一、TNF,p38 MAPK与细胞凋亡（论文文献综述）
赵磊[1]（2021）在《干眼的中医证型及杞参方治疗干眼的作用机制研究》文中研究指明目的:探究德国K5M眼表分析仪用于干眼泪膜分度诊断的诊断价值,并以此为基础研究干眼临床常见中医证型与K5M眼表检查结果及危险因素的相关性,总结干眼临床常见中医证型的眼表检查及危险因素的规律性。总结左韬教授运用杞参方论治“气阴两虚证”干眼的经验。基于网络药理学及生物信息学的研究思路,探究杞参方治疗干眼的分子网络调控机制,筛选出杞参方治疗干眼的主要成分、作用靶点、生物过程、信号通路等。基于中药网络药理学筛选出的主要信号通路,通过体内、体外实验研究杞参方对高渗诱导的干眼模型的保护作用。方法:1.收集门诊干眼患者35例,再随机抽取35例非干眼者,通过K5M眼表分析仪采集即时眼表参数,包括NI BUT f、NI BUT av、TMH,进行K5M眼表分析仪与常规眼表检查对干眼泪膜相关指标分度的诊断效能试验。2.收集门诊干眼患者160例,采集患者基本信息、危险因素情况、OSDI评分;判定中医证型,使用K5M眼表分析仪采集TMH、NIBUT f、NIBUT av、睑板腺缺失情况评分、睑板腺堵塞情况、眼红指数、脂质情况,进行干眼临床常见中医证型与K5M眼表检查结果及危险因素的相关性分析。3.（1）在TCMSP数据库中检索杞参方中14味中药的主要活性成分及作用靶点。（2）应用Cytoscape 3.8.0软件构建杞参方入血活性成分-靶点网络图;（3）通过Gene Cards、Dis Ge Net、Human Phenotype Ontology、OMIM四大疾病数据库检索当前已知的与干眼发病明确相关的靶点。（4）通过bioinformatics在线工具筛选杞参方有效成分作用靶点与干眼差异基因的交集基因及对应的药物有效成分;并运用STRING数据库对交集靶点基因进行PPI网络构建,运用Cytoscape3.8.0筛选核心网络。（5）通过Metascape数据库对杞参方作用于干眼的交集基因进行GO富集分析及KEGG调控通路富集分析。4.取60只SPF级BALB/c小鼠,采用随机数字表法将小鼠随机分为6组,分别为:空白组（BC组）,模型组（HO组）,西药组（HO+SH组）,杞参方颗粒高、中、低剂量组（HO+HD组、HO+MD组、HO+LD组）,每组10只。除BC组外,其余各组小鼠使用高渗盐水建立干眼小鼠模型。14d后进行模型评价,剔除不符合成模标准的小鼠。HO组继续点眼,方法同前,维持干眼状态;HO+SH组给予高渗盐水联合0.3%玻璃酸钠滴眼液点眼;HO+HD组、HO+MD组、HO+LD组分别给予高渗盐水点眼联合杞参方高、中、低剂量灌胃,每日一次。所有干预因素均连续施加14d。末次干预后2h,测定SⅠT、BUT及FL。进HE染色观察角膜层间结构;透射电镜观察角膜上皮细胞超微结构;TUNEL法检测角膜细胞凋亡;ELISA法检测泪液炎性因子IL—lβ、IL-6、IL-8、TNF-α的表达情况;IHC法检测小鼠角膜组织中凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK的表达;WB法检测角膜组织中AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK蛋白表达水平。5.通过500m Osm/L浓度渗透压作用于HCECs制造干眼细胞模型,将空白血清、玻璃酸钠滴眼液、杞参方颗粒高、中、低剂量的含药血清作用于已造模的干眼HCECs,CCK-8法检测不同药物刺激对HCECs存活率的影响;ELISA法检测细胞外液炎性因子IL—lβ、IL-6、IL-8、TNF-α的表达情况;ICC法检测凋亡因子caspase 1、caspase 3及AQP5的表达变化;WB检测HCECs的AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK表达情况。结果:1.K5M眼表分析仪对干眼组与非干眼组组间NIBUT f、NIBUT av、TMH比较,差异有统计学意义（P<0.05）。NIBUT f与BUT、NIBUT av与BUT、TMH与SⅠT的相关系数r分别为0.675、0.809、0.711,且在置信度（双测）为0.01时,相关性是显着的。K5M眼表分析仪的NIBUT f与常规检查诊断BUT的符合率为76.81%,ROC曲线下面积为0.838,标准误为0.036,P<0.01,95%置信区间为（0.767,0.908）;NIBUT av与BUT的符合率为76.09%,ROC曲线下面积为0.903,标准误为0.027,P<0.01,95%置信区间为（0.851,0.955）;TMH与SⅠT的符合率为92.75%,ROC曲线下面积为0.712,标准误为0.043,P<0.01,95%置信区间为（0.628,0.796）。2.（1）不同中医证型干眼患者的生物学指标分布比较:证型人数占比由高到低为:气阴两虚证>肺阴不足证>肝经郁热证>邪热留恋证。不同证型组间性别、病程比较,差异有统计学意义（P<0.05）;而不同证型组间年龄差异比较,无统计学意义（P>0.05）。（2）肺阴不足证的患者合并其他部位干燥、眼睛环境敏感、免疫系统疾病史的风险因素占比高于其他证型。肝经郁热证的患者睡眠不佳、眼药水滥用、长期用药史的风险因素占比高于其他证型。气阴两虚证的每日平均视屏终端使用时间超过5小时、糖尿病病史、角膜屈光手术史或白内障手术史的风险因素占比高于其他证型。邪热留恋证的配戴隐形眼镜、过敏性眼病史的风险因素占比高于其他证型。（3）不同中医证型与OSDI评分、NIBUT f、NIBUT av、TMH、睑板腺缺失、睑板腺开口堵塞情况、眼红指数、脂质情况分度进行相关性分析,差异有统计学意义（P<0.05）。3.筛选出杞参方活性成分127个,中药-活性成分关系217个,共得到335个作用靶点,1292种成分-靶点关系。其中作用靶点最多的3个成分依次为槲皮素、鲁期可皂甙元、山柰酚,效应靶点分别为254、84、65个。四大疾病数据库检索当前已知的与干眼发病明确相关的靶点共计3549个。取交集后得到杞参方治疗干眼的211个靶点基因;采用网络拓扑参数进行核心网络筛选,获得AKT1、IL6、VEGFA、TP53、TNF、CASP3等15个关键靶点基因。GO富集分析结果显示,生物过程方面,主要包括了血液循环、细胞因子介导的信号通路、活性氧代谢过程、MAPK级联通路的正调节、细胞增殖负调控、凋亡信号通路等生物过程。KEGG信号通路富集后,与干眼相关的主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、凋亡、上皮细胞信号转导等。4.给药干预后,所有组间小鼠干眼评价指标SⅠT、BUT、FL进行one-way ANOVA比较,差异均有显着统计学意义（P<0.01）。HE染色:BC组角膜上皮细胞形态正常,排列整齐,上皮完整连续。基底层细胞排列紧密,分布整齐;HO组及各治疗组角膜上皮均存在不同程度表层细胞丝状分离,角膜上皮细胞排列紊乱,伴有表层上皮细胞损伤、脱落,角膜表面欠光滑,角膜基质细胞排列无序,胞核固缩。其中HO+HD组要好于HO+MD组,其次依次为HO+SH组、HO+LD组、HO组。电镜:BC组角膜上皮细胞向外伸出丰富的微绒毛,呈指状突起,排列整齐规则;HO组角膜上皮微绒毛可见明显减少,微绒毛形态也与BC组有很大差别,偶见指状突起,大部分微绒毛变短,可见脱落,上皮细胞排列紊乱;杞参方各治疗组微绒毛数量多于HO组,形态较HO组排列规则、整齐;HO+SH组微绒毛数量略多于HO组,形态较HO组排列规则、整齐,但整体差于杞参方各治疗组。角膜细胞凋亡结果显示所有组间one-way ANOVA比较差异有显着统计学意义（P<0.01）。ELISA法检测泪液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的所有组间one-way ANOVA比较差异均有显着统计学意义（P<0.01）。IHC检测小鼠角膜组织中凋亡因子caspase-1、caspase-3和AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK的蛋白表达水平one-way ANOVA比较,差异均有显着统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38、ERK蛋白表达所有组间one-way ANOVA比较,差异无统计学意义（P>0.05）。WB法检测角膜组织中;WB法检测角膜组织中AQP 5、p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显着统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38MAPK、ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。5.CCK-8法检测不同药物对HCECs存活率所有组间one-way ANOVA比较差异有显着统计学意义（P<0.01）。ELISA法检测细胞外液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显着统计学意义（P<0.01）。ICC检测不同给药后的HCECs的凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的表达的one-way ANOVA比较差异均有显着统计学意义（P<0.01）。WB法检测不同干预后的HCECs的AQP 5、p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK蛋白表达所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显着统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38MAPK、ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.K5M眼表分析仪用于干眼的单一泪膜指标分度诊断时,能够为临床应用于分度诊断及疗效评价提供准确可靠的价值。2.干眼患者的风险因素情况、OSDI评分及K5M眼表分析仪检查结果情况能够为干眼的中医辨证的客观化提供一定的辅助参考依据。3.杞参方可能通过降低炎症反应和免疫应答,改善血液循环及氧代谢,抑制细胞凋亡等多途径共同发挥治疗干眼的调控作用,其中以调控MAPK信号通路、细胞凋亡等途径最为明显。4.杞参方可有效改善高渗诱导小鼠干眼模型的SⅠT、BUT、FL、角膜上皮形态及角膜上皮细胞微绒毛形态,降低泪液炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α,减少角膜组织JNK、p38MAPK、ERK的磷酸化和凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的蛋白表达,最终抑制炎症反应和细胞凋亡,减轻角膜上皮细胞损伤。5.杞参方可有效提高500 m Osm高渗诱导HCECs干眼模型的细胞存活率,降低细胞外液炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α,减少HCECs的JNK、p38MAPK、ERK的磷酸化和凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的蛋白表达,最终抑制炎症反应和细胞凋亡。
郭咏梅[2]（2020）在《硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究》文中研究指明围产期和泌乳前期的高产奶牛由于生理的变化和高的代谢水平,抗氧化功能显着降低,容易诱发氧化应激,导致疾病易感性增加。奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）是乳脂和乳蛋白合成与分泌的重要场所,其细胞的生物合成能力决定了奶牛乳腺的产奶能力。因此,深入研究硒（Se）减缓BMEC氧化应激的机理对科学合理的补加Se,缓解奶牛氧化应激,优化奶牛抗氧化防御能力具有重要的理论与实际意义。本论文以BMEC为细胞模型,分别以外源性一氧化氮（NO）诱导细胞氧化损伤、以二硝基氯苯（DNCB）抑制硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性并诱导细胞氧化损伤、以白介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）抑制白介素-1（IL-1）生物活性、以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制剂抑制其磷酸化水平、并结合过表达技术对TrxR1进行过表达,从TrxR1/MAPK/NO途径深入研究了 Se缓解BMEC氧化损伤的可能机制。本论文共分为6个试验。试验1采用单因子完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150、200 nmol/L）对BMEC抗氧化功能的调节作用,初探正常生理条件下Se对TrxR活性和NO合成的影响,为进一步探讨其促进机理提供基础。结果表明,Se对BMEC的相对增殖率（RGR）、TrxR、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）活性与总抗氧化能力（T-AOC）的促进作用,以及对丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的抑制作用呈显着的剂量依赖效应,即Se对BMEC的抗氧化功能的促进作用呈剂量依赖性。综合多项指标得出,以50 nmol/L处理组较好,100～200nmol/L处理组促进作用削弱。然而,Se的添加对正常BMEC的炎症细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性及其基因表达、NO含量、核转录因子E2相关因子2（Nrf2）的基因表达无显着影响。试验2采用完全随机试验设计,以RGR、抗氧化及炎症因子等指标为判断指标,研究不同浓度的 NO（0、250、500、750、1000、1250、1500μmol/L）,分别作用 2、4、6、8、12和24 h,筛选出适宜的NO氧化损伤建模浓度及作用时间。结果显示,过量的NO可诱导BMEC的氧化应激,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物（DETA/NO）作为外源性NO,处理浓度为1000 μmol/L作用时间为6h,RGR降低至76.61%,引起SOD、CAT、GPx活性降低,MDA含量、炎症因子及NO含量、iNOS活性升高,可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。试验3以试验2为基础,以NO诱导BMEC的氧化损伤,采用完全随机试验设计,研究不同剂量的Se（0、10、20、50、100、150及200 nmol/L）对BMEC氧化损伤的保护和可能的调节作用机制,并筛选出Se的适宜添加剂量。结果表明,NO过量诱导BMEC发生了氧化应激,引起RGR与SOD、T-AOC、CAT活性显着下降,GPx、TrxR的活性及其基因与蛋白表达、Nrf2的基因表达呈现相似的变化;而ROS活性、MDA含量呈现相反的变化趋势;p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的基因表达也显着升高,并增加了其下游IL-1等炎症因子、iNOS的表达。Se的添加显着逆转了上述指标的变化,说明Se对NO诱发的氧化应激具有显着的减缓效果,减少了 IL-1的生成,降低了 iNOS的活性与NO的释放。这可能与增高的TrxR活性及其基因与蛋白表达,进而抑制了 MAPK信号通路的激活有关。Se对过量NO诱导的细胞损伤的保护作用呈剂量依赖性,其中以20～100 nmol/L的Se保护组保护作用较好,尤其以50 nmol/L的Se保护组的保护效果更好,然而,过高浓度的Se则未能逆转NO诱导的细胞损伤,甚至会对细胞造成一定的损伤作用。试验4以试验3为基础,采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以IL-Ra抑制IL-1生物活性,从TrxR/IL-1/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。将BMEC随机分为8组,分别是:对照组（CON）、Se 处理组（Se）、DNCB 损伤组（DNCB）、IL-1Ra 处理组（IL-1Ra）、Se+DNCB预保护组（S+D）、Se+IL-1Ra 处理组（S+I）、DNCB+IL-1Ra 保护组（D+I）、Se+DNCB+IL-1Ra处理组（S-D+I）。结果表明,DNCB抑制了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达,导致凋亡信号调节激酶-1（ASK-1）活性升高,激活了 p38MAPK及JNK信号通路,增加了下游因子IL-1及NO浓度,诱导BMEC发生了氧化应激。IL-1Ra抑制了 IL-1的生物活性,降低了 NO过量生成,减缓了 DNCB引起的氧化应激,说明IL-1是诱发NO大量产生引起细胞氧化应激的关键因子。Se对DNCB引起的BMEC氧化损伤具有缓解作用,Se的添加促进了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达;可逆转DNCB引起的p38MAPK及JNK信号通路的激活,进而抑制IL-1的生成、iNOS活性及NO的过量产生。这说明Se通过TrxR抑制IL-1的活性发挥其对BMEC氧化应激的减缓作用。试验5采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以 SB203580、SP600125、PD98059 分别抑制 p38MAPK、JNK、ERK1/2 信号通路,将第三代贴壁生长的BMEC随机分为7个处理组,分别是:对照组、DNCB损伤组、Se 处理组、DNCB+Se 预保护组、DNCB+SB203580、DNCB+SP600125、DNCB+PD98059,从TrxR/MAPK/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。结果表明,DNCB抑制了 TrxR活性,ASK-1活性增加,下游p38MAPK及JNK通路被激活,并导致IL-1过量释放,诱发BMEC氧化应激,Se的预保护作用逆转了 BMEC内的氧化损伤,增强了 TrxR的表达,ASK-1活性及p38MAPK及JNK通路磷酸化水平受到抑制,逆转了 IL-1的过量释放及其下游iNOS-NO级联。当p38MAPK及JNK通路分别受到SB203580、SP600125抑制后,DNCB诱导的细胞氧化损伤被抑制,MAPK信号通路下游因子IL-1含量、iNOS活性及其基因和蛋白表达受到显着抑制,进而保护细胞免受NO蓄积的损伤,这提示Se通过TrxR抑制p38MAPK及JNK通路的激活缓解BMEC的氧化损伤。试验6采用完全随机试验设计,以NO诱导BMEC氧化损伤,采用基因过表达技术对TrxR1进行过表达,将BMEC随机分为4个组,分别是:对照组、NO损伤组、NO+Se预保护组、NO+TrxR1 OE组,进一步研究TrxR1对细胞中iNOS、IL-1β等炎症因子及p38MAPK及JNK信号通路相关因子的表达的影响,验证TrxR1基因是否是Se缓解BMEC氧化损伤的关键基因。结果表明,过表达TrxR1基因显着降低了 p38MAPK及JNK信号通路的基因表达及磷酸化水平,及其下游IL-1β和iNOS的基因与蛋白表达,减缓了 NO诱导的氧化损伤,进一步验证了 TrxR1是Se缓解BMEC氧化应激损伤的关键基因。综上所述,本研究从TrxR1/MAPK/NO途径探讨了 Se促进BMEC抗氧化功能、缓解NO诱导BMEC氧化应激的保护机制,即Se通过促进TrxR1的基因和蛋白表达,抑制了 p38MAPK/JNK信号通路的磷酸化水平,进而降低了 IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达,抑制了 NO的过量释放,保护了 BMEC免受氧化应激的损伤。
方圆[3]（2020）在《草鱼Gadd45家族基因及相关miRNA功能研究》文中提出草鱼（Ctenopharyngodon idella）是世界上水产养殖产量最高的物种。草鱼养殖易患病,提高草鱼抗病力成为提高成活率的重要手段之一,鱼体抗病能力跟遗传因素相关。Gadd45家族基因是一类重要的DNA损伤修复基因,具有调节细胞周期、参与细胞凋亡和免疫等功能,在草鱼中发现含有五个成员,分别为Gadd45aa、Gadd45ab、Gadd45ba、Gadd45bb和Gadd45g。本文从抗病转录组数据库中筛选出了Gadd45家族这五个基因并克隆其中三个基因,并且筛选Gadd45家族基因五个成员相对应的五个miRNA（miR-731、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-148和miR-429b）,研究了他们的结构与功能。论文主要研究结果如下:1.草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g等三个基因的登录号分别为KX523186,KX523187和MK829489,开放阅读框分别为474 bp,480 bp和480bp,编码氨基酸分别为157 aa,159 aa和159 aa,分子量分别为17,547Da,17,708Da和17,720 Da,理论等电点分别为4.98,4.45和4.03。通过SMART网站预测草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g分别具有90 aa,106 aa和91 aa的核糖体蛋白L7Ae结构域。草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g在草鱼12个健康组织和嗜水气单胞菌感染后的6个免疫相关组织均有表达。利用过表达和干扰手段处理三个基因后,三个基因均能激活MAPK信号通路并上调免疫基因il-8,ifn和tnf-a。2.预测得知草鱼Gadd45aa是miR-731靶基因。为验证预测真实性,用嗜水气单胞菌感染CIK细胞后不同时间点同时检测miR-731和草鱼Gadd45aa表达模式,结果发现二者在不同时间点表达趋势相反。miR-731过表达/干扰能够抑制草鱼Gadd45aa表达。双荧光素酶报告基因结果得出野生型（WT）miR-731模拟物对应的荧光素酶活性降低,miR-731突变体（Mut）不受影响,证明草鱼Gadd45aa为miR-731靶基因。在CIK细胞中,过表达miR-731后能够显着抑制6个免疫相关基因（p38,jnk,erk,tnf-a,ifn和il-8）的表达,miR-731抑制剂显着增加6个基因的表达。草鱼Gadd45aa和miR-731过表达后均能诱导CIK细胞凋亡。综上,miR-731能够通过靶向Gadd45aa调控免疫基因的表达,可能调控其靶基因参与细胞凋亡。3.为验证草鱼Gadd45ab为miR-23a-3p和miR-23a-5p靶基因,用miR-23a-3p和miR-23a-5p模拟物转染CIK细胞,q PCR检测Gadd45ab的表达被显着抑制。用miR-23a-3p和miR-23a-5p抑制剂转染的细胞中,Gadd45ab表达显着增加。这些结果表明miR-23a-3p和miR-23a-5p共同调控靶基因Gadd45ab。双荧光素酶报告载体实验进一步验证了Gadd45ab为miR-23a-3p和miR-23a-5p的靶基因。miR-23a-3p过表达显着抑制了jnk、erk、tnf-a和ifn表达,miR-23a-3p抑制剂显着增加p38、erk、tnf-a和ifn表达。miR-23a-5p过表达显着抑制p38、jnk和erk、tnf-a和il-8表达,miR-23a-5p抑制剂显着增加p38、erk、tnf-a和ifn表达。用嗜水气单胞菌感染miRNA的抑制剂后,检测到miRNA表达量均显着降低。根据caspase 3/7实验,结果得出miRNA对细胞凋亡具有抑制作用,其靶基因Gadd45ab能够促进细胞凋亡。草鱼miR-23a-5p和miR-23a-3p均能够通过调控其靶基因来激活免疫相关基因表达及抑制细胞凋亡。4.双荧光素酶报告基因实验以及miRNA-148模拟物/抑制剂对靶基因反向调控,验证得出草鱼Gadd45ba和Gadd45bb均为miR-148靶基因。在嗜水气单胞菌感染CIK细胞不同时间点中,miR-148表达水平发生显着改变,表明miR-148对于细菌侵染具有一定反应。miR-148过表达后,p38,jnk,erk,tnf-a和ifn的表达量显着下降,在miR-148抑制剂组中,p38,jnk,erk,tnf-a和ifn表达水平显着增加。草鱼miR-148对于细菌刺激产生一定反应,miR-148通过与靶基因相互作用调控免疫基因表达。5.鉴定发现草鱼Gadd45g为miR-429b靶基因。miR-429b过表达和抑制对免疫相关基因il-8,ifn和tnf-a的表达具有负调控功能。草鱼miR-429b通过抑制靶基因达到调控免疫基因作用。通过草鱼miRNA与靶基因相互作用,探究二者对抗菌免疫及凋亡功能,结果为草鱼抗病性状遗传机制提供了靶基因,也为miRNA调节草鱼抗菌免疫力研究建立了理论数据基础,为其他水产动物中进行miRNA研究提供了理论参考。
叶芬[4]（2020）在《3,3’-二吲哚甲烷通过TRAF2/p38MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡的分子机制研究》文中指出目的3,3’-二吲哚甲烷（3,3’-diindolylmethane,DIM）是存在于十字花科芸苔属蔬菜中的一种植物化学物,DIM能在体内外诱导包括胃癌细胞在内的多种肿瘤细胞凋亡,但其对胃癌细胞凋亡诱导的分子机制尚未彻底阐明。在本课题研究中,我们的主要目的是阐明DIM诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。为以DIM为代表的植物化学物应用于胃癌防治药物研发提供理论依据,同时为基于胃癌的分子诊断提供新的靶标。方法1.用DIM处理人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901以及人正常胃粘膜上皮细胞株GES-1,用MTT法比较其细胞活力;蛋白免疫印迹（Western Blot）检测增殖及细胞周期相关蛋白:抗增殖蛋白p21,细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4,CDK4）,细胞周期蛋白Cyclin D1。2.TUNEL试剂盒检测BGC-823与SGC-7901细胞凋亡水平;Western Blot检测凋亡相关蛋白:剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase 3）,裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP ribose polymerase,cleaved PARP）,B细胞淋巴瘤因子2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）及其相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）的表达。3.观察DIM对p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）的影响,p38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理后与DIM联用,观察抑制p38MAPK通路后对上述增殖及凋亡相关指标的改变。4.用TNF受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2,TRAF2）抗体对15例胃癌患者的胃癌组织与癌旁组织标本进行免疫组织化学分析,比较TRAF2在胃癌和非癌组织中的表达,同时用Western Blot检测TRAF2在BGC-823、SGC-7901和GES-1细胞中的表达水平;用TRAF2 siRNA转染BGC-823和SGC-7901细胞,观察TRAF2敲减后对胃癌细胞增殖、凋亡的影响。5.观察DIM影响下TRAF2的变化,运用TRAF2过表达质粒转染后与DIM联用,观察TRAF2过表达后对增殖、凋亡的影响。结果1.DIM显着降低BGC-823、SGC-7901的细胞增殖活性并呈剂量-效应和时间-效应关系,而GES-1细胞对DIM的敏感性相对较低。Western Blot检测p21在DIM作用下逐渐升高,CDK4和Cyclin D1的表达水平显着降低。2.TUNEL实验表明DIM可显着诱导BGC-823、SGC-7901细胞凋亡。Western Blot结果表明DIM以浓度依赖方式增加了cleaved caspase 3,cleaved PARP和Bax的表达,凋亡的相关指标Bax/Bcl-2比值也升高。3.Western Blot表明DIM能激活p38MAPK通路,其抑制剂SB203580与DIM联用后,DIM诱导的胃癌细胞增殖抑制、凋亡诱导效应被回复。4.免疫组织化学分析发现TRAF2的表达水平在胃癌组织显着高于癌旁组织;Western Blot发现在BGC-823、SGC-7901中TRAF2的蛋白表达水平显着高于GES-1。用TRAF2siRNA转染胃癌细胞株后,胃癌细胞的增殖受抑制,但促进凋亡,并激活p38MAPK信号通路。5.Western Blot检测表明DIM可呈浓度依赖性降低TRAF2的表达,TRAF2的过表达质粒转染胃癌细胞后再与DIM共处理,p38MAPK激活被抑制,也同时减弱了DIM对胃癌细胞凋亡的诱导效应。结论DIM能在BGC-823、SGC-7901胃癌细胞中呈浓度依赖性抑制细胞增殖,诱导凋亡;TRAF2在人胃癌组织及细胞中均呈高表达状态,TRAF2表达的下调与胃癌细胞增殖抑制、凋亡诱导相关。DIM主要通过调控TRAF2/p38MAPK轴实现对胃癌细胞的抑制作用。综上所述,TRAF2是DIM抑制胃癌的关键调控靶点,DIM抗胃癌主要通过TRAF2/p38 MAPK轴诱导胃癌细胞凋亡。
韩颖[5]（2020）在《基于p38MAPK信号通路的身痛逐瘀汤治疗类风湿关节炎机制研究》文中进行了进一步梳理类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病,主要表现为关节的慢性滑膜炎症,在我国有较高患病率和致残率,是威胁健康的重要疾病之一。目前RA的病因尚不清楚,患者关节部位受到炎症持续侵蚀,导致多关节畸形,病情呈进展趋势且不可逆转,常伴关节外器官损伤,导致死亡率增加。而现有的治疗手段主要以延缓病变进程为主,无法将其彻底治愈。主要的治疗药物有较多的不良反应且价格昂贵,给长期用药带来了困难。身痛逐瘀汤治疗本病疗效确切且副作用低,经过灵活化裁可应用于RA各期各型的治疗,现广泛应用于RA的临床的治疗中。因其治疗机制尚未明了,故本研究拟观察身痛逐瘀汤对胶原诱导型关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）大鼠的治疗作用和对RA成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）的影响,并基于p38丝裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）信号通路探索其可能的作用机制。第一部分身痛逐瘀汤对CIA大鼠的治疗作用目的:观察身痛逐瘀汤对CIA大鼠的治疗作用,验证其在体内对RA炎症和关节滑膜的影响。方法:SD大鼠24只,6只作为对照组,其余大鼠构建CIA模型,造模成功后随机分成3组:模型组、p38抑制剂（SB203580）组、身痛逐瘀汤组。进行药物干预,连续28天。观察大鼠的一般情况和关节肿胀情况,并对关节症状进行评分。末次给药24h后取腹主动脉血检测CRP、RF、TNF-α、IL-1β的含量,取踝关节进行HE染色观察病理学变化并评分。结果:1.与对照组相比,模型组大鼠造模7 d后开始出现RA症状,活跃度减低,体重增长缓慢。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠RA症状较轻,活跃度稍高,体重增加较快,P<0.05;2.与对照组相比,模型组大鼠关节肿胀指数、关节炎指数升高。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠关节肿胀指数及关节炎指数降低,其峰值也降低,P<0.05;3.与对照组相比,模型组大鼠血清CRP、RF、TNF-α、IL-1β含量升高。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠血清上述血清标志物均降低,P<0.01;4.与对照组相比,模型组大鼠踝关节滑膜增生和炎症细胞浸润明显。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠踝关节上述变化显着改善,关节病理评分降低,P<0.05。小结:身痛逐瘀汤能改善CIA大鼠关节炎症状和血清指标,抑制关节炎症和滑膜增生。第二部分身痛逐瘀汤对大鼠RA-FLS的影响目的:观察身痛逐瘀汤对大鼠RA-FLS增殖、侵袭及凋亡的影响。方法:分离培养正常大鼠FLS和CIA大鼠FLS（RA-FLS）。进行预实验确定p38抑制剂（SB203580）、PPARγ激动剂（GW1929）、身痛逐瘀汤含药血清的干预浓度及干预时间,用于正式试验。正常FLS设为对照组,RA-FLS设为模型组、p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组,分别进行药物干预。培养48h后,用流式细胞术检测各组细胞周期变化;CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.与对照组相比,模型组S期细胞比例显着增加,G1期细胞比例显着减少,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组S期细胞比例减少,G1期细胞比例增加,P<0.01;2.与对照组相比,模型组细胞增殖能力明显增强,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组细胞增殖能力均减弱,P<0.01;3.与对照组相比,模型组穿模细胞数明显增多,细胞侵袭能力增强,P<0.01。与模型组比较,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组穿模细胞数均减少,细胞侵袭能力被抑制,P<0.01。4.与对照组相比,模型组细胞凋亡率显着减少,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组细胞凋亡率均升高,P<0.01。小结:身痛逐瘀汤能抑制RA-FLS的异常增殖、侵袭,并诱导其凋亡。第三部分身痛逐瘀汤调控RA-FLS的机制研究目的:探索身痛逐瘀汤调控RA-FLS增殖、侵袭及凋亡的作用机制。方法:细胞分离和培养、细胞分组、药物干预同第二部分。Real-time PCR检测各组细胞中p38MAPK、PPARγ、CTGF、Cyclin-D1、caspase-3mRNA的表达;Western Blot检测各组细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、PPARγ、CTGF、Cyclin-D1、cleaved-caspase-3蛋白的表达。结果:1.各组总p38MAPK mRNA及蛋白表达无差异。与对照组相比,模型组p-p38MAPK蛋白、CTGF mRNA及蛋白表达增多,PPARγmRNA及蛋白表达减少,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组p-p38MAPK蛋白、CTGF mRNA及蛋白表达均降低,PPARγmRNA及蛋白表达均升高,P<0.05。2.与对照组相比,模型组Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达增多,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达均降低,P<0.05。3.与对照组相比,模型组caspase-3 mRNA及cleaved-caspase-3蛋白表达减少,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组caspase-3 mRNA及cleaved-caspase-3蛋白表达均升高,P<0.05。小结:1.p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路异常激活,刺激Cyclin-D1高表达,抑制cleaved-caspase-3表达,可能是RA-FLS增殖、侵袭能力增强,凋亡能力减弱的分子机制。2.身痛逐瘀汤能抑制p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路活性,下调Cyclin-D1表达,上调cleaved-caspase-3表达。3.身痛逐瘀汤能抑制RA-FLS增殖及侵袭,诱导RA-FLS凋亡,其作用机制可能与身痛逐瘀汤对p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路的调控密切相关。结论:身痛逐瘀汤能改善CIA大鼠关节炎症状和血清指标,减轻关节炎症及滑膜增生,可能与其抑制RA-FLS异常增殖及侵袭,诱导其凋亡相关。作用机制可能与身痛逐瘀汤对p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路的调控密切相关。
李雪杰[6]（2019）在《帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应和炎性反应临床观察及与p38MAPK相互作用机制的光谱研究》文中指出研究背景胸腔镜肺癌根治术虽然具有切口小、损伤少、操作精细、出血少等优点,但外科手术损伤肺组织以及淋巴结清扫等因素,患者应激反应和炎性反应依然较大;术后疼痛影响患者正常咳嗽排痰,对术后镇痛需求依然较高。而如何减少手术创伤导致的围术期应激反应以及炎性反应从而加速术后快速康复已经成为当今麻醉学临床研究的热点。患者的术后康复质量是多因素相互作用的结果:手术方式选择、手术时间、应激反应与炎性反应程度、麻醉质量、术后镇痛质量、术后并发症等。早在2001年,丹麦外科专家Kehlet先生就提出了快速康复理念（enhance recovery after surgery,ERAS）,意在减少术后平均住院日,提高患者术后恢复质量。ERAS流程中,抑制应激反应和有效术后镇痛是关键环节。胸科手术患者术后因惧怕疼痛,不敢深呼吸、咳嗽排痰受限,导致呼吸道分泌物潴留,堵塞小气道,容易造成肺不张、坠积性肺炎,进一步加重炎症反应,延长住院时间增加治疗成本,甚至威胁患者生命。有效的抑制围术期应激反应和炎性反应以及完善的术后镇痛,有利于提高患者术后生活质量,降低远期并发症的发生率。本试验设计以加快患者术后康复为出发点,采用全身麻醉联合椎旁神经阻滞,静脉复合应用帕瑞昔布,加快患者术后恢复,为今后胸腔镜患者的快速康复提供临床证据。非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）具有良好的抗炎镇痛作用,传统的NSAIDs由于恶心、呕吐、胃出血等副作用,临床上的应用日渐减少。帕瑞昔布是第二代的环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制药,静脉注射后可迅速被肝脏羧酸酯酶水解成高选择性COX-2抑制剂伐地昔布,特异性抑制COX-2阻断花生四烯酸合成前列腺素而发挥抗炎镇痛作用。由于帕瑞昔布对COX-2的高选择性,帕瑞昔布胃肠道的安全性较传统NSAIDs提高,对血小板影响轻微,不影响出血时间。帕瑞昔布超前镇痛可避免术中伤害性刺激引起中枢敏化和疼痛上调,降低围术期的应激反应和炎性反应,预防和减轻术后疼痛。研究表明,p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）的激活体磷酸化-p38丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38MAPK）与 COX-2 蛋白表达呈正相关,并且p38MAPK磷酸化被抑制可以导致COX-2蛋白表达出现明显抑制的现象。多种疼痛相关介质或受体比如COX-2、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等都与脊髓小胶质细胞p38MAPK的激活有关。就p38MAPK而言,COX-2就是一种因p38MAPK活化而表达增加的蛋白质。p38MAPK在应激以及炎症介导等大量的细胞反应中发挥关键的作用,并且和细胞的发育、生长以及分化存在密切的联系。目前帕瑞昔布抑制应激反应和炎性反应与p38MAPK的关系还未明确,本研究我们利用光谱学为基础的方法在模拟生理条件下研究了帕瑞昔布与p38MAPK相互作用,通过圆二色光谱技术以及三维荧光等技术来研究帕瑞昔布对p38MAPK蛋白结构的影响,有助于了解帕瑞昔布在体内的作用机理,为进一步研究其体内作用机制奠定了理论基础,对于合理用药及新药的研制开发具有一定的指导意义。第一部分帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应及炎性反应的临床观察目的胸科术后疼痛影响患者咳痰或深呼吸,阻碍术后康复,应激反应和炎性反应也是影响胸科手术术后恢复的一个重要方面。围术期大量促炎性细胞因子的产生将导致过度应激,破坏细胞因子之间的平衡,过度的应激反应会削弱机体生理储备,从而加重炎性反应,激发全身炎性反应综合征（systemicinflammatoryresponse syndrome,SIRS）。术后疼痛机制复杂,炎症性疼痛也是术后疼痛的一个方面。临床上提倡多模式镇痛,不同作用机制的药物或镇痛技术联合使用,并发症少。帕瑞昔布是第二代的COX-2抑制药,通过选择性抑制COX-2,阻止花生四稀酸（arachidonic acid,AA）转化为前列腺素（prostaglandinum,PG）和血栓素A2（thromboxane A2,TXA2）,进而发挥解热、抗炎及止痛作用。本研究以行胸腔镜手术的患者为观察对象,观察静脉注射帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应及炎性反应的影响以及对术后镇痛的影响,为ERAS指导下的术后镇痛提供依据。方法本试验经医学伦理学委员会审批同意,选取2016年3月至2017年3月行择期胸腔镜肺叶切除手术40例患者,美国麻醉医生协会（American society of anesthesiologists,ASA）分级为Ⅰ～Ⅱ级,术前签署知情同意书,所有患者均接受全身麻醉复合超声引导下的椎旁神经阻滞。所有患者均采用ERAS理念下的围术期管理模式,术前两小时禁饮,不留置尿管,不用术前药,采用标准化的术前准备和麻醉流程。全身麻醉前行超声引导下的椎旁神经阻滞,注入0.5%罗哌卡因20ml,阻滞后1Omin测麻醉平面,要求麻醉平面在T4-T8。患者被随机分为帕瑞昔布组（P组,n=20）和对照组（C组,n=20）,帕瑞昔布组分别于术前（T0）、术后24h（T1）注射帕瑞昔布40mg（生理盐水稀释至4ml）,对照组注射0.9%NaCl溶液4ml。分别于手术前（T0）、术后24h（T1）、术后48h（T2）后取动脉血8ml,在4℃条件下以3500r/min的转速离心15分钟。取上层血浆于-80℃低温冰箱保存。全部样本留齐后批量测定动脉血中血浆内皮素（endothelin,ET）、血栓素A2（thromboxane A2,TXA2）、IL-6、TNF-α水平。记录患者的术中使用阿片类药物总量、输液量、失血量、手术时间、24h和48小时视觉模拟评分法（visual analogue scale,VAS）疼痛评分、术后住院时间。结果1、患者一般情况共计40例患者符合标准纳入研究,两组患者在年龄、性别、身高、体重、芬太尼用量、手术时间、失血量、输液量方面无统计学差异（P>0.05）。2、患者术后VAS评分及住院时间患者术后VAS评分在T1时帕瑞昔布组低于对照组（P=0.004）,术后VAS评分在T2时帕瑞昔布组低于对照组（P=0.004）;相对于对照组,帕瑞昔布组的术后住院天数减少（P=0.007）。3、应激反应与炎性反应指标术前两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平无明显差异（P>0.05）。T1时两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平均高于术前（P<0.05）;T2时两组患者血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平均高于术前（P<0.05）。与对照组相比,T1时帕瑞昔布组血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平明显低于对照组（P<0.05）,T2时两组血浆ET、TXA2、IL-6、TNF-α水平无明显差异（P>0.05）。结论静脉注射帕瑞昔布可提高胸腔镜手术患者术后镇痛效果,减少应激反应和炎性反应,缩短患者的住院时间,加快患者术后康复,符合ERAS理念下的多模式镇痛及快速康复要求。第二部分帕瑞昔布与p38MAPK相互作用机制的光谱研究目的p38MAPK影响多种细胞内反应,在炎症、细胞周期调节、细胞死亡、发育、分化、衰老和肿瘤发生中具有公认的作用。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAKP）是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。p38信号通路是MAPK通路的一个重要分支,神经细胞在病理因素的刺激下可激活p38MAKP,进而激活MAKP信号通路,分泌白细胞介素1 β（interleukin-1β,IL-1β）和TNF-α等炎性细胞因子,引起神经系统损伤。p38MAPK的激活体p-p38MAPK与COX-2蛋白表达呈正相关,并且p38MAPK磷酸化被抑制可以导致COX-2蛋白表达出现明显抑制的现象。多种疼痛相关介质或受体都与脊髓小胶质细胞p38MAPK的激活有关,如TNF-α、IL-1β、神经激肽1（neurokinin-1,NK-1）受体和COX-2。另外p38MApK激活还可以通过激活COX-2使前列腺素合成进一步增加,参与中枢敏化。帕瑞昔布降低了围术期应激反应和炎性反应,推测其降低TNF-α、IL-1等蛋白表达机制除了直接抑制环氧化酶外,还可能是通过抑制p38MAPK所牵连的通路来起发挥作用的。本研究我们利用光谱学为基础的方法在模拟生理条件下研究了帕瑞昔布与p38MAPK相互作用,通过圆二色光谱技术以及三维荧光等技术来研究帕瑞昔布对p38MAPK蛋白结构的影响;同时对于帕瑞昔布和p38MAPK相互作用的结合位点数、结合常数、热力学常数进行计算。方法采用透射电子显微镜、紫外可见吸收光谱、稳态/时间分辨荧光光谱、圆二色光谱、能量转移等技术研究了帕瑞昔布与p38MAPK的相互作用。结果紫外-可见吸收、圆二色光谱以及三维荧光能够反映出p38MAPK的空间结构以及微环境都因帕瑞昔布结合发生改变,造成p38MAPK整体骨架结构逐渐松散,部分具有疏水性的芳香环氨基酸和多肽链暴露于溶液。根据荧光光谱和透射电镜实验结果,帕瑞昔布可以导致p38MAPK发生团聚,两者可以通过非共价键力作用一静电作用力与p38MAPK以1:1的比例发生结合,形成帕瑞昔布-p38MAPK结合物。帕瑞昔布对于p38MAPK存在一定的荧光猝灭影响,这种荧光猝灭机制归类为静态猝灭;由Stem-Volmer方程计算出在25摄氏度时,帕瑞昔布与p38MAPK的亲和常数KA为8.13 × 104/M;由Van’t Hoff方程计算出△G、△H和△S分别为-2.80X 104 J·mol-1,-1.62×105 J·mol-1·K-1和-450 J·mol-1;这种过程主要是熵驱动的自发分子反应,分子之间的结合距离为3.95nm。结论本研究发现帕瑞昔布导致p38MAPK的空间构象和微环境出现变化。p38MAPK中具有比较松散的骨架结构,同时内部的疏水性的多肽链和芳香环氨基酸不断的发生暴露。分析所有的理论数据以及实验结果显示帕瑞昔布对于p38MAPK结构影响非常显着,并且提供了的帕瑞昔布与p38MAPK相互作用的基础数据。
李仲夏[7]（2019）在《结核分支杆菌感染过程中IL-32ε介导细胞凋亡及抗菌机制的研究》文中进行了进一步梳理结核病是一种由结核分支杆菌引起的人畜共患传染病,能够引起大范围感染、畸形甚至死亡。自2015年起,结核病超越艾滋病毒感染成为全球感染死亡的主要原因,每年均导致上百万人死亡和巨大的经济损失。由于缺乏有效的治疗方案,以及各种耐药菌种的出现,结核病的预防和治疗仍是当今世界面临的主要难题之一。巨噬细胞是对抗入侵病菌的第一道防线,它能够吞噬病菌,启动炎症反应,指导适应性免疫细胞,最终清除病菌、消除炎症、恢复体内平衡。然而,结核分支杆菌作为一个强大的胞内寄生菌,在与宿主细胞的长期对抗中,进化出各种策略来躲避宿主的防御机制,并在巨噬细胞中建立合适的条件进行生存和扩散,将巨噬细胞作为其自然栖息地和在宿主中传播的工具。因此,深入了解结核分支杆菌在巨噬细胞中引起的免疫反应以及其逃避机制,对于开发有效的疫苗和针对持续性细胞内感染的靶向免疫治疗具有重要意义。越来越多的证据表明,促炎性细胞因子IL-32在宿主对结核分支杆菌等病原体的防御中发挥着重要作用。由于选择性剪接,IL-32存在多种剪接异构体,可发挥不同的生物学功能。其中,IL-32γ可通过诱导细胞凋亡,激活维生素D抗菌通路等机制抑制细胞中结核分支杆菌的增殖。然而其他剪接异构体对结核分支杆菌感染的影响还鲜有研究。因此,本研究深入探讨了结核分支杆菌感染时巨噬细胞中IL-32对细菌增殖的影响,并描述了IL-32ε诱发抗菌效应和细胞凋亡的潜在机制。主要研究内容及结果如下:1.本研究对结核分支杆菌感染前后巨噬细胞中IL-32不同剪接异构体表达量变化进行了检测。结果显示,结核分支杆菌感染后,巨噬细胞中IL-32多种剪接异构体均有表达,然而表达水平差异显着,其中攻菌后IL-32γ表达量最高,IL-32ε在攻菌前后表达量变化最大。2.由于结核分支杆菌能够诱导IL-32多种剪接异构体不同程度的表达,因此本研究进一步对这些剪接异构体的抗结核作用进行了探索。结果显示,IL-32不同剪接异构体对巨噬细胞中结核分支杆菌增殖的影响不同。其中,IL-32γ和IL-32ε实验全程均显示出显着的抗菌效果,IL-32β和IL-32δ于检测的后半段对细菌的增殖也有不同程度的抑制,而IL-32α和IL-32ζ的抗菌效果并不显着。3.鉴于细胞凋亡是IL-32抵抗结核分支杆菌感染的有效途径,因此本研究进一步探究了IL-32不同剪接异构体对细胞凋亡的影响。结果显示,IL-32不同剪接异构体对巨噬细胞凋亡的诱导能力存在差异。IL-32β、IL-32γ和IL-32ε对细胞凋亡率的上调极为显着,IL-32δ仅微弱提高细胞凋亡率,而IL-32α和IL-32ζ对细胞凋亡没有影响。进一步研究发现,区别于IL-32β和IL-32γ对Caspase-3的高活化率,IL-32ε过表达细胞中并未检测到Caspase-3的激活。并且凋亡相关基因定量结果显示,在IL-32ε过表达细胞中仅有Caspase-6和c-Myc表达上调。因此,本研究认为IL-32ε通过不依赖于Caspase-3的机制诱导细胞凋亡。4.为了进一步探究IL-32ε介导细胞凋亡的信号通路,本研究着重对IL-32ε与Nmi和β-catenin之间的相互联系进行了分析。结果显示,IL-32ε能够诱导巨噬细胞中Nmi的表达。并且,利用siRNA敲降Nmi,能够废除IL-32ε介导的抗菌效应和细胞凋亡。此外,IL-32ε过表达细胞中β-catenin蛋白水平显着降低,在IL-32ε过表达细胞中补充β-catenin也能够抑制IL-32ε介导的细胞凋亡。因此,本研究表明,IL-32ε通过上调Nmi表达,降低细胞内β-catenin蛋白水平,引起细胞凋亡。5.为了探究IL-32ε诱导Nmi表达上调的机制,本研究通过双荧光素酶报告分析逐步筛选出Nmi启动子中应答IL-32ε诱导的核心区域,并深入研究找到了调控IL-32ε诱导Nmi转录的关键转录因子Pax6和CP2。此外,本研究还发现,p38 MAPK在这一过程中起到桥梁作用,即IL-32ε通过激活p38 MAPK信号通路上调Pax6和CP2的转录活性,进而上调Nmi表达水平,明确了IL-32ε诱导Nmi表达的机制。综上所述,在巨噬细胞中,结核分支杆菌能够诱导多种IL-32剪接异构体的表达,且不同剪接异构体的抗菌能力存在差异。其中,结核分支杆菌诱导IL-32ε表达,导致p38 MAPK信号通路激活以及转录因子Pax6和CP2活化,促进了细胞中Nmi的表达。随后,Nmi的上调使细胞中β-catenin蛋白水平下降,最终导致了依赖于Caspase-6和c-Myc的细胞凋亡。这一机制在巨噬细胞抵抗结核分支杆菌感染的过程中发挥着重要作用,可能为结核病的预防及治疗提供了新的靶标。
周桂菊[8]（2019）在《TGF-β1影响汞诱导绒毛滋养细胞凋亡的研究》文中认为第一部分HgCl2诱导绒毛滋养细胞凋亡的研究目的:细胞凋亡是多细胞生物体为维持内环境稳定,由基因调控的程序性细胞死亡过程,其在胚胎形成与生长发育方面具有重要作用。环境因素中的重金属暴露对发育中胚胎的影响越来越受到关注。汞是一种广泛存在于自然界的重金属,一定量的汞暴露可引起人类胚胎损伤,导致不良妊娠结局。然而汞损伤人类胚胎的机制尚不清楚。本研究拟采取不同剂量的HgCl2对人绒毛滋养细胞（HTR-8/SVneo）进行处理,研究HTR-8/Svneo细胞的凋亡情况,探讨汞暴露对人绒毛滋养细胞的影响。材料与方法:（1）培养HTR-8/SVneo细胞48小时,不同浓度HgCl2处理细胞24小时,并进行分组,空白对照组细胞未用HgCl2处理。（2）用Annexin V-FITC/7-AAD对HTR-8/SVneo细胞进行染色,流式细胞术分析细胞凋亡的变化。（3）Western Blot检测HTR-8/SVneo细胞裂解型的caspase-3,8,9表达水平。（4）TUNEL实验方法验证不同剂量HgCl2处理的HTR-8/SVneo细胞凋亡情况。（5）对检测结果进行析,组间差异比较采用t检验或单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:（1）不同浓度HgCl2处理HTR-8/SVneo细胞后,随着HgCl2暴露浓度增加,细胞凋亡数量明显增加,而且裂解型的凋亡蛋白酶caspase-3,8和9的表达水平明显增加,各组间比较,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）与空白对照组细胞相比,在高浓度（10μM和20μM）HgCl2处理组中,HTR-8/SVneo细胞裂解型的caspase-3,8,9的表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。（3）TUNEL实验验证结果表明HgCl2诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡呈剂量依赖性。结论:本研究采取不同剂量的HgCl2对HTR-8/Svneo细胞进行处理,发现HgCl2暴露后HTR-8/Svneo细胞凋亡增加。但高浓度的HgCl2暴露后,HTR-8/Svneo细胞中裂解型的caspase-3,8和9表达水平和细胞凋亡数量增加更显着,推测高浓度的HgCl2诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡可能占主导地位。初步推断人类妊娠期间的汞暴露可诱导滋养细胞过度凋亡从而导致妊娠相关疾病的发生。第二部分TGF-β1在HgCl2诱导绒毛滋养细胞凋亡中的作用及机制研究目的:转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta,TGF-β1）参与调节绒毛滋养细胞的增殖、分化和入侵过程,有助于胎盘器官发育及胚胎着床。本研究通过观察TGF-β1对Hgcl2诱导滋养细胞凋亡的影响,研究Hgcl2暴露后滋养细胞丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中多种蛋白和TGF-β活化激酶-1（TAK1）的变化及其与细胞凋亡的关系,探索TGF-β1调控Hgcl2诱导的滋养细胞凋亡的分子机制,以期为临床上进一步研究汞暴露引起滋养细胞凋亡相关的胚胎损伤的分子指标物和潜在干预措施提供理论依据。材料与方法:（1）不同浓度HgCl2和/或TGF-β1处理HTR-8/SVneo细胞24小时,并进行分组,空白对照组细胞未采用任何试剂处理。（2）Western Blot、q RT-PCR检测细胞TGF-β1表达水平,Annexin V-FITC/7-AAD染色验证分析细胞凋亡情况。Western Blot检测细胞裂解型的caspase-3,8,9表达水平。（3）磷酸-Thr 187 TAK1抗体免疫染色测定分析细胞TAK1表达量和活性变化。TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol降调TAK1,Annexin V-FITC/7-AAD染色检测分析细胞调亡情况。Western Blot检测caspase-3与裂解型caspase-3表达水平。（4）构建TAK1质粒,转染HTR-8/SVneo细胞上调TAK1,Annexin V-FITC/7-AAD染色检测分析细胞凋亡变化。Western Blot检测分析caspase-3,裂解型caspase-3,P38及p-P38表达水平变化。（5）Western Blot检测MAPK信号通路蛋白p-JNK,p-ERK和p-P38表达水平。MAPK抑制剂下调信号通路蛋白,流式细胞术检测分析细胞凋亡变化。Western Blot检测裂解型的caspase-3,8,9表达水平。（6）分析检测结果,组间差异比较采用t检验或单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:（1）随着HgCl2处理浓度的增加,逐渐降低了滋养细胞TGF-β1的表达。在HTR-8/SVneo细胞中用TGF-β1联合HgCl2处理后,在一定程度上减弱了HgCl2诱导滋养细胞凋亡。（2）HgCl2处理组滋养细胞p-JNK,p-ERK和p-P38的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。HgCl2联合TGF-β1处理组滋养细胞p-JNK,p-ERK和p-P38的表达水平显着低于HgCl2处理组（P<0.01）,裂解型的caspase-3,8,9相对表达水平与HgCl2处理组相比亦显着降低。（3）与空白对照组相比,JNK,ERK和P38抑制剂可使滋养细胞p-JNK,p-ERK和p-P38的表达水平明显降低（P<0.05）。然而,JNK和ERK抑制剂对HgCl2诱导的滋养细胞凋亡不产生影响（P>0.05）。但P38抑制剂SB202190能显着降低HgCl2诱导的滋养细胞凋亡和凋亡蛋白酶的活化（P<0.01）。（4）TGF-β1可激活HTR-8/SVneo细胞TAK1的表达,使滋养细胞凋亡程度下降。而降调TAK1可显着减弱TGF-β1抑制HgCl2诱导的滋养细胞凋亡作用（P<0.01）。（5）通过质粒转染过表达HTR-8/SVneo细胞TAK1,可显着降低HgCl2诱导的滋养细胞凋亡（P<0.01）。结论:TGF-β1对HgCl2诱导的滋养细胞凋亡具有调节作用,可能经p38 MAPK信号通路在一定程度上抑制了HgCl2诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡,并可能涉及TAK1的表达。这些结果可能为临床上进一步研究汞暴露引起的滋养细胞相关的胚胎损伤分子指标物和潜在的干预措施提供理论依据。
段绪东[9]（2019）在《β-伴大豆球蛋白对草鱼肠道细胞凋亡的作用与机制研究》文中研究说明本研究以草鱼（Ctenopharyngodon idella）为模型,首先考察了β-伴大豆球蛋白对幼龄草鱼生产性能,肠道发育与肠道细胞凋亡的影响,并探究了β-伴大豆球蛋白引起草鱼各肠段细胞凋亡的相关分子机制。其次,采用体外消化方式消化β-伴大豆球蛋白,并从中确定出能引起草鱼肠细胞凋亡的消化产物。第三,为探究β-伴大豆球蛋白消化产物引起的细胞凋亡与细胞骨架之间的关系,本研究从出芽酵母中筛选出能鉴定草鱼肠细胞细胞骨架F-actin的新蛋白,探索了β-伴大豆球蛋白消化产物引起草鱼肠细胞凋亡的“上游”机制;通过添加p38MAPK蛋白磷酸化抑制剂,进一步探究了β-伴大豆球蛋白消化产物引起草鱼肠细胞凋亡的“下游”机制。第四,通过添加Gln,考察了Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起的草鱼肠细胞凋亡的保护作用与方式。主要研究内容和结果如下:1.日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼生产性能,肠道发育与细胞凋亡的影响试验方法:选择240尾（13.77±0.10 g）健康幼龄草鱼,随机分为对照组和β-伴大豆球蛋白组（8%β-伴大豆球蛋白等氮替代对照组中酪蛋白）,每个处理组3个重复（40尾鱼/重复）,进行7周生长试验。主要研究结果如下:1.1日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼生产性能与肠道发育的影响与对照组相比,β-伴大豆球蛋白显着降低幼龄草鱼增重百分比,特异生长率,摄食量,饲料效率,肠重,肠长,肠重指数,前、中、后肠皱襞高度（P<0.05）。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白能降低草鱼生产性能,并可能与抑制肠道发育有关。1.2日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼肠段细胞凋亡的影响及可能机制在草鱼前肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白未引起DNA片段化现象;对caspase-3,-8,-9酶活性;对Fas L,Apaf1,BAX,BCL-2,MCL-1,IAP,caspase-2,-3,-7,-8,-9,JNK与p38 MAPK等分子的m RNA水平;对T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白表达水平均无显着影响（P>0.05）;趋于降低ROS浓度（P=0.09）;显着降低NOX活性;显着降低NOX1,NOX2,DUOX,P22,P47,P67,NOXO1a,NOXO1b与DUOXA m RNA水平（P<0.05）。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白未促进草鱼前肠组织细胞凋亡,可能与其不能激活细胞凋亡相关信号通路有关。在中肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白能加剧DNA片段化现象,增加180bp DNA片段含量;提高caspase-3,-8,-9活性（P<0.05）;增加Apaf1,BAX,MCL-1,caspase-3,caspase-9,JNK与p38 MAPK m RNA水平（P<0.05）;趋于增加IAP m RNA水平（P=0.09）;未改变caspase-2,caspase-7,Fas L,TNF-α与BCL-2的m RNA水平（P>0.05）;下调caspase-8 m RNA水平（P<0.05）;提高T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白水平（P<0.05）;有增加ROS浓度的趋势（P=0.07）;提高NOX2,P47,NOXa1与NOXO1b m RNA相对表达水平（P<0.05）。以上数据表明,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过增加线粒体凋亡途径相关分子（Apaf1与BAX）表达水平,激活Caspase-9,起始线粒体凋亡途径,导致草鱼中肠组织细胞凋亡。在后肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白能加剧DNA片段化,显着增加180bp DNA片段的含量,caspase-3,-8,-9活性（P<0.05）;降低Fas L,Apaf1,BAX,BCL-2,MCL-1,IAP与JNK m RNA水平（P<0.05）;上调TNF-α,caspase-3,-7,-8与p38 MAPK的基因表达（P<0.05）;极显着或显着增加T-p38 MAPK（P<0.05）与P-p38 MAPK（P<0.05）蛋白表达量;显着增加ROS浓度,NOX活性,NOX2,P22,P47,NOXa1与NOXO1b m RNA水平（P<0.05）。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过增加TNF-α,caspase-8等死亡受体相关分子的表达;并通过增加NOX相关基因表达与酶活性增加ROS含量,从而激活p38MAPK分子,增加caspase酶活;最终促使草鱼后肠组织细胞凋亡。2.β-伴大豆球蛋白消化产物对草鱼肠细胞凋亡的作用动物试验结果表明:β-伴大豆球蛋白对草鱼前肠细胞凋亡无显着影响,但能够促进中肠与后肠细胞凋亡,且凋亡机制存在差异。这可能与不同肠段存在不同的β-伴大豆球蛋白消化产物有关。为确定引起草鱼肠道细胞凋亡的β-伴大豆球蛋白消化产物,需开展以下研究:试验方法:模拟试验一中草鱼肠道对食糜的消化,提取消化道内的消化酶,确定酶:料比,体外消化β-伴大豆球蛋白。试验设两个组:CON-BC,试验一对照组鱼肠道消化酶体外水解β-伴大豆球蛋白;BC-BC,试验一β-伴大豆球蛋白组鱼肠道消化酶体外水解β-伴大豆球蛋白;采集0.5h、1.5h、2.5h、3.5h、5.5h与7.5h的消化样品,进行SDS-PAGE电泳检测,比较两个处理组对β-伴大豆球蛋白的消化差异。根据消化产物分子量大小,采用超滤法纯化BC-BC组消化产物,并处理草鱼肠细胞,以探明引起草鱼肠细胞凋亡的真正β-伴大豆球蛋白消化产物。试验共考察7个物质（β-伴大豆球蛋白及其0.5h、1.5h、2.5h、3.5h、5.5h与7.5h消化产物）对草鱼肠细胞凋亡的影响;每种物质,设5个浓度梯度处理组,每个处理3个重复,分别添加0、1、2、4和8 mg/m L待考察物质。细胞接种于12孔板中培养48h后,分别添加7种待考察物质处理肠细胞24h。收集细胞样品,用于DNA片段化分析。结果表明:CON-BC组中β-伴大豆球蛋白的α’-亚基和α-亚基分别经0.5h与1.5h被降解为约60k Da和50k Da大小的多肽;而在BC-BC组中,分别需要1.5h与5.5h才能将它们降解为与CON-BC组相同的产物。在CON-BC与BC-BC组中,β-伴大豆球蛋白的β-亚基在7.5h时内均不能被消化。超滤能进一步分离纯化β-伴大豆球蛋白6个消化时间点的消化产物。并发现5.5h与7.5h消化的β-伴大豆球蛋白能诱导草鱼肠细胞发生DNA片段化。以上结果表明,β-伴大豆球蛋白难以被草鱼肠道消化酶消化降解;而且长期饲喂β-伴大豆球蛋白日粮的草鱼更难消化β-伴大豆球蛋白;5.5h与7.5h消化的β-伴大豆球蛋白水解产物是诱导草鱼肠细胞凋亡的真正“效应物”。3.β-伴大豆球蛋白消化产物对细胞骨架介导的草鱼肠细胞凋亡的影响试验一结果发现,日粮β-伴大豆球蛋白能通过激活线粒体凋亡通路,调控p38MAPK磷酸化水平等“下游”凋亡执行过程,促使草鱼中、后肠细胞凋亡;试验二进一步确定了促使草鱼中、后肠细胞凋亡发生的β-伴大豆球蛋白消化产物。真核生物上的研究发现,细胞骨架变化作为细胞凋亡的“上游”信号能诱导细胞凋亡。为深入探究β-伴大豆球蛋白消化产物诱导细胞凋亡过程中与细胞骨架和p38MAPK的关系,需构建一个能检测草鱼肠细胞细胞骨架的探针,并通过添加p38MAPK磷酸化抑制剂进一步确定其作用。因此,我们开展了以下两个方面的研究:3.1细胞骨架F-actin检测探针的构建试验方法:从出芽酵母数据库中筛选出能与细胞骨架F-actin结合的潜在蛋白,通过在酵母体内定位模式的鉴定与检测、体外结合分析等一系列操作,将其标记上绿色荧光蛋白（GFP）作为细胞骨架F-actin的检测探针。最终,将该探针通过脂质体转染的方法转染进入草鱼肠细胞,检测草鱼肠细胞细胞骨架。结果发现:Ecm25蛋白C-端中的cable结构域是能与细胞骨架F-actin结合的潜在蛋白。通过在酵母体内的定位模式鉴定与活细胞成像分析,体外的融合蛋白纯化以及与F-actin的直接结合检测,确定Ecm25（cable）能作为细胞骨架的检测探针。通过脂质体转染的方法将Ecm25（cable）探针转染进入草鱼肠细胞,该探针能在草鱼肠道活细胞中表达,并呈现出细胞骨架F-actin的定位方式。表明,本试验成功构建了能用于草鱼肠道活细胞中检测细胞骨架F-actin的荧光探针,为后续β-伴大豆球蛋白消化产物在细胞骨架介导细胞凋亡方面的研究提供了技术支撑。3.2β-伴大豆球蛋白消化产物诱导草鱼肠细胞凋亡的机制试验方法:本试验共设四个处理组,分别为对照组,对照+p38MAPK磷酸化抑制剂组,处理组[添加8mg/m L 7.5hβ-伴大豆球蛋白消化产物（7S-7.5h D）],处理+p38MAPK磷酸化抑制剂组（共同添加8mg/m L 7S-7.5h D,p38MAPK磷酸化抑制剂）,每个处理3个重复。草鱼肠细胞接种于12孔板中培养24h;进行质粒转染,继续培养24h;添加p38MAPK磷酸化抑制剂2h,最后添加8mg/m L的7S-7.5h D处理细胞24h。结果发现:对照组中草鱼肠细胞骨架F-actin呈极性分布,即从细胞的一端到另一端;单独添加7S-7.5h D后,细胞骨架F-actin多聚化且失去极性,即随机围绕在细胞膜周围;单独添加p38MAPK磷酸化抑制剂对细胞骨架F-actin的定位模式并无显着影响;共同添加7S-7.5h D与p38MAPK磷酸化抑制剂后,细胞形态正常,细胞骨架定位、分布与对照组相似,但细胞质中出现碎片化细胞骨架。此外,与对照组相比,单独添加7S-7.5h D能显着增加片段化DNA（180bp）与ROS的含量,T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白表达水平（P<0.05）;能极显着或显着地提高caspase-3（P<0.01）,caspase-8（P<0.01）与caspase-9（P<0.05）酶活性。与单独添加7S-7.5h D处理组相比,共同添加7S-7.5h D与p38MAPK磷酸化抑制剂有降低片段化DNA（180bp）含量与T-p38 MAPK蛋白水平的趋势（0.05<P<0.1）;能显着降低P-p38 MAPK蛋白水平（P<0.05）;显着降低caspase-3,-8,-9酶活（P<0.05）。以上数据表明,7S-7.5h D可能是通过引起细胞骨架F-actin的变化,从而增加ROS含量,激活p38MAPK信号分子,引起caspase相关酶的活性增加,最终导致草鱼肠细胞凋亡。4.Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用为考察Gln是否具有保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的作用与可能方式。需开展两方面的研究:首先,摸索Gln保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的作用与最适浓度;其次,在明确Gln具有保护作用并确定浓度情况下,考察Gln保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的可能方式。4.1摸索Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用试验方法:试验共设6个处理组,分别为对照组,β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物处理组（添加8mg/m L 7S-7.5h D）,在β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物基础上添加不同浓度Gln组（添加0.7、1.4、2.8与5.6 m M Gln）,每个处理3个重复。细胞接种于12孔板中培养24h;添加不同剂量的Gln继续培养细胞24h;再添加8mg/m L 7S-7.5h D处理细胞24h。收集细胞用于DNA片段化分析。结果发现:与7S-7.5h D处理组相比,随着Gln浓度的增加,7S-7.5h D引起的DNA片段化程度逐渐降低,当Gln为2.8 m M时与对照组无显着差异,Gln添加到5.6 m M时与对照组完全一致。表明,Gln能保护草鱼肠细胞免受7S-7.5h D诱导的细胞凋亡,且5.6 m M Gln具有最适的保护作用。4.2 Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用方式试验方法:试验共设3个处理组,分别为对照组,β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物处理组（添加8mg/m L 7S-7.5h D）,7S-7.5h D处理+Gln组（添加8mg/m L 7S-7.5h D与5.6m M Gln）,每个组3个重复。细胞接种于12孔板中培养24h;进行质粒转染后培养24h;添加Gln继续培养细胞24h;最后添加8mg/m L 7S-7.5h D处理细胞24h。结果发现:添加7S-7.5h D能导致草鱼肠细胞凋亡,细胞骨架多聚化并失去极性,随机围绕在细胞膜周围;添加5.6 m M Gln在一定程度上能保护细胞骨架免受7S-7.5h D的破坏。表明,Gln可能通过保护细胞骨架的方式保护草鱼肠细胞免受7S-7.5h D应激导致的细胞凋亡。综上所述,日粮β-伴大豆球蛋白降低幼龄草鱼生产性能,可能与其诱导肠道组织细胞凋亡有关;日粮β-伴大豆球蛋白对中肠与后肠造成了细胞凋亡,且中肠与后肠细胞凋亡的机制存在差异,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过线粒体凋亡途径起始中肠细胞凋亡,而通过ROS介导的线粒体凋亡途径与死亡受体途径共同促进后肠细胞凋亡;中、后肠细胞凋亡过程均受到p38MAPK信号分子的调控。体外消化试验结合细胞培养试验的结果发现,能诱导草鱼肠细胞凋亡的物质是β-伴大豆球蛋白5.5h与7.5h消化的产物。进一步研究发现,β-伴大豆球蛋白7.5h消化的产物可能是通过引起细胞骨架F-actin的变化,从而增加ROS含量,激活p38MAPK信号分子,增加caspase酶的活性,最终导致草鱼肠细胞凋亡。此外,Gln可能通过保护细胞骨架的方式保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物诱导的细胞凋亡。
王婷婷[10]（2019）在《胡黄连苷Ⅱ对脑缺血/再灌注损伤的保护机制研究》文中指出背景和目的:脑卒中（Cerebral stroke）是一组以脑部缺血或出血性损伤症状为主要临床表现的疾病,又称脑中风、脑血管意外,主要分为出血性脑卒中（脑出血或蛛网膜下腔出血）和缺血性脑卒中（脑梗塞、脑血栓形成）,其中以缺血性脑卒中最为常见。脑卒中具有发病急、高病死率的特点,是全球第二大致死性疾病。生理条件下,正常脑血流量（Cerebral blood flow,CBF）维持在5060 mL/100 g/min。当脑缺血发生时,CBF迅速下降,缺血核心区CBF低于7 mL/100 g/min,缺血核心区外的缺血半暗带区（Ischemic penumbra,IP）,CBF维持在717 mL/100 g/min,脑组织呈低灌注状态。IP依靠脑的侧支循环,神经细胞尚未经历不可逆死亡,因此通过治疗恢复脑血流后神经细胞尚可存活。所以,及时的溶栓治疗对于挽救急性缺血性脑卒中病人的神经功能是至关重要的。《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》中明确指出,对于缺血性脑卒中患者,应给予神经保护药物作为溶栓治疗的辅助治疗以改善神经功能。因此,揭示重要的信号分子及其相关信号通路,从而保护缺血半暗带区神经细胞,有利于神经保护治疗策略的制定。脑缺血（Cerebral ischemia）激活许多复杂的细胞信号级联反应,这些级联反应对细胞存活和多种刺激引起的损伤至关重要。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）是一种广泛存在于真核细胞中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,可以将细胞外信号转移到细胞中,以使细胞能够对缺血缺氧作出应答。其中p38MAPK途径是其主要途径之一。在脑缺血再灌注损伤中,p38 MAPK信号转导途径被激活,其将细胞外刺激信号传递至细胞内,是传递介导细胞反应的细胞信息的重要途径。我国传统中药胡黄连（Rhizoma Picrorhizae）,始载于《唐本草》,性味苦寒,其中胡黄连苷Ⅱ（Picroside II）为其主要有效成分,含量最高。本课题组前期研究显示,在大鼠脑缺血损伤急性期给予胡黄连苷Ⅱ治疗,可明显减轻皮质神经元超微结构损伤、减少神经细胞凋亡、缓解脑水肿、改善神经功能障碍,提示胡黄连苷Ⅱ可能具有抗炎、抗氧化、抑制神经细胞凋亡的保护作用。然而其参与相关调节作用的细胞和分子机制仍不清楚。为此,本实验试图通过建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/Reoxygen,OGD/R）模型模拟脑缺血/再灌注损伤,探讨胡黄苷II对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及其与p38信号通路的关系。方法:1.在体动物实验:成年健康雄性Wistar大鼠200只,SPF级,6月龄,体重230250g。自然环境（昼/夜12h/12h）中,常规适应性喂养1周,按照随机对照原则,动物分为假手术组、模型组、胡黄连苷（Picroside,Picr）组、茴香霉素（p38激动剂,Anisomycin,An）组、An+Picr组、SB203580（p38抑制剂,SB）组和SB+Picr组。应用线栓法经颈外-颈内动脉建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型,改良神经功能评分（Modified neurological severity score,mNSS）和经颅多普勒局部脑血流量（Regional cerebral blood flow,rCBF）检测作为造模成功的标准。mNSS法评价大鼠神经行为功能,2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）检测脑梗死体积,苏木精伊红（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色和透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察缺血区皮质神经元的形态结构,原位末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay,TUNEL）检测缺血区皮质神经细胞凋亡,免疫组织化学（Immunohistochemical staining,IHC）定性检测脑组织p-p38表达水平,Western Blot定量检测大鼠缺血皮质区p-p38、p-p53、IL-6和TNFα蛋白表达变化。2.体外细胞培养:利用SH-SY5Y细胞建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,设置浓度梯度,探讨胡黄连苷II对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞模型的最佳保护剂量。随后依据药物处理分为对照组、模型组、胡黄连苷（picroside,Picr）组、茴香霉素（p38激动剂,Anisomycin,An）组、An+Picr组、SB203580（p38抑制剂,SB）组和SB+Picr组。光镜下,观察细胞形态变化,细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测细胞活性,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）、Cleaved Caspase-3蛋白表达检测细胞凋亡情况,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和Western Blot（WB）定性定量检测p-p38和p-p53蛋白表达情况,WB和ELISA检测IL-6和TNFα蛋白表达情况。结果:1.动物MCAO/R实验结果（1）神经行为功能变化:mNSS评分显示,模型组、An组和An+Picr苷组大鼠评分较高,显着高于对照组（P<0.01,n=20）。而胡黄连苷II、SB203580以及两者联合治疗后,大鼠mNSS评分较模型组显着下降（P<0.01,n=20）。（2）脑梗死体积变化:TTC检测显示,模型组、An组和An+Picr组大鼠出现大片白色梗死灶,胡黄连苷II治疗后,梗死体积较模型组明显下降（P<0.05,n=5）。而SB203580以及SB2035820与胡黄连苷II联合治疗后,梗死体积较模型组下降更为明显（P<0.01,n=5）。（3）细胞形态结构变化:HE检测显示,假手术组,大鼠皮质神经元排列整齐,结构完整。MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组大鼠神经元排列紊乱,细胞固缩深染,尤以An组最为明显。而Picr组、SB组以及SB+Picr组大鼠神经元损伤较轻,细胞结构完整,部分细胞形态不规则。（4）细胞超微结构变化:TEM检测显示,假手术组,大鼠皮质神经元结构完整,细胞质内含有各种细胞器。MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组大鼠神经元双层核膜不清,胞浆细胞器溶解消失。而Picr组、SB203580组以及SB+Picr组大鼠神经元损伤较轻,细胞结构完整,核膜不清。（5）细胞凋亡变化:TUNEL检测显示,模型组和An组大鼠凋亡细胞较假手术组显着升高（P<0.01,n=5）,Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组大鼠凋亡细胞较模型组明显降低（P<0.05,n=5）。（6）p-p38蛋白表达变化:WB和IHC检测显示,假手术组,p-p38蛋白表达较低,呈弱阳性。MCAO/R后,模型组、An组、An+Picr组p-p38表达较假手术组明显升高,呈强阳性（P<0.01,n=5）。Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组大鼠p-p38蛋白较模型组显着降低,呈弱阳性（P<0.05,n=5）。（7）p-p53蛋白表达变化:WB检测显示,假手术组,p-p53蛋白表达较低。MCAO/R后,模型组、An组p-p53蛋白表达升高,显着高于假手术组（P<0.01,n=5）。Picr组和An+Picr组p-p53蛋白较模型组有所降低（P<0.05,n=5）,SB组和SB+Picr组蛋白表达较胡黄连苷组进一步下降,但无统计学差异（P>0.05,n=5）。（8）IL-6蛋白表达变化:WB检测显示,MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白表达升高,与假手术组相比,有统计学差异（P<0.01,n=5）。Picr组、SB组和SB+Picr组IL-6蛋白表达较模型组明显降低（P<0.05,n=5）,接近假手术组（P>0.01,n=5）。（9）TNFα蛋白表达变化:WB检测显示:MCAO/R后,模型组和An组TNFα蛋白表达升高,显着高于假手术组（P<0.01,n=5）。Picr组和An+Picr组TNFα蛋白表达较模型组降低,但无统计学差异（P>0.05,n=5）。2.SH-SY5Y细胞OGD/R实验结果（1）OGD/R模型建立:依据CCK8检测结果,缺氧4 h6 h时,细胞损伤较轻,细胞可通过自身修复。而缺氧时间达到12 h时,细胞损伤过重,仅有少量细胞存活。缺氧8 h时,细胞约有50%60%的细胞存活。根据细胞存活率,我们最终选取缺氧8h,复氧4 h进行下游实验。（2）胡黄连苷II的浓度优化:依据CCK8检测和光镜下观察细胞形态,经20、50和100μg/mL胡黄连苷II处理后,SH-SY5Y细胞存活率明显升高,各浓度梯度细胞存活率差异不明显（P>0.05）,故选取20μg/mL的胡黄连苷II进行下游实验。（3）细胞存活率:CCK8检测和光镜下观察显示,OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组SH-SY5Y细胞受损严重、突起消失、细胞变圆,细胞存活率明显降低（P<0.01,n=6）,经胡黄莲苷II、SB2035820以及二者联合干预后,SH-SY5Y细胞形态恢复,细胞存活率较模型组显着升高（P<0.01,n=6）。（4）凋亡细胞变化:FCM检测显示,OGD/R后,模型组出现大量细胞凋亡,经茴香霉素处理后凋亡细胞数量进一步增多,但与模型组相比无统计学差异（P>0.05,n=5）。而经胡黄连苷II和SB2035820以及二者联合干预后,凋亡细胞数量较模型组显着降低（P<0.05,n=6）.（5）Cleaved Caspase-3蛋白表达变化:WB检测显示,对照组,Cleaved Caspase-3蛋白微弱表达。OGD/R后,模型组、An组Cleaved Caspase-3蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性（P<0.01,n=6）,Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组细胞Cleaved Caspase-3蛋白较模型组显着降低,呈弱阳性（P<0.01,n=6）。（6）p-p38蛋白表达变化:WB和IF检测显示,对照组,p-p38蛋白微弱表达。OGD/R后,模型组、An+Picr组p-p38蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性（P<0.01,n=6）,而An组p-p38蛋白表达较模型组进一步增强（P<0.01,n=6）。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞p-p38蛋白较模型组显着降低,呈弱阳性（P<0.01,n=6）。（7）p-p53蛋白表达变化:WB和IF检测显示,对照组,p-p53蛋白表达呈弱性。OGD/R后,模型组、An组、An+Picr组p-p53蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性（P<0.01,n=6）。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞p-p53蛋白表达较模型组显着降低,呈弱阳性（P<0.01,n=6）。（8）IL-6蛋白表达变化:WB检测显示,OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白表达较对照组明显升高（P<0.01,n=6）。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞IL-6蛋白较模型组显着降低P<0.01,n=6)。ELISA检测细胞上清液显示,对照组,IL-6蛋白分泌较少。OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白分泌较对照组明显升高（P<0.01,n=6）,Picr组、SB组和SB+Picr组细胞IL-6蛋白分泌较模型组显着降低（P<0.01,n=6）。（9）TNFα蛋白表达变化:WB检测显示,OGD/R后,模型组TNFα蛋白表达较对照组显着升高（P<0.05,n=6）,经胡黄连苷II处理后,TNFα蛋白表达降低不明显（P>0.05,n=6）。An组和An+Picr组TNFα蛋白表达较模型组进一步上升（P<0.01,n=6）,而SB组和SB+Picr组可完全逆转表达增强的TNFα,接近于对照组水平（P>0.05,n=6）。ELISA检测细胞上清液显示,对照组,TNFα蛋白分泌较少。OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组TNFα蛋白分泌较对照组明显升高（P<0.01,n=6）,Picr组TNFα蛋白分泌较模型组降低,但无统计学差异（P>0.05,n=6）,SB组和SB+Picr组细胞TNFα蛋白分泌较模型组显着降低（P<0.01,n=6）。结论:在体动物实验和体外细胞培养证实,脑缺血/再灌注（氧糖剥夺/复氧）损伤可通过活化p38信号通路引发细胞凋亡和炎症反应,而胡黄连苷Ⅱ可通过抑制p38-p53信号通路减轻脑缺血/再灌注损伤后的炎症反应,发挥神经保护作用。
二、TNF,p38 MAPK与细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TNF,p38 MAPK与细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）干眼的中医证型及杞参方治疗干眼的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究一 K5M眼表分析仪对干眼泪膜分度的诊断试验研究 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究二 干眼常见中医证型与K5M眼表指标及危险因素的相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究三 基于“气津关系”运用杞参方论治干眼 |
| 1 人体脏腑与泪膜稳态 |
| 2 眼表微环境的气津关系 |
| 3 基于“气津关系论”运用杞参方论治干眼 |
| 研究四 基于中药网络药理学探讨杞参方治疗干眼的作用机制 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究五 基于MAPK通路研究杞参方对干眼小鼠模型眼表保护作用机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究六 基于MAPK通路研究杞参方对高渗诱导的角膜上皮细胞保护机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 中医学对干眼的认识及研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（2）硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 氧化应激的危害及其防治 |
| 1.1.1 氧化应激的产生 |
| 1.1.2 氧化应激的诱发因素 |
| 1.1.3 氧化应激对奶牛的危害 |
| 1.1.4 缓解氧化应激的措施 |
| 1.2 硒对奶牛生产性能的促进作用 |
| 1.2.1 硒在反刍动物体内的代谢与利用 |
| 1.2.2 硒对奶牛生产性能的影响 |
| 1.3 硒缓解奶牛乳腺氧化应激的研究进展 |
| 1.3.1 硒对奶牛乳腺氧化应激的调节作用 |
| 1.3.2 硒减缓氧化应激的可能机制 |
| 1.4 论文研究目的与意义 |
| 1.5 论文研究内容和技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 不同剂量硒对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化功能的调节作用 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 试验材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 过量一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 硒对一氧化氮诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的减缓作用 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 试验材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 硒通过硫氧还蛋白还原酶抑制白介素-1活性对细胞损伤的减缓作用 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 试验材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 硒通过抑制MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 试验材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 硫氧还蛋白还原酶1的过表达对硒缓解BMEC氧化应激损伤的影响 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 试验材料与方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 过量NO对细胞抗氧化功能及炎症因子的调节作用 |
| 3.1.2 Se对BMEC氧化应激的减缓作用具有剂量依赖性 |
| 3.1.3 Se缓解BMEC氧化应激的机理 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 存在的问题及进一步研究的领域 |
| 3.4 本研究的创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）草鱼Gadd45家族基因及相关miRNA功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 :文献综述-草鱼Gadd45 家族基因及其相应的miRNA功能初步研究 |
| 1.1 Gadd45家族基因结构 |
| 1.2 Gadd45家族基因的功能 |
| 1.2.1 Gadd45家族基因的免疫功能 |
| 1.2.2 Gadd45在适应性免疫中的作用 |
| 1.2.3 Gadd45家族基因在免疫细胞中的表达 |
| 1.3 草鱼Gadd45基因的功能 |
| 1.3.1 草鱼Gadd45aa与 ab免疫功能 |
| 1.3.2 草鱼Gadd45ba与 bb免疫功能 |
| 1.3.3 草鱼Gadd45g免疫功能 |
| 1.4 Gadd45与细胞凋亡 |
| 1.4.1 细胞凋亡与MAPK信号通路 |
| 1.4.2 草鱼Gadd45a、Gadd45b和 Gadd45g对于细胞凋亡作用的调控 |
| 1.5 miRNA作用机制 |
| 1.6 miRNA在免疫系统中的作用 |
| 1.6.1 miRNA在免疫细胞分化作用 |
| 1.6.2 miRNA在适应性免疫中的作用 |
| 1.7 miRNA与靶基因 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 :草鱼Gadd45家族基因免疫相关功能分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 草鱼样品获得及条件 |
| 2.1.2 主要细菌的活化 |
| 2.1.3 质粒和菌株 |
| 2.1.4 主要试剂及耗材 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 草鱼肾细胞系(CIK)培养 |
| 2.2.3 草鱼Gadd45家族基因生物信息学分析 |
| 2.2.4 草鱼Gadd45家族基因系统发育树构建 |
| 2.2.5 草鱼Gadd45 三个家族基因的cDNA序列全长克隆 |
| 2.2.6 过表达载体构建与细胞转染 |
| 2.2.7 由dsRNA介导的RNA干扰与细胞转染 |
| 2.2.8 嗜水气单胞菌感染CIK细胞 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 草鱼Gadd45 家族基因的cDNA克隆及序列分析 |
| 2.3.2 系统发育树及多重序列比对分析 |
| 2.3.3 草鱼Gadd45家族基因组织表达谱及嗜水气单胞菌感染后的时空表达谱分析 |
| 2.3.4 草鱼Gadd45家族基因对免疫相关基因的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 :草鱼Gadd45aa受 miR-731 调控及其免疫和凋亡功能探究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 草鱼肾细胞系(CIK)培养 |
| 3.2.3 miR-731模拟物与抑制剂的合成 |
| 3.2.4 miRNA实时荧光定量PCR分析 |
| 3.2.5 质粒构建与细胞转染 |
| 3.2.6 miR-731野生型和突变型的双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.7 通过Caspase-Glo?3/7 分析检测凋亡 |
| 3.2.8 生物信息学统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 草鱼Gadd45aa是 miR-731 的靶基因 |
| 3.3.2 miR-731 靶向Gadd45aa调控免疫相关基因 |
| 3.3.3 Gadd45aa和miR-731 共同促进凋亡反应 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 :草鱼Gadd45ab受 miR-23a-3p和 miR-23a-5p调控及其免疫和凋亡功能探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 草鱼CIK细胞培养与传代 |
| 4.2.3 miR-23a-3p和 miR-23a-5p模拟物与抑制剂的合成 |
| 4.2.4 嗜水气单胞菌刺激两个miRNA抑制剂 |
| 4.2.5 miRNA实时荧光定量PCR分析 |
| 4.2.6 质粒构建与细胞转染 |
| 4.2.7 miR-23a-3p和 miR-23a-5p双荧光素酶报告基因检测 |
| 4.2.8 通过Caspase-Glo?3/7 分析检测凋亡 |
| 4.2.9 生物信息学统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 草鱼Gadd45ab是 miR-23a-3p和 miR-23a-5p的靶基因 |
| 4.3.2 草鱼Gadd45ab表达受miR-23a-3p和 miR-23a-5p调控 |
| 4.3.3 miR-23a-3p和 miR-23a-5p靶向Gadd45ab调控免疫相关基因 |
| 4.3.4 miR-23a-3p和 miR-23a-5p靶向Gadd45ab调控细胞凋亡 |
| 4.3.5 miRNA对嗜水气单胞菌刺激后的影响 |
| 4.3.6 嗜水气单胞菌刺激miRNA抑制剂后对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 :草鱼Gadd45ba和草鱼Gadd45bb受 miR-148 调控及其免疫和凋亡功能探究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 总RNA提取 |
| 5.2.2 草鱼肾细胞系(CIK)培养 |
| 5.2.3 miR-148模拟物与抑制剂的合成 |
| 5.2.4 miRNA实时荧光定量PCR分析 |
| 5.2.5 质粒构建与细胞转染 |
| 5.2.6 双荧光素酶报告基因检测 |
| 5.2.7 生物信息学统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 草鱼Gadd45ba与草鱼Gadd45bb是 miR-148 的靶基因 |
| 5.3.2 miR-148对嗜水气单胞菌刺激后的表达情况 |
| 5.3.3 双荧光素酶报告基因分析 |
| 5.3.4 miR-148 改变CIK细胞中免疫应答相关基因的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 :草鱼Gadd45g受 miR-429b调控及其免疫和凋亡功能探究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 总RNA提取 |
| 6.2.2 生物信息学分析 |
| 6.2.3 miR-429b的合成(模拟物和抑制剂) |
| 6.2.4 嗜水气单胞菌感染CIK细胞后对Gadd45g和 miR-429b表达的影响 |
| 6.2.5 miR-429b对于免疫基因tnf-a,ifn和 il-8 的影响 |
| 6.2.6 实时荧光定量PCR |
| 6.2.7 数据统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 miR-429b抑制草鱼Gadd45g表达 |
| 6.3.2 miR-429b在 CIK细胞中对于草鱼Gadd45g和免疫相关基因tnf-a,ifn和il-8的表达情况 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）3,3’-二吲哚甲烷通过TRAF2/p38MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 胃癌 |
| 1.2 3,3'-二吲哚甲烷(DIM) |
| 1.2.1 植物化学物 |
| 1.2.2 DIM的结构与来源 |
| 1.2.3 DIM抗肿瘤机制 |
| 1.2.4 DIM与胃癌研究进展 |
| 1.3 p38MAPK |
| 1.3.1 MAPK信号通路概述 |
| 1.3.2 p38MAPK及其作用 |
| 1.3.3 p38MAPK与肿瘤凋亡 |
| 1.4 TRAF2 |
| 1.4.1 TRAF2 概述 |
| 1.4.2 TRAF2 与肿瘤 |
| 1.4.3 TRAF2与p38MAPK的联系 |
| 1.5 研究设计 |
| 1.5.1 研究背景 |
| 1.5.2 研究价值与意义 |
| 1.5.3 实验方案设计 |
| 第二章 DIM抑制胃癌细胞的增殖 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 仪器及材料 |
| 2.1.3 常用试剂 |
| 2.1.4 药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 和正常胃粘膜上皮细胞GES-1 培养 |
| 2.2.2 MTT法检测细胞活力 |
| 2.2.3 细胞总蛋白提取 |
| 2.2.4 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.5 蛋白质免疫印迹法检测增殖相关蛋白(p21、CDK4、Cyclin D1) |
| 2.2.6 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 DIM对胃癌细胞株增殖活力的影响 |
| 2.3.2 DIM对胃癌细胞株增殖相关蛋白水平的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 DIM促进胃癌细胞的凋亡 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 仪器及材料 |
| 3.1.3 常用试剂 |
| 3.1.4 药品及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 的培养 |
| 3.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3.2.3 细胞总蛋白提取 |
| 3.2.4 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.2.5 蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白(cleaved caspase3,cleaved PARP,Bax,Bcl-2) |
| 3.2.6 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 DIM对胃癌细胞株凋亡形态的影响 |
| 3.3.2 DIM对胃癌细胞株凋亡相关蛋白水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 DIM通过调控p38MAPK抑制胃癌细胞 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 仪器及材料 |
| 4.1.3 常用试剂 |
| 4.1.4 药品及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 的培养 |
| 4.2.2 药理学(SB203580)干预p38MAPK信号通路 |
| 4.2.3 MTT法检测细胞活力 |
| 4.2.4 细胞总蛋白提取 |
| 4.2.5 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.2.6 蛋白质免疫印迹法检测p38MAPK相关蛋白(p-ASK1,p-p38,p38,p-p53)以及增殖、凋亡相关蛋白 |
| 4.2.7 数据统计 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 DIM对胃癌细胞p38MAPK相关蛋白的影响 |
| 4.3.2 DIM与 SB203580 联用对胃癌细胞增殖活力的影响 |
| 4.3.3 DIM与 SB203580 联用对胃癌细胞p38MAPK下游蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 TRAF2 的表达水平对胃癌凋亡的影响 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.1.1 实验对象 |
| 5.1.2 仪器及材料 |
| 5.1.3 常用试剂 |
| 5.1.4 药品及试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫组化法检测胃癌组织及癌旁组织中TRAF2 的表达 |
| 5.2.2 BGC-823、SGC-7901和GES-1 细胞的培养 |
| 5.2.3 TRAF2 siRNA转染 |
| 5.2.4 MTT法检测细胞活力 |
| 5.2.5 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.6 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.2.7 蛋白质免疫印迹法检测增殖及凋亡相关蛋白 |
| 5.2.8 数据统计 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 TRAF2 在人胃癌组织和胃癌细胞中的表达 |
| 5.3.2 TRAF2 siRNA转染胃癌细胞对细胞凋亡的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 DIM通过TRAF2/p38MAPK通路抑制胃癌细胞 |
| 6.1 实验材料和仪器 |
| 6.1.1 实验对象 |
| 6.1.2 仪器及材料 |
| 6.1.3 常用试剂 |
| 6.1.4 药品及试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 胃癌细胞BGC-823、SGC-7901 的培养 |
| 6.2.2 TRAF2 过表达质粒转染胃癌细胞 |
| 6.2.3 MTT法检测细胞活力 |
| 6.2.4 细胞总蛋白提取 |
| 6.2.5 BCA法测定蛋白浓度 |
| 6.2.6 蛋白质免疫印迹法检测TRAF2、p38MAPK的相关蛋白及增殖、凋亡的相关蛋白 |
| 6.2.7 数据统计 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 DIM对胃癌细胞TRAF2 蛋白的影响 |
| 6.3.2 TRAF2 过表达质粒与DIM共处理对胃癌细胞增殖水平的影响 |
| 6.3.3 TRAF2 过表达质粒与DIM共处理对胃癌细胞TRAF2、p38MAPK及其下游蛋白表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 实验结论 |
| 7.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 第八章 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
（5）基于p38MAPK信号通路的身痛逐瘀汤治疗类风湿关节炎机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 身痛逐瘀汤对CIA大鼠的治疗作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 身痛逐瘀汤对大鼠RA-FLS的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 身痛逐瘀汤调控大鼠 RA-FLS 的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 p38MAPK信号通路与RA-FLS相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 身痛逐瘀汤治疗RA的现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应和炎性反应临床观察及与p38MAPK相互作用机制的光谱研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应及炎性反应的临床观察 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 帕瑞昔布与p38MAPK相互作用机制的光谱研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文主要创新点 |
| 研究不足之处 |
| 综述 p38MAPK:应激反应和炎性反应的分子机制和治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）结核分支杆菌感染过程中IL-32ε介导细胞凋亡及抗菌机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 结核病及其防治的研究进展 |
| 1.1.1 结核病的危害 |
| 1.1.2 结核杆菌 |
| 1.1.3 结核病的发病机制 |
| 1.1.4 结核病的治疗与诊断 |
| 1.2 结核分支杆菌与巨噬细胞的相互作用 |
| 1.3 结核分支杆菌与细胞凋亡 |
| 1.3.1 细胞凋亡是巨噬细胞对结核分支杆菌防御机制 |
| 1.3.2 细胞凋亡调控网络简介 |
| 1.4 IL-32 抗结核的研究进展 |
| 1.5 Nmi及其作用模式 |
| 1.6 Wnt/β-catenin信号通路在结核分支杆菌感染中的作用 |
| 1.7 p38 MAPK信号通路的机制与功能 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 IL-32 与结核分支杆菌的相互影响 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2攻菌实验 |
| 2.2.3 测定IL-32 表达水平 |
| 2.2.4 IL-32 表达载体构建 |
| 2.2.5 细胞转染 |
| 2.2.6 免疫印迹检测IL-32 蛋白表达水平 |
| 2.2.7攻菌实验 |
| 2.2.8 CFU测定 |
| 2.2.9 结核分支杆菌sigA表达测定 |
| 2.2.10 数据分析与统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 结核分支杆菌H37Ra诱导THP-1 细胞中IL-32 剪接异构体的产生 |
| 2.3.2 不同IL-32 剪接异构体对巨噬细胞内结核分支杆菌增殖的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 IL-32 剪接异构体对细胞凋亡的影响 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞转染 |
| 3.2.3攻菌实验 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 激活型Caspase-3 蛋白水平检测 |
| 3.2.6 细胞凋亡相关基因表达检测 |
| 3.2.7 数据分析与统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同IL-32 剪接异构体对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.2 IL-32 过表达细胞中凋亡相关基因的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Nmi参与介导IL-32ε诱导的抗菌作用和细胞凋亡 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养及转染 |
| 4.2.2 Nmi mRNA和蛋白表达水平测定 |
| 4.2.3 siRNA筛选 |
| 4.2.4 CFU测定和结核分支杆菌sigA表达测定 |
| 4.2.5 细胞凋亡检测 |
| 4.2.6 β-catenin蛋白水平的测定 |
| 4.2.7 检测β-catenin对 IL-32 诱导凋亡的影响 |
| 4.2.8 数据分析与统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 IL-32ε影响Nmi的表达 |
| 4.3.2 siRNA的筛选 |
| 4.3.3 Nmi参与调控IL-32ε介导的抗菌作用 |
| 4.3.4 Nmi参与调控IL-32ε介导的细胞凋亡 |
| 4.3.5 IL-32ε对细胞凋亡的影响依赖于β-catenin下调 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 IL-32ε通过p38 MAPK信号通路调控Nmi表达 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 构建截短Nmi启动子荧光素酶报告载体 |
| 5.2.3 截短Nmi启动子双荧光素酶报告载体活性检测 |
| 5.2.4 Nmi核心启动子区域分析 |
| 5.2.5 启动子核心区域Pax6和CP2 结合位点突变分析 |
| 5.2.6 IL-32ε过表达细胞中Pax6和CP2 表达测定 |
| 5.2.7 Pax6和CP2 诱导Nmi表达的检测 |
| 5.2.8 Pax6和CP2的siRNA合成及干扰后Nmi表达检测 |
| 5.2.9 IL-32ε过表达细胞中p38 MAPK活性检测 |
| 5.2.10 p38 MAPK介导IL-32ε诱导Nmi表达的检测 |
| 5.2.11 数据分析与统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Nmi启动子核心区域的筛选 |
| 5.3.2 Nmi启动子核心区域的分析 |
| 5.3.3 Pax6和CP2 参与调控IL-32ε介导的Nmi转录 |
| 5.3.4 p38 MAPK参与调控IL-32ε介导的Nmi转录 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）TGF-β1影响汞诱导绒毛滋养细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 HgCl_2 诱导绒毛滋养细胞凋亡的研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 HgCl_2 诱导HTR-8/ SVneo滋养细胞凋亡 |
| 2.2 HgCl_2 诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡呈剂量依赖性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 TGF-β1在HgCl_2 诱导滋养细胞凋亡中作用及机制的研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 TGF-β1 降低了 HgCl_2诱导的 HTR-8 / SVneo 细胞凋亡 |
| 2.2 TGF-β1 处理激活HTR-8/ SVneo滋养细胞TAK1 信号分子 |
| 2.3 p38 MAPK信号通路与TGF-β1 调控的滋养细胞凋亡有关 |
| 2.4 TAK1 表达参与调控HgCl_2 诱导的细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β1 对人绒毛滋养细胞生物学功能的影响 |
| 3.2 MAPK信号通路对滋养细胞凋亡的影响 |
| 3.3 TGF-β1 通过p38MAPK信号通路调控HgCl_2 诱导的滋养细胞凋亡机制及其与妊娠相关疾病的相关性 |
| 4 结论 |
| 本研究存在的局限性和前景展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）β-伴大豆球蛋白对草鱼肠道细胞凋亡的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.前言 |
| 2.文献综述 |
| 2.1 β-伴大豆球蛋白 |
| 2.2 细胞凋亡 |
| 2.3 β-伴大豆球蛋白对鱼类肠道细胞凋亡的影响 |
| 2.4 Gln对鱼类细胞的保护作用 |
| 3.存在的问题 |
| 第二章 研究的目的与意义 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究意义 |
| 3.技术路线 |
| 第三章 试验研究 |
| 试验一 β-伴大豆球蛋白对幼龄草鱼生产性能和肠道凋亡的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验设计 |
| 2.2 试验原料与日粮 |
| 2.3 试验条件与饲养管理 |
| 2.4 测定指标 |
| 2.5 统计分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 成活率、生产性能与肠道发育相关指标 |
| 3.2 DNA片段化 |
| 3.3 Caspase酶活 |
| 3.4 凋亡相关分子m RNA相对表达 |
| 3.5 p38 MAPK蛋白表达水平 |
| 3.6 ROS浓度 |
| 3.7 ROS生成酶活性与基因表达 |
| 4.讨论 |
| 4.1 β-伴大豆球蛋白抑制草鱼生长与肠道发育 |
| 4.2 β-伴大豆球蛋白依赖caspase介导的通路引起肠道细胞凋亡 |
| 4.3 β-伴大豆球蛋白诱导肠道细胞凋亡与死亡受体或线粒体介导的凋亡通路相关 |
| 4.4 β-伴大豆球蛋白诱导肠道细胞凋亡可能与ROS和 MAPK信号分子相关 |
| 5.小结 |
| 试验二 β-伴大豆球蛋白消化产物对草鱼肠细胞凋亡的作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 体外消化试验 |
| 2.3 β-伴大豆球蛋白消化产物对草鱼肠细胞凋亡的影响 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 体外消化酶料比(E:S) |
| 3.2 β-伴大豆球蛋白体外消化 |
| 3.3 β-伴大豆球蛋白体外消化产物分离纯化 |
| 3.4 β-伴大豆球蛋白及其消化产物对草鱼肠道细胞DNA片段化的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 β-伴大豆球蛋白体外消化 |
| 4.2 β-伴大豆球蛋白体外消化产物分离纯化 |
| 4.3 β-伴大豆球蛋白消化产物引起草鱼肠道细胞凋亡 |
| 5.小结 |
| 试验三 β-伴大豆球蛋白消化产物对细胞骨架介导的草鱼肠细胞凋亡的影响 |
| 1.前言 |
| 2.第一部分:细胞骨架F-actin检测探针的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3.第二部分:β-伴大豆球蛋白消化产物诱导草鱼肠细胞凋亡的机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 试验四 Gln对 β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的保护作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 草鱼肠道细胞培养 |
| 3.第一部分:摸索Gln对细胞的保护作用 |
| 3.1 试验设计 |
| 3.2 细胞处理 |
| 3.3 观测指标 |
| 3.4 数据统计分析 |
| 3.5 试验结果 |
| 3.6 讨论 |
| 4.第二部分:Gln对细胞骨架的保护作用 |
| 4.1 试验设计 |
| 4.2 细胞处理 |
| 4.3 观测指标 |
| 4.4 试验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 5.小结 |
| 第四章 全文总结与结论、创新点及有待进一步研究的问题 |
| 1.全文总结与结论 |
| 2.本研究的创新点 |
| 3.有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）胡黄连苷Ⅱ对脑缺血/再灌注损伤的保护机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠MCAO/R实验 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型 |
| 2.2 设计分组 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 胡黄莲苷Ⅱ可明显改善大鼠MCAO/R神经功能学评分 |
| 2 胡黄连苷Ⅱ可降低大鼠MCAO/R后脑梗死体积 |
| 3 胡黄连苷Ⅱ可改善大鼠皮质神经元病理改变 |
| 4 胡黄连苷Ⅱ可改善大鼠MCAO/R后皮质神经元超微结构损伤 |
| 5 胡黄连苷Ⅱ可减少大鼠MCAO/R后神经细胞凋亡 |
| 6 胡黄连苷Ⅱ可抑制大鼠MCAO/R后相关炎性因子表达水平 |
| 6.1 IL-6 表达水平变 |
| 6.2 TNFα表达水平变化 |
| 7 胡黄连苷Ⅱ可抑制大鼠MCAO/R后 p53 蛋白激活 |
| 8 胡黄连苷Ⅱ可抑制大鼠MCAO/R后 p38 信号通路激活 |
| 第二部分 SH-SY5Y细胞OGD/R实验 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygen,OGD/R)模型制备 |
| 2.2 胡黄连苷Ⅱ浓度的确定 |
| 2.3 实验分组和处理 |
| 2.4 检测方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 OGD/R细胞模型建立 |
| 2 OGD/R处理后SH-SY5Y细胞有最佳保护作用的胡黄连苷Ⅱ浓度确定 |
| 3 胡黄连苷Ⅱ对 OGD/R后 SH-SY5Y细胞影响 |
| 3.1 胡黄莲苷Ⅱ可提高OGD/R后 SH-SY5Y细胞活性 |
| 3.2 胡黄莲苷Ⅱ可降低OGD/R后 SH-SY5Y细胞凋亡 |
| 3.3 胡黄莲苷Ⅱ可抑制OGD/R后 SH-SY5Y细胞p38 蛋白激活 |
| 3.4 胡黄莲苷Ⅱ可抑制OGD/R后 SH-SY5Y细胞p53 蛋白激活 |
| 3.5 胡黄莲苷Ⅱ可抑制OGD/R后 SH-SY5Y细胞炎症因子表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、TNF,p38 MAPK与细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]干眼的中医证型及杞参方治疗干眼的作用机制研究[D]. 赵磊. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [2]硒通过TrxR1/MAPK信号通路缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的机理研究[D]. 郭咏梅. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [3]草鱼Gadd45家族基因及相关miRNA功能研究[D]. 方圆. 上海海洋大学, 2020(03)
- [4]3,3’-二吲哚甲烷通过TRAF2/p38MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡的分子机制研究[D]. 叶芬. 江苏大学, 2020(02)
- [5]基于p38MAPK信号通路的身痛逐瘀汤治疗类风湿关节炎机制研究[D]. 韩颖. 河北医科大学, 2020(02)
- [6]帕瑞昔布对胸腔镜手术应激反应和炎性反应临床观察及与p38MAPK相互作用机制的光谱研究[D]. 李雪杰. 山东大学, 2019(03)
- [7]结核分支杆菌感染过程中IL-32ε介导细胞凋亡及抗菌机制的研究[D]. 李仲夏. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [8]TGF-β1影响汞诱导绒毛滋养细胞凋亡的研究[D]. 周桂菊. 安徽医科大学, 2019(07)
- [9]β-伴大豆球蛋白对草鱼肠道细胞凋亡的作用与机制研究[D]. 段绪东. 四川农业大学, 2019(07)
- [10]胡黄连苷Ⅱ对脑缺血/再灌注损伤的保护机制研究[D]. 王婷婷. 青岛大学, 2019(07)