一、单疱疹病毒结构蛋白VP22在细胞间的穿梭及其在基因治疗中的应用（论文文献综述）
沈阳坤[1]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中认为溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
杜毅超[2]（2017）在《VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究》文中研究指明猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,疫苗免疫仍是预防控制该病的主要手段。病毒样粒子（Virus-like particles,VLPs）疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。PPV病毒样粒子（PPV-VLPs）是不含PPVDNA的空衣壳结构,由PPVVP2（下文简称:VP2）结构蛋白体外自行组装形成,形态上与天然病毒粒子相似,具有很强的免疫原性和生物学活性。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）VP22蛋白是该病毒的结构蛋白,不仅具有细胞间自由转运的能力,而且还可以促进融合抗原交叉致敏,增强免疫原性。此外,HSV-1VP22（下文简称:VP22）蛋白还可能提高DNA疫苗的免疫反应。本研究分为三个部分,详细研究内容如下:1、细胞穿膜肽VP22对生物膜穿透性的研究以载体pEGFP-N1为模板扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因,通过SOE-PCR分别将VP22基因片段拼接到EGFP基因的3’/5’端,获得VP22-EGFP和EGFP-VP22融合基因;将融合基因及EGFP基因分别克隆到pET-28a（+）载体构建重组表达质粒 pET28a-EGFP-VP22、pET28a-VP22-EGFP和pET28a-EGFP,并进行测序分析及酶切鉴定,将鉴定正确的各重组表达质粒及pET-28a空载体分别转化宿主菌E.coli BL21（DE3）进行表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析结果可见相对分子量分别为约31 kDa、31 kDa及27kDa的蛋白分子条带,大小与预期相符,表明EGFP-VP22、VP22-EGFP、EGFP蛋白表达成功。对表达的蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化,将纯化后的蛋白添加到Vero细胞中进行共培养,l0h后荧光显微镜下观察到加入VP22-EGFP和EGFP-VP22蛋白的细胞有绿色荧光,而加入EGFP的细胞与空白对照组细胞中则没有观察到绿色荧光存在,提示细胞穿膜肽VP22可有效携带与其融合的EGFP蛋白穿过细胞膜进入细胞,VP22蛋白融合到EGFP蛋白N端或C端并不影响VP22的穿膜效果。2、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及鉴定利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统进行PPV VLPs的制备。以PPV N株的基因组为模板扩增其VP2基因,通过SOE-PCR分别VP22基因拼接到VP2基因片段的3’/5’端,获得VP22-VP2和VP2-VP22融合基因;将两种融合基因及VP2基因分别克隆到pFastBacTMl载体,获得重组质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22 及 pFB-VP2。重组质粒转化至 DHlOBac 感受态细胞进行同源重组,获得重组杆粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2。重组杆粒经脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒株rBac-VP22-VP2、rBac-VP2-VP22及rBac-VP2。随后将重组杆状病毒株感染到sf9细胞进行重组蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定分析,结果可见相对分子量分别为约67 kDa、67 kDa及64 kDa的蛋白分子条带,大小与预期相符,表明VP2-VP22、VP22-VP2及VP2蛋白表达成功。进一步用PPV单抗对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,可观察到特异性荧光,再次证实重组蛋白的表达且具有生物活性。表达产物经透射电镜观察,VP2和VP22-VP2均可自我组装形成22-24nm、形态类似天然PPV的病毒样粒子;VP2-VP22没有观察到病毒样粒子,表明VP2的N端融合VP22不影响VP2形成病毒粒子的特性,而C端融合外源蛋白可能影响VP2形成病毒样粒子。3、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子免疫原性的初步评价用饱和硫酸铵法初步纯化病毒样粒子VP22-VP2（VLPs-VP22-VP2）、病毒样粒子VP2（VLPs-VP2）及重组蛋白VP2-VP22,分别配以弗氏佐剂、ISA 206佐剂及白油司本佐剂制成疫苗免疫小鼠,并以PPV油乳灭活苗和PBS为对照,比较分析三种重组蛋白的免疫原性及筛选较好的免疫佐剂。通过间接ELISA检测免疫小鼠血清中PPV特异性抗体,结果显示VLPs-VP22-VP2及VLPs-VP2能有效诱导小鼠产生特异性PPV抗体,其配以ISA 206佐剂免疫产生的抗体水平与PPV灭活苗基本相当,而重组蛋白VP2-VP22产生的抗体水平要明显低于PPV灭活苗组;IL-2是T细胞增殖的主要生长因子,IFN-γ仅由活化T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）产生,检测这两个指标的不同程度能反映动物机体的细胞免疫水平,对采集的免疫小鼠血清IL-2和IFN-γ含量测定结果显示,与阴性对照组相比,VLPs-VP22-VP2、VLPs-VP2及重组蛋白VP2-VP22免疫组均能有效刺激IL-2和IFN-γ的产生,且融合VP22的VLPs-VP22-VP2刺激机体产生IFN-γ和IL-2的水平显着高于VLPs-VP2及PPV灭活苗（P<0.05）,此外,以ISA 206为佐剂,其免疫增强的效果要优于其他佐剂（P<0.05）。上述结果表明,融合VP22蛋白可明显提高VP2蛋白的特异性T淋巴细胞的免疫应答水平,但却不能显着提高VP2蛋白的体液免疫效果;VP2N端融合VP22蛋白的免疫效果要优于其C端融合。VLPs-VP2、VLPs-VP22-VP2配以ISA 206佐剂免疫小鼠后能更有效地诱导机体产生针对PPV的体液及细胞免疫。
余娴,雷军,胥正敏,李婷婷[3]（2015）在《细胞穿膜肽VP22增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布》文中认为目的制备表达细胞穿膜肽融合蛋白PTEN-VP22的真核表达质粒,验证细胞穿膜肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布。方法构建重组真核表达质粒pc DNA3-PTEN与pc DNA3-PTEN-VP22,转染BT549细胞,Western blot与免疫荧光检测PTEN蛋白与PTEN-VP22融合蛋白的表达与分布。结果 PTEN蛋白与PTEN-VP22融合蛋白在BT549细胞中成功表达;PTEN-VP22在转染细胞中的表达与分布较之PTEN明显增多,且在细胞间的分布呈现典型的VP22分布特点,并主要分布于细胞核。结论细胞穿膜肽VP22增强了抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布。
龙雨清[4]（2015）在《mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究》文中指出黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤,占恶性肿瘤的1%3%,恶性程度高,转移早且发生广泛,对传统的治疗方法有较强的抗性,是临床治疗上一种颇为棘手的恶性肿瘤。由于黑色素瘤常发生在皮肤,易于观察,因此非常适用于基因治疗的研究。随着分子生物学、基因组学、免疫学、病理学以及相关学科的快速发展,以基因治疗为主线的治疗方法逐渐成为肿瘤学的研究热点。目前,腺病毒（Adenovirus,Ad）载体疗法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一,它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中,载体的构建和操作简单,宿主范围广,感染性强,可经不同途径进入不同组织,还能感染分化后的非分裂期细胞。本研究选择新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）的血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin neuraminidase,HN）基因作为黑色素瘤的治疗基因。大量研究结果表明,HN蛋白是NDV发挥抗肿瘤作用的主要成分,HN蛋白不仅具有介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起辅助病毒侵入肿瘤细胞的作用,还具有神经氨酸酶活性,能水解宿主细胞表面的唾液酸,暴露宿主细胞的生物识别位点,促进抗原递呈,引起肿瘤周围的细胞因子和化学因子生成增加,引发淋巴细胞、单核细胞浸润等。为了强化HN基因对黑色素瘤的治疗效果,研究中利用端粒酶启动子和酪氨酸酶双启动子来调控治疗基因HN的表达。端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是负责端粒酶催化活性最重要的组分。端粒酶活性的变化与细胞的衰老和肿瘤的发生息息相关。TERT表达于90%以上的肿瘤,大多数人类和小鼠的癌症或肿瘤衍生的细胞系中都有端粒酶活性的高表达,因而是广谱的肿瘤标志物。酪氨酸酶（Tyrosinase,Tyr）是黑色素瘤形成过程中的一种关键酶,其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量,该酶活性过高会导致色斑及黑色素瘤的形成。大量研究发现Tyr启动子只在黑色素瘤细胞中特异性表达,而在其他组织中不表达。因此,TERT和Tyr具有调控下游治疗基因HN的特性。本研究根据Gen Bank中mTERT基因序列（AF157502.1）、mTyr基因序列（D00439.1）和NDV HN cDNA序列（EF211815.1）,设计一对PCR扩增引物和两对RT-PCR扩增引物,分别从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和pShuttle-CMV-HN质粒中扩增出目的片段;将目的片段分别连接于pMD-19T载体,命名为pMD-mTERTp、pMD-mTyrp、pMD-HN;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切,用T4酶连接并构建重组穿梭载体;线性化重组穿梭载体与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,经鉴定正确后,将重组腺病毒质粒经脂质体转染HEK293细胞,包装出能表达HN基因的由双启动子调控的特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN;经RT-PCR、Western blotting鉴定及测序分析后,经CsCl密度梯度超速离心法大量纯化病毒颗粒,以TCID50方法测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的最终滴度分别为1011.25TCID50/mL、1012.52.5 TCID50/mL、1011.625 TCID50/m L、1011.875 TCID50/m L和1012.125 TCID50/mL,符合后续的抑瘤实验所需病毒要求;通过Hochest33342/PI染色实验证实构建的重组腺病毒能够感染B16细胞;MTT试验结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值,且抑制率显着大于其他对照组重组腺病毒,Western blotting检测到HN蛋白在B16细胞中的表达,经流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为28.03±0.45%、48.36±0.95%、39.12±0.78%、58.39±1.47%、19.05±0.89%。本研究的创新之处在于,首次结合端粒酶逆转录酶启动子与酪氨酸酶启动子的肿瘤特异性和组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性,成功构建出融合表达上述基因的Ad-mTERTp-Tyrp-HN,为下一步利用重组腺病毒在体外诱导肿瘤细胞凋亡及研制动物肿瘤性疾病的广谱疫苗奠定了理论和实验基础。
杨勤[5]（2014）在《铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达》文中研究说明目的：构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpessimplex virus1，HSV-1）间层蛋白VP22的融合表达的重组质粒，体外转染，观察其在真核细胞中的表达，为进一步研究铜绿假单胞菌DNA疫苗奠定基础。方法：从铜绿假单胞菌基因组中PCR扩增编码外膜蛋白F的基因序列，然后克隆至真核表达载体pVAX1，构建重组质粒pVAX1-OprF；从重组质粒pcDNA3-VP22中酶切出HSV-1VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pVAX1中，构建重组质粒pVAX1-VP22，利用酶切和序列分析方法验证所构建的载体的正确性。将VP22定向克隆至pVAX1-OprF中，构建pVAX1-VP22-OprF，将OprF定向克隆至pVAX1-VP22中，构建pVAX1-OprF-VP22（由上海生工完成）；同时利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP22蛋白的碳端，然后进行电洗脱得到纯化蛋白，将纯化的重组VP22蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠获得抗VP22多抗血清，采用Western blot的方法对其特异性进行鉴定。最后，用脂质体法将构建完成的重组质粒转染真核细胞，通过Western blot检测其在真核细胞中的表达情况。结果：酶切和核酸序列测序证实重组质粒构建完全正确；重组VP22蛋白可在大肠杆菌Rosetta2宿主菌中得到高效表达，得到相对分子质量约30KD的VP22蛋白，纯化的蛋白免疫小鼠后，获得了抗VP22多抗血清。将重组质粒转染真核细胞，Western blot结果证实重组质粒在真核细胞中得到了表达。结论：成功构建了含有VP22和OprF的双表达载体；建立了HSV-1间层蛋白原核表达系统和成功制备了抗VP22多抗血清；构建的重组质粒可在真核细胞中正确表达，为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了良好的基础。
刘会娟[6]（2012）在《疱疹病毒VP22蛋白功能研究进展》文中研究指明VP22蛋白作为疱疹病毒外膜结构中含量最多的蛋白,在疱疹病毒复制过程中发挥着重要的调控作用。本文简述了疱疹病毒VP22蛋白的转导功能、以及其与疱疹病毒其他蛋白之间的相互作用,并对其今后的研究及应用前景进行了讨论。
姜龙[7]（2012）在《鸭瘟病毒UL49基因功能研究》文中进行了进一步梳理1、鸭瘟病毒UL49基因生物信息学分析。本章根据实验室测定的DPV UL49基因核酸序列及氨基酸序列,对其进行了生物信息学分析,研究结果表明：DPVUL49基因编码VP22蛋白,此蛋白由253aa组成,分子量约为27864.575Da,其中Arg、Ala、Ser、Asp与Thr的含量最高,分别为11.85%、11.85%、11.06%、7.11%及7.11%。相似性及进化树分析表明DPV应该划分为α疱疹病毒亚科、马立克病毒属。DPV VP22蛋白无信号肽、无跨膜区、无核输入及核输出信号,等电点为9.795,其C端126aa～191aa区域保守性最强；VP22蛋白可能含有2个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP-依赖蛋白激酶磷酸化位点,9个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点及3个酰胺化功能位点。亚细胞定位分析表明,DPV VP22蛋白存在于细胞核、细胞浆及线粒体中的可能性分别为87.2%、12.7%和0.1%。2、鸭瘟病毒UL49基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备。根据实验室提供的DPV UL49基因序列,采用Oligo6.71软件设计了一对特异性引物,并将扩增出的UL49全基因克隆入pMD18-T载体中,经BamH I和Hind III双酶切后,克隆入原核表达载体pET-28a（+）中,成功构建了pET28a-UL49重组原核质粒。将此质粒转化表达宿主菌BL21（DE3）,经过对IPTG浓度、诱导温度及诱导时间的优化,确定了pET28a-UL49重组质粒表达的最佳条件：即在37℃条件下,0.6mmol/L IPTG诱导表达4h,表达的重组VP22蛋白约为35kDa,具有高度可溶性及很好的反应原性。将纯化后的重组VP22蛋白免疫雄性家兔,制备分离兔抗重组VP22蛋白高免血清,效价最高为1：32；经饱和硫酸铵法粗提、HighQ阴离子交换层析法纯化后,、Western blot检测能够与纯化的VP22重组蛋白结合,具有很强的特异性,为进一步研究VP22蛋白的功能奠定了基础。3、鸭瘟病毒VP22蛋白亚细胞定位研究。采用间接免疫荧光法研究了DPV VP22蛋白在病毒感染鸭胚成纤维细胞中的定位时相,结果表明：DPV感染细胞6h后,在胞浆、核膜周围可见特异性荧光；12h后,在胞浆、核内均可见特异性荧光,胞核中的荧光呈均匀分布；随着时间推移,在病毒感染24h和36h后,绝大多数细胞核内都出现荧光且逐渐增强,胞浆中的荧光渐趋减少。由于在感染晚期,DPV可使鸭胚成纤维细胞形成蚀斑,细胞死亡后发生脱落进入培养液中,故在48h和72h时表达荧光的细胞数量渐趋减少。此外,大肠杆菌表达的VP22重组蛋白能够由培养液自主进入细胞内部：VP22蛋白加入MEM培养液4h后,胞浆内部可发现特异性荧光,并且随着时间的推移,胞浆内的荧光越来越强,至36h时几乎所有细胞的胞浆内均可见特异性荧光并呈颗粒状分布,荧光强度达到最大；可是在胞核内始终未见特异性荧光。4、鸭瘟病毒UL49基因转录时相与表达时相分析。本试验采用荧光定量PCR法及Western blot法研究了DPV UL49基因在鸭胚成纤维细胞中的转录及表达时相,试验结果表明：DPV UL49基因在病毒感染1h后开始转录,12h后转录量开始明显增加,24h时采用Western blot法能够检测到VP22蛋白,至72h～84h时UL49基因的转录量和表达量均达到最大值,之后开始逐渐降低。5、鸭瘟病毒VP22蛋白核定位信号研究。为了研究DPV VP22蛋白是否存在核定位信号及其功能位点的位置,以绿色荧光蛋白为标记,构建了一系列不同区域截短VP22蛋白缺失突变体与GFP融合表达的真核质粒,然后使用脂质体介导转染鸭胚成纤维细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,从而确定与核定位相关的结构域,为进一步深入研究DPV VP22蛋白的结构与功能奠定了基础。试验结果表明：（1）DPV VP22蛋白具有核定位功能,并且这种功能不依赖其他DPV蛋白；（2）DPV VP22蛋白C端165aa～253aa区域能够独立作为核定位信号；（3）DPV VP22蛋白的核定位功能在活细胞及不同固定剂处理后的细胞中都能够检测到,所以其核定位功能不受固定剂的影响。6、DPV UL49基因RNA干扰有效靶点筛选及其对病毒重要糖蛋白基因转录的影响。根据实验室提供的DPV UL49基因序列,由上海吉玛制药技术有限公司设计4个不同的shRNA序列,然后插入到pGPU6载体中。将4个RNAi真核质粒与第六章构建的VP22a-GFP荧光质粒共转染鸭胚成纤维细胞,荧光显微镜观察干扰结果,4个RNAi干扰质粒均能够抑制VP22a-GFP质粒表达荧光,其中VP22-505和VP22-555表现的抑制作用最强。4种RNAi质粒对DPV UL49基因转录具有不同程度的抑制作用,尤其以VP22-505抑制效率最高,达到80%,从而确定了UL49基因中的“5-GCTGTTGGAGATTGCCAATGA-3"序列（即505bp-525bp）是RNAi发挥作用的最佳靶点。RNAi质粒VP22-505对DPV UL49基因转录抑制的同时,对DPV糖蛋白gB、gD和gE基因的转录也具有很强的抑制作用。
朴秉国[8]（2011）在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中进行了进一步梳理本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌（BEL-7402）抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
唐翌姝[9]（2012）在《1、细菌纳米磁小体为载体的基因疫苗研究2、同种异基因白细胞联合细胞瘤苗治疗肿瘤的初步研究》文中研究说明DNA疫苗是一种能激发抗原特异性免疫的方法。新型纳米材料细菌纳米磁小体（Bacterial Magnetic Particles,BMP）是趋磁性细菌体内依靠生物矿化法合成的磁性纳米颗粒,主要由磁核和包被磁核的脂质膜组成。BMP本身所特有的独特性质,使其在许多领域得到广泛的应用,但作为基因载体的应用还很少。在本研究中,我们将基因疫苗pSLC-E7-Fc作为模型,该疫苗是运用HPV-16E7作为靶抗原,两边分别与次级淋巴组织趋化因子（SLC）和IgG Fc片段基因重组。应用BMP作为载体,连接pSLC-E7-Fc形成复合疫苗（BMP-V）,进行肿瘤免疫治疗,优化BMP在体外和体内进行基因传递的条件。将BMP与DNA分别在生理盐水,pH=3,4,5,6,7,8,9的PBS中连接,结果表明与生理盐水相比,在pH=4～5的PBS中BMP连接DNA更加有效（96%vs79.5%,P<0.05）。电子显微镜显示BMP-V的大小和形态与未连接基因的BMP相似,仍然具有均质性,直径<100nm。半定量RT-PCR和流式细胞仪结果表明,BMP-V在体外有效转染的条件是用600-mT磁场作用10min。小动物体内成像实验显示磁场在BMP-V在体内转染过程中起着很重要的作用。以免疫原性较差的小鼠TC-1肿瘤为模型,BMP-V治疗小鼠皮下肿瘤模型时,与对照PBS组相比,5μg BMP-V治疗小鼠组的肿瘤明显比对照PBS组小（P<0.05）,生存期延长15.6天,但与其他剂量组（40μg,20μg,10μg）无统计学差异（P>0.05）,说明BMP-V在小鼠体内治疗中能达到微克级。在BMP-V治疗小鼠肺转移模型中,磁场作用的最佳时间与体外转染条件相同,均为10min。而BMP-V免疫的最佳方式则是皮下注射+磁场作用,其肺重比PBS对照组明显小（296.56±64.209mg vs642.02±71.873mg,P<0.05）,肿瘤结节明显减少（42.6±8.28387vs194.8±23.64849,P<0.05）。为分析BMP-V抗肿瘤效应的机制,进行了CTL活性检测和病理切片检查。结果表明,与对照PBS组相比,BMP-V免疫的小鼠显示了E7特异的CTL活性。在其肿瘤中有大量的肿瘤浸润性淋巴细胞。这说明BMP-V可诱导有效的抗原特异性的细胞免疫应答。用ELISA方法检测,结果表明小鼠体内不会产生抗BMP的抗体,说明BMP无明显免疫原性,BMP-V产生的抗肿瘤效应是由所携带的基因疫苗pSLC-E7-Fe介导,BMP不会影响携带基因的效应。病理切片结果显示,BMP-V治疗小鼠的主要脏器与正常对照组无形态差异,说明BMP在体内应用对小鼠无毒副作用。因此,BMP可以作为一种新型,简便,安全的载体系统应用到基因传递中。本研究完善和拓展BMP在基因传递方面的应用,为BMP在体内进一步应用奠定了基础。目的：恶性肿瘤已成为我国死亡率最高的疾病。除了手术,化疗,放疗三大常规疗法,生物疗法为肿瘤治疗带来了新的希望。细胞因子、单克隆抗体及其他生物治疗手段已逐渐成为临床上重要而有效的辅助治疗手段。恶性肿瘤患者的免疫功能普遍处于低下状态；而同种异体器官移植,移植物通常会刺激宿主产生强烈的细胞免疫反应。因此,利用同种异基因抗原治疗肿瘤,打破肿瘤患者的免疫低反应状态,可能成为一种有效的治疗恶性肿瘤的新途径。本研究探讨了MHC不相合同种异基因白细胞输注（Allogeneic Leukocyte Infusion, ALI）作为佐剂,联合细胞瘤苗进行肿瘤免疫治疗的疗效。方法：利用丝裂霉素C （MMC）灭活的同种异基因白细胞输注联合细胞瘤苗治疗黑色素瘤（B16-F10）,路易斯肺癌（LLC）和TC-1的荷瘤小鼠。皮下注射MMC灭活的同种异基因白细胞和细胞瘤苗混合体治疗TC-1荷瘤小鼠。流式细胞术分析黑色素瘤（B16-F10）,路易斯肺癌（LLC）和TC-1肿瘤细胞表面的MHC-I分子表达。瘤内注射MMC灭活的同种异基因白细胞联合低剂量的环磷酰胺和细胞瘤苗治疗黑色素瘤（B16-F10）,路易斯肺癌（LLC）和TC-1的荷瘤小鼠。结果：皮下注射不同比例的灭活TC-1细胞瘤苗和灭活的SP/BA混合体（1：3和1：9）后,比起PBS对照组,肿瘤体积有所减小,小鼠生存期明显延长。而比起单纯TC-1细胞瘤苗组,肿瘤生长虽有所减缓,但是小鼠生存期却无明显延长。黑色素瘤（B16-F10）,路易斯肺癌（LLC）和TC-1肿瘤细胞表面的MHC-I分子表达量分别是0.5%,1.2%,87.5%。瘤内注射MMC灭活的同种异基因白细胞联合低剂量的环磷酰胺和细胞瘤苗虽然治疗黑色素瘤（B16-F10）和路易斯肺癌（LLC）效果不明显,但是对于TC-1的荷瘤小鼠能产生明显的抗肿瘤效应。结论：灭活同种异基因白细胞输注可以诱发宿主体内大量淋巴细胞活化、增殖,释放大量Th1因子,这些细胞因子促进机体产生了特异性和非特异性抗肿瘤免疫反应,其能与环磷酰胺和细胞瘤苗联合,进而导致小鼠肿瘤生长延缓、生存期延长。该方法简单、安全、有效,有望成为一种新型的抗肿瘤疗法。
韩丽[10]（2009）在《抑制素新型基因工程疫苗的构建及其免疫效果研究》文中研究指明抑制素具有抑制促卵泡素合成与分泌的功能,其主动或被动免疫动物,可以促进排卵、提高产仔数,进而提高繁殖力。国内外科学家致力于抑制素疫苗的研究,从天然提取,人工合成,重组表达到基因免疫。基因免疫技术是上世纪90年代发展起来的免疫新技术,与第一代、第二代免疫技术相比,具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点,因而受到广泛重视。前期研究证明,抑制素DNA疫苗具有抑制素蛋白质疫苗的作用,但与蛋白质疫苗相比,抑制素DNA疫苗免疫原性相对较低;之外,目前抑制素DNA疫苗是以抗性基因标记筛选的,而美国FDA组织规定在临床上严禁使用含有抗性基因筛选标记的疫苗。为解决上述问题,本研究选择牛疱疹病毒（bovine herpes virus-BHV-1）的BVP22基因佐剂来增强激素类基因疫苗的免疫效果,主要包括抑制素和生长抑素的基因疫苗。而DNA疫苗的抗性基因则以营养筛选标记替代,且以缺失相关营养标记基因的减毒沙门氏菌为载体传递疫苗,构建成对基因治疗更为有效安全的染色体-质粒平衡致死系统。具体内容如下:（1）BVP22基因佐剂对抑制素DNA疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的抑制素DNA疫苗pEGISI-VP22,将pEGISI-VP22与pEGISI免疫雌性昆明小鼠,结果pEGISI-VP22诱导的ELISA抗体及小鼠的产仔数均显着高于pEGISI免疫组,表明与BVP22融合表达能显着增强抑制素DNA疫苗的体液免疫,并能进一步提高小鼠的繁殖力,是一种极有希望的抑制素新型DNA疫苗。（2）BVP22基因佐剂对生长抑素基因疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的生长抑素DNA疫苗pEGS2SS-VP22,体外试验证实pEGS2SS-VP22可表达生长抑素融合蛋白BVP22-S2SS。表达质粒免疫昆明小鼠,发现与BVP22融合能快速增强SS特异性ELISA抗体,提高小鼠的生长速度,表明BVP22能增强生长抑素DNA疫苗的免疫反应。同时验证BVP22基因佐剂是增强激素类基因疫苗免疫反应的新途径。（3）以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗的研究:首先利用asd基因营养筛选标记取代pVAX载体的kan抗性基因筛选标记,成功构建不含抗性筛选标记的真核表达质粒pVAX-asd。从而构建无抗性抑制素真核表达质粒pVAX-asd-IS。该质粒pVAX-asd-IS以减毒菌为载体进行传递,构建成抑制素重组菌C501（pVAX-asd-IS）。口服途径免疫45只小鼠,对其免疫剂量(1010,109,108CFU/mL)、免疫次数（1、2、3）进行比较。结果以1010CFU/mL的剂量仅免疫一次后的小鼠产仔数显着高于其他试验组与对照组。免疫后小鼠可诱导Th1和Th2型免疫反应,以诱导Th2型免疫为主。在试验结束后宰杀小鼠,取其内脏等组织,通过石蜡切片和基因整合等检测方法证明以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗是安全、有效的。（4）重组菌C501（pVAX-asd-IS）免疫途径（口服、肌注）比较研究。36只小鼠分为6组,免疫后对诱导的体液免疫、粘膜免疫以及细胞免疫中的IL-4和IFN-γ进行比较。结果说明肌注和口服免疫都可诱导机体Th1型和Th2型免疫反应,但肌注效果更好,且能提高产仔数。（5）以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素重组抗原的研究:将抑制素基因片段融合入asd筛选标记原核表达质粒pYA3493中,制备抑制素重组原核表达质粒pYAIS。将质粒pYAIS电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌asar缺失株C500中,制备重组菌C501（pYAIS）。结果表明重组菌C501（pYAIS）能稳定遗传并可表达抑制素重组抗原。分别将重组菌以三个剂量(1010,109,108CFU/mL)和不同免疫次数（1、2、3）口服免疫昆明小鼠,结果显示试验组均产生较高水平IgG抗体。与其他试验组和对照组相比,以109CFU/mL剂量免疫三次后小鼠产仔数最高,差异显着。试验中小鼠均无异常临床表现,对机体不存在急性、慢性以及生殖等方面毒性作用。
二、单疱疹病毒结构蛋白VP22在细胞间的穿梭及其在基因治疗中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单疱疹病毒结构蛋白VP22在细胞间的穿梭及其在基因治疗中的应用（论文提纲范文）
（1）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪细小病毒病毒样粒子的研究进展 |
| 1.1.1 VLPs及其免疫机制 |
| 1.1.2 PPV-VLPs的研究现况 |
| 1.1.3 展望 |
| 1.2 细胞穿膜肽的研究进展 |
| 1.2.1 细胞穿膜肽的发现及应用 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽的分类 |
| 1.2.3 HSV-1 VP22细胞穿膜肽的研究进展 |
| 1.2.4 展望 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 细胞穿膜肽VP22对生物膜穿透性的研究 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 |
| 2.2.3 重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.4 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP的原核表达 |
| 2.2.5 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP的Western Blot检测 |
| 2.2.6 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP对Vero细胞的毒性分析 |
| 2.2.7 融合蛋白EGFP-VP22和VP22-EGFP体外穿膜实验 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增 |
| 2.3.2 重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白的诱导表达及表达形式分析 |
| 2.3.4 重组蛋白的大量表达及纯化结果 |
| 2.3.5 重组蛋白的Western Blot检测 |
| 2.3.6 融合蛋白的的细胞毒性检测 |
| 2.3.7 融合蛋白的体外穿膜实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及鉴定 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 PPV基因组的提取 |
| 3.2.3 PPV VP2基因的扩增 |
| 3.2.4 PPV VP2基因克隆载体的构建 |
| 3 2.5 VP2-VP22基因的扩增 |
| 3.2.6 VP22-VP2基因的扩增 |
| 3.2.7 重组转移质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22及pFB-VP2的构建及鉴定 |
| 3.2.8 重组杆粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2的构建及鉴定 |
| 3.2.9 重组杆状病毒的制备 |
| 3.2.10 重组蛋白的表达及检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PPV VP2基因的扩增 |
| 3.3.2 重组转移质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22及pFB-VP2的构建与鉴定 |
| 3.3.3 重组杆粒的构建与PCR的鉴定 |
| 3.3.4 重组杆状病毒的制备 |
| 3.3.5 重组杆状病毒的滴度测定 |
| 3.3.6 重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.3.7 重组蛋白SDS-PAGE分析 |
| 3.3.8 重组蛋白的Western Blot检测 |
| 3.3.9 重组蛋白的免疫荧光检测 |
| 3.3.10 电镜观察病毒粒子的包装情况 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 猪细小病毒样粒子及融合蛋白免疫原性的评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要材料及试剂 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的纯化及鉴定 |
| 4.2.2 疫苗制备 |
| 4.2.3 小鼠免疫试验 |
| 4.2.4 抗体水平的检测 |
| 4.2.5 细胞因子水平的检测 |
| 4.2.6 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫原的纯化 |
| 4.3.2 酶标二抗和血清最佳稀释倍数 |
| 4.3.3 免疫小鼠血清PPV抗体检测结果 |
| 4.3.4 小鼠血清细胞因子水平的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文情况 |
（3）细胞穿膜肽VP22增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布（论文提纲范文）
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 构建重组真核表达质粒pc DNA3-PTEN |
| 2.2 构建重组真核表达质粒pc DNA3-PTEN-VP22 |
| 2.2.1 PTEN-VP22双基因获得 |
| 2.2.2 PTEN-VP22双基因连入pc DNA3 |
| 2.3 检测目的蛋白在BT549中的表达与分布 |
| 2.3.1 Western blot |
| 2.3.2 免疫荧光 |
| 2.3.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组真核表达质粒pc DNA3-PTEN的鉴定 |
| 3.2 重组真核表达质粒pc DNA3-PTEN-VP22的鉴定 |
| 3.3 VP22增强PTEN在BT549细胞的表达与分布 |
| 3.3.1 Western blot |
| 3.3.2 免疫荧光 |
| 4 讨论 |
（4）mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 端粒酶逆转录酶启动子的研究进展 |
| 1.1 端粒酶逆转录酶基因的结构与功能 |
| 1.2 hTERT启动子与mTERT启动子区域的比对 |
| 1.3 TERT启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 2 酪氨酸酶启动子的研究进展 |
| 2.1 酪氨酸、酪氨酸酶基因的结构与功能 |
| 2.2 Tyrosinase启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 3 新城疫病毒HN蛋白的抑瘤机制及其研究进展 |
| 3.1 NDV的HN蛋白的结构和功能 |
| 3.2 HN蛋白的抑瘤活性及其机制 |
| 4 腺病毒载体在基因治疗中的研究进展 |
| 4.1 腺病毒载体的概述 |
| 4.2 重组腺病毒的构建思路 |
| 第二章 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因PCR/RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN双酶切鉴定结果 |
| 2.3 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN测序结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 双启动子调控HN基因的重组腺病毒的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN 和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的PCR结果 |
| 2.2 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的双酶切结果 |
| 2.3 重组腺病毒质粒的电泳图 |
| 2.4 重组腺病毒质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.5 重组腺病毒质粒的PacⅠ单酶切结果 |
| 3 小结 |
| 第四章 重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞结果 |
| 2.2 重组腺病毒感染HEK293细胞后RT-PCR的检测结果 |
| 2.3 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.4 重组腺病毒的滴度测定结果 |
| 3 小结 |
| 第五章 重组腺病毒的体外抑瘤作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒感染小鼠黑素瘤B16细胞系的荧光检测 |
| 2.2 重组腺病毒对B16细胞的细胞活力影响研究 |
| 2.3 RT-PCR重组腺病毒在B16细胞中的表达情况检测 |
| 2.4 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.5 荧光检测B16凋亡的情况 |
| 2.6 重组腺病毒对B16细胞的凋亡作用研究 |
| 3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果与分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：Ⅰ型单纯疱疹病毒 VP22 蛋白的转导功能及其应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（6）疱疹病毒VP22蛋白功能研究进展（论文提纲范文）
| 1 疱疹病毒VP22蛋白的蛋白转导功能 |
| 2 疱疹病毒VP22蛋白与其他蛋白的相互作用 |
| 2.1 疱疹病毒VP22蛋白与其他外膜蛋白的相互作用 |
| 2.2 疱疹病毒VP22蛋白与ICP0、ICP4之间的相互作用 |
| 2.3 疱疹病毒VP22蛋白与重要糖蛋白之间的相互作用 |
| 3 展望 |
（7）鸭瘟病毒UL49基因功能研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词汇及其含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒UL49基因及其编码蛋白研究进展 |
| 1. 疱疹病毒粒子的结构 |
| 2. 疱疹病毒的基因组结构 |
| 3. 疱疹病毒VP22蛋白翻译后修饰 |
| 4. 疱疹病毒VP22蛋白的亚细胞定位研究 |
| 5. 疱疹病毒VP22蛋白的转导功能 |
| 6. 疱疹病毒VP22蛋白缺失株表型 |
| 7. 疱疹病毒VP22蛋白与其他蛋白之间的相互作用 |
| 8. 鸭瘟病毒VP22蛋白功能研究进展 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 鸭瘟病毒UL49基因生物信息学分析 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 DPV UL49基因核酸序列与氨基酸序列 |
| 1.2 20株疱疹病毒UL49基因核酸序列 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL49基因相似性比较及进化树分析 |
| 3.2 DPV VP22蛋白序列保守区域分析 |
| 3.3 DPV VP22蛋白氨基酸组成 |
| 3.4 DPV VP22蛋白的二级结构预测 |
| 3.5 DPV VP22蛋白的信号肽预测 |
| 3.6 DPV VP22蛋白的跨膜区预测 |
| 3.7 DPV VP22蛋白功能位点预测 |
| 3.8 DPV VP22蛋白抗原决定簇预测 |
| 3.9 DPV VP22蛋白的滴定曲线预测 |
| 3.10 DPV VP22蛋白亚细胞定位预测 |
| 3.11 DPV VP22蛋白的核定位信号及核输出信号预测 |
| 3.12 DPV VP22蛋白密码子偏嗜性分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 疱疹病毒分类及DPV的生物学归属 |
| 4.2 DPV VP22蛋白的分子特性 |
| 4.3 DPV VP22蛋白翻译后修饰 |
| 4.4 DPV UL49基因密码子偏嗜性研究 |
| 5.小结 |
| Abstract |
| 第三章 鸭瘟病毒UL49基因克隆、原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 质粒、菌株、毒株、抗体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.4.1 主要试剂 |
| 1.4.2 主要试剂配制 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV基因组DNA的提取 |
| 2.2 DPV UL49基因的扩增与T克隆的构建 |
| 2.2.1 DPV UL49基因引物设计 |
| 2.2.2 DPV UL49基因的PCR扩增 |
| 2.2.3 末端平滑DNA片段3'端加“A”反应 |
| 2.2.4 A-Tailing DNA片段与pMD19-T Vector的连接 |
| 2.2.5 DH5α高效率感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.2.7 DPV UL49基因T克隆的鉴定 |
| 2.3 重组原核表达质粒pET28a-UL49的构建与表达 |
| 2.3.1 重组原核表达质粒pET28a-UL49的构建 |
| 2.3.2 重组原核表达质粒pET28a-UL49的表达 |
| 2.4 重组VP22蛋白的制备与纯化 |
| 2.4.1 重组VP22蛋白的制备 |
| 2.4.2 重组VP22蛋白的纯化 |
| 2.4.3 重组VP22蛋白的超滤与冻干 |
| 2.5 Western blot法检测重组VP22蛋白的反应原性 |
| 2.6 兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.6.1 兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.6.2 兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的纯化 |
| 2.7 Western blot法检测兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的特异性 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL49基因的扩增、T克隆及亚克隆的构建 |
| 3.2 重组原核质粒pET28a-UL49的表达及表达条件优化 |
| 3.2.1 重组原核质粒pET28a-UL49的表达 |
| 3.2.2 重组原核质粒pET28a-UL49表达条件的优化 |
| 3.3 重组VP22蛋白的纯化 |
| 3.4 Western blot法检测重组VP22蛋白的反应原性 |
| 3.5 兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的制备、纯化及特性 |
| 3.5.1 琼脂双向扩散法检测兔抗重组VP22蛋白高免血清效价 |
| 3.5.2 High Q阴离子交换层析法纯化兔抗VP22蛋白IgG |
| 3.5.3 Western blot法检测兔抗重组VP22蛋白多克隆抗体的特异性 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 载体-宿主菌-培养条件最佳组合的确定 |
| 4.2 重组VP22蛋白的可溶性表达 |
| 4.3 重组VP22蛋白的纯化 |
| 4.4 兔抗重组VP22蛋白的制备 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭瘟病毒VP22蛋白亚细胞定位研究 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.4.1 主要试剂 |
| 1.4.2 主要试剂配制 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位 |
| 2.1.1 间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的建立 |
| 2.1.2 间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的条件优化 |
| 2.1.3 特异性检测 |
| 2.2 VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内部 |
| 2.2.1 VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的建立 |
| 2.2.2 VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的条件优化 |
| 2.2.3 特异性检测 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位 |
| 3.1.1 间接免疫荧光法检测DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中定位方法的条件优化 |
| 3.1.2 特异性检测 |
| 3.1.3 DPV VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位时相 |
| 3.2 VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内部 |
| 3.2.1 VP22重组蛋白能否由培养液自主进入细胞内检测方法的条件优化 |
| 3.2.2 特异性检测 |
| 3.2.3 VP22重组蛋白能够由培养液自主进入细胞内部 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 疱疹病毒VP22蛋白在病毒感染细胞中的定位研究 |
| 4.2 VP22重组蛋白能够由培养液自主进入细胞内部 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第五章 鸭瘟病毒UL49基因转录时相与表达时相分析 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 试验动物、细胞及毒株 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 试剂配制 |
| 1.3.3 RNA试验器具的处理 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 FQ-PCR法检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL49基因转录时相分析 |
| 2.1.1 鸭胚成纤维细胞的培养与病毒接种 |
| 2.1.2 Total RNA的抽提 |
| 2.1.3 Total RNA中残存基因组DNA的去除与验证 |
| 2.1.4 反转录反应 |
| 2.1.5 FQ-PCR引物的设计与合成 |
| 2.1.6 引物退火温度优化与特异性检测 |
| 2.1.7 FQ-PCR标准曲线的建立 |
| 2.1.8 DPV UL49基因转录时相分析 |
| 2.2 DPV UL49基因在病毒感染DEF细胞中的表达时相分析 |
| 2.2.1 鸭胚成纤维细胞的培养与病毒接种 |
| 2.2.2 细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.3 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.4 Western-blot分析 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 FQ-PCR法检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL49基因转录时相分析 |
| 3.1.1 Total RNA完整度与纯度检测 |
| 3.1.2 Total RNA中残存基因组DNA的去除与验证 |
| 3.1.3 引物退火温度优化与特异性检测 |
| 3.1.4 DPV UL49基因标准曲线的建立 |
| 3.1.5 DPV UL49基因转录时相分析 |
| 3.2 DPV UL49基因在病毒感染细胞中的表达时相分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 RNA质量控制与反转录 |
| 4.2 FQ-PCR试验条件优化 |
| 4.3 疱疹病毒UL49基因转录时相比较 |
| 4.4 疱疹病毒UL49基因表达时相分析 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第六章 鸭瘟病毒VP22蛋白核定位信号研究 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 质粒、菌株、毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.4.1 主要试剂 |
| 1.4.2 试剂配制 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV UL49全基因及其缺失突变体的引物设计 |
| 2.2 DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的构建 |
| 2.2.1 DPV UL49全基因及其缺失突变体的扩增 |
| 2.2.2 DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的构建 |
| 2.2.3 DPV UL49全基因及其缺失突变体T克隆的鉴定 |
| 2.3 UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的构建 |
| 2.4 DPV UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的制备 |
| 2.5 DPV VP22蛋白及其缺失突变体在活细胞中的定位研究 |
| 2.6 DPV VP22蛋白及其缺失突变体在甲醛固定细胞中的定位 |
| 2.7 DPV VP22蛋白及其缺失突变体在不同固定剂处理细胞中的定位 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL49全基因及其缺失突变体的扩增 |
| 3.2 DPV UL49全基因及其缺失突变体融合荧光质粒的构建与鉴定 |
| 3.3 DPV VP22蛋白及其缺失突变体在活细胞中的定位研究 |
| 3.4 VP22蛋白及其缺失突变体在甲醛固定细胞中的定位时相 |
| 3.5 VP22蛋白及其缺失突变体在甲醇、乙醇、丙酮固定剂处理细胞中的定位 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 核定位信号的类型及研究意义 |
| 4.2 核定位信号的研究方法 |
| 4.3 DPV VP22蛋白核定位信号的确定 |
| 4.4 疱疹病毒VP22蛋白核定位信号研究 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第七章 DPV UL49基因RNA干扰有效靶点筛选及其对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 试验动物、细胞、毒株、载体 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 试剂配制 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 靶向DPV UL49基因的RNAi重组真核质粒的构建 |
| 2.1.1 靶向DPV UL49基因的shRNA设计与寡核苷酸合成 |
| 2.1.2 shRNA模板的退火 |
| 2.1.3 pGPU6 shRNA表达载体的线性化 |
| 2.1.4 pGPU6 shRNA表达载体的构建 |
| 2.2 DPV VP22全基因融合荧光表达质粒VP22a-GFP的构建及表达 |
| 2.3 不同RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 |
| 2.4 FQ-PCR法检测不同RNAi质粒对DPV UL49基因的转录抑制作用 |
| 2.5 靶向DPV UL49基因的RNAi质粒VP22-505对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 shRNA的设计与寡核苷酸的合成 |
| 3.2 pGPU6 shRNA重组质粒的鉴定 |
| 3.3 不同重组RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 |
| 3.4 FQ-PCR法检测4种RNAi质粒对DPV UL49基因转录的抑制作用 |
| 3.5 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV UL49基因转录的影响 |
| 3.5.1 DPV UL49基因及鸭β-actin基因标准曲线的构建 |
| 3.5.2 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV UL49基因转录的影响 |
| 3.6 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gB基因转录的影响 |
| 3.6.1 DPV gB基因标准曲线的构建 |
| 3.6.2 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gB基因转录的影响 |
| 3.7 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gD基因转录的影响 #]25 |
| 3.7.1 DPV gD基因标准曲线的构建 |
| 3.7.2 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gD基因转录的影响 |
| 3.8 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gE基因转录的影响 |
| 3.8.1 DPV gE基因标准曲线的构建 |
| 3.8.2 FQ-PCR法检测RNAi质粒VP22-505对DPV gE基因转录的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 RNAi研究的意义及作用机制 |
| 4.2 靶向DPV UL49基因的shRNA序列的设计与RNAi质粒构建 |
| 4.3 不同RNAi质粒对VP22a-GFP质粒荧光表达的抑制效率比较 |
| 4.4 靶向DPV UL49基因的RNAi质粒对病毒重要糖蛋白基因转录的影响 |
| 4.5 疱疹病毒VP22蛋白转录调控功能分析 |
| 4.6 RNAi技术在疱疹病毒上的应用 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 第六部分 作者简介 |
（8）表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肝细胞癌治疗方法的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝癌的流行病学 |
| 1.3 肝病的检查及鉴别诊断 |
| 1.4 肝癌的发病机理 |
| 1.5 局部治疗 |
| 1.6 手术疗法 |
| 1.7 当前肝癌的治疗手段 |
| 1.8 遗传图谱 |
| 1.9 肿瘤的基因治疗 |
| 1.10 展望 |
| 第2章 肝癌基因治疗的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 分子发病机制的概述 |
| 2.3 分子治疗肝细胞癌 |
| 2.4 特殊药物对HCC的治疗 |
| 2.5 基因治疗 |
| 2.6 HCC与JNK1的激活作用 |
| 2.7 血管内皮生成因子的作用 |
| 2.8 复制腺病毒靶向的肿瘤病毒疗法 |
| 2.9 肿瘤微环境调节 |
| 2.10 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制方式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Ad-HP和Ad-HT对信号分子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Ad-HP和Ad-HT的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）1、细菌纳米磁小体为载体的基因疫苗研究2、同种异基因白细胞联合细胞瘤苗治疗肿瘤的初步研究（论文提纲范文）
| 图标索引 |
| 第一部分 |
| 英文缩写注解 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 英文缩写注解 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）抑制素新型基因工程疫苗的构建及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(按字母顺序排列) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 抑制素免疫技术研究进展 |
| 1.1 抑制素免疫技术的研究 |
| 1.1.1 抑制素常规免疫研究进展 |
| 1.1.2 常规抑制素免疫技术的不足之处 |
| 1.1.3 抑制素基因免疫技术的研究 |
| 1.1.4 抑制素基因免疫的优势 |
| 1.1.5 抑制素基因免疫的局限性 |
| 1.1.6 影响抑制素基因免疫效果的因素 |
| 1.1.7 目前应用于抑制素DNA疫苗中的佐剂 |
| 1.1.8 抑制素DNA疫苗的安全性 |
| 1.1.9 抑制素免疫技术的展望 |
| 1.2 VP22基因免疫增强佐剂的研究进展 |
| 1.2.1 编码转导蛋白的VP22基因的研究进展 |
| 1.2.2 VP22蛋白转导特性的确定 |
| 1.2.3 VP22蛋白的转运机制 |
| 1.2.4 VP22在基因治疗中的应用 |
| 1.2.5 VP22蛋白转导的应用前景 |
| 1.2.6 小结 |
| 1.3 以减毒沙门氏菌为载体传递疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 以减毒沙门氏菌为载体的疫苗的优点 |
| 1.3.2 携带基因工程疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制 |
| 1.3.3 减毒沙门氏菌为载体潜在的危险 |
| 1.3.4 减毒沙门氏菌载体的应用 |
| 1.3.5 携带基因疫苗与外源抗原的重组减毒沙门氏菌的研究进展 |
| 1.3.6 减毒猪霍乱沙门氏菌的研究进展 |
| 1.4 小结 |
| 第二篇 研究的目和意义 |
| 第三篇 试验研究内容 |
| 第2章 BVP22基因佐剂对抑制素DNA疫苗的免疫效果研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌株、细胞株及质粒 |
| 2.2.2 载体 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液及其相关缓冲液 |
| 2.2.5 试验中用到的培养基及制备方法如下 |
| 2.2.6 引物 |
| 2.2.7 试剂盒 |
| 2.2.8 实验动物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 VP22基因的扩增 |
| 2.3.2 pMD18-T-VP22克隆载体的构建及测序 |
| 2.3.3 融合表达质粒pEGISI-VP22的构建与鉴定 |
| 2.3.4 pEGISI-VP22重组质粒的表达鉴定: |
| 2.3.5 动物试验设计 |
| 2.3.6 抗抑制素IgG抗体检测 |
| 2.3.7 抑制素DNA疫苗免疫后对小鼠繁殖性能的分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 VP22目的基因片段的扩增 |
| 2.4.2 pEGISI-VP22重组表达质粒的鉴定 |
| 2.4.3 融合质粒pEGISI-VP22体外表达检测 |
| 2.4.4 融合质粒pEGISI-VP22转染细胞后在转录水平上的检测 |
| 2.4.5 抑制素小鼠试验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 BVP22基因佐剂对生长抑素基因疫苗的免疫效果研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、细胞株及质粒 |
| 3.2.2 质粒pEGS2SS |
| 3.2.3 主要溶液及其相关缓冲液 |
| 3.2.4 扩增SS所用引物 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.2.6 VP22基因与pEGS2SS载体基因的酶切与回收 |
| 3.2.7 融合表达质粒pEGS2SS-VP22的构建与鉴定 |
| 3.2.8 融合表达质粒pEGS2SS-VP22的体外表达鉴定 |
| 3.2.9 生长抑素基因疫苗的制备 |
| 3.2.10 试验动物分组 |
| 3.2.11 抗生长抑素IgG抗体检测 |
| 3.2.12 对小鼠的生长性能的研究 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pEGS2SS-VP22重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2 融合表达质粒pEGS2SS-VP22的融合蛋白体外表达的检测 |
| 3.3.3 生长抑素小鼠试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 含VP22基因的融合表达质粒pEGS2SS-VP22的构建与表达鉴定 |
| 3.4.2 含VP22基因的生长抑素疫苗的免疫效果 |
| 3.4.3 小结 |
| 第4章 传递抑制素DNA疫苗的重组菌C501(pVAX-asd-IS)的构建及免疫效果评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 菌株、细胞株及质粒 |
| 4.2.2 pVAX1表达载体 |
| 4.2.3 主要溶液及其相关缓冲液 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 asd基因的扩增与酶切 |
| 4.3.2 asd与pVAX的酶切 |
| 4.3.3 酶切产物的回收与纯化 |
| 4.3.4 pVAX-asd的连接反应 |
| 4.3.5 大肠杆菌χ6097/C500菌株感受态细胞的制备(甘油法) |
| 4.3.6 细菌的电转化 |
| 4.3.7 pVAX-asd真核表达载体的鉴定 |
| 4.3.8 无抗性真核表达质粒pVAX-asd-IS的构建 |
| 4.3.9 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的遗传稳定性研究 |
| 4.3.10 抑制素真核表达质粒pVAX-asd-IS在Hela细胞中融合蛋白表达检测 |
| 4.3.11 疫苗的制备 |
| 4.3.12 动物试验安排 |
| 4.3.13 疫苗安全性的评价 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 无抗性真核表达质粒载体的构建 |
| 4.4.2 无抗性抑制素真核表达质粒的构建 |
| 4.4.3 pVAX-asd-IS质粒的体外表达鉴定 |
| 4.4.4 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的遗传稳定性 |
| 4.4.5 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的免疫效果研究 |
| 4.4.6 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的安全性评价 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 平衡致死系统中asd基因筛选标记的质粒pVAX-asd的构建 |
| 4.5.2 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的构建 |
| 4.5.3 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的遗传稳定性 |
| 4.5.4 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的免疫效果 |
| 4.5.5 重组菌C501(pVAX-asd-IS)的生物安全评价 |
| 第5章 免疫途径对重组菌C501(pVAX-asd-IS)免疫效果的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、质粒 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 疫苗的制备 |
| 5.2.4 动物试验设计 |
| 5.2.5 不同途径的免疫效果研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 不同途径免疫小鼠后的IgG抗体水平检测 |
| 5.3.2 不同途径免疫小鼠后的IgA水平检测 |
| 5.3.3 不同途径免疫小鼠后的IL-4,IFN-γ的含量的检测 |
| 5.3.4 免疫后小鼠的产仔数统计分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 传递抑制素重组抗原的重组菌C501(pYAIS)的构建及免疫效果研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 菌株、及质粒 |
| 6.2.2 载体 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 主要溶液及其相关缓冲液 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 小提质粒 |
| 6.3.2 质粒酶切 |
| 6.3.3 pYAIS的连接反应 |
| 6.3.4 电转化 |
| 6.3.5 传递抑制素重组抗原的重组菌C501(pYAIS)的构建与鉴定 |
| 6.3.6 重组菌C501(pYAIS)表达的抑制素融合蛋白免疫反应性检测 |
| 6.3.7 重组菌C501(pYAIS)表达条件的优化 |
| 6.3.8 重组菌C501(pYAIS)的遗传稳定性研究 |
| 6.3.9 疫苗的制备 |
| 6.3.10 动物试验设计与安排 |
| 6.3.11 免疫后小鼠的IgG抗体水平检测 |
| 6.3.12 免疫后小鼠的IgA抗体滴度检测 |
| 6.3.13 免疫后小鼠的产仔数分析 |
| 6.3.14 重组菌C501(pYAIS)的安全性评价 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 重组菌C501(pYAIS)的构建与鉴定 |
| 6.4.2 重组菌C501(pYAIS)表达蛋白的免疫反应性检测 |
| 6.4.3 重组菌C501(pYAIS)表达融合蛋白温度条件的优化 |
| 6.4.4 重组菌C501(pYAIS)传代培养后各代细菌的生长规律 |
| 6.4.5 重组菌C501(pYAIS)传代培养后各代质粒与菌株的检测 |
| 6.4.6 动物试验结果分析 |
| 6.4.7 免疫小鼠后的抗抑制素IgA水平 |
| 6.4.8 重组菌C501(pYAIS)的安全性评价 |
| 6.5 讨论 |
| 6.5.1 抑制素疫苗的发展 |
| 6.5.2 asd宿主平衡致死系统在抑制素疫苗中的优势 |
| 6.5.3 重组菌菌C501(pYAIS)的免疫效果 |
| 6.5.4 重组菌菌C501(pYAIS)的安全性评价 |
| 第四篇 全文总结 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| CURRICULUM VITAE |
| 发表的主要论文 |
| 致谢 |
四、单疱疹病毒结构蛋白VP22在细胞间的穿梭及其在基因治疗中的应用（论文参考文献）
- [1]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [2]VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究[D]. 杜毅超. 广西大学, 2017(01)
- [3]细胞穿膜肽VP22增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布[J]. 余娴,雷军,胥正敏,李婷婷. 中国药学杂志, 2015(11)
- [4]mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究[D]. 龙雨清. 天津农学院, 2015(01)
- [5]铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达[D]. 杨勤. 川北医学院, 2014(08)
- [6]疱疹病毒VP22蛋白功能研究进展[J]. 刘会娟. 畜牧与兽医, 2012(12)
- [7]鸭瘟病毒UL49基因功能研究[D]. 姜龙. 四川农业大学, 2012(07)
- [8]表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学, 2011(05)
- [9]1、细菌纳米磁小体为载体的基因疫苗研究2、同种异基因白细胞联合细胞瘤苗治疗肿瘤的初步研究[D]. 唐翌姝. 北京协和医学院, 2012(04)
- [10]抑制素新型基因工程疫苗的构建及其免疫效果研究[D]. 韩丽. 华中农业大学, 2009(09)