上调等细胞模型;OY-TES-1下调、OY-TES-1下调+MT1F上调及MT1F过表达均抑制肝癌细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡、导致S期阻滞,3组细胞中对肝癌恶性生物学行为抑制能力从强到弱依次为:OY-TES-1下调>OY-TES-1下调+MT1F上调>MT1F过表达。OY-TES-1+MT1F双下调不引起上述改变或改变程度远低于OY-TES-1下调、OY-TES-1下调+MT1F上调及MT1F过表达。结论（1）OY-TES-1上调对正常肝细胞的生物学行为没有影响,可能与肝细胞恶变及肝癌的发生过程无关。（2）OY-TES-1的6个结构域中的Kazal结构域可能是OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为依赖的主要结构域。POU家族蛋白和NANOG可能是OY-TES-1的相互作用蛋白之一。（3）OY-TES-1在肝癌细胞和肝癌组织中可能是以全长蛋白的形式存在,OY-TES-1主要分布在细胞核中;OY-TES-1对肝癌的恶性生物学行为的影响可能是通过其C端进行。（4）OY-TES-1对肝癌细胞恶性生物学行为的调节除与增殖、迁移、细胞周期和细胞凋亡相关外,还涉及到离子转运与结合、蛋白降解、蛋白激活、表观遗传、结构完整性、转录调节等,表明OY-TES-1下调减弱肝癌细胞的恶性生物学行为是多基因、多水平、多过程综合作用的结果。（5）OY-TES-1下调所引起肝癌细胞增殖抑制、迁移下调、凋亡上调和S期阻滞与MT1F上调密切相关。肝癌细胞中OY-TES-1对MT1F的表达调节可能是通过调节MT1F的转录因子POU2F1的活性来进行的。
吴立权[4]（2013）在《BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞化疗敏感性的作用及机制研究》文中指出脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,因其侵袭性、高复发率等特征,治疗方法目前尽管由单一手术治疗发展到手术为主联合放射及化学治疗的综合治疗方案,但患者预后并没有得到明显改善。研究表明新型化疗药物可使恶性脑胶质瘤病人生存获益,但延长生存的作用有限。肿瘤耐药是化疗失败的主要原因,尤其是肿瘤的多药耐药性（MDR）,是肿瘤耐药的常见方式,更是当前化疗中亟需解决的难题。BMP是TGF-p家族中一个很重要的亚家族,是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白。近年研究发现,BMP不仅在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用,而是涉及几乎全身所有系统,在中胚层的诱导和分化、造血组织的形成和发育、神经系统的发育和修复,多种恶性肿瘤的发生、发展及预后等方面都起着重要作用。但BMP4与肿瘤尤其是胶质瘤的化疗敏感性的关系目前研究尚较少。本课题对BMP4调控U251耐药细胞株化疗敏感性的作用及机制展开体外研究,首先建立替莫唑胺诱导的胶质瘤耐药细胞株,再研究BMP4对胶质瘤耐药特性及相关基因表达的影响,最后初步探讨BMP4调控胶质瘤耐药细胞耐药性的可能机制。第一部分人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ的建立及其生物学特性研究目的：在体外建立对替莫唑胺耐药的人脑胶质瘤细胞株,对于进一步探讨胶质瘤耐药的分子机制以及寻求逆转胶质瘤耐药的有效策略,提高胶质瘤的化疗效果有重大意义。同时观察耐药细胞的生物学特性及检测耐药相关基因在耐药细胞中的表达情况。方法：采用不同梯度浓度的替莫唑胺（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/ml）递增作用于U251细胞,使其产生耐药性。光镜观察细胞生长形态；通过细胞计数计算细胞倍增时间；MTT法检测其耐药性；流式细胞仪检测耐药细胞株细胞周期的变化；RT-PCR法检测耐药细胞株中MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1等耐药基因的表达变化情况。结果：采用间歇浓度递增法成功建立了胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ,光学显微镜下可见耐药细胞胞体增大,呈多形性,胞核呈增大的明显不规则状,胞质内的颗粒样物质增多：U251/TMZ的倍增时间为（14.64±1.98）h,亲本细胞系U251的倍增时间为（10.26±1.03）h,两者相比较有明显差异性；MTT法检测其对替莫唑胺的细胞耐药倍数为6.13倍；流式细胞仪检测细胞周期结果显示U251/TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和S期明显减少,G2/M期明显增多。RT-PCR检测U251/TMZ耐药细胞株中的MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1等耐药基因的表达,发现其表达含量均明显上调。结论：采用间歇替莫唑胺浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤细胞系U251/TMZ多药耐药系,且其耐药性稳定,耐药细胞株中MDR1、BCL-2、MRP5、LRP1的表达明显上调,可能与其耐药性的形成有关。第二部分BMP4与人脑胶质瘤化疗耐药的相关性研究目的：骨形成发生蛋白4（BMP4）是一种多功能因子,其与人体生长发育及多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,但与肿瘤化疗耐药的关系目前尚不清楚,本课题探讨BMP4在人胶质瘤组织细胞中与耐药相关基因MnSOD、BCL-2表达的关系,并分析BMP4与胶质瘤细胞化疗耐药的相关性及对耐药细胞耐药性逆转的作用。方法：构建含有98例不同级别人脑星形胶质细胞瘤标本的组织芯片,评估胶质瘤标本中BMP4与MnSOD、BCL-2在不同级别胶质瘤中表达的相互关系。在诱导建立胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ过程中,检测BMP4随TMZ药物浓度的递增其表达含量的变化。将BMP4质粒体转染U251/TMZ耐药细胞中,检测耐药细胞对TMZ化疗敏感性的变化。结果：在人体胶质瘤标本中,BMP4表达强度与MnSOD表达呈负相关（r=-0.3835,P<0.05）,与BCL-2表达呈负相关γ=-0.2391, P<0.05), U251/TMZ耐药细胞株成功构建后其BMP4表达明显降低,提示BMP4可能与胶质瘤的耐药性相关。将BMP4质粒体转染耐药细胞株后,细胞耐药性被成功逆转,替莫唑胺作用下耐药细胞抑制率明显上升。结论：BMP4在人脑胶质瘤组织中与耐药基因MnSOD、BCL-2的表达明显相关,BMP4在U251/TMZ耐药细胞株中的表达明显下降,BMP4的表达与胶质瘤的耐药性密切相关。将BMP4转染到U251/TMZ胶质瘤耐药细胞株中,替莫唑胺作用下可明显提高耐药细胞的生长抑制率,证实其可调控胶质瘤耐药细胞的化疗敏感性。第三部分BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ化疗敏感性的作用机制研究目的：BMP4调控胶质瘤耐药细胞的化疗敏感性机制目前尚不清楚,本课题研究BMP4逆转U251/TMZ耐药细胞化疗耐药的作用及可能机制,探讨BMP4及其介导的相关信号通路在调控U251/TMZ耐药细胞株化疗敏感性中的作用机制。方法：BMP4质粒转染U251/TMZ耐药细胞,MTT检测转染后替莫唑胺作用下细胞的活性变化,Western-blotting检测细胞中MDR1、BCL-2、TopoⅡ的表达变化。检测转染后U251/TMZ耐药细胞中Smad1/5/8、p38的磷酸化水平。替莫唑胺作用下分别阻断BMP/Smad及p38MAPK信号途径,MTT法检测耐药细胞的活性,Western-blotting检测MDR1、BCL-2、TopoⅡ的表达变化。结果：转染了BMP4质粒的耐药细胞株,在替莫唑胺作用下,细胞活性明显下降,显示BMP4可增强U251/TMZ耐药细胞株的化疗敏感性。转染BMP4后,U251/TMZ耐药细胞中BCL-2的表达下降、Topo Ⅱ的表达增加,同空白转染组比较有明显的统计学差异（P<0.05）,MDR1表达降低,同空白转染组间无明显统计学差异（P>0.05）。BMP4质粒转染入U251/TMZ耐药细胞中后,Smad和p38MAPK信号通路均被激活。分别阻断耐药细胞中的BMP/Smad和p38MAPK信号通路,替莫唑胺作用下耐药细胞生长抑制率明显下降。RNAi阻断Smad通路后,BCL-2的表达明显上升,Topo Ⅱ的表达明显下降,与干扰前相比较,有显着的统计学差异（P<0.05）,MDR1的表达上升,但与干扰前相比较,没有显着统计学差异（P>0.05）,特异性阻断剂阻断p38MAPK信号通路后,耐药细胞中BCL-2、MDR1的表达明显升高,Topo Ⅱ的表达明显降低,与未阻断的耐药细胞相比较,有显着的统计学差异（P<0.05）。结论：BMP4可调控胶质瘤U251/TMZ耐药细胞株的化疗敏感性,其机制与调节耐药细胞中BCL-2. TopoⅡ的表达变化密切相关。BMP4可激活耐药细胞中Smad和p38MAPK信号通路,BMP4可能通过BMP/Smad和p38MAPK信号通路反馈调控U251/TMZ耐药细胞中BCL-2、TopoⅡ的表达。
范益民,刘晓东,王宏勤[5]（2011）在《胶质瘤耐药机制的相关研究进展》文中提出2000年K1eihues和Cavenee对WHO神经系统肿瘤进行了分类,将其分为七大类,其中神经上皮组织肿瘤发病率最高,其分类及分型最多。神经胶质瘤（简称胶质瘤）在神经上皮组织肿瘤中的发病率约占50%[1]。胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,而且是人类肿瘤中生存预后最差肿瘤之一[2-3]。
刘晓东[6]（2011）在《p53上调凋亡调控因子在人类脑胶质瘤中的表达及其增强化疗敏感性的研究》文中研究指明研究背景逆转胶质瘤耐药成为治疗胶质瘤的重要策略，但对胶质瘤耐药发生机制的认识仍存在争议。肿瘤耐药与其高表达耐药基因相关的看法达成了共识；组成肿瘤组织的细胞存在异质性，即由不同亚型细胞组成也是众所周知的事实，然而早先认为相关耐药基因表达是群体细胞的作用，而较少注意到因细胞异质性引发的差别。近年来肿瘤干细胞学说的提出，为解释肿瘤异质性导致肿瘤分子生物学行为差异提供了理论依据，为研究肿瘤细胞生物学特性、解释肿瘤耐药的原因等提供了新思路。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下程序性死亡的过程，对生物维持组织稳态和个体生长发育有重要的调控作用，凋亡是涉及细胞层面的一个重要生物学行为，由于大多数化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用，所以细胞凋亡通路的异常改变是肿瘤耐药的又一重要机制。逆转肿瘤耐药的研究需要我们重视凋亡调控在肿瘤细胞产生耐药性中的地位及其作用机制。从胶质瘤干细胞层面寻找耐药根源，寻找关键基因、明确凋亡通路异常机制及其相互关系是增强肿瘤对化疗药物敏感性研究的有效途径。本项目在既往研究基础上，从胶质瘤干细胞异质性入手，以胶质瘤凋亡相关的p53上调凋亡调控因子（PUMA）为切入点，以凋亡通路为主线，应用基因转染、RT-PCR、Western-blot方法，从体内体外干预实验探讨PUMA在增强胶质瘤细胞对化疗药物替莫唑胺敏感性的作用机制，即PUMA高表达或激活PUMA促进胶质瘤细胞凋亡并逆转耐药；PUMA可能调控机制：①PUMA维持细胞抗凋亡与促凋亡系统的平衡，其功能缺失，导致凋亡系统失衡，从而发生耐药；②PUMA低表达影响细胞生长周期，使得细胞能够避开化疗药物作用的有效周期，导致细胞耐药；③PUMA调控耐药相关蛋白表达，PUMA对耐药分子的调控异常与耐药发生密切相关。④激活处于G0/G1期的胶质瘤干细胞，使其进入化疗药物的有效作用周期，导致细胞内凋亡触发。本研究从细胞异质性及凋亡调控两方面寻找胶质瘤耐药的根源，并提出PUMA逆转胶质瘤耐药的调控通路模式，为防治胶质瘤化疗耐药提供新思路。研究目的：1.探讨促凋亡基因PUMA在人类脑胶质瘤中的表达，及其与Bcl-2、Bax蛋白表达的相关性。2.探讨体外转染PUMA的人类脑胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性增强的作用机制。3.通过体内实验探讨外源性PUMA对人类脑胶质瘤细胞生长的影响及其增强胶质瘤细胞对替莫唑胺（TMZ）敏感性的机制。4.探讨基于CD133免疫原型的胶质瘤干细胞耐药性的差异以及PUMA改变胶质瘤细胞对TMZ敏感性的研究。研究方法：1.应用免疫印迹法（Western blotting.WB），检测10例正常脑组织及52例脑胶质瘤瘤组织中PUMA、Bcl-2、Bax蛋白的表达，通过计算吸光度比值求得各蛋白相对表达量并统计分析结果。2.将人类脑胶质瘤细胞U87MG细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养，分别将MOI=50的空载体腺病毒（Ad-△BH3）和携带PUMA的重组腺病毒（Ad-PUMA）转染U87MG细胞，转染后用MTT比色法测定各组细胞的存活率并计算IC50，流式细胞仪检测细胞周期的变化，应用TUNEL法检测细胞的凋亡情况。Western blot检测凋亡相关蛋白P53、Bax的表达。3.建立人类脑胶质瘤细胞株U87MG裸鼠皮下移植瘤模型，将胶质瘤裸鼠随机分为四组，于建模2周后，分别自腹腔注射生理盐水100μl （对照组，n=8）、2×108 pfu/100μlAd-PUMA （ PUMA组，n=8）、TMZ 10mg/kg （TMZ组，n= 8）和2×108 pfu/100μl Ad-PUMA+ TMZ 10mg/kg （联合组，n= 8）。治疗20天后处死裸鼠，剖腹测量原位肿瘤体积、抑瘤率。TUNEL检测肿瘤细胞凋亡情况。半定量RT-PCR和Western blot检测DNA损伤修复蛋白MGMTmRNA和MGMT蛋白表达情况。4.将分选出的CD133+和CD133- U87细胞分别进行传代培养，应用WB，RT-PCR，基因转染流式细胞分析等方法观察外源性PUMA、TMZ干预前后两群细胞的生长变化情况。研究结果：1. PUMA蛋白、Bax、Bcl-2蛋白表达在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中与正常脑组织有统计学意义（P<0.01），Ⅰ级胶质瘤与对照组表达无统计学意义（P>0.05）。病理分级与PUMA、Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达相关（rPUMA=-0.925,rBax =-0.931,rBcl-2=0.945,P均<0.001）。PUMA和Bax、Bcl-2蛋白的表达相关（r1=0.963,r2=-0.937 P＜0.001）。2.外源性PUMA基因在Ad-PUMA转染U87MG 48h后，随着时间延长，PUMA表达使U87MG细胞的增殖能力降低并诱导凋亡，转染24、48、72h的生长抑制率分别为17.3%、35.6%、43.3%，凋亡率分别为20.3%、31.4%、45.4%。正常对照组、Ad-PUMA、Ad-△BH3组细胞的TMZ IC50分别为（15±1.9）、（2.3±0.14）和（14.4±1.6）μmol/L。PUMA表达的U87MG细胞DNA合成受到抑制，周期阻滞在G2期；Western blot检测显示P53表达在各组中差别无统计学意义（P>0.05）、PUMA和Bax在实验组中表达较对照组强，差别有统计学意义（P<0.01）。3.治疗20天时对照组、PUMA组、TMZ组、联合组诱发肿瘤瘤体积分别为（3.68±0.16）、（2.63±0.22）、（2.13±0.16）、（0.97±0.18）cm3四组体积进行两两比较差别有统计学意义（P均<0.05）。治疗组抑瘤率分别为28.5%、42.1%、73.6%，两两比较差别有统计学意义（P均<0.05）。TUNEL染色并计算凋亡指数（AI）：对照组（2.0±1.2）%、Ad-PUMA组（11.4±2.6）%、TMZ组（7.6±3.2）%、联合组（20.6±8.6）%进行两两比较差别有统计学意义（P均<0.05）。半定量RT-PCR和Western blot检测显示MGMT mRNA和MGMT蛋白在TMZ组中表达最高、与其他三组比较差异有统计学意义（P均< 0.05）。4. CD133阳性免疫磁珠分选出胶质瘤干细胞，CD133+胶质瘤干细胞IC50较CD133-胶质瘤干细胞高，CD133+胶质瘤干细胞对替莫唑胺不敏感。CD133+胶质瘤干细胞IC50较CD133-胶质瘤干细胞低（P < 0.05）。将分选出的CD133+胶质瘤干细胞进行分组干预，检测细胞凋亡率，联合组细胞凋亡率与其他组比较差别有显着统计学意义（P < 0.05）结论：1. PUMA可能是胶质瘤的一个重要的预后标记物。PUMA可通过促进肿瘤细胞凋亡，对脑胶质瘤的发生、发展起作用；PUMA可能与凋亡相关基因Bax、Bcl-2在脑胶质瘤的凋亡中分别起协同和拮抗作用。2. Ad-PUMA转染可有效增强人类脑胶质瘤细胞U87MG细胞对替莫唑胺的敏感性，抑制人类脑胶质瘤细胞U87MG细胞的增殖，通过诱导细胞G2期阻滞促进其凋亡，促凋亡机制不依赖于P53。3. Ad-PUMA联合TMZ具有协同抑制胶质瘤生长作用，其机制可能与Ad-PUMA促进凋亡和抑制MGMT表达有关。4. Ad-PUMA联合TMZ可以促进耐药的责任细胞胶质瘤干细胞凋亡，从而增强胶质瘤对化疗敏感性。
张晓丽,薄爱华[7]（2009）在《金属硫蛋白与肿瘤相关性的研究进展》文中认为
康俊龙[8]（2008）在《Survivin、Caspase-3在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响》文中指出目的:研究Survivin、Caspase-3和Ki-67在胶质瘤中的表达及意义。为探讨胶质瘤发生发展机制提供一些实验依据,为胶质瘤的基因诊断和治疗提供新的靶点。方法:用免疫组化法（ElivisionTM plus）检测Survivin、Caspase-3和Ki-67蛋白在68例原发和15例复发胶质瘤及10例内减压脑组织中的表达;用原位杂交法检测胶质瘤和脑组织中Survivin、Caspase-3mRNA的表达;应用TUNEL法检测68例原发胶质瘤细胞凋亡情况。结果:1、①Survivin、Ki-67蛋白在脑组织及胶质瘤中的阳性表达率有显着差异。Survivin、Ki-67蛋白在Ⅲ、IV级星形细胞瘤的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ级星形细胞瘤。原发、复发胶质瘤中Survivin、Ki-67蛋白的强阳性表达率比较均有统计学差异。②Caspase-3蛋白在脑组织与胶质瘤中以及各级别胶质瘤中的阳性表达率均没有显着差异。原发、复发胶质瘤中Caspase-3蛋白的强阳性表达率没有统计学差异。③Survivin、Ki-67蛋白表达呈正相关,Survivin、Caspase-3蛋白表达呈负相关,Caspase-3、Ki-67蛋白呈负相关。2、①Survivin mRNA在脑组织及胶质瘤中的阳性表达率有显着差异。Survivin mRNA在Ⅲ、IV星形细胞瘤的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ级星形细胞瘤。②Caspase-3 mRNA在脑组织与胶质瘤中以及各级别胶质瘤中的阳性表达率没有显着差异。③Survivin、Caspase-3 mRNA的表达呈负相关。3、胶质瘤的AI范围是7-29%,平均16.59±6.19%。Survivin、Ki-67蛋白阳性组的AI值明显小于阴性组。Caspase-3蛋白阳性组的AI值明显大于阴性组。结论:1、Survivin、Ki-67基因的强阳性表达可看作胶质瘤复发的一个高危因素。2、Survivin、Ki-67基因的高表达可作为胶质瘤分化不良的标志。3、Caspase-3在脑组织与胶质瘤之间以及各级别胶质瘤中表达无显着性差异。4、Survivin直接或间接抑制Caspase-3的表达,从而促进胶质瘤的发生、发展;Survivin和Ki-67基因在胶质瘤的发生、发展中起着协同或相互调节作用;胶质瘤的进展伴有凋亡减少、增殖增强。5、Survivin阳性组、阴性组的平均细胞凋亡指数有显着差异。Caspase-3阳性组、阴性组的平均细胞凋亡指数有显着差异。6、Survivin作用于凋亡途径的汇集点,同时又仅在肿瘤组织中特异地存在,它是促细胞凋亡治疗最理想的靶点之一。Survivin将成为胶质瘤基因诊断和靶向治疗研究的新方向。
徐松柏[9]（2008）在《RNAi沉默PTTG基因对人胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制的研究》文中研究表明胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,恶性程度高,早期诊断困难,根治机会较少,五年生存率低。研究显示,PTTG的高表达与多种肿瘤的发生、发展及侵袭进程密切相关,然而,它与胶质瘤发生发展的具体相关关系迄今尚不十分清楚。故本研究应用免疫组化法探讨了PTTG在胶质瘤组织中的表达与临床病理特征之间的关系,并进一步以多种体外培养的人胶质瘤细胞系—U87、U251及SHG-44细胞为对象,利用RNAi技术沉默其中PTTG基因的表达,观察其对人胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响并探讨其可能的作用机制。结果显示PTTG在人脑胶质瘤中表达升高,并与胶质瘤的病理分期、血管形成密切相关。所构建的RNAi表达质粒能够有效地转染胶质瘤细胞系并高效地沉默PTTG基因。RNAi沉默PTTG基因表达后,明显地改变了人胶质瘤细胞恶性生物学行为,表现为降低细胞增殖能力,诱导细胞凋亡的增加,明显降低细胞迁移速度及侵袭能力。首次发现RNAi沉默PTTG基因使细胞内质网扩张、细胞内钙储存增加,推测PTTG基因沉默影响了细胞内Ca2+信号系统,从而使胶质瘤细胞发生多种生物学行为的改变。首次发现RNAi沉默PTTG基因表达导致了Bcl-2家族蛋白的明显改变,结合caspase蛋白表达的变化,提示RNAi沉默PTTG基因表达引起的胶质瘤细胞凋亡与线粒体介导的细胞凋亡途径有关。本研究提示:针对PTTG基因表达产物的检测,将有助于对胶质瘤的恶性程度及侵袭性等做以辅助判断,指导胶质瘤的手术及进一步的治疗;RNAi技术可以作为沉默胶质瘤中PTTG基因的有效方法;而靶向PTTG的基因治疗,可能为胶质瘤的治疗提供新的策略。目前,国内外尚未见应用RNAi技术沉默PTTG基因对人胶质瘤进行抑制的相关报道。
毕长龙[10]（2007）在《脑肿瘤干细胞的多药耐药性及其机理研究》文中研究表明目的：第一章旨在应用免疫磁珠法从神经上皮肿瘤中分选CD133阳性（CD133+，脑肿瘤干细胞，BTSC）和CD133阴性（CD133-，分化成熟肿瘤细胞，TC）细胞；观察CD133+细胞和CD133-细胞的体外增殖特性和单克隆形成过程。第二章主要目的是探讨脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cells，BTSC）特征性标志物Nestin在不同病理级别的神经上皮肿瘤组织及CD133+细胞中的表达情况和临床意义。第三章重点分析比较ABC超家族转运体多药耐药蛋白MDR1、MRP1在CD133+细胞和肿瘤组织水平中的蛋白表达情况，细胞水平的活性表达情况；探讨ABC超家族转运体蛋白的耐药机理。第四章旨在分析比较DNA修复酶MGMT耐药基因在CD133+细胞和CD133-细胞中的表达情况；探讨烷化剂类抗肿瘤药物的耐药机制。方法：第一章中选取35例人脑胶质瘤、8例人脑室管膜瘤组织标本，利用免疫磁珠法分选收集CD133+细胞和CD133-细胞；分析免疫磁珠法纯化CD133+细胞的比例，并在体外应用无血清悬浮培养法（神经干细胞培养条件）进行CD133+细胞的扩增培养与传代：利用单克隆形成实验观察不同分化程度的CD133+细胞的增殖能力，BrdU掺入实验检测CD133+细胞形成脑肿瘤干细胞球（brain tumor neurospheres，BTS）的增殖过程。第二章选取30例人脑胶质瘤和3例转移癌作为研究对象，免疫组化法和RT-PCR分别检测不用病理级别神经上皮肿瘤组织及CD133+细胞中“干性”蛋白Nestin的表达情况，并与CD133+细胞的单克隆形成率作比较。第三章利用免疫磁珠法分选CD133+细胞（悬浮细胞，BTSC）和CD133-细胞（粘附细胞，TC），并采用细胞悬浮培养法进行CD133+细胞的体外扩增培养与传代，以获得足量的CD133+细胞。应用半定量RT-PCR法检测BTSC与TC中ABC超家族转运蛋白多药耐药基因MDR1、MRP1的分子水平表达情况；免疫组化和荧光法分别检测肿瘤组织水平与CD133+细胞水平中P-gp、MRP1耐药蛋白表达情况；探讨ABC超家族转运体蛋白多药耐药的机理。第四章选取25例人脑胶质瘤组织标本，RT-PCR法分析比较CD133+细胞和CD133-细胞间MGMT分子水平表达情况，探讨MGMT在烷化剂类抗胶质瘤药物耐药性方面的机制。结果：第一章的研究结果表明利用免疫磁珠法可从全部的神经上皮肿瘤病例中成功的分选出CD133阳性和阴性细胞；CD133+细胞在不同病理级别的神经上皮肿瘤中纯化的比例有差异性；CD133+细胞具有异常病理性增殖能力，肿瘤病理级别（恶性程度）越高，其增殖能力越强；CD133+细胞的单克隆形成率和肿瘤的恶性程度正相关；3例来源于脑胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞能在适合的培养条件下形成干细胞球和进行1-3次的传代。第二章的研究结果表明Nestin阳性细胞比例及分子表达水平在不同病理级别肿瘤中有差异性，与肿瘤的恶性程度正相关；GFAP在不同病理级别的神经上皮肿瘤中的表达有差异性，与肿瘤的恶性程度负相关；CD133+细胞高表达“干性基因”Nestin mRNA，而CD133-细胞几乎无表达；高级别的肿瘤中Nestin阳性细胞表现为细胞核大而深染，异型性核团明显；低级别的肿瘤和转移瘤中Nestin表达较弱或无表达；Nestin在肿瘤血管内皮细胞中染色阳性比例最高，和肿瘤病理级别无关，但随着肿瘤病理级别的增加，染色强度增高及明显的核异型性；在不同病理级别肿瘤中Nestin阳性细胞比例和CD133+细胞增殖能力相一致。第三章的研究结果表明P-gp在胶质瘤组织和CD133+细胞中的阳性率分别为33．3％、76．7％，阳性细胞比例分别为12％-38％，18％-67％；MRP1在胶质瘤组织和CD133+细胞中的阳性率分别为63．3％、86．3％，阳性细胞比例分别为18％-44％，23％-73％；CD133+细胞组和肿瘤组中各病理级别间的阳性细胞比例比较均有显着性差异，这两者之间阳性率和阳性细胞比例比较亦有显着性差异；耐药蛋白表达阳性细胞在整体肿瘤细胞中所占的细胞比例和肿瘤的恶性程度正相关，而表达阳性率和肿瘤的病理级别无关；P-gp与MRP1耐药蛋白及其活性在CD133+细胞中高度表达，而在CD133-细胞中几乎无表达；MDR1与MRP1在CD133+细胞中的活性表达分别为在CD133-细胞中的16．1倍和19．6倍。第四章的研究结果表明CD133+细胞高水平表达DNA修复酶MGMT mRNA；而CD133-细胞无MGMT耐药基因的表达：MGMT在CD133+细胞中的活性表达是在CD133-细胞中的34倍；并非所有的CD133+细胞均有MGMT活性表达；CD133+细胞中MGMT和MRP1、P-gp的表达具有明显的相关性。结论：神经上皮肿瘤组织中存在一定比例具有异常增殖能力的CD133+细胞，利用免疫磁珠法能成功的分选纯化肿瘤组织中的CD133+细胞与CD133-细胞；CD133+细胞的增殖特性和肿瘤的恶性程度相关；BTSC比NSC具有更为强大的增殖能力；在神经上皮肿瘤组织中Nestin及其活性表达检测是评价CD133+细胞生物学行为的有效方法；Nestin和GFAP在肿瘤组织中的表达水平呈互补性，两者共同参与了肿瘤的恶性进程；Nestin与CD133在神经上皮肿瘤组织中的表达可以代表BTSC的含量，是临床上判断其恶性程度与预后的有力依据和独立因素；Nestin蛋白及其活性表达上调可能是肿瘤恶性转化的重要机制之一；Nestin可作为神经上皮肿瘤恶性进程中肿瘤血管内皮细胞增殖的标志物；神经上皮肿瘤中仅有小部分细胞亚群（CD133+细胞，即脑肿瘤干细胞）具有内在的耐药活性，而且在BTSC中天然性耐药比获得性耐药更为重要；ABC转运体耐药蛋白和MGMT在CD133+细胞中的共同过度表达是脑肿瘤耐药的主要原因；CD133+细胞具有较强的DNA修复能力，MGMT在CD133+细胞中的高度表达和烷化剂类药物耐受相关；BTSC是神经上皮肿瘤化疗耐药的根源和关键性治疗标靶；CD133阳性细胞高度表达Nestin干性基因表明BTSC是静止性的细胞，传统的化疗药物不能消除BTSC，同时BTSC高度表达多种耐药酶活性，这些特性为今后临床诊断和综合治疗提供了新的思路和靶向治疗领域。
二、金属硫蛋白在人脑胶质瘤中的表达及生物学意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金属硫蛋白在人脑胶质瘤中的表达及生物学意义（论文提纲范文）
（1）高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 鉴定高级别浆液性卵巢癌诊断及预后评估的生物标志物 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MT1G通过PI3K/AKT通路促进浆液性卵巢癌发生发展的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 金属硫蛋白在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）DNMT1介导miRNA-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 参考文献 |
| 2. 第一部分 替莫唑胺耐药人脑胶质瘤细胞株(U251/TMZ)的构建及验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251 /TMZ)的成功建立 |
| 2.2.2 人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251/TMZ)细胞形态学观察 |
| 2.2.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251 /TMZ)的相关耐药基因表达 |
| 2.2.4 流式细胞术检测人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251/TMZ)的细胞凋亡水平 |
| 2.2.5 CCK-8法检测人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251/TMZ)对替莫唑胺的耐受性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 3. 第二部分 体外实验探究DNMT1通过miR-20a调控胶质瘤替莫唑胺耐药性的机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 DNMT1通过调节miRNA-20a基因启动子甲基化水平来调节miR-20a和LRIG1的表达 |
| 3.2.2 DNMT1通过miR-20a-LRIG1轴调控胶质瘤细胞耐药性 |
| 3.2.3 DNMT1-miR-20a-LRIG1轴调控mTOR的活性 |
| 3.2.4 DNMT1-miR-20a-LRIG1轴调控EGFR/AKT信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 4. 第三部分动物体内实验验证DNMT1通过miR-20a对EGFR/AKT/mTOR的调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 DNMT1对U251/TMZ细胞株体内生长的影响 |
| 4.2.2 DNMT1体内调控LRIG1表达水平和EGFR/AKT/mTOR信号通路 |
| 4.2.3 DNMT1体内调控miR-20a表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 参考文献 |
| 5. 结论 |
| 综述 微小核糖核酸在胶质瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为的分子机制初探（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 OY-TES-1对正常肝细胞生物学功能的影响 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 主要试剂及消耗品 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 1.2.1 载体构建 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 OY-TES-1过表达载体包装 |
| 1.2.4 转染预实验 |
| 1.2.5 正式转染实验 |
| 1.2.6 嘌呤霉素筛选浓度的确立 |
| 1.2.7 感染后OY-TES-1表达鉴定 |
| 1.2.8 免疫荧光细胞化学观察转染后细胞的形态变化 |
| 1.2.9 CCK-8比色法分析细胞增殖 |
| 1.2.10 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.2.11 细胞凋亡检测 |
| 1.2.12 Transwell迁移实验(Transwell migration assay) |
| 二、结果 |
| 2.1 成功构建OY-TES-1过表达慢病毒载体和感染正常肝细胞 |
| 2.2 OY-TES-1过表达后细胞形态无明显变化 |
| 2.3 OY-TES-1过表达后细胞增殖能力无明显变化 |
| 2.4 OY-TES-1过表达后细胞周期没有明显变化 |
| 2.5 OY-TES-1过表达后对细胞凋亡没有影响 |
| 2.6 OY-TES-1过表达后细胞迁移能力没有明显变化 |
| 三、讨论 |
| 3.1 OY-TES-1上调对肝细胞的生物学行为没有影响 |
| 3.2 OY-TES-1上调OY-TES-1可能与肝细胞恶变无关 |
| 四、本章小结 |
| 本章参考文献 |
| 第二章 OY-TES-1的结构域、亚细胞定位及相互作用蛋白的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1.1 OY-TES-1基因序列 |
| 1.1.2 OY-TES-1蛋白序列 |
| 2 实验方法 |
| 1.2.1 蛋白质跨膜片段和可溶性预测 |
| 1.2.2 亚细胞定位分析 |
| 1.2.3 结构域和结构域-结构域相互作用分析 |
| 1.2.4 肝癌中OY-TES-1共表达基因的ONCOMINE分析 |
| 1.2.5 OY-TES-1共表达基因基因本体(Gene Ontology,GO)注释 |
| 1.2.6 OY-TES-1共表达基因的COREMINE文献共现分析 |
| 1.2.7 通过Gene MANIA生成生物学相互作用网络 |
| 二、结果 |
| 2.1 OY-TES-1可能为可溶性蛋白 |
| 2.2 OY-TES-1可能是核蛋白 |
| 2.3 OY-TES-1中可鉴定到6个结构域 |
| 2.4 肝癌中60个基因被发现与OY-TES-1共表达 |
| 2.5 9个OY-TES-1共表达基因参与生物学过程调节 |
| 2.6 8个OY-TES-1共表达基因共现于肝癌中 |
| 2.7 NANOG、POU family等可能是OY-TES-1的最佳候选互作蛋白 |
| 三、讨论 |
| 3.1 推测OY-TES-1蛋白应主要分布于细胞核中 |
| 3.2 OY-TES-1对肝癌等癌症生物学行为的影响可能是通过其C端进行的 |
| 3.3 8个OY-TES-1共表达基因与肝癌细胞增殖、迁移和/或凋亡有关 |
| 3.4 POU家族蛋白和NANOG可能是OY-TES-1的相互作用蛋白 |
| 四、本章小结 |
| 本章参考文献 |
| 第三章 肝癌细胞中OY-TES-1蛋白的表达及定位 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂及消耗品 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 RT-PCR |
| 1.2.3 IHC、ICC、IFC和IFHC |
| 二、结果 |
| 2.1 肝癌细胞表达OY-TES-1 mRNA |
| 2.2 OY-TES-1及其C-端、N-端截短蛋白主要在肝癌细胞核中表达 |
| 2.3 肝癌组织中OY-TES-1及其C、N端截短蛋白均主要在细胞核中表达,癌旁组织中无表达 |
| 三、讨论 |
| 3.1 OY-TES-1在肝癌组织中是可能是以全长蛋白的形式存在 |
| 3.2 肝癌细胞中OY-TES-1蛋白主要分布于细胞核中 |
| 四、本章小结 |
| 本章参考文献 |
| 第四章 肝癌中与OY-TES-1相关的差异表达基因筛选 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1.1细胞株 |
| 1.1.2主要试剂及消耗品 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 OY-TES-1 siRNA的设计与合成 |
| 1.1.5 OY-TES-1蛋白序列 |
| 2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养(具体见第二章1.2.2) |
| 1.2.2 siRNA转染 |
| 1.2.4 表达谱芯片分析 |
| 1.2.5 基因功能注释和分类 |
| 1.2.6 差异表达基因的RT-qPCR验证 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 二、结果 |
| 2.1 RNAi后OY-TES-1表达下调 |
| 2.2 OY-TES-1下调后1051个基因表达改变2倍以上 |
| 2.3 功能注释中,金属硫蛋白的“金属结合和螯合作用”富集值最大 |
| 2.4 功能聚类中,金属硫蛋白富集值最大 |
| 2.5 217个差异表达基因参与肝癌细胞的生物学行为调节 |
| 2.6 164个差异表达基因参与Pathways in cancer等10条通路的调节 |
| 2.7 RT-qPCR验证OY-TES-1下调后MT1F和MT1E表达上调 |
| 三、讨论 |
| 3.1 OY-TES-1下调后金属硫蛋白等12类基因表达发生明显变化 |
| 3.2 金属硫蛋白与OY-TES-1下调关系最密切 |
| 3.3 OY-TES-1下调后98个基因与肝癌细胞生物学行为改变密切相关 |
| 3.4 ATP酶及其活性调节相关基因表达与OY-TES-1下调关系密切 |
| 3.5 OY-TES-1下调的生物学行为变化与蛋白降解或激活、转录调节等过程密切相关 |
| 四、本章小结 |
| 本章参考文献 |
| 第五章 OY-TES-1与MT1F表达关系及其对肝癌恶性生物学行为影响分析 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1. 1.1细胞株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 主要试剂及消耗品 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 1.2.1 载体构建 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 OY-TES-1 shRNA、MT1F shRNA和MT1F过表达慢病毒载体包装 |
| 1.2.4 转染预实验 |
| 1.2.5 正式转染实验 |
| 1.2.6 感染后OY-TES-1和MT1F表达的鉴定 |
| 1.2.7 IFC观察转染后细胞的形态变化 |
| 1.2.8 比色法分析细胞增殖 |
| 1.2.9 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.2.10 细胞凋亡检测 |
| 1.2.11 Transwell迁移实验(Transwell migration assay) |
| 1.2.12 RT-qPCR比较正常肝组织、肝癌组织及其癌旁组织MT1F和OY-TES-1表达 |
| 二、结果 |
| 2.0 成功构建OY-TES-1 干扰、MT1F干扰和过表达慢病毒载体 |
| 2.1 OY-TES-1下调和MT1F上调后肝癌细胞细胞形态无明显变化 |
| 2.2 OY-TES-1下调对肝癌细胞的增殖抑制作用强于其它处理组 |
| 2.3 OY-TES-1下调和MT1F上调可将肝癌细胞的增殖阻滞于S期 |
| 2.4 OY-TES-1下调和MT1F上调可促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.5 OY-TES-1下调和MT1F上调可抑制肝癌细胞迁移 |
| 2.6 正常肝组织和癌旁组织中MT1F表达远高于肝癌组织 |
| 三、讨论 |
| 3.1 不同癌细胞中OY-TES-1对其恶性生物学行为影响的机制也不尽相同 |
| 3.2 OY-TES-1下调所致的恶性生物学行为改变与MT1F上调密切相关 |
| 3.3 OY-TES-1可能通过转录因子POU2F1实现对MT1F的表达调节 |
| 四、本章小结 |
| 本章参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 综述 OY-TES-1与肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（4）BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞化疗敏感性的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 博士生自认为的论文创新点 |
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ的建立及其生物学特性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 BMP4与人脑胶质瘤化疗耐药的相关性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ化疗敏感性的作用机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1. 转运蛋白介导的胶质瘤多药耐药 |
| 2. 酶介导的胶质瘤多药耐药 |
| 3. 其他相关因素 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）胶质瘤耐药机制的相关研究进展（论文提纲范文）
| 1 多药耐药参与的胶质瘤耐药 |
| 2 DNA损伤修复相关因素与胶质瘤耐药形成 |
| 2.1 六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanineDNA methyltranferase, MGMT) |
| 2.2 核苷酸切除修复 |
| 2.3 DNA错配修复（mismatch repair, MMR) |
| 3 凋亡通路异常导致胶质瘤耐药 |
| 3.1 p53基因异常与胶质瘤耐药关系 |
| 3.2 p53上调凋亡调控因子与胶质瘤耐药 |
| 4 肿瘤干细胞在胶质瘤耐药研究中的地位 |
（6）p53上调凋亡调控因子在人类脑胶质瘤中的表达及其增强化疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 PUMA 在人类脑胶质瘤中表达及其与Bcl-2、Bax 相关性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PUMA 通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的实验研究 |
| 前言 |
| 第一章 PUMA 通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体外研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 PUMA 通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体内研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PUMA 增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺的化疗敏感性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附图表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）金属硫蛋白与肿瘤相关性的研究进展（论文提纲范文）
| 1 MT的基本特性及生物学功能 |
| 2 MT与肿瘤的关系 |
| 3 结束语 |
（8）Survivin、Caspase-3在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（9）RNAi沉默PTTG基因对人胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 PTTG与肿瘤 |
| 1 PTTG的发现 |
| 2 PTTG的启动子 |
| 3 PTTG的调控区 |
| 4 PTTG蛋白（securin） |
| 5 PTTG的表达 |
| 6 PTTG的调控 |
| 7 PTTG的功能 |
| 8 展望 |
| 第二章 RNAi在胶质瘤治疗中的应用 |
| 1 RNAi概述 |
| 2 RNAi的发现 |
| 3 RNAi的组成 |
| 4 RNAi的作用机制 |
| 5 RNAi的主要问题及解决 |
| 6 RNAi治疗胶质瘤的研究进展 |
| 7 展望 |
| 第二篇 实验内容 |
| 第一章 PTTG在人脑胶质瘤中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 附图 |
| 第二章 PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 附图 |
| 第三章 RNAi沉默PTTG对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 附图 |
| 第四章 RNAi沉默PTTG对胶质瘤细胞生物学行为影响的可能机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新点及意义 |
| 攻读期间发表论文及参与课题情况 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
（10）脑肿瘤干细胞的多药耐药性及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一章 CD133~+细胞的分选和增殖特性的观察 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第二章 BTSC标志物Nestin在神经上皮肿瘤中的表达与临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第三章 ABC家族耐药蛋白在脑胶质瘤CD133~+细胞中的作用机制分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第四章 MGMT在CD133~+脑肿瘤干细胞中的表达研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
四、金属硫蛋白在人脑胶质瘤中的表达及生物学意义（论文参考文献）
- [1]高级别浆液性卵巢癌生物标志物的筛选及金属硫蛋白调控浆液性卵巢癌发生发展的机制研究[D]. 司曼飞. 北京协和医学院, 2020(05)
- [2]DNMT1介导miRNA-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的机制研究[D]. 亓旭晨. 浙江大学, 2016(06)
- [3]OY-TES-1影响肝癌恶性生物学行为的分子机制初探[D]. 胡启平. 广西医科大学, 2016
- [4]BMP4调控人脑胶质瘤耐药细胞化疗敏感性的作用及机制研究[D]. 吴立权. 武汉大学, 2013(07)
- [5]胶质瘤耐药机制的相关研究进展[J]. 范益民,刘晓东,王宏勤. 中国医药科学, 2011(15)
- [6]p53上调凋亡调控因子在人类脑胶质瘤中的表达及其增强化疗敏感性的研究[D]. 刘晓东. 山西医科大学, 2011(08)
- [7]金属硫蛋白与肿瘤相关性的研究进展[J]. 张晓丽,薄爱华. 河北北方学院学报(医学版), 2009(02)
- [8]Survivin、Caspase-3在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响[D]. 康俊龙. 福建医科大学, 2008(01)
- [9]RNAi沉默PTTG基因对人胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制的研究[D]. 徐松柏. 吉林大学, 2008(11)
- [10]脑肿瘤干细胞的多药耐药性及其机理研究[D]. 毕长龙. 中南大学, 2007(01)